Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий: свойства, разнообразие, диагностика тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, доктор биологических наук Мулюкин, Андрей Львович

• Мулюкин, Андрей Львович
• доктор биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации доктор биологических наук Мулюкин, Андрей Львович

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Явление покоя у бактерий

1.1. Основные термины и положения

1.2. Стационарные (пролиферативно покоящиеся) клетки

1.3. Специализированные покоящиеся формы бактерий

1.3.1. Типы специализированных покоящихся форм

1.3.2. Генетические механизмы контроля образования покоящихся форм

1.3.3. Свойства специализированных покоящихся форм 41 1.3.4 Механизмы устойчивости и прорастания покоящихся форм (на примере эндоспор)

1.3.5. Диагностика покоящихся форм

Глава 2. Состояние покоя у неспорообразующих бактерий

2.1. Некультивируемые клетки "

2.1.1. Ультрамикробактерии

2.1.2. Жизнеспособные некультивируемые клетки

2.1.3. Восстановление способности некультивируемых клеток ревертировать к росту

2.2. Недостаточно изученные способы выживания неспорообразующих бактерий

2.3. Цистоподобные формы

Глава 3 . Ауторегуляция процессов образования покоящихся форм

3.1. Ауторегуляция процессов образования спор и акинет

3.2. Ауторегуляция цитодифференцировки и синтеза вторичных метаболитов стрепто-мицетов

3.3. Ауторегуляторы развития миксобактерий

3.4. Кворум-сенсинговая регуляция стационарной фазы

3.5. Ауторегуляторные факторы и сЬ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Объекты и методы исследования

4.1. Объекты

4.2. Базовые среды и условия культивирования микроорганизмов

4.3. Микробиологические методы

4.4. Стрессорные воздействия и устойчивость клеток

4.5. Приемы реанимации покоящихся клеток

4.6. Исследование фенотипической диссоциации

4.7. Микроскопические методы

4.8. Биохимические методы 91.

4.8.1. Включение радиоактивно-меченых предшественников белков и нуклеино- 91 вых кислот

4.8.2. Выделение, очистка и идентификация ауторегуляторнык факторов (¿

4.8.3. Выделение надмолекулярных комплексов ДНК (НК ДНК)

4.8.4. Выделение клеточных липидов и определение их содержания

4.8.5. Анализ метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК)

4.8.6. Определение активности ферментов

4.9. Молекулярно-генетические методы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 5. Свойства цистоподобных покоящихся форм.

5.1. Особенности морфологии и ультраструктурной организации

5.2. Длительность сохранения колониеобразующей способности

5.3. Экспериментально не выявляемая метаболическая (дыхательная) активность

5.4. Устойчивость к повреждающим воздействиям

5.5. Доказательства образования ЦПК как этапа в цикле развития культур

Глава 6. Условия образования цистоподобных покоящихся клеток неспорообразующих бактерий

6.1. Трофическая регуляция образования ЦПК

6.2. Плотностная регуляция образования ЦПК

6.3. Развитие стресса голодания

6.4. Внесение химического аналога аутоиндукторов анабиоза

Глава 7. Разнообразие покоящихся форм неспорообразующих бактерий

7.1. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм неспорообразующих бактерий

7.1.1. Разнообразие ЦПК P. awantiaca и P.flnorescens

7.1.2. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм М. smegmatis

7.2. Межштаммовый уровень разнообразия покоящихся форм

7.3. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм

7.3.1. Внутрипопуляционное разнообразие ЦПКМ luteus

7.3.2. Внутрипопуляционный уровень разнообразия покоящихся форм у

М. smegmatis

7.3.3. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий (ЦПК и эндоспор) по показателям термоустойчивости и реверсии к росту

Глава 8. Фенотипическая вариабельность: сопряженность с состоянием покоя и свойства дпссоциантов

8.1. Фенотипическая диссоциация у P. aurantiaca и P. flitorescens

8.2. Фенотипическая вариабельность у штаммов Sp7 и sp245 A. brasilense

8.3. Фенотипическая диссоциация с выщеплением антибиотикоустойчивых вариантов

8.4. Изучение фенотипической диссоциации с выщеплением вариантов, различающихся по показателям устойчивости и способности к образованию покоящихся форм как механизма переживания бактерий в окружающей среде

Глава 9. Диагностика и более полное выявление покоящихся форм

9.1. Изучение покоящихся клеток в природных субстратах in situ прямыми микроскопическими методами '

9.2. Разработка специальных процедур и применение различных методов учета для выявления пролиферативно-активных покоящихся клеток, не обнаруживаемых методами посевов

9.3. Повышение чувствительности ПЦР для детекции покоящихся форм как источника ДНК-матриц

Глава 10. Ауторегуляция процессов перехода бактерий впокоящееся состояние

10.1. Выделение и изучение природы ауторегуляторных факторов di

10.2. Динамика накопления ауторегуляторного фактора di Micrococcus luteus

10.3. Биологические эффекты АОБ

10.3.1. Биологическая активность ауторегуляторных факторов

10.3.2. Зависимость эффектов АОБ от возраста культур

10.3.3. Зависимость эффектов АОБ от их концентрации

10.3.4. Универсальность и особенности ауторегуляции, осуществляющейся при участии факторов di (АОБ)

10.3.5. Функции АОБ в образовании нежизнеспособных мумифицированных кле- 249 ток

10.4. Механизмы действия АОБ в процессах приобретения и поддержания состояния покоя

10.4.1. Роль АОБ в ингибировании метаболических процессов у покоящихся форм и их устойчивости

10.4.2. Роль АОБ в изменении структурной организации ДНК

10.4.3. Функции АОБ при прорастании покоящихся форм 268 10.5. Сравнительное изучение действия низкомолекулярных ауторегуляторов - неаци-лированного лактона гомосерина и алкилоксибензола - на рост и развитие бактерий

Прикладные аспекты исследований

ОБСУЖДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий: свойства, разнообразие, диагностика»

Актуальность проблемы и состояние вопроса

При изменении условий окружающей среды - исчерпании питательных веществ, источников энергии и пространственных возможностей, происходит или снижение скорости роста микроорганизмов, или стратегия роста заменяется стратегией переживания и перехода в состояние покоя. Начало исследований покоящегося состояния у микроорганизмов положили работы Ф. Кона и Р. Коха, описавших в 1876 г. эндоспоры бацилл. Наибольшую интенсивность и разносторонность изучение форм и механизмов покоя приобрело в середине XX века в рамках отдельного направления микробиологии. В настоящее время интерес к явлению покоя обусловлен явлением персистенции возбудителя туберкулеза [Wayne, 1994; Zhang, 2004] и других заболеваний [Watson et al., 1998; Бухарин и соавт. 2005], существованием антибио-тикоустойчивых клеток-персисторов [Keren et al. 2004, Lewis, 2007], обнаружением древних микроорганизмов [Cano, Borucky, 1995; Vreeland et al. 2000], в том числе, в глубокомерзлых породах [Звягинцев и соавт., 1985]. Однако у большинства видов неспорообразующих бактерий покоящиеся формы неизвестны, что определило актуальность диссертационной работы.

Множество публикаций посвящено жизнеспособному некулътивируемому (ЖНК) состоянию бактерий, в котором клетки, сохраняя потенциальную жизнеспособность, утрачивают способность образовывать колонии на плотных средах [Xu et al., 1982; Colwell et al., 1985; Oliver et al., 1993; Mukamolova et al., 1995; Oliver, 2005; Sachidanandham, Yew-Hoong Gin, 2009]. Несмотря на дискуссии по поводу адекватности этого термина состоянию неделения и сохранения клетками жизнеспособности [Bloomfield et al. 1998; Головлев, 1998; Barer, Har-wood, 1999], не вызывает сомнений существование самого явления и важность его исследований особенно в связи с мониторингом патогенных и условно-патогенных бактерий в природных местах обитания. ЖНК-состояние рассматривают и как форму покоя [Kaprelyants et al., 1993; Rahman et al., 1996], и как стадию на пути к отмиранию популяции [Joux et al., 1997; McDougald et al., 1998]. Некоторые авторы считают, что пребыванием клеток в таком состоянии нельзя объяснить длительное выживание бактерий в неростовых условиях [Bogosian et al., 1996]. Облигатное свойство всех бактерий формировать в циклах развития их культур покоящиеся «микроцисты», предназначенные для выживания вида, постулировалось Биссетом [Bisset, 1952]. Экспериментальные доказательства справедливости этой гипотезы - образование клеток цистоподобного типа, были получены позже для узкого круга микроорганизмов [Дуда и соавт., 1982; Sadasivan, Neyra, 1987; Бабусенко и соавт., 1991; Garduno et al., 2002; Berleman, Bauer, 2004]. При описании новых таксонов ряда неспорообразующих прокариот отмечалось образование клеток, схожих по строению с цистами [Горленко и соавт., 1976; Жилина, Заварзин, 1979; Heulin et al., 2003; Zhang et al., 2003; Zhilina et al., 2004; Ahmed et al., 2007]. При этом в работах таксономической направленности не исследовали их свойства как форм, предназначенных для длительного переживания вида. Отсутствие информации о покоящихся формах неспорообразующих бактерий обусловлено, во многом, отсутствием сведений об условиях, оптимальных для их образования в лабораторных культурах. При этом без достаточного количества покоящихся клеток невозможно исследование их свойств. Следует отметить, что трактовка термина «покой» для неспорообразующих бактериям широка и охватывает: (1) клетки культур стационарной фазы [Vulic, Kolter, 2001]; (2) некультивируемые формы [Roszak, Colwell, 1987; Kaprelyants et al., 1993]; (3) неактивные клетки в биопленках [Costerton et al., 1999; Xu et al., 1998]; (4) антибиотико-устойчивые персисторы [Shah et al., 2006]; (5) вышеупомянутые клетки цистоподобного типа. Это не тождественные состояния пролиферативного и метаболического покоя. Основанием для отнесения клеток к покоящимся формам прокариот является доказательство: 1) длительного сохранения их способности к репродукции; 2) резко сниженной или экспериментально не выявляемой метаболической активности; 3) повышенной устойчивости к повреждающим воздействиям; 4) отличий в ультраструктурной организации от вегетативных (делящихся и стационарных) клеток; 5) их образования в циклах развития культур - в соответствии с определением, принятым в литературе по спорам [Sudo, Dworkin, 1973; Cross, Atwell, 1975; Калакуцкий, Агре, 1977].

Другой важной проблемой при изучении способов выживания! микроорганизмов в природе в неростовых условиях является выяснение закономерностей и регуляции образования покоящихся форм. К настоящему времени накоплен обширный материал о сигнальных метаболитах и регуляторных системах, контролирующих многие процессы в циклах развития микробных популяций, такие как длительность лаг-фазы, споро- и антибиотикообразование, реактивацию некультивируемых клеток микрококков и др. [Хохлов, 1988; Fuqua et al., 1994; Олескин и соавт., 2000; Lazazzera, 2000; DeLisa, Bentley, 2002; Mukamolova et al., 1998; 2006]. Описаны плотностные ауторегуляторы — ацилированные гомосеринлактоны (ГСП) у ряда грамотрицательных бактерий, которые в зависимости от клеточной плотности популяции-контролируют индукцию ряда синтезов в стационарной фазе [Fuqua et al., 1994; Greenberg et al., 1996; Taga, Bassler, 2005]. Участие этих факторов в регуляции состояния покоя неизвестно. Регуляторы другого типа - факторы d|, представленные у ряда бактерий алкилоксибензо-лами (АОБ), имеют функции аутоиндукторов анабиоза [Эль-Регистан и соавт., 1979; 1980; Светличный и соавт., 1986; Осипов и соавт., 1985; Батраков и соавт., 1993; Лойко и соавт., 2002]. Безусловную важность представляет дальнейшее развитие исследований регуляции образования покоящихся форм у широкого круга микроорганизмов, осуществляющейся с участием коммуникативных факторов из групп алкилоксибензолов и гомосеринлактонов, а также изучение их видо(не)специфичности и функциональной роли в переходе клеток в состояние покоя и выходе из него.

Таким образом, изучение способов и форм покоя у неспорообразующих бактерий представляет фундаментальный и практический интерес для микробной экологии, медицины, биотехнологии.

Цель работы

Цель настоящего исследования - изучить способы выживания неспорообразующих бактерий в неростовых условиях: морфотипы покоя, условия и регуляцию образования и характеристики покоящихся клеток.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) выявить условия, способствующие образованию цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) у неспорообразующих бактерий в циклах развитая их культур;

2) охарактеризовать ЦПК как формы покоя по показателям: длительности сохранения про-лиферативного потенциала; отсутствия метаболической активности; устойчивости к повреждающим воздействиям; особенностям ультраструктурной организации;

3) охарактеризовать внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм по морфологическим типам, способности ревертировать к росту, степени глубины покоя, устойчивости к повреждающим воздействиям, фенотипической диссоциации при прорастании;

4) изучить роль внеклеточных ауторегуляторных факторов микроорганизмов в контроле перехода бактерий в состояние покоя и его поддержании;

5) разработать подходы к диагностике покоящихся форм бактерий в лабораторных культурах и природных образцах.

Научная новизна и значимость работы

Для широкого круга неспорообразующих грамположительных и грамотрицательных бактерий доказано, что при их росте в различных условиях цикл развития культур завершается образованием цистоподобных клеток (ЦПК), обладающих всеми признаками покоящихся форм прокариот. Для массового образования ЦПК в лабораторных культурах разработаны воспроизводимые условия, имитирующие природные. Эти условия принципиально применимы для получения покоящихся форм бактерий других таксонов с учетом специфики их ростовых потребностей.

Впервые показано внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий. Внутривидовое разнообразие проявляется как полиморфизм покоящихся клеток и зависит от условий их образования. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся клеток определенного морфотипа выражается в их разнокачественности по устойчивости к повреждающим воздействиям, отклику на условия прорастания и потребности в специальных процедурах реактивации. Показаны различия в способности покоящихся клеток разных типов ■ к фенотипической диссоциации. Расширены представления о функциях плотностных ауторе-гуляторов в процессах образования покоящихся форм. Продемонстрировано видонеспеци-фичное концентрационно-зависимое действие внеклеточных алкилоксибензолов при образовании: 1) жизнеспособных ЦПК; 2) не прорастающих на плотных средах, некультивируемых клеток и 3) нежизнеспособных микромумий. Показана принципиально сходная и видонеспе-цифичная функция алкилоксибензолов и неацилированного гомосеринлактона в ограничении роста численности клеток популяции и смене стадий развития бактериальных культур.

Для повышения эффективности экологического мониторинга разработаны диагностические критерии для обнаружения ЦПК в природных образцах ш situ, в том числе глубокомерзлых осадках. Критерии основаны на учете особенностей ультраструктурной организации покоящихся форм и соотношения в них ряда биогенных элементов (Са/К, P/S). Для покоящихся форм, не образующих колонии на обычных средах, применены разные методы учета и приемы выявления жизнеспособных клеток за счет варьирования состава сред для снятия эффекта субстрат-ускоренной смерти и защиты от окислительного стресса. Показана возможность повышения чувствительности ПЦР при использовании покоящихся форм бактерий (ЦПК и эндоспор) как источников матриц ДНК.

Постулируется, что внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий обеспечивает длительное, не сопоставимое со временем генерации клеток, выживание вида в природе при неблагоприятных для роста условиях и его расселение при наступлении ситуаций, предусматривающих возможность реверсии к росту.

Практическая значимость работы

Полученные результаты могут быть использованы для: 1) совершенствования методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов; 2) разработки способов получения длительно хранящихся стабильных бактериальных препаратов; 3) повышения эффективности экологического и санитарно-эпидемиологического мониторинга ок- -ружающей среды за счет учета покоящихся и не прорастающих на плотных средах клеток. Цистоподобные покоящиеся клетки сапротрофных аналогов патогенных бактерий рекомендованы для включения в тест-системы для проверки действия антимикробных агентов. Химические аналоги ауторегуляторных факторов (АОБ) испытаны в качестве новых биоцидов для защиты различных материалов от микробного разрушения, что оформлено в виде 2 заявок на патенты РФ.

Основные защищаемые положения:

1. Широкому кругу неспорообразующих бактерий свойственен переход в состояние эндогенного покоя, являющегося необходимой стадией в циклах развития их культур. Его формой являются цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК), обладающие всеми признаками покоящихся форм прокариот.

2. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм проявляется как образование ЦПК разных типов при развитии микробной популяции (культуры) в различных условиях ее роста и является важным эволюционно приобретенным свойством для длительного выживания вида.

3. Популяции покоящихся форм гетерогенны по показателям их устойчивости к повреждающим воздействиям, отклику на условия роста, потребности в процедурах реактивации и популяционному спектру в новом цикле развития.

4. Покоящиеся формы бактерий можно выявлять по их диагностическим критериям прямыми микроскопическими методами, более полно учитывать культуральными методами и использовать в ПЦР.

5. Процессы приобретения, развития и поддержания состояния покоя контролируются внеклеточными видонеспецифичными низкомолекулярными ауторегуляторами, представленными у ряда бактерий моно- и диалкилоксибензолами.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены в форме устных и стендовых сообщений на: International Workshops on Bioencapsulation" (Потсдам, Германия, 1996; Барселона, Испания, 1997); 12-emes Rencontres de Blois "Frontiers of Ше"(Блуа, Франция, 2000); Geo-Extreme Workshop (Тремити, Италия, 2001); 3rd Int. Conference on Protein Stabilisation (Тулуза, Франция, 2002); Bacterial Paleontology/ Astrobiology (Москва, ПИН РАН, 2002); Second European Workshop on Exo/Astrobiology (Грац, Австрия, 2002); European Geophysical Society-2003 (Ницца, Франция, 2003); 1st и 2nd FEMS Congress European microbiologists (Любляна, Словения, 2003; Мадрид, Испания, 2006); 35th Scientific Assembly COSPAR (Париж, Франция, 2004); Российско-французском семинаре «Восток 2005» (Репино, Ленинградская обл., 2005); Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиоти-ческих систем» (Саратов, 2007); Open Science Conference SCAR-IASC-IPY (Санкт-Петербург, 2008); Конференциях памяти проф. М.В.Гусева «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (МГУ, 2006; 2009); конкурсах научных работ ИНМИ РАН.

Публикации- По материалам диссертации опубликовано 74 работы, включая 37 экспериментальных статей, 2 обзора (38 в списке журналов ВАК), 3 главы в монографиях, 5 работ в материалах научных мероприятии, 2 заявки на патент, 26 тезисов докладов.

Бюджетное финансирование. Работа выполнена в рамках тем «Разработка методических приемов хранения, поддержания и учета культур уникальных и экстремофильных микроорганизмов» (№ гос/рег. 01200213054); «Ауторегуляция адаптации и устойчивости микроорганизмов к стрессовым воздействиям» (№ 01200213058); «Выживание микроорганизмов: клеточные формы, механизмы, регуляция» (№ 01200601980). Исследования были осуществлены при поддержке грантов РФФИ 99-04-49144, 01-04-48771, 02-04-49150, 03-04-48403, 04-0449710, 05-04-49520, 06-08-01469, 07-04-01011; прикладного гранта РФФИ-офи-07-04-12121.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 349 страницах текста и включает 86" рисунков и 51 таблице; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием методов и результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы (100 русских и 628 иностранных наименований).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Мулюкин, Андрей Львович

выводы

1. Доказано образование цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) у неспорообразующих бактерий - грамположительных Micrococcus luteus, Arthrobacter globiformis, Mycobacterium smegmatis, M. phlei, Lactobacillus plantarum, Rhodococcus rhodochrous, Staphylococcus aureus и грамотрицательных Pseudomonas aurantiaca, P. fluorescens, Escherichia coli, Azospirillum brasilense.

2. Эффективность образования покоящихся форм обеспечивается дисбалансом источников питания в среде; стрессом голодания; индукцией автолиза у части популяции с высокой клеточной плотностью; повышением в культуре концентрации аутоиндукторов анабиоза (алкилоксибензолов).

3. ЦПК неспорообразующих бактерий образуются в циклах развития их культур и обладают всеми признаками покоящихся форм прокариот: длительным сохранением жизнеспособности; экспериментально не выявляемым уровнем метаболической активности; повышенной устойчивостью к повреждающим воздействиям; особенностями «ультраструктурной организации.

4: В ^разных условиях развития в культурах неспорообразующих (Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aurantiaca, Azospirillum brasilense и др.) и спорообразующих (Bacillus snb-tilis, В. се re us) бактерии формируются покоящиеся формы различных морфологических типов и степени устойчивости к повреждающим воздействиям. Наличие ЦПК у спорообразующих бацилл является проявлением полиморфизма форм покоя и альтернативой эндоспорам в условиях репрессии спорообразования.

5. Доказана внутрипопуляционная гетерогенность покоящихся форм одного и того же типа-по устойчивости к повреждающим воздействиям; отклику на ростовые условия; потребности в специфических условиях для прорастания.

6. Внутрипопуляционное разнообразие ЦПК проявляется в расширении спектра фенотипи-ческой диссоциации популяций, прорастающих из этих покоящихся форм. Это сопровождается появлением и развитием фенотипов, отличных от доминантного типа по колониально - морфологическим, ростовым, биохимическим признакам и устойчивости к антимикробным агентам.

7. Покоящиеся формы поддаются выявлению в природных образцах прямыми микроскопическими методами. Для дифференциального определения вегетативных w покоящихся

• клеток бактерий разработаны диагностические критерии, основанные на особенностях ультраструктурной организации и различиях в соотношениях Са/К и P/S. Показана возможность более полного учета численности потенциально жизнеспособных покоящихся форм, а также повышения чувствительности ПЦР при использовании эндоспор и ЦПК как источника матриц.

8. Выявлено видонеспецифичное концентрационно-зависимое действие внеклеточных микробных ауторегуляторов - алкилоксибензолов (АОБ), в ингибировании роста бактериальных культур и переходе клеток в состояние покоя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе диссертационного исследования была решена важная фундаментальная проблема, а именно, доказано наличие форм покоя - цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) - у широкого круга неспорообразующих бактерий, обеспечивающих длительное выживание вида в условиях, когда рост невозможен. Образование ЦПК в циклах развития бактериальных культур правомочно рассматривать как экстремальную форму ответа неспорообразующих бактерий на стрессы голодания и ограничения пространства. Приоритетным является выявление закономерностей регуляции образования ЦПК, которая определяется трофическими условиями и клеточной плотностью культур и осуществляется при участии низкомолекулярных внеклеточных ауторегуляторов. На основе выявленных закономерностей разработаны условия, имитирующие природные ситуации и способствующие массовому образованию покоящихся форм. Практическая ценность этих разработок состоит в их применимости для дальнейших исследований форм покоя у других микроорганизмов.

Установлено, что ЦПК обладают всеми характеристиками покоящихся форм микроорганизмов и отличаются от цист азотобактера особенностями ультратонкого строения и большей устойчивостью к стрессорным нагрузкам. Доказательства образования ЦПК неспорооб-разующими бактериями в разных условиях развития, хотя и с различными эффективностью и свойствами, позволяют констатировать неотъемлемость стадии покоя в онтогенезе культур неспорообразующих бактерий. Интерес для микробной экологии представляют данные о распространенности цистоподобных клеток бактерий в природных объектах, в том числе, древних глубокомерзлых подпочвенных осадках. Таким образом, постулируется, что длительное выживание неспорообразующих бактерий обеспечивается образованием ЦПК, обладающих повышенной стрессоустойчивостью и высоким потенциалом возобновления роста.

Впервые показано внутривидовое разнообразие форм покоя бактерий, когда в разных условиях роста культур цикл их развития завершается образованием покоящихся клеток, различающихся структурной организацией, устойчивостью к повреждающим воздействиям и характером развития в новом цикле. Важной закономерностью является гетерогенность популяции покоящихся форм бактерий по их отклику на возврат условий роста и потребности в процедурах реактивации. Многоуровневое разнообразие ЦПК обеспечивает гибкость стратегии выживания вида в меняющихся условиях. Представляет теоретический и практический интерес связь между пребыванием клеток бактерий в состоянии покоя в виде цистоподобных форм и повышением фенотипической вариабельности популяций, развивающихся при их прорастании. Перспективу для дальнейших исследований имеют данные о повышении частоты появления антибиотикорезистентных вариантов микобактерий и стафилококков, выявляемых при прорастании определенных морфологических типов покоящихся форм этих бактерий.

Новизну составляет также разработка критериев для прямого выявления покоящихся клеток в природных образцах in situ на основе особенностей их ультраструктурной организации и соотношений в них ряда биогенных элементов (Са/К, P/S). Этот блок исследований приобретает важность для выявления и оценки физиологического состояния микробных клеток in situ, поскольку покоящиеся формы не поддаются обнаружению прямыми молекулярными методами (FISH). Теоретически и практически значимым результатом работы является повышение эффективности учета жизнеспособных покоящихся клеток, которые не выявляются традиционными методами посевов. Данный раздел исследований создает предпосылки к повышению эффективности экологического и санитарно-эпидемиологического мониторинга. В работе установлены закономерности видонеспецифичного, концентрационно-зависимого действия микробных ауторегуляторов класса алкилоксибензолов при образовании: 1) жизнеспособных ЦПК; 2) не прорастающих на плотных средах (некультивируемых) форм и 3) принципиально нежизнеспособных микромумий. На основании выявленных закономерностей регуляции развития микробных культур разработаны подходы к обеспечению обратимого или необратимого подавления развития микроорганизмов с участием алкилоксибензолов и их производных.

Практическая значимость работы состоит в совершенствовании методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов и разработке способов получения длительно хранящихся стабильных бактериальных препаратов за счет перевода клеток в состояние покоя. Цистоподобные покоящиеся клетки бактерий рекомендованы для включения в тест-системы для проверки действия антимикробных агентов. Химические аналоги ауторегуляторных факторов испытаны в качестве новых биоцидов для защиты различных материалов от микробного разрушения, что оформлено в виде заявок на патенты РФ.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Мулюкин, Андрей Львович, 2010 год

1. Акименко В.К Альтернативные оксидазы микроорганизмов. М. : Наука.1989. 263 с.

2. Бабусенко Е.С., Элъ-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий //Успехи химии. 1991. Т. 60. С. 2362 2373.

3. Батраков С.Г., Придачина H.H., Кругляк Е.Б., Новогрудская Е Д, Чекасина Е.В. Необычный полиольный липид, 2-С-с1-талопиранозил-5-алкил-(С19 С21)-резорцин, из азотфикси-рующей бактерии Azotobacter chroococcwn II Биоорг. химия. 1982. Т.8. С. 980 986.

4. Батраков С.Г., Элъ-Регистан Г.И., Придачина H.H., Ненашева В.А., Козлова А.Н., Гряз-нова М.Н., Золотарева ИН., Тнрозол ауторегуляторный фактор di Saccharomyces serevisiae //Микробиология. 1993. Т. 62. С. 633 - 638.

5. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л, Романова Ю.М., Элъ-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина. 2005. 367 с.

6. Волкогон В.В., Мамчур А.Е, Лемешко С.В., Минягто В.Г. Азоспириллы эндофиты семян злаковых растений //Микробиологич. журнал. 1995. Т. 57. С. 14-19.

7. Галъчеико В. Ф. Метанотрофные бактерии. М.: ГЕОС. 2001. 500 с.

8. Герасименко Л.М., Заварзин Г.А., Розанов А.Ю., Ушатинская Г.Т. Роль цианобактерий в образовании фосфатных минералов//Журн. общ. биологии. 1999. Т. 60. С. 415-430.

9. Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. С. 725-735

10. Головлев ЕЛ. Академик Николай Дмитриевич Иерусалимский (1901—1967) II Микробиология. 1999.~T.68. С.800-808

11. Голод H.A., Лойко Н.Г. Лобанов КВ., Миронов С.А. Воейкова Т.А., Галъченко В.Ф., Николаев Ю.А., Элъ-Регистан Г.И. Роль микробных ауторегуляторов — алкилоксибензолов, в контроле экспрессии стрессовых регулонов //Микробиология. 2009. Т. 78. №6. С. 731741.

12. Гордеев К.Ю., Битков В.В., Придачина H.H., Ненагиев В.А., Батраков С.Г. Бактериальные 5-н-алкил(С19-С25)резорцины- неконкурентные ингибиторы фосфолипазы А2 // Биоорг. химия. 1991. Т. 17. С. 1357-1364.

13. Горленко В.М. Спорообразование у почкующейся фотогетеротрофной бактерии // Микробиология. 1969. Т. 38. С. 128-134.

14. Горленко В.М., Kennen О.И., Пучков А.Н. Морфологическая дифференциация несерных пурпурных бактерий //Микробиология. 1976. Т. 47. Вып. 5. С. 817-823.

15. Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнег.ов С.И. Экология водных микроорганизмов. 1977. М: Наука. 287 с.

16. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Элъ-Регистан Г.И. О механизмах взаимодействия ДНК с химическими аналогами аутоиндукторов анабиоза // Микробиология 2005. Т. 74. С.616-625.

17. Давыдова O.K., Дерябин Д. Г., Элъ-Регистан Г.И. Исследование влияния химических аналогов ауторегуляторных di факторов микроорганизмов на структурные переходы ДНК методом ИК-спектроскопии //Микробиология. 2007. Т.76. С.306 312.

18. Данилевич В.Н., Гришин Е.В. Новый подход для выделения геномной ДНК из дрожжей и грибов: получение ДНК-содержащих клеточных оболочек и их прямое использование в

19. ПЦР //Биоорг. химия. 2002. Т. 28. С. 156-167.

20. Данилевич В.Н., Дуда В.И., Сузина Н.Е., Гришин Е.В. Получение и характеристика ДНК-содержащих микромумий дрожжей и грамположительных бактерий с увеличенной проницаемостью клеточной оболочки: Применение в ПЦР// Микробиология. 2007. Т. 76. С. 72-82.

21. Демкипа Е.В., Соина B.C., Элъ-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т. 69. №3. С. 383-388.

22. Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Баринова Е.С., Дуда В.Е., Воронин A.M. Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры микробных клеток in situ в экстремальных биотопах//Микробиология. 2004 Т. 73. С 832-840

23. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.В., Элъ-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus шт. 504 // Микробиология. 2001. Т. ,70. С. 811-819.

24. Дуда В.И. Особенности клеточной дифференциации бактерий // В сб. : Онтогенез микроорганизмов, 1979. С. 186-197.

25. Дуда В.И. Особенности цитологии спорообразующих бактерий // Успехи микробиол. 1982. вып. 17. С. 87-116.

26. Дуда В.И., Пронин С.В., Эль-Регистан Г.И., Капрельтщ A.C., Митюшина Л.Л., Образование покоящихся рефрактерных клеток у Bacillus cereus под воздействием ауторегуля-торного фактора//Микробиология. 1982. Т. 51. С. 77 81.

27. Дуда В.И. Анабиоз бактериальных спор // В кн. "Торможение жизнедеятельности микроорганизмов (ред. Бекер М.Е, Рапопорт А.И., Калакуцкий Л.В. и др.), Рига, "Зинатне",. 1987, с. 155-159.

28. Евдокимова Н.В., Дорофеев А Г., Паников Н.С. Динамика выживания и перехода в покоящееся состояние бактерий Pseudomonas fluorescens в процессе азотного голодания // Микробиология. 1994. Т.63. С. 195-203.

29. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. М.: КМК Scientific Press. 1997. 144 с.

30. Ермакова М.Т., Шнырова В.А., Головлев Е.А., Взаимосвязь между скоростью роста и дыханием Rhodococcus minimus II Микробиология. 1990. Т. 59. С. 558-564.

31. Жданов К.И., Дьячков Е.П., Стручков В.А., Стражевская Н.Б., Дьячков П.Н. ДНК-связанные липиды: моделирование взаимодействия ДНК со стеариновой и ненасыщенными жирными кислотами // Изв. Акад. наук. Сер. химическая. 2003. №9. С. 1794-1800.

32. Жилина Т.Н. Жизненные структуры миксобактерий Archangium // Микробиология. 1968. Т. 37. С. 903-907.

33. Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Образование цист метаносарциной // Микробиология. 1979. Т. 48. №3. С. 451-456

34. Жилина Т.Н., Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Кострикина H.A., Лысенко A.M. Orenia sivashensis sp.nov. новая умеренно галофильная анаэробная бактерия из лагун Сиваша // Микробиология. 1999. Т. 68. С. 529-537.39.