Поиск, изучение и практическое применение генов 5'-нуклеотидаз промышленно-значимых видов бацилл тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Юсупова Юлия Рашитовна

• Юсупова Юлия Рашитовна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Юсупова Юлия Рашитовна

1.2. Цель и задачи работы

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы

1.4. Положения, выносимые на защиту

1.5. Личный вклад соискателя

1.6. Публикации и апробация работы

1.7. Структура и объем работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Промышленно значимые штаммы Bacillus

2.2. Биосинтез пуриновых нуклеотидов их взаимопревращение у Bacillus subtilis, биосинтез рибофлавина

2.2.1. Биосинтез пуриновых нуклеотидов и их взаимопревращение у B. subtilis

2.2.1.1. Путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo

2.2.1.2. Регуляция экспрессии генов пуринового оперона

2.2.1.3. Репрессия генов pur оперона PurR

2.2.1.4. Регуляция экспрессии генов с помощью сенсорных РНК, аттенуация генов пуринового метаболизма с помощью гуанинового рибопереключателя

2.2.1.5. Ретроингибирование ферментов биосинтеза пуринов de novo

2.2.1.6. Резервный (salvage) путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов

2.2.1.7. Промежуточный продукт биосинтеза пуринов, AICAR-P, как важный клеточный алармон

2.2.2. Биосинтез рибофлавина

2.2.2.1. Регуляция транскрипции rib-оперона

2.2.2.2. Ретроингибирование ферментов биосинтеза рибофлавина

2.2.2.3. Роль нуклеотидаз в биосинтезе рибофлавина

2.3. Нуклеотидазы: общие сведения, биологическая роль, классификация

2.3.1. Общие сведения о нуклеотидазах и их биологическая роль

2.3.2. Суперсемейство белков HAD - краткая характеристика

2.3.2.1. Семейство II-A NagD и его представители

2.3.2.2. Семейство IIB Cof и его представители

2.3.2.3. Семейство IA

2.3.3. Нуклеотидазы, принадлежащие другим семействам

2.3.3.1. Семейство HD

2.3.3.2. Кальцийнериновая металлофосфатаза UshA E. coli

2.3.3.3. Нуклеотидаза и полифосфатаза семейства SurE - UmpG E. coli

2.3.4. Охарактеризованные нуклеотидазы B. subtilis

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Бактериальные штаммы, бактериофаги

3.2. Методы работы с бактериями, среды

3.2.1. Основные среды и добавки

3.2.2. Трансформация штаммов E. coli

3.2.3. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК)

3.2.4. Трансформация, трансдукция и получение немаркированных генетических модификаций в хромосоме штаммов Bacillus

3.2.5. Проведение ферментаций в пробирках со штаммами-продуцентами

B. amyloliquefaciens

3.2.6. Проведение ферментаций в колбах со штаммом-продуцентом B. subtilis Y25 и штаммом дикого типа B. subtilis BsC+

3.2.7. «Гало-тест» на продукцию рибофлавина

3.4. Методы работы с ДНК, олигонуклеотиды, плазмиды

3.5. Аналитические методы

3.5.1. Определение концентраций пуриновых производных в культуральной среде

3.5.2. Определение концентрации остаточной глюкозы в культуральной среде

3.5.3. Определение накопления биомассы клетками

3.5.4. Качественное и количественное определение рибофлавина в среде

3.6. Биохимические методы

3.6.1. Приготовление грубых клеточных экстрактов E. coli и Bacillus

3.6.2. Электрофорез В ПААГ

3.6.3. Очистка и определение концентрации рекомбинантных белков

3.6.4. Определение молекулярного веса и возможной четвертичной структуры белков методом гель-фильтрации

3.6.5. Измерение общей фосфатазной активности белков Ht-YutF и Ht-YitUBs по отношению к pNPP

3.6.6. Измерение общей фосфодиэстеразной активности Ht-YitUBs

3.6.7. Определение субстратной специфичности Ht-YutF и Ht-YitUBs

3.6.8. Определение фосфатазной активности Ht-YutF по отношению к физиологическим субстратам

3.6.9. Определение фосфатазной активности Ht-YitU к монофосфорным эфирам нуклеозидов в адаптированных условиях (метод Chen и метод Cariani)

3.6.10. Определение кинетических параметров Ht-YutF и Ht-YitUBs

3.6.11. Измерение общей фосфатазной и фосфодиэстеразной активности YueE

3.6.12. Определение фосфодиэстеразной активности Ht-YueE с помощью адаптированной методики с использованием HPLC

3.6.13. Определение кинетических параметров Ht-YueE

3.6.14. Определение активности ß-галактозидазы

3.7. Компьютерные методы: базы данных, программы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Поиск генов 5'-нуклеотидаз у B. subtilis путём выявления генов, ортологичных известным генам 5'-нуклеотидаз из E. coli

4.1.1. Анализ предположительного белка YutF in silico

4.1.2. Изучение вклада продукта гена yutF в общую р-нитрофенил фосфатазную активность клеток штамма B. subtilis

4.1.3. Гетерологичная экспрессия и очистка белка YutF

4.1.4. Определение возможной четвертичной структуры белка

4.1.5. Изучение биохимических свойств белка YutF

4.1.5.1. Изучение оптимума pH

4.1.5.2. Изучение активации фермента ионами металлов

4.1.5.3. Определение субстратной специфичности Ht-YutF

4.1.5.4. Определение кинетических параметров Ht-YutF

4.1.6. Исследование оперона yutD-yutE-yutF

4.1.7. Влияние концентрации неорганического фосфата на экспрессию гена yutF

4.2. Поиск генов 5'-нуклеотидаз B. subtilis и B. amyloliquefaciens с использованием прямого селективного отбора: ген yitU

4.2.1. Идентификация гена yitU, сообщающего устойчивость к пуриновым нуклеозидам

4.2.2. Функциональная характеристика белка YitU

4.2.3. Гетерологичная экспрессия и очистка белка YitUBs

4.2.4. Изучение биохимических свойств белка YitUBs

4.2.4.1. Определение типа связи, гидролизуемой YitUBs

4.2.4.2. Изучение оптимума pH

4.2.4.3 Изучение активации фермента ионами металлов

4.2.4.4. Определение субстратной специфичности Ht-YitUBs

4.2.4.5. Определение кинетических параметров Ht-YitUBs

4.2.5. Эффект сверхэкспрессии yitU на продукцию рибофлавина и пуриновых нуклеозидов

4.2.5.1. Сверхэкспрессия гена yitU приводит к внеклеточному накоплению рибофлавина штаммом B. subtilis дикого типа

4.2.5.2. Делеция гена yitU снижает накопление рибофлавина, а сверхэкспрессия гена приводит к увеличению продукции этого метаболита у штамма Y25

4.2.6. Эффект делеции и сверхэкспрессии yitU на продукцию пуриновых нуклеозидов и AICAR

4.2.6.1. Делеция yitU снижает накопление пуриновых нуклеозидов и AICAR, а сверхэкспрессия гена приводит к увеличению продукции этих метаболитов у штамма

AJ1991

4.2.6.2 Делеция yitU снижает накопление AICAR в среде, а сверхэкспрессия гена приводит к увеличению продукции этого метаболита в соответствующем штамме-

продуценте

4.3. Поиск генов 5'-нуклеотидаз B. subtilis с использованием прямого селективного отбора: ген yueE

4.3.1. Идентификация гена yueE, сообщающего устойчивость к пуриновым нуклеозидам

4.3.2. Гетерологичная экспрессия и очистка белка YueE

4.3.3. Начальная характеристика биохимических свойств белка YueE

Заключение

Общие выводы

Список сокращений

Список цитируемой литературы

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск, изучение и практическое применение генов 5'-нуклеотидаз промышленно-значимых видов бацилл»

1.1. Актуальность и степень разработанность темы

Данная работа посвящена поиску и изучению генов, кодирующих 5'-нуклеотидазы у грамположительных бактерий рода Bacillus: Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Нуклеотидный метаболизм обеспечивает биосинтез и взаимопревращение в клетке входящих в состав ДНК и РНК пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, а также содержащих нуклеотиды важных кофакторов: FAD (флавинадениндинуклеотид), FMN (флавинмононуклеотид), NADP (никотинамидадениндинуклеотидфосфат), коэнзима А, рибофлавина и т.д. 5'-Нуклеотидазы являются неотъемлемой частью нуклеотидного метаболизма у всех живых организмов. Эти ферменты осуществляют дефосфорилирование нуклеотидов и их производных до соответствующих нуклеозидов и неорганического фосфата и, таким образом, вовлечены в salvage путь биосинтеза нуклеотидов. Кроме того, как было показано относительно недавно, эти ферменты могут также участвовать и в синтезе производных нуклеотидов de novo [Sarge et al., 2015].

К настоящему моменту многие ключевые ферменты, участвующие в метаболизме нуклеотидов, подробно охарактеризованы, однако остаются ещё и неизученные ферменты, и кодирующие их гены, такие, как, например, гены 5'-нуклеотидаз. Для эукариот, в особенности для млекопитающих, целый ряд кодирующих 5'-нуклеотидазы генов и функции их продуктов достаточно хорошо изучены [Zimmermann, 1992]. В частности, для них показаны локализация (внутри- или внеклеточная), субстратные специфичности и физиологическая роль [Bianchi and Spychala, 2003, Bogan and Brenner., 2010]. Однако у прокариот, и, в частности, у бактерий рода Bacillus эти ферменты и кодирующие их гены изучены значительно меньше.

Нуклеотидный метаболизм является источником таких важных соединений как AMP (аденозин-5'-монофосфат), GMP (гуанозин-5'-дифосфат), IMP (инозин-5'-монофосфат), AICAR-P (AICAR-фосфат), а также продуктов их дефосфорилирования, аденозина, гуанозина, инозина, AICAR (5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид или акадезин) и др. Эти вещества не только выполняют ряд ключевых функций в клетке, но также представляют интерес для пищевой промышленности и медицины. Так, например, соли IMP и GMP наряду с глутаматом натрия обладают высокой способностью усиливать вкус пищи и поэтому являются важными компонентами пищевых добавок. Пуриновые нуклеозиды аденозин и гуанозин применяются при изготовлении лекарственных препаратов для лечения кардиологических и онкологических заболеваний. Инозин входит в состав препаратов «Инозин пранобекс», «Рибоксин», которые используются как иммуномодуляторы, кардио- и гепатопротекторы. Рибофлавин (витамин B2) применяют при гиповитаминозе и целом ряде

других заболеваний. Для AICAR в последнее время также был показан широкий спектр возможного терапевтического применения. Так, например, фосфорилированная форма AICAR способна связываться с аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназой (AMPK - adenosine monophosphate activated proteinkinase) эукариот, являясь, таким образом, модулятором действия этого глобального регулятора метаболических процессов в клетке. Поэтому AICAR используется в медицине для нормализации обмена углеводов и липидов. Он повышает выносливость организма, улучшает кровоснабжение тканей, ускоряет липолиз, подавляет рост опухолевых клеток, эффективен при хронических и острых лейкозах [Sengupta et al., 2007].

Для многих из перечисленных соединений промышленными продуцентами являются штаммы грамположительных бактерий рода Bacillus, B. subtilis и B. amyloliquefaciens [Schallmey et al., 2004; Liu et al., 2013].

Поскольку важные этапы биосинтеза аденозина, гуанозина, инозина, AICAR и других нуклеозидов осуществляют пока неизвестные у бацилл фосфорилазы (5'-нуклеотидазы), поиск соответствующих генов и изучение биохимических свойств их продуктов могут быть полезны для конструирования эффективных продуцентов этих востребованных в пищевой промышленности и медицине веществ.

Таким образом, поиск и изучение генов, кодирующих 5'-нуклеотидазы, имеет фундаментальное значение, так как расширяет представление о ферментах превращения нуклеотидов и регуляции клеточного метаболизма, а также имеет прикладное значение в области создания продуцентов для биотехнологических производств.

1.2. Цель и задачи работы

Работа посвящена поиску и изучению генов, кодирующих 5'-нуклеотидазы B. subtilis и B. amyloliquefaciens, определению биохимических свойств и субстратной специфичности продуктов этих генов, а также изучению влияния инактивации и повышенной экспрессии этих генов на продукцию пуриновых производных в штаммах дикого типа и соответствующих штаммах-продуцентах.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. с помощью различных подходов провести поиск генов, кодирующих 5'-нуклеотидазы у B. subtilis и B. amyloliquefaciens;

2. клонировать найденные гены в составе экспрессионных векторов, наработать и очистить белки - продукты этих генов;

3. охарактеризовать биохимические свойства и выявить субстратную специфичность каждого из очищенных белков;

4. изучить регуляцию экспрессии гена 5'-нуклеотидазы;

5. выявить эффекты инактивации и сверхэкспрессии гена 5'-нуклеотидазы в штаммах B. subtilis дикого типа и штаммах-продуцентах AICAR и рибофлавина на основе бацилл.

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе были идентифицированы три гена, кодирующие ферменты, которые участвуют в нуклеотидном метаболизме B. subtilis и B. amyloliquefaciens, yutF, yitU и yueE. Для поиска генов были использованы 2 разных подхода.

Первый подход основан на поиске в базах данных B. subtilis и B. amyloliquefaciens белков гомологичных ранее охарактеризованной 5'-нуклеотидазе UmpH из Escherichia coli. Он осуществлялся in silico с использованием программы BLASTp (Basic Local Alignment Search Tool protein, средство поиска основного локального выравнивания для аминокислотных последовательностей). С помощью этого подхода было обнаружено, что предполагаемая гидролаза суперсемейства HAD (haloacid dehalogenase - галогенкислотные дегидрогеназы), кодируемая геном yutF, является наиболее вероятным ортологом UmpH у B. subtilis. Ген yutF B. subtilis был клонирован и экспрессирован в клетках E. coli. Для белка YutF впервые были определены биохимические характеристики: оптимум pH, активация ионами металлов, субстратная специфичность и кинетические параметры. Показано, что он обладает фосфогидролазной активностью в отношении множества физиологических субстратов, включая различные 5'-нуклеотиды и их метаболические предшественники. В отличие от UmpH, наиболее предпочтительными природными субстратами для рекомбинантного YutF являются XMP (ксантозин-5'-монофосфат), PRPP (5-фосфорибозил-1-пирофосфат) и R5P (рибозо-5-фосфат). В настоящей работе экспериментально показано, что ген yutF входит в состав оперона yutDEF и впервые изучена регуляция его экспрессии.

Второй подход к поиску 5'-нуклеотидаз был впервые предложен в настоящей работе и основан на получении библиотеки генов с последующим прямым отбором фрагментов ДНК, содержащих гены 5'-нуклеотидаз по устойчивости клеток штамма E. coli GS72 (TG1 AdeoD gsk-3) к ингибирующим концентрациям пуриновых нуклеозидов, гуанозину и инозину. С помощью этого подхода у B. subtilis и B. amyloliquefaciens были обнаружены гены yitU и yueE, продукты которых были биохимически охарактеризованы.

Продукт гена yitU относится к 5'-нуклеотидазам суперсемейства HAD, проявляет специфичность в отношении широкого спектра дезоксирибо- и рибонуклеозидмонофосфатов, а также участвует в биосинтезе рибофлавина из FMN. Показано, что благодаря способности дефосфорилировать важный редокс-активный кофактор FMN и аналог AMP со множеством регуляторных функций, AICAR-P, YitU участвует в регуляции клеточного метаболизма. Также впервые было продемонстрировано,

что сверхэкспрессия yitU может быть успешно применена для улучшения свойств штаммов, продуцирующих рибофлавин и AICAR.

Ген B. subtilis yueE впервые был клонирован, экспрессирован в клетках E. coli и для него была показана фосфодиэстеразная активность в отношении циклических нуклеотидов.

Результаты диссертационной работы углубляют знания о ферментах превращения нуклеотидов, регуляции экспрессии кодирующих их генов, а значит и регуляции клеточного метаболизма в целом. Кроме того, полученные результаты имеют важное практическое значение и могут быть использованы для создания новых и улучшения имеющихся штаммов-продуцентов рибофлавина и AICAR.

1.4. Положения, выносимые на защиту

1. С помощью поиска in silico у B. subtilis идентифицирован новый ген yutF, ортологичный гену известной 5'-нуклеотидазы из E. coli, UmpH, и показано, что yutF обеспечивает основную фосфатазную активность в отношении пара-нитрофенилфосфата (pNPP) у B. subtilis.

2. Изучены биохимические свойства и субстратная специфичность продукта гена yutF из B. subtilis, наработанного и очищенного в виде рекомбинантного белка. Белок принадлежит к суперсемейству HAD и является 5'-нуклеотидазой, наиболее активной в отношении XMP, а также предшественников нуклеотидов, R5P и PRPP.

3. Показано, что ген yutF входит в состав трицистронного оперона yutDEF, сверхэкспрессия yutF приводит к повышенной экспрессии оперона yutDEF, и эта положительная регуляция усиливается в присутствии неорганического фосфата.

4. С помощью предложенного оригинального подхода к поиску генов 5'-нуклеотидаз, основанного на прямом фенотипическом отборе фрагментов ДНК, у B. subtilis и B. amyloliquefaciens найдены гены yitU и yueE.

5. Продукт гена yitU наработан в E. coli в виде рекомбинантного белка и охарактеризован как 5'-нуклеотидаза суперсемейства HAD с широкой субстратной специфичностью и наибольшим сродством к FMN.

6. Сверхэкспрессия гена yitU существенно увеличивает внеклеточное накопление рибофлавина и AICAR и может быть успешно применена для улучшения свойств соответствующих штаммов-продуцентов.

7. Продукт гена yueE впервые очищен в виде рекомбинантного белка и охарактеризован как фосфодиэстераза, обладающая специфичностью к 2',3'-cAMP.

1.5. Личный вклад соискателя

Все основные результаты получены лично автором, либо при его участии в планировании и проведении экспериментов. Изучение регуляции гена yutF B. subtilis проводилось совместно с сотрудником лаборатории № 2 АО «АГРИ» Романенковым Д. В. Выделение, очистка, определение биохимических характеристик и кинетических параметров рекомбинантных белков проводились совместно с сотрудником лаборатории лаборатории № 2 АО «АГРИ» Скрипниковой В. С. Количественное измерение рибофлавина, пуриновых нуклеозидов и AICAR проводилось совместно с сотрудниками аналитической группы АО «АГРИ».

1.6. Публикации и апробация работы

Результаты исследования представлены в 7 научных публикациях, в том числе в 3 статьях в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК.

Материалы диссертации были представлены в виде стендовых и устных докладов на 15-ой Международной научной конференции IBS 2012 (International Biotechnology Symposium & Exhibition, Сеул, Южная Корея); 16-ой Международной научной конференции IBS 2014 (International Biotechnology Symposium & Exhibition, Форталеза, Бразилия); 15-ой Международной научной конференции IUMS 2017 (International Union of Microbiological Societies, Сингапур); на конкурсе молодых ученых АО «АГРИ» (Москва, 2014); на межлабораторном семинаре АО «АГРИ» (Москва, 2020).

1.7. Структура и объем работы

Диссертация состоит из 8 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Общие выводы», «Список сокращений» и «Список цитированной литературы». Работа изложена на 131 странице, включая 53 рисунка и 16 таблиц. Список цитированной литературы содержит 183 источника, в том числе 4 на русском языке.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Промышленно значимые штаммы Bacillus

Род Bacillus включает несколько десятков видов аэробных спорообразующих палочковидных бактерий. Представителей этого рода можно встретить в верхних слоях почвы и ризосфере, в воде, воздухе, на растениях, продуктах питания и в желудочно-кишечном тракте насекомых и животных. Наиболее хорошо изученные представители рода - B. subtilis, B. amyloliquefaciens и Bacillus licheniformis. Эти виды бактерий непатогенны, не синтезируют эндотоксины и другие токсичные соединения; имеют статус безопасных организмов (GRAS, generally regarded as safe), присвоенный им Управлением контроля качества продовольственных продуктов и лекарственных средств США (FDA - Food and Drug administration). Геномы, транскриптомы и клеточный метаболизм этих бактерий достаточно хорошо изучены и описаны в литературе [Kunst et al., 1997; Barbe et al., 2009; Chen et al., 2007; Sharma et al., 2013]. Многие бациллы обладают достаточно высокой скоростью роста на простых или комплексных питательных средах, устойчивы к стрессовым и внешним неблагоприятным факторам [Beuscher et al., 2012]. Помимо этого, эти бактерии достаточно активно секретируют белки и могут продуцировать целый ряд других метаболитов. Благодаря этому штаммы B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis и другие близкородственные им бактерии используют в промышленной биотехнологии для производства ферментов (преимущественно липаз, амилаз и протеиназ), рекомбинантных белков, антимикробных соединений (пептидных и липопептидных антибиотиков, бактериоцинов), инсектицидов, адсорбентов, поверхностно-активных соединений, а также D-рибозы, витаминов, пуриновых нуклеозидов, поли-гамма-глутаминовой кислоты и других продуктов, которые широко применяются в промышленности, сельском хозяйстве и медицине [Schallmey et al., 2004; Earl et al., 2008; Abriouel et al., 2011; Liu et al., 2013; van Dijl and Hecker, 2013]. Некоторые виды бацилл непосредственно используют в продуктах питания человека (штаммы B. subtilis Natto) и в качестве пробиотиков для человека и сельскохозяйственных животных (штаммы B. subtilis, B. licheniformis, непатогенные штаммы B. cereus) [Hong et al., 2005; Abriouel et al., 2011; Cutting 2011]. Известно, что некоторые бациллы, в частности B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. pumilus и другие, способны выделять в среду соединения, стимулирующие рост растений, эти бактерии могут применяться в качестве биоудобрений [Bhattacharyya et al., 2012; Nagôrska et al., 2007]. Штаммы B. amyloliquefaciens применяют в сельском хозяйстве в качестве микроорганизма-симбионта, помогающего растениям противостоять различным вредителям корневой системы [Berg et al., 2014].

Помимо промышленного применения представители рода Bacillus также являются

одними из важнейших модельных организмов наряду с другим хорошо изученным микроорганизмом - E. coli. B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis и некоторые другие представители рода Bacillus обладают природной компетентностью. Компетентность - это такое физиологическое состояние клетки, при котором она способна усваивать экзогенную ДНК. В конце 50-х годов Спицайзен [Spizizen, 1958] описал относительно простой и хорошо воспроизводимый метод трансформации компетентных клеток штамма B. subtilis, что сделало этот микроорганизм ещё более привлекательным для лабораторных исследований и для промышленного применения. На сегодняшний момент представителей рода Bacillus активно используют в лабораториях для исследования путей биосинтеза ключевых соединений (пуриновые, пиримидиновые нуклеотиды, витамины), для исследования внутриклеточных потоков [Dauner and Sauer, 2001; Rühl et al., 2010], для исследования биоплёнок [Cairns et al., 2014] и т.д. Примечательно, что в 2019 году B. subtilis был выбран как модельный объект для изучения влияния микрогравитации и повышенного ионизирующего излучения на транскриптом одноклеточного грамположительного организма в условиях космической станции [Morrison et al., 2019]. До недавнего времени исследования транскриптома в космическом полёте проводились только на небольшой выборке грамотрицательных бактерий (Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Rhodospirillum rubrum), что ограничивало возможность обобщать выводы в более широком диапазоне микроорганизмов. Действительно, было показано, что в двух независимых полётах происходят схожие изменения в уровнях экспрессии некоторых генов, ответственных за образование биоплёнок, синтез биотина, аргинина, генов устойчивости к антибиотикам и т.д. [Morrison et al., 2019].

Тем не менее, несмотря на столь длительный и вполне успешный путь изучения бацилл, до сих пор остается ещё много неизвестных и неописанных генов и их функций, даже в таких центральных путях метаболизма, как например, биосинтез и взаимопревращение пуринов.

2.2. Биосинтез пуриновых нуклеотидов их взаимопревращение у Bacillus subtilis, биосинтез рибофлавина.

2.2.1. Биосинтез пуриновых нуклеотидов и их взаимопревращение у B. subtilis

Пуриновые нуклеотиды во всех живых организмах задействованы в центральном клеточном метаболизме, они участвуют во многих клеточных реакциях, входят в состав ДНК и РНК, являются источниками энергии, кофакторами ферментов в метаболических путях, включаются в синтез таких важных для метаболизма клетки соединений, как NAD (никотинамидадениндинуклеотид) и NADP (никотинамидадениндинуклеотидфосфат)

[Kornberg et al., 1955], рибофлавин [Baugh and Krumdieck, 1969], фолиевая кислота [Vieira and Slaw, 1961], и гистидин [Moyed andMagasanik, 1960] участвуют в передаче сигналов и т.д.

Синтез пуриновых нуклеотидов de novo в клетках B. subtilis зависит от соотношения уровней образования и потребления пентозофосфатов, так как пуриновые нуклеотиды синтезируются из простого предшественника PRPP (Рисунок 1, стр. 13). В тканях животных, растений и микроорганизмов увеличение скорости нуклеинового обмена коррелирует с повышением активности ферментов пентозофосфатного пути и наоборот [Артамонов 1976; Oishi and Aida, 1963]. PRPP также связан с такими метаболическими потоками, как биосинтез пиримидиновых и пиридиновых нуклеотидов, триптофана (Рисунок 1, стр. 13). PRPP служит также связующим звеном между биосинтезом пуринов и углеводным обменом. Поэтому на регуляцию пуринового биосинтеза оказывают своё влияние все метаболические пути, в которые вовлечён PRPP.

Также биосинтез пуринов связан с синтезом витамина тиамина (B1) и аминокислоты гистидина (Рисунок 1).

Путь salvage служит для внутриклеточного взаимопревращения пуринов, также пуриновые нуклеотиды могут быть получены из пуринов, поступающих в клетку извне (Рисунок 1).

2.2.1.1. Путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo

Путь биосинтеза пуриновых нуклеозидов de novo у B. subtilis является многостадийным процессом (Рисунок 2, стр. 13), который завершается образованием таких ключевых соединений как IMP, GMP и ADP (аденозин-5'-дифосфат). У B. subtilis гены, отвечающие за синтез пуриновых нуклеотидов организованы в полицистронный оперон purEKBCSQLFMNHD (далее pur-оперон), состоящий из 12 перекрывающихся генов. Все гены кластера транскрибируются с оА-зависимого промотора, расположенного перед геном purE [Ebbole and Zalkin, 1987; Ebbole and Zalkin, 1989] и терминируются после гена purD. Три остальных гена (purA, guaA и guaB), необходимые для синтеза AMP и GMP, не входят в оперонную структуру pur.

Все ферменты, участвующие в биосинтезе пуринов de novo, монофункциональные, за исключением бифункциональной AICAR формилтрансферазы / IMP-циклогидролазы, кодируемой геном purH.

Глюкоза

Рисунок 1. Взаимосвязь путей биосинтеза пуринов de novo и salvage с другими метаболическими путями. Обозначения: ATP - аденозин-5'-трифосфат; ADP - аденозин-5'-дифосфат; AMP - аденозин-5'-монофосфат; A

- аденин; AR - аденозин; AICAR - 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид; IMP - инозин-5'-монофосфат; Hx

- гипоксантин; HxR - инозин; XMP - ксантозин-5'-монофосфат; X - ксантин; XR - ксантозин; GTP - гуанозин-5'-трифосфат; GDP - гуанозин-5'-дифосфат; GMP - гуанозин-5'-монофосфат; G - гуанин; GR - гуанозин; R5P

- рибозо-5-фосфат; Б-рибулозо-5Р - Б-рибулозо-5-фосфат; FMN - флавинмононуклеотид или рибофлавин-5'-фосфат; FAD - флавинадениндинуклеотид; PEP - фосфоенолпируват; PRPP - 5-фосфорибозил-1-пирофосфат; Pyruvate - пируват; Acetyl-CoA - ацетил-Коа.

PRPP

purF

AICAR

I У

purD PRA —■■ GAR -

purN

=GAR -

purLQS

- FGAM■

purM purEK

- AIR -

purE

- NCAIR —fCAIR -

purC

нуклеотидазы

purB

- SAICAR —»-AICAR-P -

purH

FAICAR -

purH

IMP

Рисунок 2. Схема пути de novo биосинтеза пуриновых нуклеотидов у B. subtilis.

Сокращения: PRA - 5-фосфорибозиламин; GAR - 5-фосфорибозилглицинамид; FGAR - 5'-фосфорибозил-М-формилглицинамид; FGAM - 5'-фосфорибозил-М-формилглицинамидин; AIR - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол; NCAIR - 5'-фосфорибозил-5-карбоксиаминоимидазол; CAIR - 5'-фосфорибозил-4-карбокси-5-аминоимидазол; SAICAR - 5'-фосфорибозил-4-^-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол; AICAR - 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид; AICAR-P - AICAR-фосфат; FAICAR - 5'-фосфорибозил-5-формил-4-аминоимидазолкарбоксамид; IMP - инозин-5'-монофосфат. Гены, кодирующие соответствующие ферменты: purF - глутамин-PRPP-амидотрансфераза; purD - GAR-синтетаза; purN - GAR-формилтрансфераза; purLQS -FGAM-синтетаза II; purM - AIR-синтетаза; purE - NCAIR-мутаза; PurK, NCAIR-синтетаза; purC - SAICAR-синтетаза; purB - аденилсукцинатлиаза; purH - AICAR-формилтрансфераза / IMP-циклогидролаза.

2.2.1.2. Регуляция экспрессии генов пуринового оперона

Биосинтез пуриновых нуклеотидов и их взаимопревращение подвержены строгой регуляции, цель которой - обеспечить необходимый внутриклеточный баланс пулов этих соединений. Экспрессия всех генов, участвующих в синтезе пуриновых нуклеотидов, зависит от двух факторов - связывания белка-репрессора PurR, кодируемого геном purR [Zalkin, 1993] и аттенуации транскрипции, которая происходит по механизму гуанин-зависимого рибопереключателя [Johansen et al, 2003]. Также в регуляции синтеза и превращения пуриновых соединений важную роль играет ретроингибирование ключевых ферментов биосинтеза конечным продуктом.

2.2.1.3. Репрессия генов pur оперона PurR

Репрессор PurR - белок гомодимер, который связывается с регуляторной областью pur-оперона, а именно с боксами: Риг-бокс1 либо Риг-бокс2. Было показано, что с точки зрения связывания с репрессором Риг-бокс1 является «сильным», а Риг-бокс2 - «слабым» [Shin et al., 1997; Bera et al., 2003]. Также на С-конце белка PurR имеется последовательность из 13 нуклеотидов для связывания с PRPP. Добавление в среду культивирования аденина приводит к увеличению пула ADP - главного аллостерического ингибитора PRPP-синтетазы, что в свою очередь снижает активность PRPP-синтетазы и, соответственно, пул PRPP. Белок-репрессор PurR связывается с регуляторной областью pur-оперона, что приводит к блокированию пути синтеза пуриновых нуклеотидов de novo [Rappu et al., 1999; Saxild et al., 2001; Weng et al., 1995; Rappu et al., 2003]. Добавление гуанозина, наоборот, увеличивает пул PRPP и, таким образом, индуцирует экспрессию генов, регулируемых PurR [Rappu et al., 1999; Saxild and Nygaard, 1991; Johansen et al., 2003]. Таким образом, в регуляции pur-оперона имеет место аденин-опосредованная репрессия PurR.

2.2.1.4. Регуляция экспрессии генов с помощью сенсорных РНК, аттенуация генов пуринового метаболизма с помощью гуанинового рибопереключателя

Большинство бактериальных генов, задействованных в различных метаболических путях, подвержены негативной регуляции по типу обратной связи, т.е. репрессируются конечными продуктами данного метаболического пути. Регуляция экспрессии таких генов осуществляется либо на уровне инициации транскрипции, либо на уровне её элонгации. В первом случае функцию сенсоров, улавливающих критические концентрации сигнальных метаболитов в клетке, выполняют регуляторные белки-репрессоры, которые приобретают способность с высокой точностью связываться с регуляторными последовательностями генов и подавлять инициацию их транскрипции [Browning and Busby, 2004]. Во втором случае

в качестве рецепторов специфических метаболитов-эффекторов могут выступать не только белковые молекулы, но и, например, молекулы РНК [Winkler et al., 2002; Mironov et al., 2002].

РНК-регуляторы по-другому называют сенсорными РНК или рибопереключателями («riboswitches»). Рибопереключатели являются цис-действующими регуляторными элементами, т.к. расположены, как правило, в 5'-лидерных не кодирующих областях мРНК генов, экспрессию которых они модулируют. Важным свойством рибопереключателей является способность напрямую, без помощи белковых посредников, распознавать и связывать определенные клеточные метаболиты. В результате связывания с метаболитом происходит «переключение» между альтернативными конфигурациями мРНК и, таким образом, осуществляется контроль транскрипции либо трансляции соответствующих мРНК, которые обычно кодируют белки, участвующие в биогенезе или транспорте этих метаболитов.

Типичная сенсорная РНК состоит из двух модульных доменов: аптамера и экспрессионной платформы [Lemay et al., 2011]. Аптамер является наиболее консервативным доменом сенсорной РНК и отвечает за связывание специфических клеточных метаболитов посредством формирования компактной трёхмерной структуры, являющейся своего рода «карманом» для связываемого лиганда [Winkler and Breaker, 2003]. Второй домен -экспрессионная платформа - обычно расположен после аптамера и характеризуется большим разнообразием как нуклеотидной последовательности, так и общей архитектуры, и модулирует экспрессию генов, главным образом, путём изменения конформации вторичной структуры мРНК [Lemay et al., 2011]. Таким образом, рибопереключатели способны формировать альтернативные вторичные структуры в зависимости от присутствия специфического метаболита и модулировать процесс элонгации транскрипции мРНК или инициации трансляции этих мРНК [Nudler and Mironov, 2004; Vitreschak et al., 2004; Mandal and Breaker, 2004; Kim and Breaker, 2012].

У B. subtilis экспрессия генов пуринового оперона, а также ряда других генов, вовлечённых в метаболизм пуринов, помимо репрессии инициации транскрипции белком PurR, регулируется по механизму терминации транскрипции. Было установлено, что экспрессия генов pur-оперона негативно регулируются гипоксантином и гуанином. Регуляция осуществляется по механизму гуанин-зависимого рибопереключателя - в присутствии гуанина происходит формирование терминатора транскрипции, а при отсутствии обеспечивается сквозная транскрипция структурной части гена [Mandal et al., 2003]. Таким образом, повышение пулов гуанина у B. subtilis приводит к преждевременной терминации транскрипции генов pur-оперона.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Юсупова Юлия Рашитовна, 2022 год

- • •

Рисунок 34. Электрофореграмма грубых клеточных экстрактов штамма E. coli BL21(DE3) (27 мкг общего белка) с указанными плазмидами и очищенного белка Ht-YitUBs. Дорожки: 1 - pET15b(+); 2 - pET15-yitUBs; 3 -pET15-H6-yitUBS; 4 - очищенный Ht-YitUBs (7 мкг); M - стандартные маркёры молекулярного веса белков, kDa (Unstained Protein Molecular Weight Marker, Thermo Scientific, Lithuania, Vilnius). Окрашивание препарата -Coomassie Brilliant Blue.

С помощью гель-фильтрации определили молекулярный вес белка Ш-У1Швз - он составил 32 ± 5 Юа, что свидетельствует о том, что белок в активной форме представляет собой мономер (Рисунок 35).

3,0

2,5

го 2,0 О

1,5

1,0

Thyroglobulin (669 kDa)

ф Apoferritin (443 kDa)

0,2

ß-amylase (200 kDa)

Alcohol dehydrogenase (150 kDa)

Albumin (66 kDa)

Ht-YitU ~ 32 kDa a

Carbonic anhydrase (29 kDa)

0,4

Kav

0,6

0,8

Рисунок 35. Определение молекулярного веса белка Ht-YitUBs с помощью гель-фильтрации. Треугольником обозначен очищенный Ht-YitUBs, ромбами обозначены молекулярные веса известных белков (Gel Filtration Markers Kit for Protein Molecular Weights 29,000-700,000 Da, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

В дальнейшем провели очистку рекомбинатного полигистидин-меченного белка Ш-YitUвs с использованием металл-аффинной хроматографии с последующим электрофорезом в ПААГ (Рисунок 34, дорожка 4).

4.2.4. Изучение биохимических свойств белка YitUвs 4.2.4.1. Определение типа связи, гидролизуемой YitUвs

На начальном этапе изучения биохимических свойств белка У1Швз использовали общепринятый подход для исследования белков с неизвестными функциями, в основе которого лежит энзиматический скрининг (Таблица 10). В ходе скрининга в первую очередь определяется активность в отношении хромогенных субстратов, и, следовательно, тип гидролизуемой связи. На следующем этапе изучается ферментативная активность к ряду природных субстратов - субстратная специфичность.

Поскольку по результатам анализа т silico исследуемый нами белок У1Швз осуществляет дефосфорилирование субстрата, в качестве хромогенных субстратов мы использовали указанные в Таблице 10 соединения.

Таблица 10. Определение гидролазной активности Ht-YitUBs.

Фосфатазы или монофосфоэстеразы (ЕС 3.1.3) Фосфодиэстеразы (ЕС 3.1.4) Эстеразы (ЕС 3.1.1) (карбоксилэстеразы, липазы, тиоэстеразы, и фосфолипазы)

Тип гидролизуемой связи фосфомоноэфирная (простая эфирная) фосфодиэфирная (сложная эфирная) оксо- или тио- эфирная

Хромогенные субстраты пара-нитрофенил фосфат (^ЫРР) бис-пара-нитрофенил фосфат (Ы8-^ЫРР), пара-нитрофенил-тимидин монофосфат (^ЫР-ТМР), пара-нитрофенилфосфорил холин (^ЫРРС) пара-нитрофенил пальмитат (^ЫР-раШШе)

Природные субстраты нуклеотиды, сахара и сахарные спирты сАМР, 3',5'^МР, одно- или двухцепочечная ДНК, РНК, фосфолипиды оксо- или тиоэфиры и различные жирные кислоты

Активность Ш-^Ш по отношению к хромогенным субстратам + - -

Эксперименты проводили с клеточными экстрактами штаммов E. coli BL21(DE3), содержащими экспрессионные плазмиды pET15-yitUBs и pET15-H6-yitUBs. Определение активности по отношению к хромогенным субстратам показало, что из проверенных нами хромогенных субстратов белки YitUBs и Ht-YitUBs проявляют активность только к ^NPP (Таблица 10, Рисунок 36, стр. 84). Таким образом, мы показали, что белок YitUBs является фосфомоноэстеразой и его активность не меняется при наличии полигистидиновой последовательности на N-конце белка. Поэтому дальнейшие эксперименты проводили с очищенным препаратом рекомбинантного белка Ht-YitUBs.

□ BL21(DE3) pET-15b(+)

□ BL21(DE3) pET15-yitUBs

□ BL21(DE3) pET15-H6-yitUBs

13

15 -

10

5 -

10 mM pNPP + 5 mM Mg

2+

Рисунок 36. _р-нитрофенил фосфатазная активность клеточных экстрактов штаммов BL21(DE3) с различными плазмидами, несущими ген Показаны средние значения трёх независимых экспериментов и стандартные

отклонения.

0

Так же, как и в случае белка Н^ШР, для изучения биохимических свойств очищенного рекомбинантного белка YitUвs использовали измерения двух типов активностей: ^-нитрофенил фосфатазной активности (для хромогенного субстрата ^ЫРР) и 5'-нуклеотидазной (для природных фосфорилированных субстратов). Чтобы определить оптимальные условия для работы белка, для обеих активностей были определены рН оптимум и зависимость от присутствия двухвалентных катионов.

4.2.4.2. Изучение оптимума pH

Зависимость фосфатазной активности Ht-YitUBs от pH по отношению к ^NPP (10 mM) или GMP (3 mM) определяли в присутствии 5 mM MgCh и очищенного белка Ht-YitUBs. pH-оптимумы в соответствующих 100 mM буферах составили: 5,5-6,5 в буфере MES, 6,0-7,5 в имидазольном буфере, 7,1-8,9 в буфере Tris-HCl и 9,0-9,5 в CHES буфере (буфер на основе №циклогексил-2-(амино)этансульфоновой кислоты) (Рисунок 37, стр. 85).

А.

Б.

Рисунок 37. Зависимость фосфатазной активности Ht-YitUBs от pH по отношению к pNPP (А) и GMP (Б) в различных буферах.

4.2.4.3 Изучение активации фермента ионами металлов

Зависимость фосфатазной активности Ht-YitUBs от присутствия в среде ионов металлов изучали в 50 mM имидазольном буфере при pH 7,0, в качестве субстратов использовали pNPP (10 mM) и IMP (3 mM) (Рисунок 38, стр. 86). Концентрацию ионов Mg2+ варьировали следующим образом: 0,04-10,0 mM, ионы Mn2+, Ni2+ и Co2 использовали в концентрациях 0,5 и 1,0 mM (Рисунок 38).

Как следует из приведённых данных, как для р-нитрофенил фосфатазной, так и для 5'-нуклеотидазной активностей оптимальные значения pH и концентраций ионов Mg2+ совпадали и составляли pH 7,1-7,5 и 5 mM MgCh, соответственно, поэтому в дальнейшем эти условия были использованы при изучении кинетических параметров и субстратной специфичности фермента.

А.

200 п

I 150 -\ S

100

50

32,9 —ï-

0,04 mM Mg2+

156,0

5 mM

Mg2+

122,6

10 mM p NPP

18,9

10 mM

Mg2+

1 mM Mn2

11,9

Г~*~1

1 mM Ni2+

0

Б.

15,0

x 10,0 -s S

s л

§ 5,0 H S

0,0

3 mM IMP

5,80 ï

0,24 0,40

3,36 -i

6,54

6,86 à

6,54 ï

6,12 -i

5,19 ï

0,55

0,22

0,28

,0,0025 mM 0,1 mM 1 mM 3 mM 5 mM 7,5 mM 10 mM 15 mM 20 mM,, 0,5 mM 0,5 mM 0,5 mM

„2+ M;2+ ,~„2+

Mn2

Ni2'

Co2'

Mg2'

Рисунок 38. Зависимость фосфатазной активности Ht-YitUBs от присутствия ионов металлов по отношению к ^NPP (А) и IMP (Б).

4.2.4.4. Определение субстратной специфичности Ht-YitUBs

Далее определяли 5'-нуклеотидазную активность Ht-YitUBs по отношению к ряду природных субстратов (моно-, ди-, три- фосфорные эфиры нуклеозидов, фосфорилированные сахара, кофакторы). Было показано, что рекомбинантный Ht-YitUBs катализирует дефосфорилирование широкого ряда субстратов, включая дезоксирибо- и рибонуклеотиды, демонстрируя наибольшую каталитическую эффективность в отношении FMN, dAMP, GMP, dGMP, CMP, AMP, XMP, IMP и AICAR-P (Таблица 11, стр. 87).

Таблица 11. Специфическая активность рекомбинантного Ht-YitUBs по отношению к различным субстратам

Субстрат Активность A, мкмоль мин-1 мг-1 Источник

FMN (0,1 mM) 24,8 ± 3,6 Данная работа

17 ± 2 [Sarge et al., 2015]

ARPP (0,3 mM) 1,7 ± 0,4

dAMP 13,1 ± 1,9

GMP 12,1 ± 1,7

CMP 10,9 ± 1,5

AMP 9,7 ± 1,4

dGMP 9,5 ± 1,6

XMP 8,4 ± 1,4

IMP 6,4 ± 0,9

AICAR-P 2,8 ± 0,6

2'-AMP 2,2 ± 0,4

CDP 1,4 ± 0,4

UMP 1,3 ± 0,3

GDP 1,3 ± 0,4

6-фосфо-глюконат 1,2 ± 0,3

IDP 0,90 ± 0,19

Пиридоксаль-5-фосфат 0,78 ± 0,12

NADP 0,75 ± 0,11

Рибозо-5-фосфат 0,54 ± 0,08

TDP 0,52 ± 0,07 Данная работа

Маннозо-6-фосфат 0,52 ± 0,07

3'-AMP 0,37 ± 0,06

Глюкозо-6-фосфат 0,33 ± 0,05

ADP 0,32 ± 0,05

Фруктозо-6-фосфат 0,29 ± 0,04

ITP 0,21 ± 0,04

Эритрозо-4-фосфат 0,19 ± 0,03

CTP 0,16 ± 0,03

GTP 0,14 ± 0,02

Фосфорибозилпирофосфат 0,13 ± 0,02

UDP 0,13 ± 0,02

ATP 0,12 ± 0,02

FAD <0,1

UTP <0,1

Фосфоенолпируват <0,1

Глюкозо-1-фосфат <0,01

Фосфорноуксусная кислота <0,01

Скорость гидролиза субстратов (3 тМ, если не указано иное) очищенным Ш-У1ШВз (0,12 мкг) определяли в стандартных условиях по образующемуся Ръ как это описано в разделе «Материалы и методы». Показаны средние значения трёх независимых экспериментов ± стандартная ошибка.

4.2.4.5. Определение кинетических параметров Ht-YitUBs

Для субстратов, в отношении которых была обнаружена относительно высокая активность белка Ht-YitUBs, а именно FMN, dAMP, GMP, dGMP, CMP, AMP, XMP, IMP и AICAR-P, определили кинетические параметры (Таблица 12, стр. 88). Полученные экспериментальные данные обрабатывали с помощью программы GraphPad Prism 8. Результаты исследования показали, что Ht-YitUBs обладает низкой субстратной специфичностью и невысокой каталитической активностью по отношению ко всем тестируемым субстратам, за исключением рибофлавин 5'-монофосфата или FMN, для

которого константа Михаэлиса была почти на три порядка ниже, а каталитическая эффективность была на два порядка выше, чем у других протестированных субстратов.

Практически в тоже время, что проводились данные эксперименты, появилась статья, в которой авторы обнаружили, что продукты генов B. subtilis ycsE, ywtE и yitU катализируют реакцию дефосфорилирования одного из предшественников в пути биосинтеза рибофлавина, ARPP [Sarge et al, 2015] (Рисунок 5, стр. 19, «Обзор литературы»). Авторы публикации показали кинетические характеристики рекомбинантных белков YcsE, YwtE и YitU в отношении ARPP, указывающие на высокую специфичность белков к этому фосфорилированному соединению. Кроме того, в статье была также показана высокая специфическая активность этих белков в отношении FMN, однако кинетические параметры белков в отношении этого субстрата не были изучены. В ходе наших экспериментов мы не проводили измерение активности в отношении ARPP из-за его коммерческой недоступности, однако показали высокую специфическую активность рекомбинантного YitU в отношении FMN (Таблица 11), значения которой соответствовали значениям, представленным в статье Sarge с соавторами. Кроме того, мы показали, что хотя константы Михаэлиса для ARPP и FMN были примерно одинаковыми, каталитическая константа (kcat) и каталитическая эффективность (kcat/Км) фермента в отношении FMN были значительно выше, чем в отношении ARPP (Таблица 12).

Таблица 12. Кинетические параметры Ш-йШВз по отношению к наиболее предпочтительным субстратам.

Субстрат Km Vmax kcat kcat/KM Источник

(mM) (Е мг-1) (с-1) (с-1 M-1)

FMN 0,096 ± 0,015 43,18 ± 1,52 22,97 2,39*105 Данная работа

ARPP 0,081 ± 0,006 - 0,88 1,09*104 [Sarge et al., 2015]

dAMP 8,24 ± 0,42 49,35 ± 1,10 26,25 3,19*103 Данная работа

GMP 7,00 ± 0,29 39,97 ± 0,69 21,26 3,04*103 Данная работа

dGMP 5,61 ± 0,79 25,95 ± 1,33 13,80 2,46*103 Данная работа

CMP 17,45 ± 1,82 73,65 ± 3,94 39,18 2,25*103 Данная работа

AMP 14,32 ± 1,01 52,94 ± 2,13 28,16 1,97*103 Данная работа

XMP 21,74 ± 2,93 70,47 ± 6,56 37,49 1,72*103 Данная работа

IMP 17,81 ± 3,15 49,51 ± 4,53 26,34 1,48*103 Данная работа

AICAR-P 10,19 ± 1,50 21,20 ± 4,12 11,28 1,11*103 Данная работа

Кинетические параметры определяли с использованием соответствующего анализа активности с десятью различными концентрациями субстрата. Показаны средние значения трёх независимых экспериментов ± стандартная ошибка. Е - единицы фермента.

Интересно, что для всех изученных нами субстратов, реакция описывались уравнением Михаэлиса-Ментен, за исключением АГСАК-Р, для которого кинетика описывалась сигмоидальной кривой с коэффициентом Хилла 1,83 ± 0,15. Таким образом, реакция с АГСАК-Р в качестве субстрата характеризовалась положительной кооперативностью.

Таким образом, было показано, что наиболее предпочтительным субстратом для рекомбинантного белка YitUBs является FMN. Кроме того, как и большинство нуклеотидаз HAD-суперсемейства этот фермент обладает широкой специфичностью и при повышении соответствующих внутриклеточных пулов способен дефосфорилировать целый ряд субстратов, включая дезоксирибо- и рибонуклеотиды. Было показано, что среди этих соединений фермент обладает наибольшей каталитической эффективностью в отношении монофосфатов dAMP, GMP, dGMP, CMP, AMP, XMP, IMP и AICAR-P. Для всех изученных субстратов, реакция описывались уравнением Михаэлиса-Ментен, за исключением AICAR-P, для которого кинетика характеризовалась положительной кооперативностью с коэффициентом Хилла 1,83 ± 0,15.

4.2.5. Эффект сверхэкспрессии yitU на продукцию рибофлавина и пуриновых нуклеозидов

4.2.5.1. Сверхэкспрессия гена yitU приводит к внеклеточному накоплению рибофлавина штаммом B. subtilis дикого типа

В ходе экспериментов по изучению свойств штаммов B. subtilis 168 и E. coli BL21(DE3), содержащих плазмиды pMWALl-yitUBs и pMWALl-yitUBa, отметили, что при культивировании клеток в минимальной жидкой среде появляется жёлто-зелёное окрашивание. Для контрольных штаммов (содержащих вектор без вставки), культивируемых в таких же условиях, такого эффекта не наблюдалось. Для более точного исследования этого явления сконструировали штамм B. subtilis 168 trpC+ (BsC+). Этот штамм способен расти на минимальных средах без добавления триптофана, что улучшает качественный и количественный анализ проб на присутствие окрашенного продукта. Штамм BsC+ трансформировали плазмидами pMWAL1, pMWAL1-yitUBs, pMWAL1-yitUBs и pMWAL1-PyitUBa-yitUBs. Также на основе штамма BsC+ получили штамм с инактивированным геном yitU - BsC+AU. Делеция yitU существенно не повлияла на рост и клеток и потребление ими глюкозы (Рисунок 39).

ББО4

BsC+AyitU

1,5

2 I

(О

о" О

0,5

24 48

Время (ч)

72

3 «

м

О *

2 2 с

96

Рисунок 39. Влияние делеции уНи на рост клеток (сплошные линии) и потребление глюкозы (пунктирные линии) штаммом BsC+. Показаны средние значения трёх независимых экспериментов ± стандартные отклонения.

При культивировании штаммов ВбС+, содержащих различные конструкции с генами угЮв& и уНива, в бесцветной среде проявлялось жёлто-зелёное окрашивание (Рисунок 40, А), причём интенсивность окрашивания зависела от типа плазмиды. Наиболее интенсивно была окрашена среда культивирования штамма ВбС+ (pMWAL1-PyiШвa-yiШвs), содержащего плазмиду, с которой экспрессия гена y/tUвs контролировалась с помощью регуляторных элементов гена угШва.

2

5

4

1

0

0

А. Б.

В. Г.

Рисунок 40. Влияние сверхэкспрессии гена у^и на окрашивание культуральной среды. А, Б - штамм BsC+ и его производные: 1. BsC+, 2. BsC+AU, 3. BsC+ (pMWAL1), 4. BsC+ (pMWAL1-yitUвs), 5. BsC+ (pMWAL1-yitUвa), 6. BsC+ (pMWAL1-PyitUвa-yitUвs). В, Г - штамм BsAyutF и его производные: 1. BsAyutF, 2. BsAyutF (pMWALl), 3. BsAyutF (pMWAL1-yitUвs), 4. BsAyutF (pMWAL1-yitUвa), 5. BsAyutF (pMWAL1-PyitUвa-yitUвs). Б, Г - фото сделано в УФ лучах.

Для того чтобы понять, действительно ли уровень 5'-нуклеотидазной активности У1Ш коррелирует с интенсивностью окраски, развивающейся при культивировании штаммов, провели исследование 5'-нуклеотидазной активности в штамме, содержащем экспрессионные плазмиды с генами yitUвs и уНи^а. В качестве родительского штамма использовали штамм с инактивированным геном yutF - BsДyutF, чтобы исключить влияние 5'-нуклеотидазы YutF на полученные значения активности.

Действительно, сравнение 5'-нуклеотидазных активностей грубых клеточных экстрактов штамма BsДyutF, содержащего конструкции pMWAL1, pMWAL1-yitUвs, pMWAL1-yitUвa и pMWAL1-PyitUвa-yitUвs, показало, что этот уровень возрастает в ряду: pMWAL1-yitUвs, pMWAL1-yitUвa и pMWAL1-PyitUвa-yitUвs (Рисунок 41) и коррелирует с возрастанием окрашивания среды культивирования.

Интересно, что при культивировании штамма BsДyutF, содержащего pMWAL1-PyitUвa-yitUвs, наблюдалось более интенсивное окрашивание, чем в случае штамма BsC+ (pMWAL 1 -PyitUвa-yitUвs) (Рисунок 40, В), что, возможно, указывает на некое взаимодействие функций двух нуклеотидаз в клетке. Однако в данной работе этот аспект не изучался.

□ BsAyutF pMWALI

□ BsAyutF pMWALI-yitUBs

□ BsAyutF pMWALI-yitUBa

□ BsAyutF pMWALI -PyitUBa- yitUBs

80

60

5 л

§ 40 5

20 -

15 mM IMP

72

Рисунок 41. 5'-нуклеотидазные активности в отношении 15 mM IMP в грубых клеточных экстрактах в штамме BsAyutF, содержащем различные конструкции с генами yitUBs и yitUBa. Показаны средние значения трёх независимых экспериментов и стандартное отклонение.

Так как было показано, что для YitU наиболее предпочтительным субстратом является FMN, мы предположили, что продукт его дефосфорилирования, рибофлавин, который образуется в клетках благодаря сверхэкспрессии гена у1Ю, и придает окраску культуральной жидкости. Флуоресценция окрашенных культуральных жидкостей в ультрафиолетовом свете также говорила в пользу этой гипотезы (Рисунок 40, Б, Г).

0

Чтобы подтвердить предположение о том, что выделяемое в среду вещество может быть рибофлавином, провели тест, в котором использовали штамм ауксотроф по рибофлавину - В. subtilis 168 Дг/Ь. Этот штамм не способен расти на минимальных средах без добавления рибофлавина. При посеве газона этого штамма на агаризованную минимальную среду без рибофлавина и нанесении на него суспензии клеток штаммов, выделяющих рибофлавин, В. subtilis 168 Дг/Ь начинает расти за счёт диффузии рибофлавина в среду, и его рост тем интенсивнее, чем больше рибофлавина выделяет штамм-прототроф. Как видно из Рисунка 42, гало из растущих клеток В. subtilis 168 Дг/Ь образовывалось вокруг зон роста штаммов, содержащих плазмиды pMWAL1-yitUвs, pMWAL1-yitUвa или pMWAL1-PyitUвa-yitUвs, и отсутствовало вокруг зон роста контрольных штаммов, содержащих исходный вектор, или имеющих делецию yitUвs, что подтверждает наше предположение о повышенном накоплении рибофлавина при сверхэкспрессии уии. Кроме того, размер гало вокруг штамма с наибольшей 5'-нуклеотидазной активностью, BsДyutF (pMWAL1-PyiШвa-yitUвs), был максимальным.

1 2 3

4 5 6

Рисунок 42. Эксперимент с образованием гало роста штамма-ауксотрофа по рибофлавину, В. яиЫШя 168 Дг/Ь, на минимальной среде в присутствие штаммов: 1. ВеДуи1Р, 2. ВеДуи1Р Ди, 3. ВеДуи^ (pMWAL1), 4. ВеДуи1Р (pMWAL1-yitUвs), 5. ВеДуи^ (pMWAL1-yitUвa), 6. ВеДуи^ (pMWAL1-PyitUвa-yitUвs). Подробное описание эксперимента в «Материалах и методах».

Прямым доказательством повышенного накопления рибофлавина в супернатантах штамма ВбС+ (pMWAL1-PyitUвa-yitUвs) послужил LC-MS/MS анализ (Рисунок 43, стр.93). В ходе анализа показали, что в супернатантах штаммов ВбС+ (pMWAL1) и ВбС+ (pMWAL1-Ру1Шва-у1Швз) действительно присутствует рибофлавин, причём его концентрация в 20 раз выше для штамма ВбС+ (pMWAL1-PyitUвa-yitUвs), чем для контрольного штамма ВбС+ (pMWAL1).

Рисунок 43. LC-MS/MS хроматограммы переходов предшественник-продукт. 377—243, 377—198, 377—172, 377—^117 и 377—99 для стандартов рибофлавина в растворе (0,45 мг/л) (Стандарт рибофлавина) и 10-ти кратно разведенных культуральных жидкостей штаммов BsC+ (pMWAL1) и BsC+ (pMWAL1-PyitUвa-yitUвs).

Исследование кинетики накопления рибофлавина штаммами вбС+ с различными конструкциями, содержащими гены yitUвs и yitUвa, а также штамма ввС+Ди, также подтвердило, что экспрессия гена yitU в штамме дикого типа вбС+ приводит к повышенному накоплению рибофлавина в среде. Штамм дикого типа, штамм с делецией гена yitU (ввС+Ди) и штамм вбС+, содержащий вектор pMWAL1, не накапливали рибофлавин до детектируемого с помощью HPLC уровня (Рисунок 44, стр. 94 и Таблица 13, стр. 94). Штаммы вбС+, содержащие плазмиды pMWAL1-yitUвs, pMWAL1-yitUвa и pMWAL1-PyitUвa-yitUвs, накапливали от 1 до 5 мг/л рибофлавина (Рисунок 44 и Таблица 13). Экспрессия гена yitUвs под контролем промотора yitUвa приводила почти к пятикратному увеличению накопления рибофлавина по сравнению с накоплением в штамме, где ген yitUвs находился на плазмиде под собственным промотором (Рисунок 44 и Таблица 13).

4

ВБС+ (pMWAL1-PyitUBa-YitUBs)

24

48

Время (ч)

72

96

BsC+ (pMWAL1-yitUBa)

BsC+ (pMWAL1 -yitUBs)

BsC+

BsC+ ЛU

BsC+ (pMWAL1)

Рисунок 44. Влияние сверхэкспрессии генов и у^иВа на накопление рибофлавина в штаммах дикого типа ВбС+. Показаны средние значения трёх независимых экспериментов и стандартные отклонения.

5

3

2

1

0

0

Таблица 13. Накопление биомассы и рибофлавина в штаммах ВвС+ и его производных.

Штамм OD600 96 ч Рибофлавин, мг/л 96 ч

ВэС+ 0,4 < 0,1

ВэС+Ди 0,5 < 0,1

ВэС+ (pMWAL1) 1,2 < 0,1

ВэС+ (pMWAL 1 -yitUвs) 1,2 1,1 ± 0,1

ВэС+ (pMWAL1-yitUвa) 0,9 2,4 ± 0,1

ВэС+ (pMWAL 1 -PyitUвa-yitUвs) 0,8 5,0 ± 0,1

Концентрацию рибофлавина определяли как описано в разделе «Материалы и методы». Показаны средние значения трёх независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

4.2.5.2. Делеция гена уЫи снижает накопление рибофлавина, а сверхэкспрессия гена приводит к увеличению продукции этого метаболита у штамма Y25

Дальнейшее исследование влияния делеции и сверхэкспрессии гена уОи на накопление рибофлавина продолжили в соответствующем штамме-продуценте рибофлавина В. subtШs У25. Этот штамм способен накапливать рибофлавин из-за повышенной экспрессии генов пуринового синтеза, сверхэкспрессии генов рибофлавинового оперона, а также за счёт сниженной активности рибофлавин киназы, кодируемой геном ггЬС1.

Инактивация гена yitU в штамме У25 снизила как накопление рибофлавина, так и скорость потребления глюкозы, но немного увеличила накопление биомассы (Рисунок 45, А, Б). Напротив, экспрессия генов yitUвs и у^Ша в составе плазмид pMWAL1-yitUвs и pMWAL1-yitUвa, соответственно, привела к увеличению накопления рибофлавина и

к небольшому увеличению потребления глюкозы в штамме Y25 (Рисунок 45, Г).

Положительный эффект сверхэкспрессии yitU на накопление рибофлавина можно объяснить несколькими факторами: 1) активацией одного из этапов биосинтеза флавинов de novo (а именно, дефосфорилирование ARPP), 2) повышенной конверсией FMN в рибофлавин, что приводит к снижению внутриклеточного пула FMN (Рисунок 5, стр. 19), и 3) усилением экспрессии генов биосинтеза рибофлавина в результате снятия негативной регуляции FMN.

А.

Б.

Y25

Y25AU

1,5

2 I

о ° 1

<а 1

о" О

0,5

12 10

8 с

6 g о

iC

4 1

0 24 48 72 96 120 144 168 192 Время, ч

120 100

ц

Т= 80 г

I 60

га

f 40

ю

S

20 0

Y25

Y25AU

24 48 72 96 120 144 168 192 Время, ч

В.

Y25 (pMWAL1) Y25 (pMWAL1-yitUBs) Y25 (pMWAL1-yitUBa)

1,5

2 I

§ 1 со

о" О

0,5

0 24 48 72 96 120 144 168 192 Время, ч

Г.

120

5 100 2

£ 80

s

m

S 60 ■fr

о

Ю 40 Q.

20 0

Y25 (pMWAL1) Y25 (pMWAL1 -yitUBs) Y25 (pMWAL1 -yitUBa)

0 24 48 72 96 120 144 168 192 Время, ч

2

0

0

2

0

Рисунок 45. Влияние делеции гена у1Ю (А, Б) и его сверхэкспрессии (В, Г) на рост клеток, потребление глюкозы (пунктирные линии) (А, В) и накопление рибофлавина (Б, Г) в штамме-продуценте Y25. Показаны средние значения трёх независимых экспериментов и стандартные отклонения.

4.2.6. Эффект делеции и сверхэкспрессии yitU на продукцию пуриновых нуклеозидов и AICAR

Исследование биохимических характеристик YitUBs показало, что этот белок проявляет активность в отношении нуклеозид монофосфатов. Можно предположить, что повышение такой активности приведёт к внеклеточному накоплению их дефосфорилированных производных, нуклеозидов. Поэтому были изучены эффекты инактивации и сверхэкспрессии гена yitU в модельных продуцентах пуриновых нуклеозидов и AICAR.

В качестве таких продуцентов выбрали штаммы AJ1991 и его производный штамм AJ1991purH::spc, соответственно. Первый штамм является продуцентом HxR и GR и может также накапливать небольшие количества других пуриновых нуклеозидов, XR (ксантозин) и AICAR. Второй штамм благодаря инактивации гена purH и нарушенному превращению AICAR-P в IMP является продуцентом AICAR.

4.2.6.1. Делеция yitU снижает накопление пуриновых нуклеозидов и AICAR, а сверхэкспрессия гена приводит к увеличению продукции этих метаболитов у штамма AJ1991

Для проверки влияния инактивации гена уиива на накопление продукции в модельном штамме-продуценте ЛЛ991, получили соответствующий штамм, на хромосоме которого удалён собственный ген уОи. С полученным штаммом AJ1991 AyitU и с контрольными штаммами проводили стандартную пробирочную ферментацию, которая показала, что делеция гена уии приводит почти к полному блокированию накопления пуриновых нуклеозидов, инозина и гуанозина (Таблица 14).

Таблица 14. Влияние инактивации и сверхэкспрессии гена yitU на накопление HxR, GR и AICAR в штамме-пр

родуценте AJ1991.

Штамм HxR, г/л GR, г/л AICAR, г/л

AJ1991 3,25 ± 0,39 1,35 ± 0,39 < 0,01

AJ1991 AyitU 0,22 ± 0,01 0,19 ± 0,00 < 0,01

AJ1991(pMWAL1) 2,58 ± 0,22 2,13 ± 0,23 0,014 ± 0,05

AJ1991 (pMWAL 1 -yitUBa) 3,49 ± 0,11 1,90 ± 0,06 1,90 ± 0,17

Показаны средние значения трёх независимых экспериментов ± стандартное отклонение

Сверхэкспрессия гена уии имела в штамме AJ1991 обратный эффект: плазмидный штамм AJ1991 (pMWЛL1-yitUвa) накапливал заметно больше HxR, ЛICЛR и XR чем контрольный штамм содержащий вектор, AJ1991 (pMWAL1) (Таблица 14).

4.2.6.2 Делеция yitU снижает накопление AICAR в среде, а сверхэкспрессия гена приводит к увеличению продукции этого метаболита в соответствующем штамме-продуценте

В разделе 4.2.4.5 (стр. 87) мы показали, что, реакция с AICAR-P в качестве субстрата характеризовалась положительной кооперативностью с коэффициентом Хилла 1,83 ± 0,15. Можно предположить, что положительная кооперативность фермента при гидролизе AICAR-P может позволить клетке адаптироваться к условиям, в которых пул AICAR-P сильно увеличивается.

Чтобы проверить эффект делеции и сверхэкспрессии yitU в этих условиях, мы использовали штамм-продуцент AICAR из лабораторной коллекции, AJ1991purH::spc, у которого усилен путь биосинтеза пурина de novo, а также вследствие инактивации гена purH нарушена конверсия AICAR-P в IMP. Внесением в него делеции yitU получили штамм AJ1991purH::spc AyitU (AJAU). Затем в штаммы AJ1991purH::spc и AJAU перенесли вектор pMWALl и плазмиды для экспрессии генов yitUBs и yitUBa, pMWALl-yitUBs и pMWALl-yitUba, соответственно. С полученными штаммами проводили пробирочную ферментацию, в которой каждые 12 часов снимали пробы и измеряли рост клеток, потребление глюкозы и накопление AICAR. Делеция гена yitU привела к практически полному прекращению накопления AICAR, а также снизила уровень потребления глюкозы штаммом AJAU (Рисунок 46, А, Б). Это может быть объяснено тем, что штамм перестал синтезировать пурины, и глюкоза использовалась только для роста и поддержания клеток.

А.

Б.

AJ1991purH::spc AJAU

AJ1991purH::spc AJAU

25

70 60 50

40 «в

S £2

30 % g

С < 20 i-

10 0

0 12 24 36 48 60 72 Время, ч

1

0 12 24 36 48 60 72 Время, ч

4

3

0

В.

Г.

АЛ991ригН::врс (pMWAL1) АЛ991ригН::врс (pMWAL1-yitUBa) AJAU (pMWAL1-yitUBa)

25 20

2

1 15

о о со

□10

О

5

* У т Ж Т

/г -а

70

60 50

С

40^ «

30 8 20 2

1010 -10

12

24 36 48 Время, ч

60 72

АЛ991ригН::врс (pMWAL1) АЛ991ригН::врс (pMWAL1-yitUBa) AJAU (pMWAL1-yitUBa)

= 3

ас <

О 2 <С

1

12 24 36 48 Время, ч

60

72

5

4

0

0

0

0

Рисунок 46. Влияние делеции гена уии (Л, Б) и его сверхэкспрессии (В, Г) на рост клеток, потребление глюкозы (пунктирные линии) (Л, В) и накопление АТСАЯ (Б, Г) в штамме-продуценте АЛ991ршгН:^рс. Показаны средние значения трёх независимых экспериментов и стандартные отклонения.

Таблица 15. Накопление биомассы и АТСАЯ в пробирочной ферментации штаммами АЛ991ршгН:^рс и его

роизводными.

Штамм OD600 72 ч Л1СЛ^ г/л 72 ч

AJ1991pшгH::spc 22,85 2,88 ± 0,064

AJДU 22,04 < 0,01

А11991ршгН:^рс (pMWAL1) 22,87 2,74 ± 0,08

AJ1991pшгH::spc (pMWAL1-yitUвs) 18,33 4,10 ± 0,03

AJ1991pшгH::spc (pMWAL1-yitUвa) 18,60 4,24 ± 0,23

AJДU (pMWAL1-yitUвs) 19,65 3,72 ± 0,07

AJДU (pMWAL1-yitUвa) 18,63 3,53 ± 0,20

Показаны средние значения трёх независимых экспериментов ± стандартное отклонение

Сверхэкспрессия гена у1Шв& в штамме AJДU восстановила накопление АГСАЯ (Рисунок 46, В, Таблица 15). В штамме АЛ991ршгН::вре со сверхэкспрессией гена у1Шв& наблюдали небольшое снижение накопления биомассы при неизменном потреблении глюкозы, но при этом большее накопление АГСАЯ по сравнению с контрольным штаммом АЛ991ршгН::вре (pMWAL1). Кроме того, по сравнению с контрольным штаммом АЛ991ршгН::вре (pMWAL1), штамм со сверхэкспрессией у1Шви демонстрировал снижение накопления биомассы, что, тем не менее, не приводило к снижению скорости потребления глюкозы (Рисунок 46, В), скорее всего, из-за более активного биосинтеза продукта. Такое же влияние на рост, потребление глюкозы и накопление АГСАЯ наблюдалось в штаммах АЛ991ршгН::вре и АЖи и в результате экспрессии генаyitUвs (Рисунок 46, В, Г).

Таким образом, действительно, в штамме AJ1991purH::spc, в котором усилен путь биосинтеза пурина de novo и конверсия AICAR-P в IMP заблокирована, плазмидная экспрессия генаyitU как из B. subtilis (Рисунок 47), так и из B. amyloliquefaciens (Рисунок 46) привела к увеличению накопления продукта гидролиза AICAR-P, AICAR. Инактивация yitU в хромосоме продуцента AICAR, AJ1991purH::spc, практически не повлияла на рост клеток, но снизила продукцию AICAR (Рисунок 46, А, Б), что очевидно привело к внутриклеточному накоплению AICAR-P. Из полученных данных можно предположить, что YitU в B. amyloliquefaciens обеспечивает основную активность, дефосфорилирующую AICAR-P. Резко возросший пул AICAR-P, а также и других нуклеозидов за счёт инактивации yitU в штамме AJAU очевидно и приводит к подавлению биосинтеза пуриновых соединений de novo (например, по механизму ингибирования конечным продуктом) и, как следствие, к резкому снижению накопления пуринов, о котором сообщалось выше (раздел 4.2.6.1,стр. 96).

А.

Б.

AJ1991purH::spc (pMWALI) AJ1991purH::spc (pMWALI-yitUBs) AJAU (pMWALI -yitUBs)

AJ1991purH::spc (pMWALI) AJ1991purH::spc (pMWAL1-yitUBs) AJAU (pMWALI-yitUBs)

о о со

25

20

15

§ 10

70 60

50 С

40 « о

iC