Поиск молекулярно-цитогенетических маркеров с использованием геномной ВАС библиотеки лука батуна: Allium fistulosum L. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Шейх Бейг Гохарризи Мохаммад Али Мохаммад

  • Шейх Бейг Гохарризи Мохаммад Али Мохаммад
  • кандидат науккандидат наук
  • 2016, Москва
  • Специальность ВАК РФ03.01.06
  • Количество страниц 126
Шейх Бейг Гохарризи Мохаммад Али Мохаммад. Поиск молекулярно-цитогенетических маркеров с использованием геномной ВАС библиотеки лука батуна: Allium fistulosum L.: дис. кандидат наук: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии). Москва. 2016. 126 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Шейх Бейг Гохарризи Мохаммад Али Мохаммад

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................11

1.1. Использование ВАС-клонов в молекулярно-цитогенетических исследованиях.........................................................................................................11

1.1.1. Конструирование библиотек бактериальных искусственных хромосом 16

1.1.2. ВАС-векторы.................................................................................................20

1.1.3. Скрининг ВАС-библиотек с ДНК-зондами................................................24

1.2. Тандемные повторы в геноме растений........................................................27

1.2.1 Хромосомная организация тандемных повторов.......................................31

1.2.2 Функция и эволюция тандемных повторов.................................................33

1.2.3. Субтеломерный повтор................................................................................37

1.3. Особенности организации генома A. fistulosum............................................41

1.3.1. Теломера........................................................................................................43

1.3.2. Ретротранспозоны.........................................................................................47

1.4 Флуоресцентная in situ гибридизация.............................................................48

1.5. Краткая ботаническая характеристика лука батуна.....................................50

ГЛАВА11.МАТЕРИАЛЫИМЕТОДЫ...............................................................51

2.1. Растительный материал...................................................................................51

2.2. Выделение ДНК...............................................................................................51

2.3 Краткое описание геномной библиотеки BAC..............................................51

2.3.1 Конструированиегеномной библиотеки BAC.............................................51

2.3.2 Выделение высокомолекулярной ДНК из A. fistulosum.............................51

2.3.3 Запаивание ДНК в агарозу............................................................................52

2.3.4 Расщепление ДНК встроенной в агарозные микрогранулы......................52

2.3.5 PFGE анализ разделённых фрагментов для клонирования.......................53

2.3.6 Лигирование ДНК с вектором......................................................................53

2.4. Скрининг библиотеки BAC............................................................................55

2.4.1 Скрининг библиотек BAC при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)........................................................................................................................55

2.4.2. Осаждение ПЦР-продукта...........................................................................57

2.5. Выделение плазмидной ДНК..........................................................................57

2.6. Мечение ДНК...................................................................................................58

2.6.1. Мечение ДНК при помощи Nick-трансляции............................................58

2.6.2 Мечение продукта ПЦР.................................................................................58

2.7 Dot-blot проверка меченой ДНК......................................................................58

2.8 Приготовлениепрепаратов митотических хромосом....................................59

2.9. Флуоресцентная in situ гибридизация FISH и BAC-FISH...........................59

2.9.1. Микроскопия и анализ изображения..........................................................60

2.10. Кариотипирование.........................................................................................60

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .. 61

3.1 Прицентромерный тандемный повтор AfiT32...............................................61

3.1.1 Скрининг библиотеки BAC А. fistulosum с AfiT32 праймерами...............62

3.1.3. BAC-FISH анализ клонов несущих AfiT32 прицентромерные повторы 66

3.2 Тандемный повтор GL58, ассоциированный с гетерохроматином.............71

3.2.1 Скрининг BAC библиотеки А. fistulosum с CL58 праймерами.................72

3.2.2. BAC-FISH анализ клонов, несущих GL58 тандемные повторы..............74

3.3 Субтеломерный сателлитый тандемный повтор 378 п.н..............................78

3.3.1. Скрининг BAC библиотеки А. fistulosum с субтеломерным повтором ... 78

3.3.2 BAC-FISH анализ клонов, несущих субтеломерный повтор....................80

3.4 CL26 тандемный повтор ассоцированный с рибосомальными генами......82

3.4.1 Поиск и создание ДНК зонда.......................................................................82

3.4.2 Скрининг ВАС-библиотеки с праймерами на CL26 тандемный повтор . 87

3.4.3 FISH-анализ ВАС-клона 5.3.1., содержащего CL26-повтор.....................90

3.4.4 Анализ геномной вставки ДНК ВАС-клона 5.3.1 на наличие 378 п. н.

субтеломерного повтора.........................................................................................90

3.4.6 ПЦР анализ ВАС-клона 5.3.1 с праймерами на последовательности IGS

45S rDNA.................................................................................................................95

ВЫВОДЫ................................................................................................................99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................103

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА.....................................122

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», 03.01.06 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск молекулярно-цитогенетических маркеров с использованием геномной ВАС библиотеки лука батуна: Allium fistulosum L.»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы

BAC-клоны в сочетании с FISH являются эффективным методом для исследования генома и физического картирования. ВАС-FISH был успешно использован для создания хромосом специфических маркеров с целью идентификации индивидуальных хромосом картофеля (Song et al., 2000) проса (Akiyama et al., 2004), сорго (Islam-Faridi et al., 2002), люпина (Ksi^zkiewicz et al., 2013), томатов (Szinay et al., 2008) и др. ВАС-FISH картирование хромосомы 1 сорго показало, что данный подход гораздо эффективнее для создания хромосом-специфичных маркеров, чем отбор с помощью проточной цитометрии или микродессекции (Islam-Faridi et al., 2002). FISH-картирование ВАС-клонов было ключевым моментом в секвенировании генома томатов (Szinay D. и д.р., 2008).

Благодаря ранее проведенным исследованиям было показано, что библиотеки бактериальных искусственных хромосом (Bacterial Artificial Chromosome, BAC) представляют собой один из основных способов изучения и анализа генома. Использование ВАС-векторов позволяет клонировать последовательности ДНК размером до 300 тысяч пар нуклеотидов (Tao and Zhang., 1998). С помощью данного метода удалось получить геномные ДНК-библиотеки для некоторых важных сельскохозяйственных культур, таких как пшеница (Moullet et al. 1999), картофель (Song et al. 2000), рис (Wang et al. 1995), сорго (Woo et al. 1994), а также для лука репчатого (Suzuki et al. 2001). Ранее была создана ВАС-библиотека геномной ДНК лука батуна, A. fistulosum L. (Киселева и др. 2012).

Важно отметить, что лук батун является носителем хозяйственно-ценных генов и может быть использован в селекции лука репчатого. Было отмечено, что

лук батун мало поражается луковой листовой гнилью и розовой корневой гнилью (Currah, Maude, 1984; Netzer et al.1985), а также имеет хорошую устойчивость к луковой мухе и антракнозу (Galvan et al. 1997; De Ponti et al. 1984). Кроме того, лук батун, превосходит лук репчатый по таким показателям как содержание сухого вещества и морозостойкость, характеризуется более коротким и ранним цветением. Он имеет более острый вкус, а для насекомых-опылителей отличается большей привлекательностью соцветий (Van der Meer, Van Bennekom, 1978).

Геном лука батуна остается недостаточно изученным из-за его больших размеров, высокой частоты дупликаций и повышенной гетерозиготности. Тем не менее, в Университете Миссури (USA) в 2013 году началась работа над проектом по секвенированию генома A. fistulosum. Геном лука-батуна равен 26.3 пикограмма (Narayan., 1988) или состоит из 11 466 тыс. п. н. (Ricroch et al., 2005) на 1 C, делая его одним из самых больших геномов среди культивируемых растений (6, в 16 и 103 раз больше, чем кукуруза (Zea mays), помидор (Lycopersicon esculentum) и Arabidopsis thaliana соответственно.

Тандемные повторы часто формируют последовательности ДНК таких важных структур хромосом как центромера и теломера, а также субтеломерные и другие гетерохроматиновые области. Тандемные повторы активно изучаются в течение последних лет (Henikoff et al. 2001; Jiang et al. 2003). Тандемные повторы представляют собой ценный источник молекулярно цитогенетических маркеров для идентификации индивидуальных хромосом (Albert et al. 2010). Поэтому поиск тандемных повторов в геноме лука батуна и их использование в качестве ДНК-зондов для скрининга ВАС-библиотеки явилось одним из ключевых моментов в выявлении ВАС-клонов для создания молекулярно-цитогенетических маркеров.

Поскольку лук батун является донором ценных генов и используется в

программах межвидовой селекции, работа над созданием хромосомспецифичных молекулярно-цитогенетических маркеров представляет собой крайне важную задачу. Молекулярно-цитогенетические маркеры являются самым быстрым и надежным инструментом мониторинга интрогрессии генетического материала от донора в геном реципиента. Цели и задачи работы. Цель работы - создание молекулярно-цитогенетических маркеров на основе специфических тандемных повторов и изучение их геномной организации с использованием ВАС-библиотеки лука батуна (Allium fistulosum L.).

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Создать ДНК-зонды на основе тандемных повторов для скрининга ВАС-библиотеки;

2. Провести ПЦР-скрининг ВАС-библиотеки с праймерами на прицентромерный повтор AfiT32 и BAC-FISH картирование клонов, несущих этот повтор;

3. Провести ПЦР-скрининг ВАС-библиотеки с праймерами на тандемный повтор CL58 и BAC-FISH картирование клонов, несущих этот повтор;

4. Провести скрининг ВАС-библиотеки для поиска субтеломерного тандемного повтора с использованием ДНК-зондов и BAC-FISH картирование клонов, несущих этот повтор;

5. Провести биоинформатический анализ данных секвенирования следующего поколения (NCBI, SRX268217) для поиска хромосомо-специфичных повторов;

6. Провести ПЦР-скрининг ВАС-библиотеки с праймерами на хромосомо-специфический повтор CL26 и BAC-FISH картирование клонов, несущих CL26;

7. Провести ПЦР-анализ БЛС-клона 5.3.1, несущего СЬ26-повтор с праймерами на рибосомальные гены, межгенный спейсер 45 Б рДНК и 378 п. н субтеломерный повтор.

Научная новизна: Получены новые молекулярно-цитогенетические маркеры для идентификации хромосом 5, 6, 7 и 8 A. fistulosum в результате скрининга ВАС-библиотеки A. flstulosum и изучена их геномная и хромосомная организация. Выявлено 10 ВАС-клонов с тандемными повторами, которые являются ценным генетическим ресурсом для фундаментальных исследований по эволюции хромосом растений.

Найден новый тандемный повтор СЬ26 (400 п.н.) в результате биоинформатического анализа данных секвенирования следующего поколения (КСБ1, БКХ268217). Установлено, что СЬ26-повтор составляет 0,2% генома A. flstulosum и локализован на хромосоме 6 в области вторичной перетяжки, ЯОР (Ядрышко Образующий Регион).

Изучена геномная организация СЬ26-повтора с использованием ВАС-клона, несущего этот повтор. Установлено, что СЬ26-повтор локализован проксимальнее субтеломерного повтора и находится рядом с ЮБ (межгенный спейсер) 45 Б рРНК генов. Выдвинута гипотеза о переносе единиц субтеломерного повтора ретротранспозонами из субтеломерной области в место локализации СЬ26-повтора в процессе эволюции генома A. flstulosum. Практическая значимость. Полученные хромосомоспецифичные маркеры могут быть использованы в межвидовой селекции луков для мониторинга интрогрессии генетического материала лука батуна в геном реципиента. Созданные маркеры являются важным инструментом для интегрирования генетических и физических карт A. flstulosum. Методология и методы диссертационного исследования

Диссертационное исследование выполнено с использованием современного оборудования и современных биотехнологических, молекулярных и молекулярно-цитогенетических методов. Методология и методы исследования представлены полностью в разделе «Материалы и методы». Положения, выносимые на защиту

1. Набор молекулярно-цитогенетических маркеров для идентификации индивидуальных хромосом 5, 6, 7 и 8 Allium fistulosum.

2. 10 ВАС-клонов с тандемными повторами, которые являются ценным генетическим ресурсом для фундаментальных исследований по эволюции хромосом растений.

3. Новый тандемный повтор CL26 (400 п.н.), занимающий 0,2% генома Allium fistulosum, который с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) локализован на хромосоме 6 в области вторичной перетяжки, ЯОР (Ядрышко Образующий Регион).

4. Геномная и хромосомная организация CL26-повтора, свидетельствующая о том, что ^26-повтор расположен в молекуле ДНК проксимальнее субтеломерного повтора и входит в состав ВАС-клона, содержащего межгенный спейсер 45 S рРНК генов и субтеломерный повтор.

Работа поддержана грантом Министерства образования и науки Российской Федерации: аспирантский проект VN 258163.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 150-летию РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2015) и 7 Международном симпозиуме по съедобным луковым «Edible Alliaceae» (Турция, Нигде, 2015).

Личный вклад автора. Результаты представленных в данной диссертации исследований получены лично автором в Центре молекулярной биотехнологии

и на кафедре генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева». Подавляющая часть экспериментальной работы выполнена автором самостоятельно. Скрининг ВАС-библиотеки с использованием ДНК-зондов проведен лично автором. Приготовление препаратов хромосом и постановка флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) выполнены автором самостоятельно. Микроскопия, кариотипирование, гель-электрофорез проведены лично автором. Участие автора в обсуждении полученных результатов и написании научных статей.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста и включают 26 рисунков, 1 таблицу. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы», «Список иллюстративного материала». Список литературы включает 162 источника, из них 159 - на иностранном языке.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование ВАС-клонов в молекулярно-цитогенетических исследованиях

Клонирующие векторы на основе бактериальных искусственных хромосом (ВАС), позволяющие клонировать большие фрагменты геномной ДНК (до 300 п. н.) являются одним из главных инструментов анализа генома, функциональной характеристики генов и физического картирования. Первое сообщение о клонировании большого фрагмента ДНК было опубликовано в 1987 Дэвидом Бэрком и др. Клонирование было основано на искусственной дрожжевой хромосоме, состоящей из точки начала репликации, теломеры и центромеры. У системы искусственных дрожжевых хромосом есть главное преимущество - это способность содержать в себе полные геномные локусы больших генов, включая ряд альтернативных промоторов и экзонов и их элементов контроля репликации. Однако у YAC-векторов есть ряд недостатков: высокий процент химерности (примерно 50% клонов искусственных дрожжевых хромосом химерны и могут генерировать различные перестройки вставок (Burke, 1990 and Anderson, 1993), 15-ти мегабазные участки хромосом донора, вставленные в дрожжи, не могут быть отделены от искусственных дрожжевых хромосом простыми методами, более того, клоны искусственных дрожжевых хромосом нестабильны и склонны удалять внутренние области из своих вставок (Burke 1990; Neil и др.1990; Green и др. 1991; Anderson 1993). В начале 1990-х был разработан клонирующий вектор BAC на основе F-плазмиды, найденной в E. coli (Shizuya и др., 1992). В BAC-клонах можно разместить вставки до 300 т.н. (Monaco and Zoia, 1994). Для сравнения, система космид может быть клонирована с максимальным размером вставки в 40-50 т.н. (Neil и др., 1990).

Клетки E. coli могут быть эффективно трансформированы ВАС-вектором с помощью электропорации. ВАС-клонам характерна более низкая частота химерности, легкость очищения ДНК-вставки от генома бактерии и легкость работы и размножения клонов BAC по сравнению с системами YAC. Поэтому, BAC вытеснили искусственные дрожжевые хромосомы и используются в крупномасштабном физическом картировании и секвенировании (Cai и др., 1998; Kelley и др., 1999). Большинство векторов BAC обладает особенностями выбранной плазмиды, такими как ген устойчивости к антибиотикам и полилинкером, и репортерным геном (рисунок 1).

Библиотеки бактериальных искусственных хромосом, в которых каждый клон хранится индивидуально, быстро становятся главным инструментом в молекулярной генетике и цитогенетических исследованиях. BAC-библиотеки были разработаны для большого количества таксонов.

Использование разнообразных BAC-библиотек можно разбить на 5 категорий:

1) Использование BAC-клонов для BAC-end секвенирования (Venter и др., 1996; Boysen и др., 1997), STS (sequence tagged site) картирования (Venter и др., 1996 и 1998), и быстрого поиска определенных геномных областей для фенотипически значимых генов (Bouck и др., 1998).

2) Использование BAC для клонирования ДНК и разработки методов генетического фингерпринтинга высокой пропускной способности (Marra и др., 1997), сборка контигов (Ding и др., 1999). Высокая пропускная способность физического картирования уже привела к созданию контигов BAC, покрывающих полностью хромосомы и/или полные наборы хромосом (Mozo и др., 1999).

3) Интегрирование генетических и физических карт для клонирования генов (Nam и др. 1999; Sanchez и др. 1999 Lin и др. 2000).

4) Мультиплекный (мультипраймерный) метод скрининга, основанный на ВАС-картировании (Cai и др., 1998).

5) Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH), картирорвание ВАС-клонов на физической хромосоме (Jiang и др. 1995; Lapitan и др., 1997). Основанная на методе FISH локализация последовательностей ДНК клонов на хромосомах, позволяет молекулярным и физическим картам быть непосредственно нанесенными на структуру хромосом, и впоследствии предоставляет полезную информацию об отношениях между структурой хромосомы, последовательностью ДНК и рекомбинацией (Peterson и др., 1999).

Бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) являются идеальным материалом для интеграции последовательности ДНК с цитогенетическими маркерами. Они были основными векторами, используемыми в секвенировании генома. BAC также хорошо подходят для флуоресцентной гибридизации (FISH) тем, что они дают стабильную форму клонированной ДНК, которая производит яркие, четкие сигналы на метафазных и интерфазных хромосомных препаратах (Korenberg и др., 1999). Этот инструмент может быть использован для быстрой идентификации генов с хромосомными перестройками. После начального развития технологии, совместными международными усилиями была собрана коллекция BAC-клонов, которые являются как ДНК-маркирующими, так и отображают цитогенетические бэнды с использованием FISH. Кроме того, за последнее десятилетие, FISH превратилась в метод, который используется в клинических и исследовательских лабораториях по всему миру. FISH способна одновременно обнаруживать области гомологии между хромосомами и заполнять пробелы в эволюционной истории обменов, дупликаций и перестроек

в геноме (Cheung и др., 1990). В частности, способность к гибридизации комплекса ДНК образцов в конкретные метафазные хромосомы и интерфазные ядра сделало FISH незаменимым инструментом, как для клинической диагностики, так и для фундаментальных исследований (Blozer и др., 1999). Тем не менее, применение методов FISH было ограничено из-за отсутствия ДНК образцов высокого качества, которые бы охватывали весь геном. Эта ситуация в настоящее время устранена путем генерации BAC-ресурса (Cheung и др., 1990).

Рисунок 1. Схема ВАС-вектора рВе1оВАС 11. герЕ ген кодирует белок, важный для репликации, начиная с oriS. Ген устойчивости хлорамфеникола (СМК). В полилинкере расположен 1ае7-альфа пептидная часть гена бэта-галактазидазы

l.l.l. Конструирование библиотек бактериальных искусственных хромосом

Картирование и анализ сложных геномов требует применения множества ресурсов и методов. Например, библиотеки искусственной дрожжевой хромосомы (YAC), содержащие до 2 мегабаз вставок ДНК фрагмента, были использованы для расшифровки всего генома (Chumakov и др., 1995). Библиотеки бактериальной искусственной хромосомы (BAC) позволяют создавать упорядоченные библиотеки ДНК различных видов с большими геномами, при этом большой размер вставки сокращает необходимое количество клонов, требуемых для клонирования полного генома.

В противовес их названию BACs, по сути, - не искусственные хромосомы, а скорее генетические конструкции, полученные на основе F-плазмиды, обнаруженной в E. coli (Peteson и др., 2000). F-плазмида -внехромосомная кольцевая молекула ДНК - содержит факторы (tra-гены - гены переноса), которые позволяют ей переходить из одной клетки в другую при конъюгации бактерий. Клонирование в векторы BAC редко приводит к химерным или перестроенным вставкам (Boysen и др., 1997; Venter и др., 2001) из-за присутствия генов фактора F (parA и parB), которые препятствуют тому, что одна клетка бактерии содержит больше одной копии BAC. Таким образом, BAC-клоны вытеснили YAC-клоны как доминирующий вектор для клонирования крупных вставок и широко используются в проектах по крупномасштабному физическому картированию (Gregory и др., 2002; Schulte и др., 2009).

Физические карты являются основой при секвенировании больших и сложных геномов, а также ускоряют поиск и выделение нужных генов (Gregory и др., 2002; Stein 2000). Так созданная физическая карта генома кукурузы была использована как база для геномного секвенирования (Coe и др., 2002).

Хромосомно-специфичная BAC-библиотека была использована для анализа трех близкородственных гомологичных геномов в составе генома пшеницы (Triticum aestivum L.) (Paux и др., 2008; Safar и др., 2004).

Большие вставки геномной ДНК в ВАС-библиотеках позволяют создавать физические карты (McPherson и др., 2001). Библиотека BAC с очень большими вставками может быть частично построена методом расщепления; однако, библиотеки больших вставок BAC могут быть построены только из механически вырезанной геномной ДНК с большой молекулярной массой, это необходимо, чтобы воссоздать случайные фрагменты всего генома (Godiska и др., 2008). Синергетический подход к объединению библиотек, созданных различными методами, поможет убрать пробелы в физической карте, которые могут получаться из-за неравномерного распределения сайтов рестрикции при использовании рестрикционных эндонуклеаз. Карты BAC, которые обеспечили базу для геномного секвенирования, принесли большую пользу, объединив многочисленные библиотеки (McPherson и др., 2001; Coe и др., 2002; Tao и др., 2001; WuCC и др., 2008). Клонирование геномной ДНК с использованием BAC-клонов можно разделить на 4 основных этапа: первый этап - подготовка высокомолекулярной ДНК. Существенным элементом для работы с осадком ДНК мегабазного (Mb) размера и эффективного выделения большого фрагмента ДНК, клонируемого в бактериальной искусственной хромосоме, является ДНК высокой молекулярной массы (HMW) (Zhang и др., 1995). У дрожжевых систем и млекопитающих систем высокомолекулярная ДНК была подготовлена благодаря непосредственному включению целых клеток (Overhauser and Radic 1987). В растительных системах наличие клеточной стенки затрудняет подготовку высокомолекулярной ДНК. У растений изолируют протопласты с помощью гидролаз клеточной стенки (с целлюлазами и пектиназами), и затем помещают в агарозу (Cheung и Gale, 1990; VanDaelen и др., 1989). В этом

методе, тип и количество гидролаз клеточной стенки варьируются для различных видов растений. Кроме того, высокомолекулярная ДНК растений содержит существенное количество хлоропластов и ДНК митохондрий (Martin и др., 1992; Woo и др., 1994). Об альтернативном способе изоляции протопласта сообщалось Guidet и Langridge (1992), авторы непосредственно помещали измельчённые ткани пшеницы и родственых ей видов в агарозу. Наконец в 1995 был открыт новый метод приготовления высокомолекулярной ДНК из ядер растений (Zhang и др.1995). Этот метод базировался на физическом разрушении стенок растительной клетки, изолировании ядра и запаивания ядер в агарозу или в микрочастицы. В этом методе получается большое количество высококачественной ДНК. Вторая фаза в создании BAC-библиотеки - это подготовка BAC-вектора ДНК. Третья фаза создания библиотеки - подготовка ДНК вставок. В заключительной четвертойфазе отобранные ДНК вставки определенного размера лигируются с векторной ДНК (рисунок 2).

pick transform ants

Рисунок 2. Схема клонирования геномной ДНК в BAC-векторе.

1.1.2. ВАС-векторы

BAC-векторы, такие как pBeloBAC11 (рисунок 3), полученные на базе F-фактора, содержат минимальные последовательности, необходимые для автономной репликации, контроля за количеством копий и делением плазмиды. Рекомбинантная BACs, в которую вставлена ДНК разрезанного lacZ гена, легко определяется благодаря преобразованию цвета колонии от синего к белому. Вектор pIndigoBAC дает более интенсивный синий цвет, чем pBeloBAC11. Сайт клонирования и в pBeloBAC11 и в pIndigoBAC получен из pGEM3Z и содержит все сайты рестрикции как у pGEM3Z. В pBeloBAC11 только у ферментов Ш^Ш, BamHI и Sph есть уникальные сайты рестрикции. В pIndigoBAC сайт EcoRI, находящийся в гене устойчивости к хлорамфениколу у рВе1оВАС11, был вырезан, позволив использовать уникальный сайт EcoRI в полилинкере в качестве места для вставки клонированной ДНК. Способность клонировать в уникальный сайт EcoRI позволяет эффективно создавать большие фрагменты ДНК с помощью метода частичного расщепления (Вптеп и др., 1999).

ВатШ 8рк\ НтйIII

герЕ

Рисунок 3. Диаграмма вектора рВе1оВАС11. Плазмида на основе мини-Б-

плазмиды.

Однако в описанных выше векторах выход плазмидной ДНК был низким. Поэтому BAC-векторы были модифицированы. Построение многокопийного вектора BAC (pBACe3.6) осуществили с помощью помещения копии многокопийного pUC-вектора в сайт клонирования вектора BAC (Frengen и др., 1999). Оригинальный вектор BAC может быть восстановлен от больших вставок ДНК в pBACe3.6 и использован для создания библиотек BAC. Однако, из-за того, что колонии pBACe3.6 не могут быть отличены от рекомбинантных клонов BAC, необходимо следить за материалом, чтобы избежать контаминации BAC многокопийным pBACe3.6 вектором (Frengen и др., 1999). Более того, чтобы облегчить позиционное картирование генов растений, был создан двойной BAC-вектор (BIBAC), чтобы клонировать и вставлять большие фрагменты ДНК в растения (рисунок 4) (Hamilton и др., 1996; Liu и др., 1999). Вектор BIBAC содержит векторную основу BAC, которая использует ориджин F-плазмиды для репликации в E.coli и использует единственную копию ориджина Ri в Agrobacterium rhizogenes. В дополнение к позиционному клонированию, BIBAC и библиотеки transformation-competent artificial chromosome (TAC) могут также использоваться для главных задач, таких как физическое картирование и секвенирование генома, для которых используются ВАС-библиотеки. BAC-библиотеки более популярны, чем BIBAC и библиотеки TAC, потому что у BIBAC и векторов TAC (~23 т.н.) больший размер, чем у вектора BAC (~7.5 т.н.), что приводит к трудностям при создании библиотек больших фрагментов ДНК (Qu и др., 2003) и большим затратам при повтороном «шот-ган»-секвенировании вставок векторных последовательностей (Song и др., 1995; Mao и др., 2000; Li и др., 2003; Xu и др., 2004).

Рисунок 4. Бинарный BAC-вектор (BIBAC). Плазмида на основе

мини^-плазмиды.

1.1.3. Скрининг ВАС-библиотек с ДНК-зондами

Скрининг библиотеки BAC является обязательным и ключевым шагом к поиску определенных последовательностей для согласования физической и генетической карты, с помощью которого BAC-клоны и контиги можно будет разместить и упорядочить вдоль генетической карты (Paux и др., 2008). Очень трудно получить большое количество BAC-клонов по сравнению с обычно используемыми векторными системами, потому что подготовка ДНК-вставки высокой молекулярной массы сложна, а эффективность преобразования BAC довольно низкая, также несколько лет назад скрининг BAC считался ограниченным, главным образом, из-за отсутствия высококачественных плотных генетических карт (You и др., 2010; Luo и др., 2009). Поэтому, необходимо развивать методы скрининга, которые позволят стабильно использовать ограниченное число BACs.

Скрининг ВАС-библиотек можно проводить тремя различными способами: 1) гибридизация исследуемой колонии; 2) блоттинг-метод по Саузерну; 3) ПЦР-скрининг (рисунок 5A).

Гибридизация исследуемой колонии, основанная на использовании фильтра высокоплотной точной копии (high-densityreplica, HDR) является эффективной в том случае, когда геномная структура исследуемой цели неизвестна и невозможно включить многокопийную последовательность, кДНК и колонию с маркёрными экспрессируемыми последовательностями (EST). Это мощный инструмент для того, чтобы проанализировать организмы с относительно маленьким размером генома или генома, ограниченного в объемах, чтобы выполнить гибридизацию колонии в крупном масштабе. HDR должны готовиться неоднократно, потому что они могут использоваться

максимум для 20-30 гибридизаций. Кроме того, последовательности, содержащие мультикопии не могут использоваться в качестве образца, пригодного для ПЦР-скрининга, так как такие области тщательно исключаются из последовательностей праймера. Кроме того, область фильтров НОЯ, необходимая для скрининга, увеличивается пропорционально размеру генома проанализированных организмов, что делает эту технологию более трудоемкой.

Гибридизация по Саузерну: гибридизация образцов с помощью двух блоттинг-фильтров Саузерна. Метод обычно такой же, как НОЯ, определяется конкретный фильтр НОЯ, для которого далее исследуют гибридизацию, выполненную для выявления конкретного клона (клонов) (рисунок 5В). В основанном на ПЦР скрининге больший размер генома влияет только на первую стадию скрининга, которая является просто небольшой частью всей процедуры (рисунок 5С).

Основанный на ПЦР скрининг подходит для широкого спектра экспериментов, особенно для глубокого анализа, такого как строительство контига вокруг целого генома высших эукариотов. Первая стадия скрининга выполняется на основных пулах ДНК, вторичных пулах ДНК, представляющих каждый ряд, колонку и пластину, подготовленных к каждому суперпулу.

ВАС library

1 1

First screening

(A) (B) <C)

Colony hybridization Southern hybridization PCR Screening

Рисунок 5. Методы скрининга библиотек ВАС: А-гибридизация колоний, В -Саузерн-гибридизация, С- ПЦР скрининг.

1.2. Тандемные повторы в геноме растений

Термин «повторяющаяся ДНК» относится к соответствующим фрагментам ДНК, которые присутствуют в многократных копиях в геноме. Повторяющаяся ДНК была первоначально обнаружена с помощью реассоционной кинетики (Britten и Kohne, 1968). Повторяющаяся ДНК может быть рассеяна по всему геному или быть локализована в определенных областях в тандемной конфигурации (Shweta и др., 2014). Повторяющаяся ДНК -важный элемент эукариотического генома, увеличивающийся пропорционально размеру генома (Bennett и Leitch 2005, Bennetzen и др., 2005). Значительная часть повторяющейся ДНК рассеяна и включает в себя активные и бездействующие мобильные генетические элементы; у растений они могут составлять больше чем 50% полного размера генома (Vitte и Panaud 2005, Hawkins и др., 2006).

Похожие диссертационные работы по специальности «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», 03.01.06 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шейх Бейг Гохарризи Мохаммад Али Мохаммад, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Киров И.В. Разработка и применение высокочувствительного метода физического картирования генов на хромосомах растений// дис. канд.биол.наук. Рос. гос. аграр. университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва.-2015.

2. Киселева, А. В. Создание геномной вас библиотеки allium fistulosum l. И ее использование в молекулярно-цитогенетических исследованиях// дис. канд.биол.наук. Рос. гос. аграр. университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва.-2013.

3. Киселева, А.В. Создание геномной ВАС библиотеки Allium fistulosum L. для получения цитогенетических маркеров / А. В. Киселева, И. А. Фесенко, Л. И. Хрусталева // Известия ТСХА. - 2012. - № 6. - С. 31-39.

4. Adams, S. P. Loss and recovery of Arabidopsistype telomere repeat sequences 50-(TTTAGGG)(n)-30 in the evolution of a major radiation of flowering plants/ S. P. Adams, T. P. Hartman, K. Y. Lim, M.W. Chase, M. D. Bennett, I. J. Leitch, A. R. Leitch // Proceedings of the Royal Society London, Biological Sciences. - 2001. - № 268. - P. 1541-1546.

5. Akiyama Y., High-Resolution Physical Mapping in Pennisetum squamulatum Reveals Extensive Chromosomal Heteromorphism of the Genomic Region Associated with Apomixis / Conner Y.,GoelS. // Plant Physiology. -2004. -No. 134. -P. 17331741.

6. Albert PS, Diversity of chromosomal karyotypes in maize and its relatives./ Gao Z, Danilova TV, Birchler JA // Cytogenet Genome. -2010. -Res 129. -P. 6-16. doi: 10.1159/000314342

7. Anamthawat-Jonsson, K., Isolation and characterization of genome-specific

DNA sequences in Triticeae species /J. S. Heslop-Harrison. // Molecular and General Genetics MGG. -1993. No 240.2. -P. 151-158.

8. Anderson, C. Genome shortcut leads to problems // Science. -1993. -No 259. -P. 1684-1687.

9. Anderson, C. Genome shortcut leads to problems // Science. 1993. № 259. P. 1684-1687.

10. Barnes SR, The organization, nucleotide sequence, and chromosomal distribution of a satellite DNA from A. cepa./ James AM, Jamiesson G // Chromosoma. -1985. -No 92. -P. 185-192.

11. Barry, J. D. Why are parasite contingency genes often associated with telomeres? / J. D. Barry, M. L. Ginger, P. Burton, R. McCulloch // Int. J. Parasitol. -2003. - № 33. - P. 29-45.

12. Bennett, M. D. Plant genome size research: a field in focus. / leitch, I. J. // annals of botany. -2005. -No 95. -P. 1-6.

13. Bennetzen, J. L., Mechanisms of recent genome size variation in flowering plants, / Ma, J., Devos, K. M., // annals of botany. -2005, -No 95. -P. 127-132.

14. Benson G ,Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences.// Nucleic Acids. -1999. -Res 27. -P.573-80.

15. Benson G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences //Nucleic acids research. - 1999. - T. 27. - №. 2. - C. 573.

16. Benson G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences //Nucleic acids research. - 1999. - T. 27. - №. 2. - C. 573.

17. Birren, B. R. U. C. E., V. A. L. E. R. I. A. Bacterial artificial chromosomes." Genome analysis / Mancino, and H. I. R. O. A. K. I. Shizuya. // A laboratory manual. -1999. -No 3. -P. 241-245.

18. Blackburn, E. H. Switching and signaling at the telomere / E. H. Blackburn // Cell. - 2001. - № 106. - P. 661-673.

19. Borst, P. Antigenic variation in trypanosomes / P. Borst, G. Rudenko, M. C. Taylor, P. A. Blundell, F. Van Leeuwen, W. Bitter , M Cross , R McCulloch // Arch. Med. Res. - 1996. - № 27 (3). - P. 379-388.

20. Bouck, J. Analysis of the quality and utility of random shotgun sequencing at low redundancies / Miller, W., Gorrell, J.H., Muzny, D. and Gibbs, R.A. // Genome Res. -1998. -No 8. -P. 1074-1084.

21. Boysen, C. Fluorescence-based sequencing directly from bacterial and P1-derived artificial chromosomes.Simon / M.I. and Hood, L. // BioTechniques. -1997. -No 23. -P. 978-982.

22. Broun, P. Telomeric arrays display high levels of heritable polymorphism among closely related plant varieties / P. Broun, M. W. Ganal, S. D. Tanksley // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1992. - № 89. - P. 1354-1357.

23. Burke, D.T. YAC cloning: options and problems // GATA. -1990. -No 7. -P. 94-99.

24. Cai, W.-W. An anchored framework BAC map of mouse chromosome 11 assembled using multiplex oligonucleotide hybridization / Reneker, J., Chow, C.-W., Vaishnav, M. and Bradley, A. // Genomics. -1998. -No 54. -P. 387-397.

25. Cheung, W.Y. The isolation of high molecular weight DNA from wheat, barley and rye for analysis by pulsed-field gel electrophoresis. / Gale, M.D. // Plant Mol. Biol. -1990. -No 14. -P. 881-888.

26. Chumakov, I.M. A YAC contig of the human genome / I.M. Chumakov, P. Rigault, I.L. Gall, C. Bellanne-Chantelot, A. Billault, S.Guillou, P. Soularue, G. Guasconi, E. Poullier, I. Gros // Nature. - 1995. - № 377. - P. 175-297.

27. Coe E. Access to the maize genome: an integrated physical and genetic map. / Cone K, McMullen M, Chen SS, Davis G, Gardiner J, Liscum E, Polacco M, Paterson A, Sanchez-Villeda H, Soderlund C, Wing R. // Plant Physiol. -2002. -No 128. -P. 912.

28. Currah, L. Laboratory tests for leaf resistance to Botrytis squamosa in onions / L. Currah, R.B. Maude // Ann Appl Biol. - 1984. - № 105. - P. 277-283.

29. De Ponti O.M.B., Resistance to the onion fly in Allium cepa and Allium fistulosum/ Inggamer H. ed. Q.P. van der Meer // Proc 3rd Eucarpia Allium Symp. PUDOC Wageningen, the Netherlands. -1984. -P. 21-23.

30. Devison. J., Large-scal polymorphism of heterochromatic repeats in the DNA of Arabidopsis thaliana / Tyagi. A., and Comai. L,// BMC plant biology. -2007. -No 7. -P. 44.

31. Ding, Y. Contig assembly of bacterial artificial chromosome clones through multiplexed fluorescence-labeled fingerprinting. / Johnson, M.D., Colayco, R., Chen, Y.L., Melnyk, J., Schmitt, H. and Shizuya, H. // Genomics. -1999. -No 56. -P. 237246.

32. Dong F., Development and application of a set of chromosome-specific cytogenetic markers in potato / Song J., Naess S. K., Helgeson J. P., Gebhardt C., and Jiang J. // Theor. Appl. Gen. -2000. -No. 101, -P. 1001-1007.

33. Dong, F. Development and applications of a set of chromosome-specific cytogenetic DNA markers in potato / F. Dong, J. Song, S.K. Naess, J. P. Helgeson, C. Gebhardt, J. Jiang // Theor Appl Genet. - 2000. - № 101. - P. 1001-1007.

34. Fajkus, J., Organization of telomeric and subtelomeric chromatin in the higher plant nicotianatabacum /Kovarik, A., Kralovics, R., Bezdek, M. // Molecular and General genetics. -1995. -No. 247 . -P. 633-638.

35. Fesenko IA, Organization of the 378 bp satellite repeat in terminal heterochromatin of Allium fistulosum./Khrustaleva LI, Karlov GI// Genetika. -2002, -No 38. -P. 894-903.

36. Flavell RB, Genome size and the proportion of repeated nucleotide sequence DNA in plants/ Bennett MD, Smith JB, Smith DB // Biochem.Genet. -1974. -No 12. -P. 257-269.

37. Frengen E. A modular, positive selection bacterial artificial chromosome vector with multiple cloning sites. / Weichenhan D, Zhao B, Osoegawa K, van Geel M, de Jong PJ. // Genomics. -1999. -No 58. -P. 250-253.

38. Fuchs, J. Telomere sequences localization and karyotype evolution in higher plants / J. Fuchs, A. Brandes, I. Schubert // Plant Systematics and Evolution. - 1995. - № 196. - P. 227 - 241.

39. Galvan, G.A. Screening for resistance to anthracnose (Colletotrichum gloeosporioides Penz.) in Allium cepa and its wild relatives / G. A. Galvan, W. A. Wietsma, S. Putrasemedja, A. H. Permadi, C. Kik // Euphytica. - 1997. - № 95. - P. 173-178.

40. Garcia-Cao, M. Epigenetic regulation of telomere length in mammalian cells by the Suv39h1 and Suv39h2 histone methyltransferases / M. Garcia-Cao, R. O'Sullivan, A. H. Peters, T. Jenuwein, M. A. Blasco // Nat. Genet. - 2004. - № 36. -P. 94-99.

41. Gindullis F. The large-scale organization of the centromeric region in Beta species /C. Desel, I. Galasso, T. Schmidt // Genome Res. -2001. -№ 11. -P. 253-265.

42. Godiska R. Biasfree cloning of 'unclonable' DNA for simplified genomic finishing. / Mead DA, Dhodda V, Hochstein R, Karsi A, Ravin N, Wu CC. // Sudbury, MA: Jones and Bartlett Publishers. -2008.

43. Gong, Z. Repeatless and Repeat-Based Centromeres in Potato: Implications for Centromere Evolution / Z. Gong, Y. Wu, A. Koblizkova, G. Torres, K. Wang, M. Iovene, P. Neumann, W. Zhang, P. Novak, C. R. Buell, J. Macas, J. Jiang // The Plant Cell. - 2012. - V. 24, № 9. - P. 3559-3574.

44. Gottschling, D.E. Position effect at S. cerevisiae telomeres: reversible repression of Pol II transcription / D. E. Gottschling, O. M. Aparicio, B. L. Billington, V. A. Zakian // Cell. - 1990. - № 63. - P. 751 - 762.

45. Gottschling, D.E. Position effect at S. cerevisiae telomeres: reversible repression of Pol II transcription / D. E. Gottschling, O. M. Aparicio, B. L. Billington, V. A. Zakian // Cell. - 1990. - № 63. - P. 751 - 762.

46. Green, E.D. Detection and characterization of chimeric yeast artificial-chromosome clones / Riethman, H.C., Dutchik, J.E., Olson, M.V. // Genomics. -1991. -No 11. -P. 658 - 669.

47. Gregory, S. G. A physical map of the mouse genome / S. G. Gregory, M. Sekhon, J. Schein, S. Zhao et al. // Nature. - 2002. - V. 418, № 6899. - P. 743-750.

48. Grunstein, M. Yeast heterochromatin: regulation of its assembly and inheritance by histones / M. Grunstein // Cell. - 1998. - № 93. - P. 325-328.

49. Guident, F. Megabase DNA preparation from plant tissue. / Langridge, P. // Method Enzymol. -1992. -No 216. -P. 3-21.

50. Hamilton CM. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. / Frary A, Lewis C, Tanksley SD. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996, -No 93. -P. 9975-9979.

51. Harrison, G.E. Centromeric repetitive DNA sequences in the genus Brassica / G. E. Harrison, J. S. Heslop-Harrison // Theor. Appl. Genet. - 1995. - № 90. - P. 157-165.

52. Hawkins. J. S, Differential lineage-specific amplification of transposable elements is responsible fro genome size variation in gossypium, / Kim. H, Naso. J. D, Wing. R. A, and Wendel. J.F, // genome research. -2006, -No 16. -P. 1252-1261.

53. Henikoff, S. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA / S. Henikoff, K. Ahmad, H. S. Malik // Science. - 2001. - № 293. - P. 10981102.

54. Henikoff, S. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA / S. Henikoff, K. Ahmad, H. S. Malik // Science. - 2001. - № 293. - P. 10981102.

55. Hertweck K. Assembly and comparative analysis oftransposable elements from low coverage genomic sequence data in Asparagales // Genome. -2013. № 56. -P. 487-494.

56. Heslop-Harrison. J. S, Comparative genome organization in plants: from sequence and markers to chromatin and chromosomes // The plant cell. -2000. -No 12. -P. 617-636.

57. Hudson, T. An STS-based map of the human genome. / et al. // Science. 1995. -No 270. -P. 1945-1954.

58. Inada I. C-banded karyotype analysis of Allium fistulosum and A. altaicum and their phylogenetic relationship. / Endo M. // Japan.Soc.Hort.Sci. -1994. -No 63. -P. 593-602.

59. Inada I., C-banded karyotype analysis of Allium fistulosum and A. altaicum and their phylogenetic relationship./ Endo M.// J.Japan.Soc.Hort.Sci. -1994, -No 63. -P. 593-602.

60. Irifune K, Nucleotide sequences of a highly repeated DNA sequences and its chromosomal localization in Allium fistulosum /Hirai K, Zheng J, Tanaka R, Morikawa H. //TheorAppl Genet. -1995. -No. 90. -P. 312-6.

61. Irifune, K. Nucleotide sequences of a highly repeated DNA sequences and its chromosomal localization in Allium fistulosum / K. Irifune, K. Hirai, J. Zheng, R.Tanaka, H. Morikawa // Theor. Appl. Genet. - 1995. - № 90. - P. 312 -316.

62. Islam-Faridi M. N. A molecular cytogenetics map of sorgum chromosome 1: fluorescence in situ hybridization analysis with mapped bacterial artificial chromosomes / Childs. K., Klein. P. E. // Genetics. -2002. -No 161. -P. 345-353.

63. Jiang, J. A molecular view of plant centromeres / J. Jiang, J. A. Birchler, W. A.

Parrott, R. K. Dawe // Trends Plant Sci. - 2003. - № 8. - P. 570-575.

64. Jiang, J. A molecular view of plant centromeres / J. Jiang, J. A. Birchler, W. A. Parrott, R. K. Dawe // Trends Plant Sci. - 2003. - № 8. - P. 570-575.

65. Jiang, J. Metaphase and interphase fluorescence in situ hybridization mapping

of the rice genome with bacterial artificial chromosomes. / Gill, B.S., Wang, G-L., Ronald, P.C. and Ward, D.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA . -1995. -No 92. -P.

4487-4491.

66. Kalkman, E. R. Analysis of the C-banded karyotype of Allium cepa L. Standard system of nomenclature and polymorphism / E. R. Kalkman // Genetica. -1984. - № 65. - P. 141-148.

67. Kamm, A. Analysis of a repetitive DNA family from Arabidopsis arensa and relationship between Arabidopsis species / A. Kamm // Plant Mol. Biol - 1995 -№ 27 (5). - P. 853-862.

68. Kelley, J.M. High throughput direct end sequencing of BAC clones / Field, C.E., Craven, M.B., Bocskai, D., Kim, U.-J., Rounsley, S.D. and Adams, M.D. // Nucleic Acids Res. -1999. -No 27. -P. 1539-1546.

69. Khrustaleva, L. I. Cytogenetical studies in the bridge cross Allium cepa x (A. fistulosum x A. roylei) / L. I. Khrustaleva, C. Kik // Theor Appl Genet. - 1998. - №

96. - P. 8-14.

70. Khrustaleva, L.I., and Kik, C. 1998. Cytogenetical studies in the bridge cross Allium cepa x (A. fistulosum x A. roylei). Theor. Appl. Genet. 96(1): 8-14.

71. Kidwell. M, Transposable elements and host genome evalution, / Lisch. D, // trends in ecology and evolution. -2000, -No 15. -P. 95-99.

72. Koo D-H, Rapid divergence of repetitive DNAs in Brassica relatives/ Hong CP, Batley J, Chung YS, Edwards D, Bang J-W, Hur Y, Lim YP. // Genomics. -2011. -No

97. -P. 173-185.

73. Ksi^zkiewicz M., Comparative genomics of Lupinusangustifolius gene-rich regions: BAC library exploration, genetic mapping and cytogenetics /Katarzyna W., Szczepani A., et al. // BMC Genomics. -2013. № 14. P.

74. Kumar, A. The Ty1-copia group of retrotransposons in plants: genomic organisation, evolution, and use as molecular markers / A. Kumar, S. R. Pearce, K.

McLean, G. Harrison, J. S. Heslop-Harrison, R. Waugh, A. J. Flavell // Genetica. -1997. - № 100. - P. 205-217.

75. Kumar, A. The Ty1-copia group of retrotransposons in plants: genomic organisation, evolution, and use as molecular markers / A. Kumar, S. R. Pearce, K. McLean, G. Harrison, J. S. Heslop-Harrison, R. Waugh, A. J. Flavell // Genetica. -1997. - № 100. - P. 205-217.

76. Kummar. A. Plant retrotransposons / Bennetzen. J. L, // Annal review of genetics. -1999, -No 33, -P. 479-532.

77. Lamb. J. C, plant chromosomes from end to end: telomeres, heterochromatin and centromeres / Yu. W., Han. F., and Bichler. J. A.,// current opinion in plant biology. -2007. -No 10. -P. 116-122.

78. Lapitan, N.L.V. FISH physical mapping with barley BAC clones. / Brown, S.E., Kennard, W., Stephens, J.L. and Knudson, D.L. // Plant J. -1997. -No 11. -P. 149-156.

79. Li X, Qian Q, Fu Z, Wang Y, Xiong G, Zeng D, Wang X, Liu X, Teng S, Hiroshi F: Control of tillering in rice. Nature. 2003, 422: 618-621. 10.1038/nature01518

80. Lin, Y-r. Locus-specific contig assembly in highly-duplicated genomes using the BAC-RF method. / Draye, X., Qian, X., Ren, S., Zhu, L-h., Tomkins, J., Wing, R.A., Li, Z. and Paterson, A.H. // Nucleic Acids Res. -2000. in press.

81. Liu YG. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. / Shirano Y, Fukaki H, Yanai Y, Tasaka M, Tabata S, Shibata D. // ProcNatlAcadSci USA. -1999. -No 96. -P. 6535-6540. 10.1073/pnas.96.11.6535.

82. Luo, M. C. A high-throughput strategy for screening of bacterial artificial chromosome libraries and anchoring of clones on a genetic map constructed with

single nucleotide polymorphisms / M. C. Luo, K. Xu, Y. Ma, K. R. Deal, C. M. Nicolet, and J. Dvorak // BMC Genomics. - 2009. - № 10. - P. 28.

83. Macas J, Next generation sequencing-based analysis of repetitive DNA in the model dioecious plant Silenelatifolia./ Kejnovsky E, Neumann P, Novak P, Koblizkova A, Vyskot B// PLoS One. - 2002, -No 6. -P. 27335.

84. Macas J, Next generation sequencing-based analysis of repetitive DNA in the model dioecious plant Silenelatifolia/ Kejnovsky E, Neumann P, Novak P, Koblizkova A, Vyskot B. //PLoS One. -2011. No. 6

85. Mao L. JOINTLESS is a MADS-box gene controlling tomato flower abscission zone development. / Begum D, Chuang HW, Budiman MA, Szymkowiak EJ, Irish EE, Wing RA. // Nature. -2000. -No 406. -P. 910-913. 10.1038/35022611.

86. Marra, M.A. High throughput fingerprint analysis of large-insert clones / Kucaba, T.A., Dietrich, N.J., Green, E.D., Brownstein, B., Wilson, R.K., McDonald, K.M., Hillier, L.W., McPherson, J.D. and Waterson, R.H. // Genome Res. -1997. -No 7. -P. 1072 1084.

87. Martin, G.B. Construction of a yeast artificial chromosome library of tomato and identification of cloned segments linked to two disease resistance. / Ganal, M.W. and Tanksley, S.D. // Loci. Mol. Gen. Genet. -1992. -No 233. -P. 25-32.

88. McPherson JD. A physical map of the human genome. / Marra M, Hillier L, Waterston RH, Chinwalla A, Wallis J, Sekhon M, Wylie K, Mardis ER, Wilson RK, Fulton R, Kucaba TA, Wagner- McPherson C, Barbazuk WB, Gregory SG, Humphray SJ, French L, Evans RS, Bethel G, Whittaker A, Holden JL, McCann OT, Dunham A, Soderlund C, Scott CE, Bentley DR, Schuler G, Chen HC, Jang WH, Green ED. // Nature. -2001. -No 409. -P. 934-941.

89. Mehrotra S., Repetitive sequences in plant nuclear DNA: types, distribution, evolution and function/ Goyal. V. // Genomics Proteomics Bioinformatics. -2014. -№ 12. -P. 164-71.

90. Miller J.T., Cloning and characterization of a centromere-specific repitive DNA from Sorgum bicolor / Jacko. S.A., Nasuda. S., et al. // heor and Appl Genet. -1998. -№ 9. -P. 832-839.

91. Monaco, Anthony P. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools / Zoia Larin // Trends in biotechnology. -1994. -No12. -P. 280-286.

92. Moullet O. Construction and characterization of a large DNA insert library from the D genome of wheat / Zhang. H. B., Lagudah. E. S. // Theor. Appl. Genet. -1999. -№ 99. -P. 305-313.

93. Moullet O. Construction and characterization of a large DNA insert library from the D genome of wheat / Zhang. H. B., Lagudah. E. S. // Theor. Appl. Genet. -1999. -No 99. -P. 305-313.

94. Moullet O., Construction and characterization of a large DNA insert library from the D genome of wheat / Zhang. H. B., Lagudah. E. S. // Theor. Appl. Genet. -1999. -№ 99. -P. 305-313.

95. Mozo, T. A complete BAC-based physical map of the Arabidopsis thaliana genome. / Dewar, K., Dunn, P., Ecker, J.R., Fischer, S., Kloska, S., Lehrach, H., Marra, M., Martienssen, R., Meier-Ewert, S. and Altmann, T. // Nat. Genet. -1999. -No 22. -P. 271-275.

96. Muller, H. J. The re-making of chromosomes / H. J. Muller // Collecting Net, Woods Hole. - 1938. - № 13. - P. 181-198.

97. Nagaki, K. Characterization of CENH3 and centromere- associated DNA sequences in sugarcane / K. Nagaki, M. Murata // Chromosome Res. - 2005b. - № 13. - P. 195- 203.

98. Nagaki, K. Sequencing of a rice centromere uncovers active genes / Nagaki, Z. Cheng, S. Ouyang, P. B. Talbert, M. Kim, K. M. Jones, S. Henikoff, C. R. Buell, J. Jiang // Nat. Genet. - 2004. - № 36. - P. 138-145.

99. Nam, Y.-W. Construction of a bacterial artificial chromosome library of

Medicago truncatula and identification of clones containing ethylene-response genes. / Penmesta, R.V., Endre, G., Uribe, P., Kim, D. and Cook, D.R. // Theor. Appl. Genet. -1999. -No 98. -Po 638- 646.

100. Narayan, R. K. J. Constraints upon the organization and evolution of chromosome in Allium / R. K. J. Narayan // Theor. Appl. Genet. - 1988. - № 75. - P. 319-329.

101. Narayan, R. K. J. Constraints upon the organization and evolution of chromosome in Allium / R. K. J. Narayan // Theor. Appl. Genet. - 1988. - № 75. - P. 319-329.

102. Neil, D.L. Structural instability of human tandemly repeated DNA sequences cloned in yeast artificial chromosome vectors / Villasante, A., Fisher, R.B., Vetrie, D., Cox, B., Tyler-Smith, C // Nucleic Acids Res. -1990. -No 18. -P. 1421-1428.

103. Netzer, D. Greenhouse technique to evaluate pink root disease caused by Pyrenochaeta terrestris / D. Netzer, H. D. Rabinowitch, C. Weintal // Euphytica. -1985. - № 34. - P. 385-391.

104. Novak P, Graph-based clustering and characterization of repetitive sequences in next-generation sequencing data. / Neumann P, Macas J // BMC Bioinformatics. -2010, -No 11, -P. 378. doi: 10.1186/1471-2105-11-378

105. Novak P, RepeatExplorer: a Galaxy-based web server for genome-wide characterization of eukaryotic repetitive elements from next-generation sequence reads./ Neumann P, Pech J, Steinhaisl J, Macas J //Bioinformatics. - 2013, -No 29. -P. 792-3. doi: 10.1093/bioinformatics/btt054

106. Ohmido, Visualization of the terminal structure of rice chromosomes 6 and 12 with multicolor FISH to chromosomes and extended DNA fibers /Nobuko, et al. // Plant molecular biology. -2001. No. 47.3. -P. 413-421.

107. Overhauser, J. Encapsulation of cells in agarose beads for use with pilsed-field electrophoresis. / Radic, M.Z. // Focus. -1987. -No 9. -P. 8-9.

108. Paux E. A physical map of the 1-gigabase bread wheat chromosome 3B. / Sourdille P, Salse J, Saintenac C, Choulet F, Leroy P, Korol A, Michalak M, Kianian S, Spielmeyer W, Lagudah E, Somers D, Kilian A, Alaux M, Vautrin S, Berges H, Eversole K, Appels R, Safar J, Simkova H, Dolezel J, Bernard M, Feuillet C. // Science/ -2008. -No 322. -P. 101-104.

109. Pearce SR. The Ty1-copia group retrotransposons of Allium cepa are distributed throughout the chromosomes but are enriched in the terminal heterochromatin. / Pich U, Harrison G, Flavell AJ, Heslop-Harrison JS, Schubert I, Kumar A. // Chromosome Res. -1996. -No 4. -P. 357-364.

110. Pearce, S. R. The Ty1-copia group retrotransposons of Allium cepa are distributed throughout the chromosomes but are enriched in the terminal heterochromatin / S. R. Pearce, U. Pich, G. Harrison, A. J. Flavell, J. S. Heslop-Harrison, I. Schubert, A. Kumar // Chromosome Res. - 1996. - № 4. - P. 357- 364.

111. Peterson, D.G. Localization of single- and low-copy sequences on tomato synaptonemal complex spreads using fluorescence in situ hybridization (FISH). / Lapitan, N.L.V. and Stack, S.M. // Genetics. -1999. -No 152. -P. 427-439.

112. Pich, U. How do Alliaceae stabilize their chromosome ends in the absence of TTTAGGG sequnces / U. Pich, J. Fuchs, I. Schubert // Chromosome Res. - 1996a. -№ 4(3). - P. 207-213.

113. Pich, U. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium cepa / U. Pich, I. Schubert // Chromosome Res. - 1998. - № 6. - P. 315-321.

114. Pich, U. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium cepa / U. Pich, I. Schubert // Chromosome Res. - 1998. - № 6. - P. 315-321.

115. Pich, U., Closely related Allium species (Alliaceae) share a very similar satellite sequence. /Fritsch, R., and Schubert I.,// Plant Syst. -1996a, -vol. 202, -P. 255-264. doi:10.1007/BF00983386.

116. Pich, U., how do Alliaceae stabilize their chromosome ends in the absence of

TTTAGGG sequences? /Fuchs, J., and Schubert, I.,// Chromosome. -1996, -Res. 4. -P. 207-213,doi: 10.1007/ BF02254961. PMID:8793205.

117. Pryde, F. E. Chromosome ends: all the same under their caps / F. E. Pryde, H.

C. Gorham, E. J. Louis // Curr. Opin. Genet. Dev. - 1997. - № 7. - P. 822-828.

118. Qu S. Development of a new transformation-competent artificial chromosome (TAC) vector and construction of tomato and rice TAC libraries. / Coaker G, Francis

D, Zhou B, Wang GL. // Molecular Breeding. -2003. -No 12. -P. 297-308.

119. Ramel. C, Mini-and microsatellites. // environmental Health pesrectives. -1997. -No 105. -P. 781-789.

120. RAskina . O, Repetitive DNA and chromosomal rearrangements: speciation-related events in plant genomes / Barber . J. C, Nevo. E and Belyayev. A, // cytogenetics and genome research. -2008. -No 120. -P. 351-357.

121. Reeves, A. Micromeasure for Windows, Version 3.2. / A. Reeves, J.Tear // 1999. - Режим доступа: http://www.colostate.edu/Depts/Biology/MicroMeasure.

122. Richards, E. J. Isolation of a higher eucariotic telomere from Arabidopsis thaliana / E. J. Richards, F. M. Ausubel // Cell. - 1988. - № 53. - P. 127-136.

123. Ricroch A. Evolution of genome size across some cultivated Allium species / Yocktreug R., Brown S.C., Nadot S // Genome. -2005. -No 48. -P. 511-520.

124. Ricroch, A. Evolution of genome size across some cultivated Allium species / A. Ricroch, R. Yockteng, S. C. Brown, S. Nadot // Genome. - 2005. - № 48(3). - P. 511-520.

125. Rogers, S. O. Exctraction of DNA from plant tisues / S. O. Rogers, A. J. Bendich // Plant. Mol. Biol. - 1988. - № 6. - P. 1- 10.

126. Rudall P, Microsporogeneisis and pollen sulcus type in Asparagales (Lilianae)/ Furness C, Chase M, Fay M. // Canadian Journal of Botani. -1997. -No. 75. -P. 408430.

127. Safar J. B: Dissecting large and complex genomes: flow sorting and BAC

cloning of individual chromosomes from bread wheat. / Bartos J, Janda J, Bellec A, Kubalakova M, Valarik M, Pateyron S, Weiserova J, Tuskova R, Cihalikova J, Vrana J, Simkova H, Faivre-Rampant P, Sourdille P, Caboche M, Bernard M, Dolezel J, Chalhoub. // Plant J. -2004. -No 39. -P. 960-968.

128. Sanchez, A.C. Genetic and physical mapping of xa13, a recessive bacterial blight resistance gene in rice. Theor. / Ilag, L.L., Yang, D., Brar, D.S., Ausubel, F., Khush, G.S., Yano, M., Sasaki, T., Li, Z. and Huang, N. // Appl. Genet. -1999. -No 98. -P. 1022-1028.

129. SanMiguel, P. Nested retrotransposons in the intergenic regions of the maize genome / P. SanMiguel, A. Tikhonov, Y. K. Jin N. Motchoulskaia, J. L. Bennetzen // Science. - 1996. - № 274. - P. 765-768.

130. Schmidt, T. Genomes, genes and junk: the large scale organization of plant chromosomes / T. Schmidt, J. S. Heslop-Harrison // Trends in Plant Science. - 1998. - № 3. - P. 195-199.

131. Schulte D. The International Barley Sequencing Consortium-at the threshold of efficient access to the barley genome. / Close TJ, Graner A, Langridge P, Matsumoto T, Muehlbauer G, Sato K, Schulman AH, Waugh R, Wise RP, Stein N // The International Barley Sequencing Consortium-at the threshold of efficient access to the barley genome. Plant Physiol. -2009. -No 149. -P. 142-147.

132. Shibata F, The identification and analysis of the sequences that allow the detection of Allium cepa chromosomes by GISH in the allodiploid A. wakegi / Hizume M. // Chromosoma. -2002. -No. 111. -P. 184-91.

133. Shizuya, H. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector / Birren, B., Kim, U.-J., Mancino, V., Slepak, T., Tachiiri, Y. and Simon, M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1992. -No 89. -P. 8794-8797.

134. Song WY. A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance

gene, Xa21. / Wang GL, Chen LL, Kim HS, Pi LY, Holsten T, Gardner J, Wang B, Zhai WX, Zhu LH. // Science. -1995. -No 270. -P.1804-1806.

135. Song, J. Construction of a bacterial artificial chromosome (BAC) library for potato molecular cytogenetics research / J. Song, F. Dong, J. Jiang // Genome. - 2000. - № 43(1). - P. 199-204.

136. Stein, N. Subgenome chromosome walking in wheat: A 450-kb physical contigin Triticum monococcum L. spans the Lr10 resistance locus in hexaploid wheat (Triticumaestivum L.) / N. Stein, C. Feuillet, T. Wicker, E. Schlagenhauf, B. Keller // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2000. - № 97. - P. 13436- 13441.

137. Suzuki, G. BAC FISH analysis in Allium cepa / G. Suzuki, A. Ura, N. Saito, G. S. Do, B. B. Seo, M. Yamamoto, Y. Mukai // Genes Genet Syst. - 2001. - № 76(4). -P. 251-255.

138. Sykorova, E. Minisatellite telomeres occur in the family Alliaceae but are lost in Allium / E. Sykorova, J. Fajkus, M. Meznikova, K.Y. Lim, K. Neplechova, F.R. Blattner, M.W. Chase, A. R. Leitch // Am. J. Bot. - 2006. - № 93(6). - P. 814- 823.

139. Sykorova, E. The absence of Arabidopsis-type telomeres in Cestrum and closely related genera Vestia and Sessea (Solanaceae): first evidence from eudicots / E. Sykorova, K.Y. Lim, M.W. Chase, S. Knapp, I. J. Leitch, A. R. Leitch, J. Fajkus // Plant Journal. - 2003. - № 34. - P. 283-291.

140. Szinay, D. High-resolution chromosome mapping of BACs using multi-colour FISH and pooled-BAC FISH as a backbone for sequencing tomato chromosome 6 / D. Szinay, S. B. Chang, L. Khrustaleva, S. Peters, E. Schijlen, Y. Bai, W. J. Stiekema, R. C. van Ham, H. de Jong, R. M. Klein Lankhorst // Plant J. - 2008. - № 56(4). - P. 627-637.

141. Tao QZ. Bacterial artificial chromosome-based physical map of the rice genome constructed by restriction fingerprint analysis. / Chang YL, Wang JZ, Chen HM, Islam-Faridi MN, Scheuring C, Wang B, Stelly DM, Zhang HB. // Genetics. -

2001. -No158. -P. 1711-1724.

142. Tao, Q. Cloning and stable maintenance of DNA fragments over 300 kb in Escherichia coli with conventional plasmid-based vectors / Q. Tao, H. B. Zhang // Nucleic Acids Research. - 1998. - № 26(21). - P. 4901-4909.

143. Van Daelen. preparation of megabase-sized tomato DNA and sparation of large restriction fragments by field inversion gel electrophoresis (FIGE). / R.A.J., Jonkers, J.J. and zabel, p. // Plant.Mol.Biol. -1989. -No 12. -P. 341-352.

144. Van der Meer, Q.P. Improving the onion crop (Allium cepa L.) by transfer of characters from Allium fistulosum L. / Q. P. Van der Meer, J. L. Bennekom van // Biul Warzywniczy. - 1978. - № 22. - P. 87-91.

145. Venter, J.C. A new strategy for genome sequencing / Smith, H.O. and Hood, L. // Nature. -1996. -No 381. -P. 364-366.

146. Venter, J.C. Shotgun sequencing of the human genome / Adams, M.D., Sutton, G.G., Kerlavage, A.R., Smith, H.O. and Hunkapiller, M. // Science. -1998. -No 280. -P. 1540-1542.

147. Vershinin, A. V. The large-scale genomic organization of repetitive DNA families at the telomeres of rye chromosomes / A. V. Vershinin, T. Schwarzacher, J. S. Heslop-Harrison // Plant Cell. - 1995. - № 7. - P. 1823-1833.

148. Vitte. C, Ltr retrotransposons and flowering plant genome emergence of the increase, decrease model / Panaud. O, // cytogenetic genome research. -2005, -No110. -P. 91-107.

149. Vries, J. N. de. Onion chromosome nomenclature and homoeology relationships - workshop report / J. N. de Vries // Euphytica. - 1990. - № 49. - P. 13.

150. Wang, G. L. Construction of a rice bacterial artificial chromosome library and identification of clones linked to the Xa-21 disease resistance locus / G. L. Wang, T.

E. Holsten, W. Y. Song, H. P. Wang, P. C. Ronald // Plant J. - 1995. - № 7. - P. 525533.

151. Wang, S. S. Telomere-telomere recombination provides an express pathway for telomere acquisition / S. S. Wang, V. A. Zakian // Nature. - 1990. - № 345. - P. 456458.

152. Woo S. S. Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of Sorghum bicolor / Jiang J., Gill B. S. // Nucl. Acids Res. -1994. -No 22. -P. 4922-4931.

153. Woo S. S., Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of Sorghum bicolor /Jiang J., Gill B. S. et al. // Nucl. Acids Res. -1994. -№ 22. -P. 4922-4931.

154. Woo, S.S. Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of Sorghum bicolor. / Jiang, J., Gill, B.S. Paterson, A.H. and Wing, R.A. // Nucl. Acid res. -1994. -No 22. -P. 4922-4931.

155. Wu CC. Construction and characterization of a soybean bacterial artificial chromosome library and use of multiple complementary libraries for genome physical mapping. / Nimmakayala P, Santos FA, Springman R, Scheuring C, Meksem K, Lightfoot DA, Zhang HB. // TheorAppl Genet. -2004. -No 109. -P. 1041-1050.

156. Xu YH. Identification of a 98-kb DNA segment containing the rice Eui gene controlling uppermost internode elongation, and construction of a TAC transgene sublibrary. / Zhu YY, Zhou HC, Li Q, Sun ZX, Liu YG, Lin HX, He ZH. // Molecular Genetics and Genomics. -2004, -No 272. -P. 149-155.

157. You, F. M. A new implementation of high-throughput five-dimensional clone pooling strategy for BAC library screening / F. M. You, M. C. Luo, K. Xu, K. R. Deal, O. D. Anderson, J. Dvorak // BMC Genomics. - 2010. - V. 11, № 1. - P. 692.

158. ZengQingdong, Construction and Characterization of a Bacterial Artificial Chromosome Library for the Hexaploid Wheat Line 92R137,/Fengping Yuan, XinXu,

Xue Shi, XiaojunNie, HuaZhuang, Xianming Chen, Zhonghua Wang, Xiaojie Wang, Lili Huang, Dejun Han, and Zhensheng Kang,// BioMed Research International. -2014. -Volume 2014 .Article ID 845806, 9 pages.

159. Zhang H, Boom-bust turnovers of megabase-sized centromeric DNA in Solanumspecies:Rapid evolution of DNA sequences associated with centromeres/ Koblizkova A, Wang K et al. // Plant Cell. -2014. -No. 26. -P. 1436-1447.

160. Zhang h. Preparation mega size DNA from nuclei plant. / Zhao x., Ding x., Paterson H., Wing A. // The Plant journal. -1995. -No 7. -P. 175-184.

161. Zhang,H. B. Preparation of megabase-size DNA from plant nuclei / H. B. Zhang, X. Zhao, X. Ding, A. H. Paterson, R.A. Wing // The Plant Journal - 1995. -V. 7, № 1. - P.175-184.

162. Zhong, X.B. Preparation of tomato meiotic pachytene and mitotic metaphase chromosomes suitable for fluorescence in situ hybridization (FISH) / X. B. Zhong, J.H de Jong, P. Zabel // Chromosome Res. - 1998. - 4. - P. 24-28.

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Рисунок 1. Схема ВАС-вектора pBeloBACll. repE ген кодирует белок, важный для репликации, начиная с oriS. Ген устойчивости хлорамфеникола (CMR). В полилинкере расположен lacZ-альфа пептидная часть гена бэта-галактазидазы15

Рисунок 2. Схема клонирования геномной ДНК в BAC-векторе........................19

Рисунок 3. Диаграмма вектора pBeloBACll. Плазмида на основе мини-F-плазмиды.....................................................................................................................21

Рисунок 4. Бинарный BAC-вектор (BIBAC). Плазмида на основе мини-F-плазмиды.....................................................................................................................23

Рисунок 5. Методы скрининга библиотек BAC: А-гибридизация колоний, В -Саузерн-гибридизация, С- ПЦР скрининг...............................................................26

Рисунок 6. Схематическое представление главных классов мобильных элементов....................................................................................................................30

Рисунок 7. Схема строения субтеломеры эукариотической хромосомы............40

Рисунок 8. Схема структуры теломеры A) Вид упрощенной структуры терминальной петли теломеры, две дцДНК-теломеры, связывающие белок и ссДНК-теломера. B) G-quadruplex/G4 структуры, которые могут быть сформированы богатой гуанином (G-rich) ДНК, стрелки указывают на 5' конец нитей ДНК: i) параллельные G4-структуры между двумя самоспаренными ДНК нитями ii) антипараллельные G4 между двумя самоспаренными нитями; iii)

параллельные и антипаралелльные 04-структуры между G-пробегами на той же самой нити ДНК.........................................................................................................45

Рисунок 9. Схема pCCIBAC вектора......................................................................54

Рисунок 10. Результаты ПЦР-пулов ВАС-клонов с использованием праймеров AFiT32. Дорожки 1-2: геномная ДНК Allium fistulosum в качестве контроля. Ряд 3-11: ПЦР продукт амплификации пулов плазмидной ДНК ВАС-клонов. М -маркер размеров 100bp Plus......................................................................................63

Рисукнок 11. Результаты ПЦР-амплификации с праймерами AfiT32: a) с плазмидной ДНК BAC-клонов: 1 - 10.10.3, 2- 10.11.3, 3 - 5.2.2, 4 - 11.4.2, 511.4.7, 6 - 11.4.8 и 7 - 10.11.4; b) повторная амлификация с ПЦР прдуктами, полученными с этими ВАС-клонами: 2 - 197 п. н. фрагмент; маркер размеров 100 b.p..........................................................................................................................65

Рисукнок 12. а) FISH с ВАС-клоном 10.11.3, несущим вставку прицентромерного тандемного повтора AfiT32, на митотических метафазных хромосомах A. fistulosum (красная флуоресценция); b) FISH c ПЦР-продуктом, полученным с AfiT32 праймерами и ВАС-клоном 10.11.3 в качестве матричной ДНК (зеленая флуоресценция).................................................................................68

Рисукнок 13. Идиограмма кариотипа A. fistulosum с хромосомной локализацией прицентромерного повтора.......................................................................................70

Рисукнок 14. Результаты ПЦР-амплификации ДНК BAC-клонов с праймерами на CL58 тандемный повторов. Дорожка 1 - ВАС-клон 9.6.2 ; 2 - ВАС-клон 9.6.3; 3 - ВАС-клон 9.7.2; 4 - ВАС-клон 9.8.3; 5 - ВАС-клон 10.1.4; 6 - ВАС-клон 9.7.3; 7 - ВАС-клон 10.1.3 , М- маркер размеров 100b. p. Plus....................73

Рисукнок 15. (А) Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) с BAC-клоном 9.8.3, меченым Biotin-16-dUTP и детектированным streptavidin-Cy3 (красная флуоресценция) на хромосомах А. fistulosum. (В) Идеограмма хромосом кариотипа А. fistulosum с указанием локализации ВАС клонов, несущих CL58 тандемный повтор......................................................................................................76

Рисукнок 16. (А) Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) с BAC-клоном 9.6.3, меченым Biotin-16-dUTP и детектированным streptavidin-Cy3 (красная флуоресценция) на хромосомах А. fistulosum. (В) BAC-FISH с BAC-клоном 9.7.2, на хромосомах А. fistulosum. (C) BAC-FISH с BAC-клоном 9.7.3, на хромосомах А. fistulosum...........................................................................................77

Рисунок 17. Результаты ПЦР-амплификации BAC-клонов со специфичными праймерами 378 п. н. сателлитной ДНК. Дорожка 1 - BAC-клон 5.3.1, Дорожка 2 - BAC-клон 14.1.2. Маркер размеров 100 b. p.....................................................79

Рисунок 18. FISH на митотической метафазной хромосоме A. fistulosum с BAC-клонами, несущими субтеломерный сателлитный повтор: А) BAC-клон 5.3.1, B) BAC-клон 14.1.2. ВАС-клоны были помечены Biotin-16-dUTP и детектированы streptavidin-Cy3 (красная флуоресценция). Масштабная линейка -10 мкм.........................................................................................................................81

Рисунок 19. A) Результаты ПЦР с праймерами CL26 и геномной ДНК A. fistulosum. Б) Графическая форма кластера CL26 полученного после кластеризации ридов A. fistulosum с помощью программы Repeat Explorer........84

Рисунок 20. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH): А) в качестве пробы был использован ПЦР продукт, полученный с ОЬ26-праймерамии геномной ДНК A. cepa на митотических метафазных хромосомах A. cepa; В) в качестве пробы был использован ПЦР-продукт, полученный с CL26 праймерамии

геномной ДНК A. fistulosum на митотических метафазных хромосомах A. fistulosum. CL26 ПЦР-продукт был помечен Biotin-16-dUTP и детектирован streptavidin-Cy3 (красная флуоресценция). Хромосомы контроркашены DAPI (синее/серое окрашивание).......................................................................................86

Рисунок 21. Результаты ПЦР скрининга ВАС библиотеки с CL26 праймерами: 1-5 дорожки - пулы из 8 ВАС-клонов. Дорожка 5 - пул из 8 ВАС-клонов, на котором получен ПЦР-продукт ожидаемого размера 400 п. н. Маркер размеров 100 b. p.........................................................................................................................88

Рисунок 22. Результат ПЦР с праймером CL26: 1 - маркер размеров 100 b. p. Plus, 2 - ВАС-клон 5.3.1. в качестве матричной ДНК, 3- геномная ДНК A. fistulosum в качестве матричной ДНК.....................................................................89

Рисунок 23. ПЦР с праймерами на 378 п. н. субтеломерный повтор и плазмидной ДНК ВАС-клона 5.3.1.Маркер размеров 100 b. p..............................91

Рисунок 24. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) на митотических метафазных хромосомах A. fistulosum c пробами: А) ВАС-клон 5.3.1 плазмидная ДНК, меченная Dig-11dUTP (зеленая флуоресценция), сигналы в субтеломерных областях всех хромосом; В) ПЦР-продукт, полученный с праймерами на 378 п. н. субтеломерный повтор и ВАС-клоном 5.3.1, который был помечен Dig-11dUTP (зеленая флуоресценция), сигналы в субтеломерных областях всех хромосом; С) ПЦР-продукт, полученный с праймерами на CL26-повтор и ВАС-клоном 5.3.1, который был помечен Dig-11dUTP (зеленая флуоресценция), сигналы в субтеломерных областях на короиком плече на паре гомологичных хромосом 6; D) двухцветный FISH c ПЦР продуктами на CL26 повтор (Biotin-16dUTP, красная флуоресценция) и 378 п. н. субтеломерный

повтор ф1§-11ШТР,зеленая флуоресценция); D') увеличенная хромосома 6 после двухцветной FISH. Масштабная линейка - 10 мкм.....................................93

Рисунок 25. Схематическая модель геномной ДНК 45S рДНК Allium сера и положение праймеров................................................................................................96

Рисунок 26. Результаты ПЦР с праймерами IGS-F и IGS-R: дорожка 1 -геномная ДНК A. fistulosum, дорожка 2 - ВАС-клон 5.3.1, маркер размеров 100 b. p. Plus. (A) Плазмида BAC-клона 5.3.1 со специфичными праймерами 25S-R-25S граница-F. (B) плазмида BAC-клона со 5.3.1 специфичными праймерами 25S-R-25S граница-F..................................................................................................97

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.