Поиск генов-мишеней для видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Михеев, Максим Вячеславович

• Михеев, Максим Вячеславович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Михеев, Максим Вячеславович

1. Список используемых сокращений.

2. Введение.

3. Обзор литературы.

3.1. Классические методы видовой идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека.

3.1.1. Морфологические методы.

3.1.2. Биологические методы.

3.1.3. Серологические методы.;.

3.2. Современные подходы к видоспецифичной идентификации вирусов.

3.2.1. Рестрикционный анализ вирусной ДНК.

3.2.2. Полимеразная цепная реакция.

3.2.3. Идентификация ортопоксвирусов с использованием полимеразной цепной реакции.

3.3. Олигонуклеотидные микрочипы.

3.3.1. Методы изготовления микрочипов.

3.3.2. Методы работы с микрочипами.

3.3.3. Практическое применение микрочипов в диагностических целях.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск генов-мишеней для видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах»

Успехи кампании ликвидации оспы в мире, проводившейся Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) с 1958 года, привели к прерыванию трансмиссии вируса натуральной оспы (VARV) у людей. Последний случай оспы в мире был зарегистрирован 26 октября 1977 года. Последующие два года активного поиска не выявили новых очагов инфекции, и в \iae 1980 года ВОЗ объявила, что одержана победа над оспой.

Значение лабораторной диагностики в условиях, когда оспа искоренена, очень высоко. Это объясняется ниже перечисленными фактами.

Во-первых, в природе продолжают свободно циркулировать другие вирусы, относящиеся, как и вирус натуральной оспы, к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae; в том числе патогенные для человека вирус оспы обезьян (MPXV), вирус оспы коров (CPXV), вирус оспы буйволов (BPXV) и непатогенные для человека вирусы эктромелии (оспы мышей) (ECTV), оспы верблюдов (CMLV) и некоторые другие (Bourke and Dumbell 1972; Маренникова и Щелкунов, 1998).

Во-вторых, в связи с прекращением вакцинации людей против оспы, у большинства людей отсутствует иммунитет к ортопоксвирусным заболеваниям. Это позволяет быстрее распространяться и изменяться в сторону большей патогенности в человеческой популяции ранее мало патогенным для человека ортопоксвирусам, типа CPXV и MPXV (Baxby and Bennett, 1997; Breman, 2000; Meyer et al., 1999; Mukinda et al, 1997). В настоящий момент известны примеры подтверждающие возможность такого развития событий: начавшаяся в 1996 г. в Конго и продолжающаяся до сих пор необычно массовая вспышка оспы обезьян среди людей (Mukinda et al, 1997, Hutin et al, 2001); а также известен случай завоза из Африки вируса оспы обезьян в США, когда был инфицирован им 71 человек (Update Weekly CDC, 2003).

В-третьих, известны случаи неправильной идентификации ортопоксвирусов. Например, поначалу вирус оспы обезьян не могли отличить от вируса натуральной оспы(Arita and Henderson, 1976; Marennikova, et al., 1972). Были случаи, когда герпесвирусные инфекции принимали за оспу обезьян (Jezek et al, 1988).

Кроме перечисленного выше вирус натуральной оспы рассматривается как потенциальное биологическое оружие (Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002; Mahy, 2003; Mortimer, 2003), по этой причине в США ввели обязательную вакцинацию определенных групп людей (Cono et al., 2003).

Учитывая вышеизложенное, становится понятным, почему в эпидемиологической ситуации, сложившейся в настоящее время, необходимо располагать такими методами лабораторного исследования, которые бы давали возможность в короткие сроки расшифровать этиологию оспоподобного заболевания.

Из методов лабораторной диагностики наибольшее значение имеют методы быстрой диагностики. В настоящее время значительно возросли требования, предъявляемые к диагностическим методам. Применяемые методы диагностики оспы должны обладать помимо быстроты ответа, высокой чувствительностью, гарантировать обнаружение вируса в материалах с малым его содержанием, а также обеспечивать дифференциацию близкородственных ортопоксвирусов.

Появление метода амплификации фрагментов ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Bej et al, 1991) создало предпосылки к разработке вариантов процедур экспресс идентификации ортопоксвирусов. Данный метод позволяет проводить детекцию вирусов непосредственно в клинических материалах, для него не требуется какой-либо наработки тестируемого вируса, что особенно важно в случае высокопатогенных штаммов. В настоящее время описаны методы идентификации по генам геммаглютинина (Ropp et al., 1995), белка включения А-типа (Meyer et al., 1997) и белок модифицирующий ответ на цитокины белка (CrmB) (Loparev et al., 2001). Однако во всех работах при анализе расширенных выборок штаммов какого-либо вида ортопоксвирусов часто выявлялась их гетерогенность по спектруполучающихся субфрагментов, что вносило некоторую неоднозначность в трактовку получаемых результатов.

С разработкой техники олигонуклеотидных микрочипов появился новый метод диагностики различных заболеваний и дифференциации видов, основанный на ПЦР с последующей идентификацией гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах. Этот метод, так же как ПЦР, имеет преимущество - возможность обнаружения следовых количеств исследуемого материала в образце. Но в отличие от метода ПЦР микрочиповая технология позволяет анализировать образцы по множеству локусов одновременно, что повышает надежность полученных результатов. Ранее микрочипы для идентификации ортопоксвирусов не применялись.

Цели и задачи исследованияОсновной целью настоящего исследования была разработка вариантов метода видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, гибридизацией ПЦР-фрагментов вирусной ДНК на олигонуклеотидных микрочипах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:1) Подобрать метод выделения ДНК ортопоксвирусов из различных материалов, обеспечивающий эффективное проведение ПЦР на полученных образцах ДНК.

2) Предложить мишени для создания олигонуклеотидного микрочипа на основании имеющихся в вепеВапк нуклеотидных последовательностей генов ортопоксвирусов.

3) Определить нуклеотидные последовательности генов хемокинсвязывающего белка и а/р-интерферонсвязывающего белка ОПВ для имеющихся в нашей лаборатории штаммов ОПВ.

4) Идентифицировать видоспецифичные отличия в нуклеотидных последовательностях секвенированных ортопоксвирусных генов.

5) Проверить воспроизводимость результатов идентификации ОПВ наолигонуклеотидных микрочипах, разработанных совместно с ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) и Управлением по контролю, за продуктами и лекарствами (Food and Drug Administration - FDA, США).

Научная новизна и практическая ценность работы1. Осуществлен выбор метода выделения ДНК вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов из инфицированных культур клеток, хорионаллантоисных оболочек развивающихся куриных эмбрионов и корочек кожных поражений людей.

2. Совместно с сотрудниками ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) разработан и протестирован олигонуклеотидный микрочип для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов по фрагменту гена СгтВ.

3. Секвенирован ген хемокинсвязывающего белка для 86 штаммов ортопоксвирусов разных видов. На основании компьютерного анализа сделано заключение о возможности видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе.

4. Совместно с сотрудниками FDA (США) разработан и протестирован вариант олигонуклеотидного микрочипа для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов по гену хемокинсвязывающего белка.

5. Секвенирован ген ортопоксвирусного a/ß-интерферонсвязывающего белка для 58 штаммов 6-ти видов ортопоксвирусов. Проведенный компьютерный анализ позволил выявить видоспецифичные различия в структуре данного гена, перспективные для использования в технологии гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе.

Основные положения выносимые на защитуРазработан метод, позволяющий выделять ортопоксвирусную ДНК из инфицированных культур клеток, хорионаллантоисных оболочек куриных эмбрионов и корочек кожных поражений людей в количествах, достаточных для проведения одной ПЦР при наличии в них 5-6 вирионов.

Утверждена методика выделения ДНК из вируса оспы человека и вируса оспы обезьян в условиях лаборатории с биологической безопастностью 4-го уровня. Впервые определены нуклеотидные последовательности ортопоксвирусных генов хемокинсвязывающего белка 86 штаммов и a/p-интерферонсвязывающего белка 58 штаммов. Суммарно было определено 170 т.п.н. Данные секвенирования депонированы в базе данных GenBank.

Для генов СгтВ, хемокинсвязывающего белка и a/p-интерферонсвязывающего белка Выявлены видоспецифичные замены, которые могут быть использованы в качестве мишени для диагностики и видовой идентификации ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе.

Совместно с сотрудниками ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) и FDA (США), разработано 2 олигонуклеотидных микрочипа для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов.

Публикации по теме диссертацииLapa S., Mikheev М., Shchelkunov S., Mikhailovich V., Sobolev A., Blinov V., Babkin I., Guskov A., Sokunova, Zasedatelev A., Sandakhchiev L., and Mirzabekov A. 2002. Species identification of orthopoxviruses on oligonucleotide microchip. J. Clin. Microbiol., V. 40., N 3., P. 753-757.

Михеев M.B., JIana С.А., Щелкунов C.H., Чикова А.К., Михайлович В.М., Соболев А.Ю., Бабкин И.В., Грядунов Д.А., Булавкина М.А., Гуськов А.А., Сокунова Е.Б., Кочнева Г.В., Блинов В.М., Сандахчиев JI.C., Заседателев А.С., Мирзабеков А.Д. 2003. Видовая идентификация ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах. Вопр. Вирусологии, Т. 48., С. 4-9.Laassri М., Chizhikov V., Mikheev М., Shchelkunov S., Chumakov К. 2003. Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. J. Virol. Methods., V. 112(1-2)., P. 67-78.

Михеев M.B., Фещенко M.B., Щелкунов C.H. 2004. Филогенетический анализ гена хемокинсвязывающего белка ортопоксвирусов. Мол. Генетика, Микробиол. Вирусология, Т. 1., С. 29-36.Mikheev M.V., Feschenko M.V, Shchelkunov S.N. Comparative study of the Orthopoxvirus genes B19R and B29R. In: 3th Internetional conference on Bioinformatics of genome regulation and structure, July 14-20,2002, Novosibirsk, Russia. P. 13-15.Shchelkunov S.N., Babkin I.V., Mikheev M.V., Gileva I.P., Ryazankin I.A., Totmenin A.V., Nepomnyashchikh T.S., Feshchenko M.V., Shchelkunova G.A., Sandakhchiev L.S. (2002) Comparison of orthopoxviral virulence factors. In: The World of Microbes. Paris, France. 2002, 27 July-1 August, Abstracts. V-493.Babkin I.V., Mikheev M.V., Feshchenko M.V., Shchelkunov S.N. Phylogenetic analysis of conservative and variable orthopoxvirus genes. In: XlVth International Poxvirus and Iridovirus Workshop. Lake Placid, New York, 2002, Sept. 20-25, P. 96.

Вклад автора. Секвенирование генов хемокинсвязывающего (vCCI) и а/р-интерферонсвязывающего (a/fl-IFNr) белков большого набора штаммов ортопоксвирусов выполнено лично автором. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ортопоксвирусных генов vCCI, a/p-IFNr и СгтВ выполнен лично автором. Автором лично проведен выбор метода выделения ДНК вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов в условиях лаборатории высокой физической защиты, разработана «Методика приготовления ДНК вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян», обеспечившая возможность выделения и выноса в биохимическую лабораторию с уровнем биобезопасности 2 препаратов ДНК вируса натуральной оспы. Создание олигонуклеотидного микрочипа для видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов гибридизацией с последовательностями гена СгтВ осуществлено сотрудниками Центра микрочипов ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) при участии автора. Олигонуклеотидный микрочип для одновременной идентификации ортопоксвирусов и вируса ветряной оспы разработан сотрудниками лаборатории современных методов, FDA (США) при участии автора.

3. Обзор литературы3.1. Классические методы видовой идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека3.1.1. Морфологические методыТяжесть клинического течения, высокая контагиозность заболевания (35-45%), эпидемический характер распространения, летальность, колебавшаяся от 1% в странах Африки и Южной Америки до 45% в странах азиатского субконтинента (Henderson, 1976), а также невозможность в ряде случаев отличить оспу только по клиническим признакам от везикулярных заболеваний, вызываемых вирусами группы герпеса и близкородственными ортопоксвирусами (Bourke and Dumbell 1972; Маренникова и Щелкунов, 1998), явились теми факторами, которые способствовали развитию системы лабораторной диагностики.

Лабораторная диагностика является одним из направлений вирусологии,V,базирующемся на ее успехах и достижениях. В середине XX столетия, лабораторной диагностики вирусных инфекций не существовало вообще и дискутировался вопрос ее необходимости. Это объяснялось тем, что вирусология еще 50-60 лет тому назад не располагала методами, которые бы были достаточно чувствительны и специфичны для индикации различных вирусов. Известным тормозом в развитии этого направления вирусологии являлось также отсутствие специфической противовирусной терапии, что снижало ценность лабораторного подтверждения диагноза заболевания. Между тем, существует много примеров, иллюстрирующих чрезвычайно большую роль, которую сыграла лабораторная диагностика. В странах, неэндемичных по оспе, дифференциальный диагноз кожных везикулярных болезней иногда представлял большие трудности. Поэтому значение своевременной диагностики сыграло огромную роль в быстрой локализации эпидемических очагов завозных вспышек натуральной оспы.

В связи с этим уже на ранних этапах развития вирусологии для целей лабораторной диагностики оспы применяли ряд приемов, позволявших в течение 24 часов после поступления материала в лабораторию, давать ответ о наличии или отсутствии в нем поксвирусов. Среди этих методов наиболее ранним был метод вирусоскопии - обнаружения в материале от подозрительных на оспу больных элементарных телец вируса, названных по имени их описавшего автора - тельца Пашена. Наибольшее признание в России на первых порах получил способ окрашивания вирионов методом серебрения, предложенный М.А. Морозовым (Морозов, 1924). Модифицированный Гиспеном (Gispen, 1952) вариант этого метода входил в число рекомендованных ВОЗ в 1969 году методов диагностики оспы (World Health Organization, 1969). Метод вирусоскопии, хотя и давал большой выигрыш во времени, вследствие простоты, доступности и быстроты получаемого ответа, но его эффективность зависела от вида исследуемого материала. При использовании пустулезной жидкости и, особенно, корок возможность обнаружения вируса, а главное, достоверность получаемых результатов значительно снижалась. Затруднительной является и дифференциация телец Пашена от несколько меньших по размеру телец Арагао - возбудителя ветряной оспы. Вследствие указанных недостатков метод вирусоскопии с начала 70 годов XX века практически не использовался.

Значительно более широкое применение для лабораторной диагностики оспы наихел метод электронной микроскопии (ЭМ). Вирусы были одними из первых биологических объектов, наблюдавшихся с помощью электронного микроскопа. В 1948 году во время эпидемии оспы в Нью-Йорке было показано, что с помощью ЭМ можно расшифровать этиологию кожных везикулярных заболеваний, вызванных покс- и герпес вирусами (Nagler and Rake, 1948). Однако только после разработки метода негативного контрастирования (Brenner and Home, 1959) ЭМ по существу стала использоваться в качестве диагностического метода. Использование этого метода стало возможным благодаря накоплению знаний о морфологии и размерах вирусных частиц. Идентификация ортопоксвирусов может легкобыть осуществлена по характерному строению вириона, имеющего овальную или кирпичеобразную форму и размеры 100-260x100-260x200-390 нм (Bourke and Dumbell 1972). Согласно последним данным, ортопоксвирусы имеют размеры 200x200x250 нм (Muller and Williamson, 1987; Virus Taxonomy, 2000). Существуют три главных структурных компонента поксвирусов: нуклеоид, латеральные тела, ассоциированные с нуклеоидом, и внешняя оболочка. Внешняя оболочка - двойная липопротеидная мембрана толщиной 5 нм. На ее поверхности находятся тубулярные структуры, располагающиеся хаотично. Нуклеоид зрелых частиц имеет двояковогнутую форму, в вогнутых изгибах располагаются латеральные тельца (Muller and Williamson, 1987; Virus Taxonomy, 2000). Морфология нуклеоида одинакова у всех ортопоксвирусов (Muller and Williamson, 1987). В технике негативного контрастирования используется натриевая соль фосфорно-вольфрамовой кислоты, которая проникая внутрь некоторых вирионов, например, в вирионы С-формы, делает видимой их внутреннюю структуру. У вирионов М-формы, не пропускающих внутрьГ ч.краски, негативное контрастирование подчеркивает особенности структуры их поверхности.

Использование ЭМ возможно на любой стадии заболевания, хотя в струпах, как правило, наблюдается больше вирионов, чем при исследовании везикулярной и пустулезной жидкостей, но они более разрушены (Long et al, 1970). Чувствительность этого метода находится в пределах 105 - 107 вирионов на мл (Macrae, 1967) и может быть повышена до 103,5 вирионов предварительной обработкой образца специфическими антителами (Маренникова и др., 1990). Помимо этого, добавление специфических антител позволяет осуществлять видовую дифференциацию ортопоксвирусов и значительно сокращается время, необходимое для просмотра, и повышается достоверность ответа (Marennikova et al., 1988; Маренникова и др., 1990). При сравнении трех методов - ЭМ, реакции преципитации в агаре и выделении вируса на куриных эмбрионах - для обследования различных материалов от 849 больных, наивысший процент положительных находок был при электронной микроскопии (Long et al, 1970; Nakano, 1973). Более высокая чувствительность ЭМ посравнению с выделением вируса на куриных эмбрионах может быть объяснена за счет того, что при ЭМ, в отличие от выделения вируса, было возможно выявление инактивированного вируса.

К дополнительным преимуществам данного метода можно отнести быстроту получаемого ответа: для проведения исследования требуется всего 1,5 — 2 часа. Кроме того эффективность ЭМ, в отличие от метода обнаружения вирусных частиц с использованием светового микроскопа, не зависит от характера материала для исследования (везикулярная, пустулезная жидкости, струпы, соскоб папул) (Мальцева, 1980).

В связи с тем, что диагностическая ценность метода ЭМ была подтверждена рядом исследователей, в 1971 году он стал обязательным диагностическим исследованием, проводимым сотрудничающими центрами ВОЗ в период программы глобальной ликвидации оспы и постэрадикационного эпиднадзора (Fenner and Nakano, 1988).

Сообщая о высокой чувствительности и надежности этого метода быстрой диагностики оспы, большинство исследователей отмечают ряд его недостатков. К числу последних следует отнести необходимость наличия громоздкого и дорогого оборудования, которое может позволить себе не всякая диагностическая лаборатория, и необходимость в высококвалифицированном персонале. При использовании метода ЭМ без обработки специфическими антителами,. отсутствует возможность проводить видовую дифференциацию ортопоксвирусов.

3.1.2. Биологические методыДаже тогда, когда наличие вируса было доказано при помощи выше описанных методов, выделение оспенного вируса оставалось наиболее важным методом диагностики оспы. Для выделения вируса рекомендовались различные процедуры, среди которых инокуляция взятого от больного материала чувствительным животным, инокуляция в культуры клеток и инокуляция в хорионаллантоисную оболочку развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) (Маренникова и др., 1963, 1964). Выделение вируса как методподтверждения позволяет определить его видовую принадлежность начиная с самых ранних стадий инфекции и заканчивая отторжением последнего струпа. Так, известен случай выделения вируса на ХАО РКЭ, зараженных глоточным смывом, взятым на 3-й день болезни от больного, у которого оспа протекала без сыпи (Маренникова и др., 1963).

Спектр чувствительных к ортопоксвирусам тканевых культур практически не ограничен (ВахЬу, 1975; №капо, 1977; Маренникова и др., 1963, 1964). Для.их выделения могут быть использованы однослойные культуры различных первичных и перевиваемых клеток (почечные ткани обезьян, фибробласты эмбрионов человека, диплоидные и перевиваемые линии человека и др.). Метод основан на способности вирусов вызывать цитопатическое действие (ЦГТД). Как и выделение на куриных эмбрионах метод является одним из наиболее чувствительных. Метод выделения вируса из монослоя клеток позволяет получать положительные результаты при исследовании везикулярной, пустулезной жидкости и из струпов больного практически в 100% случаев (исключение составляли образцы, доставленные из жарких стран, для которых положительные результатыполучались в 94% случаев), а также выявлять вирус в образцах, содержащих его в малых количествах (Маренникова и др., 1963; Мальцева, 1980).

Одним из недостатков метода является трудность дифференциации близкородственных ортопоксвирусов. С этой целью был предложен ряд дополнительных приемов, в частности, неспособность вируса оспы обезьян, в отличие от' других ортопоксвирусов, активно репродуцироваться в перевиваемой линии клеток почек эмбриона свиньи применяли для идентификации этого вируса (Маренникова и др., 1971). Для дифференциации ортопоксвирусов в культуре клеток использовали различные маркеры: характер ЦПД, морфология и сроки появления бляшек, а также характер внутриклеточных включений (Маренникова и др., 1964; Гурвич и Маренникова, 1964). Значительно большие возможности дифференциации ОПВ дает метод, основанный на различии ЦПД при изменении температуры, при которой проводили инкубацию. Данный метод позволяет дифференцировать не только различные роды ОПВ, но и VARV minor от major (Гурвич и Маренникова, 1964).

Для дифференциации ортопоксвирусов использовали также различную чувствительность лабораторных животных к этим вирусам. Так, в частности, характер реакции при накожном заражении кроликов позволяет отличить вирус натуральной оспы от вируса осповакцины, оспы обезьян и оспы коров (Маренникова, 1962; Маренникова и Мальцева, 1964).

Общим недостатком всех биологических методов, включающих в себя выделение вируса на ХАО, культурах клеток и чувствительных животных, является получение положительных результатов в лучшем случае через 72 часа, а иногда, в случае необходимости подтвердить диагноз, через 6-7 суток (Гурвич и Маренникова, 1964). Это значительно снижало ценность такой лабораторной диагностики этой опасной инфекции.

3.1.3. Серологические методы Методами быстрой диагностики оспы, используемыми на ранних этапах, являются различные серологические реакции с целью обнаружения специфического комплекса антиген-антитело. Методы, основанные на этом принципе, получили название непрямых. Использование этих методов шло по двум направлениям: для обнаружения специфических антител в сыворотках больных и для выявления вирусных антигенов. Для обнаружения и количественной оценки антител применяли различные серологические реакции. Среди наиболее часто употребляемых, классических, - реакция нейтрализации вируса, при которой специфические антитела блокируют характерный эффект, вызываемый вирусом в соответствующей биологической системе. К таким реакциям относятся:- Реакция связывания комплемента (РСК), при которой комплекс антиген-антитело адсорбирует комплемент и тем самым задерживает гемолиз бараньих эритроцитов;- Реакция торможения гемагглютинации (РТГА), при которой антитела, соединяясь с вирусом, предотвращают агглютинацию эритроцитов кур, вызываемую рядом ортопоксвирусов. Этот метод позволяет в большинстве случаев дифференцировать натуральную оспу от осповакцины по значительно превосходящим титрам антигемагглютининов (АГА) (Маренникова и Щелкунов, 1998). В ходе наблюдений было установлено, что максимальные титры АГА отмечались, как правило, на 10-15 день болезни, после чего наблюдалось их постепенное снижение. Благодаря простоте и доступности этот метод использовали для серологических обследований людей и животных, в частности, в исследованиях по выявлению вирусов оспы обезьян и оспы коров (Jezek and Fenner, 1988). В 1981-1983 годах было проведено серологическое обследование населения ряда Африканских стран, в ходе которого производилась сравнительная оценка различных методов выявления антител к ортопоксвирусам. В этом исследовании было показано, что РТГА значительно уступает по чувствительности реакции нейтрализации и иммуноферментному анализу(ИФА), для которых в 15% и 19% случаев, соответственно, были обнаружены антитела при отрицательном результате в РТГА.

Методы РСК и РТГА не отвечали требованиям, предъявляемым к методам быстрой диагностики. Так, наличие антикомплементарных факторов в везикулярной, пустулезной жидкостях и суспензии корок от больного делало невозможным, в ряде случаев, использование РСК. Что касается РТГА, то этот тест не являлся, по существу, методом быстрой диагностики, так как имел диагностическую ценность только при обнаружении не менее, чем четырехкратного нарастания титра антигемагглютининов в сыворотках больного, полученных с интервалом не менее 5-7 дней (Мальцева, 1980).

Значительно более обнадеживающие результаты, по сравнению с РСК и РТГА, были получены при использовании для диагностики оспы реакции микропреципитации в агаре (РМПА) (Маренникова и Мальцева, 1961). Существует несколько модификаций.данного метода. Прямая постановка метода основана на образовании в агаровом геле зон преципитации при взаимодействии вирусного антигена со специфической сывороткой (Маренникова и Мальцева, 1961). Ранее его широко использовали в диагностической практике в комплексе с другими методами. Однако, несмотря на методическую простоту, его существенным недостатком, является его более низкая чувствительность, по которой он значительно уступает классическим методам диагностики оспы; кроме того, при использовании этого метода иногда получаются ложноположительные результаты.

Известно, что РМПА в ее обычной постановке не дает возможности четко дифференцировать наиболее важные с практической точки зрения ортопоксвирусы: вирусы натуральной оспы, оспы обезьян и осповакцины. Значительно более четкие результаты в РМПА были получены с серией антивидовых гипериммунных кроличьих сывороток. В этом тесте серологическая неидентичность вируса устанавливалась при неполном слиянии полос преципитации и образовании «шпор» (Рис. 1). Как видно на рис. 1, помимо антигенов, которые являются общими для исследуемых вирусов (слияние полос преципитации), каждыйиз них имеет специфические антигены, образующие «шпоры». Эти результаты послужили предпосылкой для возникновения двухступенчатой РМПА. а также РМПА с моноспецифичными сыворотками. Таким образом, появились модификации метода РМПА. которые с успехом использовали для выявления специфичных для вирусов натуральной оспы, оспы обезьян и осповакцины антигенов в течение 24 часов. Чувствительность данных методов не отличается от чувствительности обычной РМПА. внутригрупповая дифференциация близкородственных ОПВ возможна только, если концентрация вируса в исследуемом материале довольно высока и составляет не менее 104 ООЕ/мл (Мальцева, 1980).

Рис. 1. Реакция неполной антигенной идентичности вирусов натуральной оспы и осповакцины, выявляемая в РМПА. Верхняя лунка - гипериммунная антносповакцинная кроличья сыворотка. Левая лунка - вирус осповакцины (штамм ЭМ-63). Правая лунка - вирус натуральной оспы (штамм Harvey). Стрелкой показана «шпора» образующаяся при неполной преципитации (Мальцева, 1980).

В начале 70-х годов был разработан диагностический препарат для выявления поксвирусов в реакции непрямой гемагглютинации (PHI"А). Этот препарат состоял из бараньих эритроцитов, нагруженных специфическими lgG-антителами. Тестирование этого метода на материалах от больных, подозрительных на заболевание натуральной оспой, показала его высокую чувствительность и специфичность, значительно выше РМПА (Носков и др., 1972). Па основании этих наблюдений метод РИГА был внесен в «Инструкцию по лабораторной диагностике оспы». В ходе программы глобальной ликвидации оспы данныйметод был использован в качестве метода быстрого обнаружения оспенного антигена (Носков и др., 1972). Сравнение результатов, полученных в РНГА, с данными полученными методами выделения вируса на ХАО РКЭ и ЭМ, показало, что только в 70% случаев было получено совпадение результатов. Чувствительность этого теста, могла бы быть выше, если бы не сомнительные реакции, наблюдавшиеся в 18% случаев при исследовании струпов от больных с лабораторно подтвержденной оспенной инфекцией (Мальцева, 1980). Позже эти побочные реакции были эффективно устранены путем предварительной сорбции неспецифических гемагглютининов бараньими эритроцитами (Шелухина и др., 1986). Благодаря относительно высокой чувствительности и простоте этот тест может использоваться в полевых условиях, например, для диагностики оспы обезьян у людей в эндемических очагах инфекции.

Другим методом, использующимся для быстрой лабораторной диагностики ортопоксвирусных инфекций был, метод иммунофлуоресценции (ИФ) (Авакян и др., 1961). Метод основан на обнаружении комплекса антиген-антитело путем конъюгации молекулы антитела с флуоресцирующими красителями. Использование ИФ с диагностической целью для выявления антигенов ортопоксвирусов давал высокую эффективность при исследовании препаратов, взятых на ранних периодах заболевания (макуло-папулезной и везикулярной жидкостей). Чувствительность ИФ на этих стадиях не отличается от ЭМ, выше,.чем при РНГА и значительно выше, чем в РМПА. Исследования мазков пустулезной жидкости иикорок часто давал недостоверные результаты из-за наличия неспецифического свечения тканевого дебриса лейкоцитов. Применение приема предварительного накопления вируса в чувствительной культуре клеток, хотя и увеличивал время исследования до 16-20 часов по сравнению с 1,5 часа, необходимыми для исследования мазков, делало ИФ приемлемой для исследования материала, полученного на любой стадии заболевания (Гурвич и РойхеЛь, 1965). При этом чувствительность метода не отличалась от таковой для ЭМ и метода выделения вируса на ХАО РКЭ (Мальцева, 1980). Использование различных температурныхгрежимов при инкубации зараженных культур клеток не является достаточно надежным для дифференциации ортопоксвирусов, так как количество и состав очагов клеток с цитоплазматическим свечением и наличие многоядерных клеток в препаратах в значительной степени зависит от концентрации вируса в исследуемом материале (Мальцева,г1980). Проблема частично решалась при использовании моноспецифических антител, которые позволяют проводить дифференциацию близкородственных ортопоксвирусов (Мальцева, 1980). .

Использование пероксидазы в качестве ферментной метки антител позволило упростить метод ИФ. Этот вариант метода получил название иммуноферментного анализа (ИФА). Не отличаясь от ИФ по чувствительности и специфичности, метод обладает целым рядом преимуществ. ИФА легче стандартизировать, так как легко избежать использования специфических ферментных коньюгатов путем применения комплекса пероксидаза — антипероксидаза. Окрашенные препараты долго хранятся и возможно применение как световой, так и электронной микроскопии.В отличие от ИФ метод не давал неспецифического окрашивания лейкоцитов, хотя примесь крови в препаратах затрудняла интерпретацию результатов, так как эритроциты содержат эндогенные пероксидазы (МальцеваГ1980).

Модификация метода ИФА, использующая адсорбированные на пластинах антитела получила название твердофазного иммуноферментного анализа. Данный метод в отличие от ИФА и ИФ, при исследовании коррк от больных не давал отрицательных или сомнительных результатов. Что касается специфичности твердофазного ИФА, то при исследованиигматериалов от больных ветряной оспой и герпесом зостер ни в одном случае не были получены ложноположительные результаты. По чувствительности этот метод превосходит не только другие методы быстрой лабораторной диагностики оспы, но и самый чувствительный биологический метод — выделение вируса на куриных эмбрионах — так как в нем можно выявлять инактивированный вирус. К другим достоинствам метода относятся:методическая простота, минимальные количества требуемых реагентов, наличие автоматизированных систем для ИФА-анализа и быстрота получаемого ответа: менее 3,5 часов при наличии готовых тест-систем. Дальнейшее усовершенствование этого метода шдо в направлении создания возможности определения видовой принадлежности ортопоксвирусов. С этой целью используются моноспецифические сыворотки или моноклональные антитела к различным видам ортопоксвирусов (Мальцева, 1980).г3.2. Современные подходы. к видоспецифичной идентификации вирусовВ последнее время к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий. Разработка молекулярных методов детекции видоспецифичных отличий основана на следующих основных принципах: ■ ' ■1. Комплементарность нуклеотидных оснований - аденин всегда гибридизуется с гуанином, а тимидин с цитозином;2. При нагревании происходит разъединение цепей ДНК (денатурация);3. При охлаждении происходит восстановление двухцепочечной структуры в соответствии с правилом комплементарное™ нуклеотидов;г4. Расщепление молекулы ДНК может быть достигнуто с помощью специальных бактериальных ферментов - эндонуклеаз, рестрицирующих молекулу ДНК в местах со строго определенной для каждой эндонуклеазы последовательностью нуклеотидов;г5. Искусственный ферментативный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro (ПЦР);6. Фрагменты ДНК в полиакриламидном или агарозном гелях легко разделяются под действием электрического тока; положение фрагментов ДНК при электрофорезе определяется размерами ДНК-фрагментов.

3.2.1. Рестрикционный анализ вирусной ДНКПервый метод идентификации поксвирусов на основе последовательности ДНК состоял в гидролизе ДНК рестриктазой и последующем электрофоретическом разделении образовавшихся фрагментов в агарозном геле. Хотя разные виды ортопоксвирусов по последовательности ДНК имеют высокий уровень гомологии, тем не менее их. можно различить по спектру фрагментов, генерируемых той или иной рестриктазой. (Esposito et al., 1978; Mackett and Archard, 1979; Esposito and Knight, 1985). Однако штаммы ортопоксвирусов, принадлежащие одному виду, могут существенно различаться по спектру рестрикционных фрагментов (Маренникова и др., 1996; Esposit and Knight, 1985), что осложняет использование данного метода для дифференциации ортопоксвирусов.гНедостатком такого анализа является необходимость осуществления препаративной наработки.и высокой очистки образца вируса, что существенно удлиняет время анализа по сравнению с другими методами диагностики^ Поэтому-данный подход не получил широкого — распространения при идентификации поксвирусов.

3.2.2. Полимеразная цепная реакцияПосле открытия в середине 80-х годов XX века принципа ПЦР появилась реальная возможность прямой детекции возбудителей инфекционных заболеваний (Mullis and Falona, 1987; Stoflet et. al, 1988; Шипулин и др., 1998).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. Общая схема ПЦР приведена на рис. 2. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом - ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНКполимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК "с нуля", ей необходима короткая "затравочная" цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды (Mullís and Falona, "1987; Stoflet et. al, 1988).

Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтезагполимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами "затравочной" ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров "узнавать" строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности (Mullís and Falona, 1987; Stoflet et. al, 1988).

В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые "ограничивают" амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК' нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов (см. Рис. 2А):

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Михеев, Максим Вячеславович

7. Выводы

1) Впервые определены нуклеотидные последовательности гена хемокинсвязывающего белка (уСС1) для 86 штаммов и гена а/р-интерферонсвязывающего белка (а/р-1РМг) для

58 штаммов шести видов ортопоксвирусов. Расшифрованные последовательности депонированы в базе данных ОепВапк.

2) В результате компьютерного анализа секвенированных генов уСС1 и №№ выявлены видоспецифичные различия, что позволяет использовать их в качестве мишени для диагностики и видовой идентификации ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе. Впервые разработан олигонуклеотидный микрочип и показана возможность диагностики ортопоксвирусов по гену хемокинсвязывающего белка, специфичность которой проверена на препаратах ДНК 45 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, осповакцины и оспы мышей (эктромелии).

3) Впервые разработан олигонуклеотидный микрочип для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов при использовании гена СгтВ в качестве мишени,. На препаратах ДНК

59 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, осповакцины доказана надежность и воспроизводимость разработанного метода.

4) В результате проведенного сравнения, предложен метод, позволяющий выделять ортопоксвирусную ДНК из инфицированных культур клеток, хорионаллантоисных оболочек куриных эмбрионов и корочек кожных поражений людей в количествах, достаточных для проведения ПЦР при наличии в исходных образцах 5-6 вирионов.

5) Разработана и утверждена методика выделения ДНК вирусов натуральной оспы и оспы обезьян в условиях лаборатории с уровнем биобезопасности 4 (В5Ь-4) и передачи этой ДНК в лабораторию с уровнем биобезопасности 2 (В5Ь-2).

6. Заключение

В связи с прекращением вакцинации людей против оспы у большинства людей отсутствует иммунитет к ортопоксвирусным заболеваниям. Это позволяет быстрее распространяться и изменяться в сторону большей патогенности в человеческой популяции ранее малопатогенным для человека ортопоксвирусам, таким как CPXV и MPXV (Baxby and Bennett, 1997; Breman, 2000; Meyer et al., 1999; Mukinda et al, 1997). Начавшаяся в 1996 г. в Конго и продолжающаяся до сих пор массовая вспышка оспы обезьян среди людей (Mukinda et al, 1997, Hutin et al, 2001) подтвердила возможность такого развития событий. Более того, в 2003г. зарегистрирована вспышка оспы обезьян среди людей в США (Update Weekly CDC, 2003) и оспы коров среди людей в Бразилии. Кроме всего перечисленного, вирус натуральной оспы рассматривается как потенциальное биологическое оружие (Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002; Mahy, 2003; Mortimer, 2003).

Учитывая вышеизложенное, становится понятным, почему необходимо располагать такими методами лабораторной диагностики, которые бы обладая высокой чувствительностью, давали возможность в короткие сроки расшифровать этиологию оспоподобного заболевания.

Одним из таких методов, появившимся в последнее десятилетие, является метод диагностики различных заболеваний и дифференциации видов, основанный на идентификации посредством гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом. Область применения микрочипов быстро расширяется. В настоящее время микрочипы уже используются для диагностики вирусных и бактериальных инфекций, а.также в поиске наследственных болезней. Использование микрочипов позволяет быстро обнаруживать устойчивых к антибиотикам бактерий. С помощью микрочипов определяют уровень экспрессии генов. Данная работа посвящена разработке метода диагностики ортопоксвирусов гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе.

На пути к достижению этой цели были выбраны методы выделения ДНК из различных типов образцов: Метод Б позволяет выделять ДНК из ХАО РКЭ и жидких образцов в течение 1 ч; Метод В оптимизирован для выделения ДНК из высушенных образцов, таких как высушенная кровь и струпы, полученные от больных оспой, на его выполнение требуется около 2 ч. Количества ДНК, выделенной из 6 вирионов, очищенного в градиенте сахарозы вируса VACV штамма ЛИВП, в образце объемом 50 мкл оказалось достаточным, для надежного получения специфического ПЦР-продукта. Выполненные исследования позволили разработать и утвердить методику выделения ДНК вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян в условиях лаборатории BSL-4.

С целью определения района генома ортопоксвирусов, пригодного для конструирования олигонуклеотидного микрочипа, осуществили поиск в международном банке данных (GeneBank) гена, структура которого известна для наибольшего числа штаммов. На момент поиска это был ген СгтВ, структура которого была известна для 53 различных штаммов ортопоксвирусов, принадлежащих видам: VARV, CPXV, MPXV, VAC, CMLV. С помощью компьютерного анализа последовательности гена СгтВ ортопоксвирусов были выявлены видоспецифичные замены и выбран район для разработки олигонуклеотидного микрочипа.

Используя выровненные нуклеотидные последовательности предложенного локуса гена СгтВ, совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии имени Энгельгардта РАН (г. Москва), были рассчитаны 14 олигонуклеотидных зондов для пяти, участков с видоспецифичными отличиями и был сконструирован олигонуклеотидный микрочип. Специфичность метода была проверена на ДНК 59 штаммов 6-ти различных видов ОПВ. На 16 из 59 использованных образцов ортопоксвирусных ДНК была проверена воспроизводимость результатов гибридизацией на микрочипе в четырех повторах.

С целью увеличения количества локусов, по которым может проводиться идентификация ортопоксвирусов, проведено секвенирование ортопоксвирусных генов хемокинсвязывающего белка и a/p-интерферонсвязывающего белка. Для гена хемокинсвязывающего белка определены последовательности 86 штаммов ОПВ, из них 24 -VARV, 19 - MPXV, 23 - CPXV, 10 - VACV и по 5 штаммов CMLV и ECTV. Для гена а/ринтерферонсвязывающего белка определены последовательности 58 штаммов ОПВ, из них 19 - VARV, 5 - MPXV, 19- CPXV, 8 - VACV, 5 - CMLV и 2 штамма ECTV! Суммарно было, определено 170 т.п.н. Данные секвенирования депонированы в базе данных GenBank.

При проведении компьютерного анализа полученных данных секвенирования выявлены видоспецифичные отличия в нуклеотидных последовательностях генов vCCI и a/ß-IFNr, которые могут быть использованы в качестве мишени при диагностике на олигонуклеотидном микрочипе.

Совместно с сотрудниками FDA (США) по гену vCCI был разработан олигонуклеотидный микрочип, содержащий 48 олигонуклеотидных гибридизационных зондов для видоспецифичной идентификации ОПВ, а также 10 зондов для идентификации вируса варицеллы зостер. Проверка возможности идентификации ОПВ на микрочипе по гену vCCI была проведена на препаратах ДНК 45 штаммов шести различных видов ортопоксвирусов. У всех протестированных ОПВ была правильно определена видовая принадлежность.

Анализ структуры гена a/ß-IFNr ортопоксвирусов выявил видоспецифичные различия, которые потенциально можно идентифицировать при гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе. После экспериментальной проверки данного генетического локуса в качестве мишени для нового варианта олигонуклеотидного микрочипа можно будет создать объединенный микрочип, обеспечивающий одновременный анализ по трем различным генам ортопоксвирусов: CrmB, vCCI и a/ß-IFNr.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Михеев, Максим Вячеславович, 2004 год

1. Авакян A.A., Альтштейн А.Д., Кириллова Ф.М., Быковский А.Ф. 1961. Пути усовершенствования лабораторной диагностики оспы. Вопр. Вирусол., №2., с. 196-200.

2. Бабкин И.В., Петров H.A., Каблова Г.В., Петров B.C., Щелкунов С.Н., Сандахчиев JI.C. 1997. Изучение вариабельности генов A27L и A56R ортопоксвирусов. Докл. РАН., Т.357,№1, С. 117-122.

3. Бароян О.В., Серенко А.Ф. 1961. Вспышка оспы в Москве в 1959-1960 гг. // Журн. микробиол. № 4. С. 72-79.

4. Гаврилова Е.В., Бабкин И.В., Щелкунов С.Н. 2003. Мультиплексный ПЦР- анализ для видоспецифичной экспресс идентификации ортопоксвирусов. Молекурлярная генетика, микробиология и вирусология, Т. 1, С. 45-51.

5. Гурвич Э.Б., Маренникова С.С. 1964. Лабораторная диагностика оспы и сходных с ней вирусных заболеваний с помощью метода тканевых культур. Acta virol. V. 8, p. 435-442.

6. Гурвич Э.Б., Ройхель В.М. 1965. Возможности метода флуоресцирующих антител в диапюсике и дифференциальной диагностике оспы. Acta Virol., т.9, №2., с.165-171.

7. Иванов И.Б., Ершов Г.М., Барский В.Е., Бельговский А.И., Кирилов Е.В., Крейндлин Э.Я., Паринов C.B., Мологина Н.В., Мирзабеков А.Д. 1997. Диагностика генетических мутаций на олигонуклеотидных микрочипах. Мол. Биол., Т. 31., № 1., с. 159-167.

8. Мальцева H.H. 1980. Экспресс-диагностика заболеваний, вызванных ортопокс- и некоторыми герпес вирусами. Дис. Докт. Мед. Наук. 412с.

9. Маренникова С.С. 1962. Материалы по изучению возбудителя, лабораторной диагностике и экстренной профилактике натуральной оспы. Дис. Доктора мед. Наук. 431с.

10. Маренникова С.С., Гурвич Э.Б., Юмашева М.А. 1963. Лабораторная диагностика оспы и сходных с ней вирусных заболеваний с помощью метода тканевых культур. Acta virol., V. 7., р. 124-130.

11. Маренникова С.С., Гурвич Э.Б., Юмашева М.А. 1964. Лабораторная диагностика оспы и сходных с ней вирусных заболеваний с помощью метода тканевых культур. Acta virol. V. 8., p.135-142.

12. Маренникова С.С., Мальцева H.H. 1961. Использование реакции микропреципитации на стекле для лабораторной диагностики натуральной оспы. Вопр. вирусол. Вып.2. С.204-206.

13. Маренникова С.С., Мальцева H.H. 1964. Сравнительное изучение некоторых штаммов вируса вакцины. Сообщение II. Патогенность для лабораторных животных. Вопр. Вирусологии, Т. 3., С. 287-291.'

14. Маренникова С.С., Шелухина Э.М., Гурвич Э.Б. 1971. Идентификация вируса неотличимого от возбудителя натуральной оспы среди обезьян. Вопр. Вирусологии, № 4., с. 470-473.

15. Маренникова С.С., Шелухина-Э.М., Ефремова Е.В. 1984. Новый взгляд на биологию вируса оспы коров. Acta Virol., V. 57., С. 437-444.

16. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. 1998. Патогенные для человека ортопоксвирусы. Москва «КМК Scientific Press Ltd». 386с.

17. Маренникова С.С., Янова H.H., Жукова O.A. 1990. Электронная микроскопия как метод диагностики при эпидемиологическом надзоре за поксвирусными инфекциями. Ж. микробиол. Вып. 8. С. 57-62.

18. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. ,№01-19/52-17. Утв. Госкомсанэпиднадзором 22.06.95.

19. Морозов М.А. 1924. О тельцах Пашена. Врач. Дело., Вып.24-26., С.1449-1450.

20. Носков Ф.С., Маренникова С.С., Конникова P.E. и др. 1972., Применение реакции непрямой гемагглютинации для лабораторной диагностики натуральной оспы. Вопр. Вирусол., № 3., С. 347-351.

21. Певзнер П.А., Лысов Ю.П.; Храпко K.P., Белявский А. В., Флорентьев В. Л., Мирзабеков А.Д. 1991. Оптимальные чипы для мегабазного секвенирования ДНК. Мол. Биол., Т. 25., С. 552 561.

22. Приказ Минздрава РФ № 64 от 21.02.2000 г "Об Утверждении Номенклатуры Клинических Лабораторных Исследований"

23. Шелухина Э.М., Леви М.И., Мацевич Г.Р., Маренникова С.С., Хабахпашева Н.А. 1986.

24. Возможности реакции пассивной гемагглютинации как метода быстрого обнаружения ортопоксвирусов и антител к ним. Вопр. Вирусол., Вып. 6., С.756-750.

25. Шипулин Г. А., Саркисян К. А., Богословская Е. В., Шипулина О. Ю., Воробьева М. С. 1998. Место полимеразной цепной реакции в диагностике ВИЧ-инфекции. Эпидемиология и инфекционные болезни, №5, С. 59-63.

26. Щелкунов С.Н. 1996. Ортопоксвирусный геном: Обзор. Молекуляр. биол., Т.30, №1, С.5-32.

27. Arita I., Henderson D.A. 1976. Vondeypox and whitepox viruses in West and Central Africa. Bull. Wld. Hlth. Org., V. 53., P. 347-353.

28. Bavykin S. G., Akowski J. P., Zakhariev V. M., Barsky V.E., Perov A.N., Mirzabekov A.D. 2001. Portable system for microbial sample preparation and oligonucleotide microarray analysi. Appl. Environ. Microbiol., V. 67., P. 922-928.

29. Baxby D. 1975. Identification and interrelationship of the variola-vaccinia subgroup of poxviruses. Progr. Med. Virol., V. 19., p. 215-246.

30. Baxby D., Bennett M., 1997. Cowpox: a re-evaluation of the risks of human cowpox based on new epidemiological information. Arch. Virol., V. 13 (Suppl.). P. 1-12.

31. Bedson H.S., Dumbell K.R. 1964. Hybrids derived from the viruses of variola major and cowpox. J. Hygiene. V. 62., P. 147-158.

32. Bej A.K., Mahbubani M.H., Atlas R.M. 1991. Amplification of nucleic acids by polymerase chain reaction (PCR) and other methods and their applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., V. 26., P. 301-334.

33. Blanchard A.P., Kaiser R.J., Hood L.E. 1996. High-density oligonucleotide arrays. Biosens. Bioelectron., V. 11., P. 687-690.

34. Blin N, Stafford D.W. 1976. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes. Nucleic Acid Res., V. 3, 2303.

35. Bourke A.T.C., Dumbell K.R. 1972. An unusual poxvirus from Nigeria. Bull. Wld. Hlth. Org., V. 45., p. 621-623.

36. Bowtell D.D. 1999. Options available-from start to fmish-for obtaining expression data by microarray. Nat. Genet. Suppl., V. 21., P. 25-32.v 45. Breman J.G. 2000. Monkeypox: an emerging infection for humans? Eds W.M. Scheld et. al.,

37. Emerging infection 4., ASM Press., Washington D.C., P.45-67.

38. Breman J.G., Henderson D.A. 2002. Diagnosis and management of smallpox. N. Engl. J. Med., V. 346., P. 1300-1308.

39. Brenner S., Home R.W. 1959. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta, V. 34., P. 103-110.

40. Chizhikov V., Wagner M., Ivshina A., Hoshino Y., Kapikian A. Z., Chumakov K. 2002. Detection and genotyping of human group a rotaviruses by oligonucleotide microarray

41. W hybridization. J. Clin. Micr., V. 40., P. 2398 2407.

42. Cono J., Casey C.G., Bell D.M. 2003. Smallpox Vaccination and Adverse Reactions: Guidance for Clinicians. MMWR. V. 52(RR04), p. 1-28.

43. Cronin M.T., Fucini R.V., Kim S.M., Masino R.S., Wespi R.M., Miyada C.G. 1996. Cystic fibrosis mutation detection by hybridization to light-generated DNA probe arrays. Hum. Mutat., V. 7., P. 244-255.

44. Crowther J.R. 2002. The ELISA Guidebook. Methods in Molecular Biology, V. 149. New Jersey: Humana Press, pp. 446.

45. Diehl F., Beckmann B., Kellner N. Hauser N.C., Diehl S., Hoheisel J.D. 2002. Manufacturing DNA microarrays from unpurified PCR products. Nucleic Acid Res., V. 30., No. 16

46. Douglass N.J., Richardson V., Dumbell K.R. 1994. Evidence for recent genetic variation in monkeypox viruses. J. Gen. Virol., V. 75., P. 1303-1309.'

47. Dragon A.D., Spadoro J.P., Madej R. 1993. Quality Control of Polymerase Chain Reaction.

48. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington: ASM Press; pp.160.

49. Duggan D.J., Bittner M., Chen Y., Meltzer P., Trent J.M. 1999 Expression profiling using cDNA microarrays. Nat. Genet. Suppl., V. 21., P. 10-14.

50. Dumbell K.R. Huq F. 1986. The virology of variola minor. Correlation of laboratory tests with ^ the geographic distribution and human virulence of variola isolates. Amer. J. Epidemiol., V.123., P. 403-415.

51. Esposito J.J., Knight J.C. 1985. Orthopoxvires DNA: A comparison of restriction profiles and maps. Virology., V. 143., №. 1., P. 230-251.

52. Esposito J.J., Obijeski J.F., Nakano J.H. 1978 Orthopoxvirus DNA: strain differentiation by electrophoresis of restriction endonuclease fragmented virion DNA. Virology., V. 89., P.53-66.

53. Fenner F. 1958. The biological characters of several strain of vaccinia, cowpox, and rabbitpox viruses. Virology., V. 5., P. 502-509.

54. Fenner F., Nakano J.H. 1988. Poxviridae.// Laboratory Diagnosis of Infection Diseases: Principles and Practices (E.H.Lennette, P. Halonen, F.A. Murphy, eds.). V.2. Viral, rickettsial and chlamydial diseases. Chapter 10. New York: Springer Verlag.

55. Fodde R., Losekoot M. 1994. Mutation derection by denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE). Hum. Mutat., V. 2., P. 404-414.

56. Fodor S.P.A., Read J.L., Pirrung M.C., Stryer L., Lu A.T., Solas D. 1991. Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis. Science, V. 251., P. 767-773.

57. Fotin A.V., Drobyshev A.L., Proudnikov D.Y., Perov A.N., Mirzabekov A.D. 1998. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic. Acids Res.,V. 6., P. 1515-1521.

58. Gillespie D., Spiegelman S. 1965. A quantitative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane. J. Mol. Biol. V. 12., P. 829-842.

59. Gispen R. 1952. Silver impregnation of smallpox elementary bodies after treatment of xylol. Antonia v. Lecuwenhoek. J. Microbiol. Serol., V.19., P.157-165.

60. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. 1990 The complete DNA sequence of vaccinia virus. Virology., V. 179., P. 247-266.

61. Gunderson K.L., Huang X.C., Morris M.S., Lipshutz R.J., Lockhart D.J., Chee M.S. 1998. Mutation detection by ligation to complete n-mer DNA arrays. Genome Res., V. 8., P. 11421153.

62. Guschin D., Yershov G., Zaslavsky A. 1997. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA, and protein microchips. Anal. Biochem., V. 250., P.203-211.

63. Hacia J.J., Edgemon K., Fang N., Mayer R.A., Sudano D., Hunt N., Collins F.S. 2000. Oligonucleotide microarray based detection of repetitive sequence changes. Hum. Mutat., V. 16., P. 354-363.

64. Hall T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucl. Acids. Symp. Ser., V. 41., P. 95-98.

65. Head S. R., Rogers Y., Parikh K., Lan G., Anderson S., Goelet P., Boyce-Jacino M. T. 1997. Nested genetic bit analysis (N-GBA) for mutation detection in the p53 tumor suppressor gene. NAR., V. 25., P. 5065 5071.

66. Heller R. A., Schena M., Chai A., Shalon D., Bedilion T.,' Gilmore J., Woolley D. E., Davis R. W. 1997. Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 94, P. 2150-2155.

67. Henderson D.A., 1976. The eradication of smallpox. Scientific American., V. 235., №4., p.25-35.

68. Jeannmougin F., Thompson J.D., Gouy M., Higgins D.G., Gibson,T.J. 1998. Multiple sequence alignment with Clustal X. Trends Biochem. Sci., V. 23, P. 403-405.

69. Jezek Z., Fenner F. 1988. Human Monkeypox. // Monographs in Virology. V.17 (Melnick J.L., ed.) Basel-Munchen Paris-London-New York-New Delhi-Singapore-Tokyo-Sydney:1. Karger. 140 pp.

70. Jezek Z., Szczeniowski M., Paluku K.M., Mutombo M., Grab B. 1988. Human monkeypox: confusion with chickenpox. Acta .Tropica, V. 45., P. 297-307.

71. Kane M.D., Jatkoe T.A., Stump C.R., Lu J., Thomas J.D., Madore S.J. 2000. Assessment of the sensitivity and specificity of oligonucleotide (50mer) microarrays. Nucleic Acids Res. V.28., №. 22., P. 4552-4557.

72. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B., Nei M. 2001. MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software. Arizona State University Tempe. Arizona.

73. Li J., Chen S., Evans D.H. 2001. Typing and Subtyping Influenza Virus Using DNA Microarrays and Multiplex Reverse Transcriptase PCR. J. Clinical Microbiol., V. 39., P. 696704.

74. Lipshutz R.J., Fodor S.P.A., Gingeras T.R., Lockhart D.J. 1999. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat. Genet. Suppl., V. 21., P. 20-24.

75. Long G.W., Noble J., Murphy F.A., Herrmann K.L., Lourie B. 1970. Experience with electron microscopy in the differential diagnosis of smallpox. Appl. Microbiol., V. 20., P. 497 504.

76. Loparev V.N., Massung R.F., Esposito J.J., Meyer H. 2001. Detection and differentiation of old world orthopoxviruses: restriction fragment length polymorphism of the crmB gene region. J. Clin. Microbiol., V. 39., P. 94-100.

77. Lusso P. 2000. Chemokines and viruses: The Dearest enemies. Virology., V. 273., P. 228-240.

78. Mackett M., Archard L.C. 1979. Conservation and variation in orthopoxvirus genome structure. J. gen. Virol., V. 45., P. 683-701.

79. Macrae A.D. 1967. Laboratory diagnosis of smallpox. Mon. Bull. Min. Public Health Lab. Serv.,V. 26, P. 189-191.

80. Mahy B.W.J. 2003. An overview on the use of a viral pathogen as a bioterrorism agent: why smallpox? Antiviral Research, V. 57., P.l-5.

81. Marennikova S.S., Nagieva F.G., Matsevich G.R., Shelukhina E.V., Khabahpasheva N.A., Platonova G.M. 1988. Monoclonal antibodies to monkeypox virus: preparation and application. Acto Virol., V. 33., P. 246-253.

82. Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Malceva N.N. et al. 1972. Isolation and properties of the casual agent of a new variola like disease (mankeypox) in man. Bull. Wld. Hlth. Org., V. 46., p. 599-611.

83. Marmur J., Doty P. 1961. Thermal renaturation of deoxyribonucleic acids. J. Mol. Biol. V. 3., P. 585-594.

84. Massung R.F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran T.E., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. 1994. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain, Bangladesh-1975. Virology, V. 201., P. 215-240.

85. Matson R.S., Rampal J., Pentoney S.L., Anderson P.D., Coassin P. 1995. Biopolymer synthesis on polypropylene supports: oligonucleotide arrays. Anal. Biochem., V. 224., P. 110116.

86. Meyer H., Neubauer H., Pfeffer M. 2002. Amplification of 'variola virus-specific' sequences in German Cowpox virus isolates. Journal of Veterinary Medicine, V. 49., P. 17-19.

87. Meyer H., Pfeffer M., Rziha H.J. 1994. Sequence alteration within and downstream of the Atype inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. J. gen. Virol. V. 75., P. 89-101.

88. Meyer H., Ropp S.L., Esposito J.J. 1997. Gene for A-type inclusion body protein is useful for a polymerase chain reaction assay to different ortholpoxviruses. J. Virol. Meth., V. 64., P. 217-221.

89. Meyer H., Schay C., Mahnel H., Pfeffer M. 1999 Characterization of orthopoxviruses isolated from man and animals in Germany. Arch Virol., V. 144., P. 491-501.

90. Milner N., Mir K.U., Southern E.M. 1997. Selecting effective-antisense reagents on combinatorial oligonucleotide arrays. Nat. Biotech." V. 15., P. 537-541.

91. Mortimer P.P. 2003. Can Postexposure Vaccination against Smallpox Succeed? Clinical Infectious Diseases, V. 36, P.622-629.

92. Mukinda V. В., Mwema G., Kilundu M., Heymann D.L., Khan A.S., Esposito J.J. 1997. Re-emergence of human monkeypox in Zaire in 1996. Lancet., V. 349., P. 1449-1450. .

93. Muller G., Williamson J.D. 1987. Poxviridae. / In: Animal virus structure. Perspectives in Medical Virology (Eds. Nermut M.V., Steven A.C.). Elsevier. Amsterdam-New York-Oxford., V. 3., P. 421-433.

94. Mullis K.B., Faloona, F. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzymol., V. 155., P. 335-350.

95. Murray A. E., Lies D., Li G., Nealson K., Zhou J., Tiedje J. M. 2001. DNA/DNA hybridization to microarrays reveals gene-specific differences between closely related microbial genomes. PNAS, V. 98., P. 9853 9858:

96. Nagler F.P.O., Rake G. 1948. The use of electron microscope in diagnosis of variola, vaccinia and varicella. J. Bacteriol., V. 55.', №. 1., P.45-51.

97. Nakano J.H. 1973. Evaluation of virological laboratory methods for smallpox diagnosis. Bull. Wld. Hlth. Org., V. 48., P. 529-534.

98. Nakano J.H. 1977. Comparative diagnosis of poxvirus diseases. In: Kurstak E.(ed.) Comparative diagnosis of viral diseases. New York Acad. Press., V. 1. Human and related viruses., part 1., p. 287-339.

99. Nei, M., Kumar S. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University.Press. - New York.-2000.-333 pp.

100. Neubauer H., Pfeffer M., Meyer H. 1997. Specific detection of mousepox virus by polymerase chain reaction. Laboratory Animals, V. 31., P. 201 -205.

101. Neubauer H., Reischl U., Ropp S., Esposito J.J., Wolf R, Meyer H. 1998. Specific detection of monkeypox virus by polymerase chain reaction. J. Virological Methods, V. 74., P. 201-207.

102. Newton C.R., Graham A. 1996. PCR. Oxford: Bios Scientific Publishers., p. 18.

103. Nygaard A. P., Hall. B. D. 1964. Formation and properties of RNA-DNA complexes. J. Mol. Biol. V. 9., P. 125-142.

104. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Sekya T. 1989. Detection of polymorphism of heman DNA by gel electorphoresis as single cell conformation polymorphism. Proc. Natl. Acad. Sci., V. 86., P. 2766-2770.

105. Parinov S., Barsky V., Yershov G., Kirillov E., Timofeev E., Belgovskiy A., Mirzabekov A. 1996. DNA sequencing by hybridization to microchip octa- and decanucleotides extended by stacked pentanucleotides. NAR., V. 24., P. 2998 3004.

106. Patel A.H., Gaffney D.F., Subak-Sharpe J.H., Stow N.D. 1990. DNA sequence of the gene encoding a major secreted protein of vaccinia virus, strain Lister. J. Gen. Virol., V. 71., P. 2013-2021.

107. Persing D.H, Cimino G.D. 1993. Amplification Product Inactivation Methods. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington: ASM Press, pp.105.

108. Pilaski J., Rosen A., Darai G. 1986. Comparative analysis of the genomes of orthopoxviruses isolated from elephant, rhinoceros, and okapi by restriction enzym es., Brief report. Arch Virol., V. 88., P.135-142.

109. Pilaski J., Rosen-Wolff A. 1988. Poxvirus infection in zoo-kept mammals. Virus Diseases in Laboratory and Captive Animals. Darai, G. ed., P. 83-100

110. Porwollik S., Wong R. M., McClelland M. 2002. Evolutionary genomics of Salmonella: Gene acquisitions revealed by microarray analysis. PNAS, V. 99., P. 8956 8961.

111. Proudnikov D., Timofeev E., Mirzabekov A. 1998. Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manufacture of DNA and DNA oligonucleotide microchips. Anal. Biochem. V. 259., P. 34-41.

112. Pulford D. J., Meyer H., Ulaeto D. 2002. Orthologs of the vaccinia A13L and A36R virion membrane protein genes display diversity in species of the genus Orthopoxvirus. Arch. Virol., V. 147., №5, P. 995-1015.

113. Rampal J.B. 2001. DNA Arrays: Methods and Protocols. V. 170. New Jersey: Humana Press, pp. 264.

114. Ropp S.L., Jin Q., Knight J.C., Massung R.F., Esposito J.J. 1995. PCR strategy for identification and differentiation of smallpox and other orthopoxviruses. J. Clin. Microbiol., V. 33., P. 2069-2076.

115. Rychlik W., Rychlik P. Oligo 6: Primer analysis software. Molecular biology insights. -Connecticut-2000.

116. Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science, V. 270., P. 467-460.

117. Schena M.1999. DNA microarrays: A practical approach. New York: Oxford University Press, pp. 210.

118. Schroder S., Weber J., Pau H. 2001. 50 nucleotide long probes on microarrays enable high signal intensity and high specificity. Genomic Discovery.

119. Shchelkunov S.N., Massung R.F., Esposito J.J. 1995. Comparison of the genome DNA sequences of Bangladesh-1975 and India-1967 variola viruses. Virus Res., V.36,№1, P.107-118.

120. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V.„ Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. 1993. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses. FEBS Lett., V.327,№3, P.321-324.

121. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Loparev V.N., Safronov P.F., Gutorov V.V., Chizhikov V.E., Knight J.C., Parsons J.M., Massung R.F., Esposito J.J. 2000. Alastrim smallpox varioia minor virus genome DNA sequences. Virology., V.266,№2, P.361-386.

122. Sosnowski R.G., Tu E., Butler W.F., O'Connell J.P., Heller M.J. 1997. Rapid determination of single base mismatch mutations in DNA hybrids by direct electric field control. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 94., P. 1119-1123.

123. Southern E.S., Mir K., Shchepinov M. 1999. Molecular interactions on microarrays. Nat. Genet. Suppl. V. 21., P. 5-9.

124. Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoreses. J. Mol. Biol., V. 98., P. 503-517.

125. Spencer R.C., Lightfoot N.F. 2001. Preparedness and response to bioterrorism.' J. Infect., V. 43., P. 104-110.

126. Stoflet E.S., Koeberl D.D., Sarkar G., Sommer S.S. 1988. Genomic amplification with transcript sequencing. Science, V. 239., P. 491-494.

127. Tinsley C.R., Perrin A., Borezee E., Nassif X. 2002. Neisseria microarrays. Methods Enzymol. V. 358., P. 188-207.

128. Update: Multistate Outbreak of Monkeypox — Illinois, Indiana, Kansas, Missouri, Ohio, and Wisconsin, 2003. CDC. MMWR. Weekly. V. 52., P. 642-646.

129. Virus Taxonomy. 2000. Academic press. Seventh report of the international committee on taxonomy of viruses, (ed. Van Regenmortel et al). P.137-157.

130. Volokhov D., Rasooly A., Chumakov K., Chizhikov V. 2002. Identification of listeria species by microarray-based assay. J. Clin. Micr., V. 40., P. 4720 4728.

131. Wallace R.B., Shaffer J., Murphy R.F., Bonner J., Hirose T., Itakura K. 1979. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. V. 6(11)., P. 3543-3557.

132. Wang D., Coscoy L., Zylberberg M., Avila P. C., Boushey H. A., Ganem D., DeRisi J. L. 2002. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. PNAS, V. 99., P. 15687 -15692.

133. Wang R., Beggs M. L., Robertson L. H., Cerniglia C. E. 2002. Design and evaluation of oligonucleotide-microarray method for the detection of human intestinal bacteria in fecal samples. FEMS Microbiol. Lett., V. 213., P. 175 182.

134. Watson J. D., Crick F. H. 1953. Molecular structure of nucleic acids: structure for deoxyribose nucleic acid. Nature V. 248., P. 737-738.

135. Watson J.D. 1968. The double helix. (Norton critical edition. 1980), London: W.W. Norton & Co., pp 298.

136. World Health Organization. 1969. Guide to the laboratory diagnosis of smallpox for smallpox eradication programmes. Geneva: WHO.

137. Yu J., Othman M.I., Faijo R., Zareparsi S., MacNee S.P., Yoshida S., Swaroop A. 2002. Evaluation and optimization of procedures for target labeling and hybridization of cDNA microarrays. Molecular Vision, V. 8., P. 130-137.