Плазмидные характеристики различных сероваров сальмонелл и их применение в системе микробиологического мониторинга при сальмонеллезе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Ковальчук, Наталья Ивановна

• Ковальчук, Наталья Ивановна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ковальчук, Наталья Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Характеристика бактерий рода Salmonella.

1.1. История открытия.

1.2. Классификация.

1.3. Биологическая характеристика сальмонелл.

1.4. Антигенная структура и серологическая идентификация.

1.5. Вирулентность.

Глава 2. Внутривидовое типирование.

2.1. Фенотипические методы внутривидового типирования.

2.1.1. Биотипирование.

2.1.2.0пределение антибиотикограммы.

2.1.3. Фаготипирование.

2.2. Генотипические методы внутривидового типирования.

2.2.1. Плазмидный анализ.

2.2.2. Электрофорез в пульсирующем поле.

2.2.3. Риботипирование.

2.2.4. ПЦР-генетическое типирование.

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Материалы исследования.

3.2. Методы исследования.

Глава 4. Фенотипическая и плазмидная характеристика S. enteritidis в Приморском крае

4.1. Плазмидная характеристика S. enteritidis

4.1.1. Плазмидная характеристика популяции S. enteritidis в различные годы наблюдения

4.2. Фенотипическая характеристика плазмидоваров Б. еШегШсНБ.

4.2.1. Биохимическая активность штаммов Б. егиегШсИз.

4.2.2. Антибиотикорезистентность штаммов 8. егЛегШсНэ.

4.2.2.1. Я-плазмиды штаммов 8. ег^егШсНз.

4.3. Характеристика штаммов Б. егйегШсПз, не содержащих плазмиду вирулентности.

Глава 5. Фенотипическая и плазмидная характеристика 8. 1урЫтигшт в Приморском крае.

5.1. Плазмидная характеристика 1урЫшигшш.

5.1.2. Структурная характеристика плазмиды 60 МОа штаммов Б. 1урЫтипшп, выделенных при зоонозном типе инфекции.

5.1.3. Функциональная характеристика плазмиды 60 МБа штаммов Б. 1урЫтипшп, выделенных при зоонозном типе инфекции.

5.2. Фенотипическая характеристика 8.1урЫтигшт.

5.2.1. Биохимическая активность штаммов 8.1урЫшипиш.

5.2.2. Вирулентность штаммов 1урЫтипит, возбудителей зоонозного и нозокомиального сальмонеллеза

5.2.3. Антибиотикорезистентность штаммов 8.1урЫшигшш.

5.2.3.1. Я-плазмиды штаммов 8.1урЫшигшш.

Глава 6. Фенотипическая и плазмидная характеристика штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл в Приморском крае.

6.1. Характеристика штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл, выделенных в единичном экземпляре.

6.2. Характеристика штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл, представленных несколькими культурами.

Глава 7. Микробиологический молекулярно-генетический мониторинг за возбудителями сальмонеллеза.

7.1. Мониторинг генетического родства штаммов S. enteritidis, на основе рестрикционного анализа криптических плазмид с малой молекулярной массой.

7.2. Мониторинг этиологической значимости плазмидоваров S. enteritidis.

7.3. Установление источников и факторов передачи возбудителей инфекции в процессе микробиологического мониторинга на примере редко выявляемых сероваров сальмонелл.

7.4. Использование плазмидных характеристик в организации микробиологического мониторинга за сальмонеллезами.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Плазмидные характеристики различных сероваров сальмонелл и их применение в системе микробиологического мониторинга при сальмонеллезе»

Заболеваемость, вызванная сальмонеллами, продолжает оставаться актуальной во всем мире. Сальмонеллезы распространены настолько широко, что в настоящее время ни в одной стране мира не стоит вопрос об их ликвидации, а говорят только о снижении уровня заболеваемости и ограничении распространения возбудителя среди основных источников этой инфекции.

Изучение этиологической структуры сальмонеллезов и сероварного пейзажа сальмонелл у людей и животных позволяет решать один из ключевых вопросов эпидемиологии сальмонеллезов - выявить основные источники и факторы передачи возбудителей инфекции.

Микробиологическому мониторингу, как важнейшей части эпидемиологического надзора за сальмонеллезом, всегда уделялось важное внимание. Обычно для типирования возбудителей сальмонелл еза применяют биохимические методы, фаготипирование, определение устойчивости или чувствительности к антибиотикам. Помимо некоторых преимуществ, которые свойственны этим методам (простота и достаточная оперативность), они имеют ряд существенных недостатков, связанных с тем, что основаны на регистрации фенотипических признаков. В настоящее время известно, что фенотип возбудителей бактериальных инфекций подвержен значительной вариабельности, а это снижает эффективность внутривидового типирования исследуемых штаммов микробов. В связи с этим разработка эффективных методов внутривидового типирования возбудителей сальмонелл еза является весьма актуальной.

В последние годы для внутривидового типирования сальмонелл широко применяются молекулярно-генетические методы, среди которых наиболее распространенным является плазмидный анализ. Этот метод в комплексе с рестрикционным анализом очищенных плазмидных ДНК является наиболее удобным и широко используемым методом оценки геномного полиморфизма сальмонелл. Он основан на относительной консервативности плазмид и стабильности наследования их в процессе культивирования микробов. Сущность его заключается в изучении плазмидных профилей (спектра плазмид) у штаммов микроба. Применение плазмидного анализа позволяет дифференцировать отдельные серовары сальмонелл на плазмидные варианты (плазмидовары), что открывает перспективу для изучения структуры популяции микроба, фенотипических и генотипических характеристик отдельных плазмидоваров возбудителя [16].

Цель исследования

Изучение фенотипических и плазмидных характеристик различных сероваров сальмонелл и возможности их использования для внутривидового типирования возбудителя и микробиологического мониторинга при сальмонеллезе.

Задачи исследования

1. Изучить фенотипические и плазмидные характеристики штаммов Б. е^егШсИБ, циркулирующих в Приморском крае.

2. Изучить фенотипические и плазмидные характеристики штаммов Б. 1урЫтигшт, вызывающих два; типа инфекции — зоонозный и антропонозный.

3. Изучить фенотипические и плазмидные характеристики штаммов сероваров сальмонелл, редко выявляемых на территории края.

4. Изучить генотипическое родство штаммов доминирующих плазмидоваров Б. е^егШШБ на основе рестрикционного анализа мелких криптических плазмид и генотипическое родство штаммов Б. 1урЫтигшт зоонозного происхождения на основе рестрикционного анализа плазмиды массой 60 МБа.

5. Выяснить возможность использования плазмидного анализа в комплексе с рестрикционным анализом отдельных плазмид и ГЩР-диагностикой' плазмид вирулентности в системе длительного централизованного микробиологического молекулярно-генетического мониторинга при сальмонелл езе.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Установлено, что штаммы всех сероваров сальмонелл гетерогенны по спектру плазмид и характеризуются значительным количеством плазмидоваров возбудителя.

По наличию плазмид все штаммы Б. егЛегШсНБ были распределены на 59 плазмидоваров. Выявлены доминирующие; и редко выявляемые плазмидовары Б. ег^егШсЦэ. Выяснено, что доминирующие плазмидовары характеризуются различной этиологической значимостью, способной изменяться не только ежегодно, но и по месяцам.

Выявлены различия между штаммами 8. 1урЫтигшт возбудителя зоонозного и госпитального сальмонеллеза. Большинство штаммов Б. 1урЫтипит, вызывающих пищевую инфекцию, содержат плазмиду вирулентности молекулярной массой 60 1УГОа, вирулентны для белых мышей и чувствительны к антибиотикам. Штаммы Б. 1урЫшигшш госпитального происхождения несут коньюгативную Я-плазмиду, кодирующую полиантибиотикорезистентность, обладают сниженной вирулентностью для мышей и не имеют плазмиды вирулентности.

Рестрикционный анализ плазмиды массой 60 МБа в комплексе с ПЦР-тестированием на наличие БруС-гена позволил дополнительно дифференцировать штаммы Б. 1урЫтигшт зоонозного происхождения, содержащие плазмиду вирулентности и штаммы содержащие криптические плазмиды той же массы.

Полученные результаты доказали действенность использования плазмидных характеристик для внутривидового типирования различных сероваров сальмонелл. Показана высокая эффективность их использования в системе длительного централизованного микробиологического мониторинга при сальмонеллезах, что позволяет решать конкретные вопросы эпидемиологии: установление генетического родства штаммов сальмонелл, определение значимости доминирующих плазмидоваров в этиологии болезни, установление источников и факторов передачи возбудителей инфекции и установление эпидемиологической связи заболевания с определенным пищевым продуктом.

Научно-практическая значимость

Научно-практическая значимость работы состоит в том, что:

- на основе плазмидного анализа разработан метод внутривидового типирования сальмонелл, который используется для централизованного микробиологического молекулярно-генетического мониторинга за микробом в Приморском крае. Все результаты мониторинга представлены Центрам ГСЭН в Приморском крае в виде 18 выпусков «Ежемесячного информационного бюллетеня о штаммах сальмонелл в Приморском крае»;

- разработаны, утверждены главным государственным санитарным врачом Приморского края и внедрены в практику методические указания «Предэпидемическая диагностика и профилактика госпитального сальмонеллеза»;

- материалы работы используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней ВГМУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы бактерий всех исследованных сероваров гетерогенны по характеристике выявляемых у них плазмид

2. Штаммы бактерий* серовара Enteritidis разделены на доминирующие и редко выявляемые плазмидовары. Доминирующие плазмидовары ' характеризуются различной этиологической значимостью, но только по годам, но и по месяцам.

3. Система микробиологического молекулярно-генетического мониторинга, основанная на плазмидных характеристиках штаммов сальмонелл, позволяет осуществлять эффективное слежение за возбудителем.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (Владивосток, 2004).

Материалы диссертации представлены и обсуждены на пяти конференциях:

- научно-практической конференции, посвященной 75-летию санитарноэпидемиологической, службы Российской Федерации; Владивосток, 1997 г.;

- научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах

Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 1998 год, -2-й международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 1998 г.;

- юбилейной научно-практической конференции, посвященная' 50-летию санитарно-эпидемиологической службы Приморья, Владивосток, 1999 г.;

- American Society for Microbiology Conference on Salmonella: Pathogenesis,

Epidemiology, and Vaccine Development, Alghero, Sardinia, Italy, 2003 r. и

По материалам диссертации опубликовано 24 научные работы в центральной и региональной печати.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность доктору медицинских наук Ф.Н. Шубину за предоставленную тему, руководство, помощь в работе и создание условий для ее выполнения. Особую благодарность автор выражает директору НИИЭМ СО РАМН, академику РАМН, доктору медицинских наук H.H. Беседновой и академику РАМН, доктору медицинских наук Г.П. Сомову за создание условий для выполнения диссертации.

За оказанную консультативную помощь и помощь в освоении методик автор искренне благодарен сотрудникам лаборатории молекулярной эпидемиологии НИИЭМ СО РАМН: научному сотруднику, к. м. н.^ А. В. Ракову, младшему научному сотруднику H.A. Кузнецовой и ст. лаборанту JI.H. Алейниковой.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Ковальчук, Наталья Ивановна

149 Выводы

1. Плазмиды содержат большинство штаммов всех сероваров сальмонелл, при этом штаммы несут от одной до пяти плазмид молекулярной массой от 0,8 MDa до 130 MDa. Популяции бактерий Salmonella enterica subsp. enterica всех исследованных сероваров гетерогенны по характеристике выявляемых, у них плазмид и характеризуется значительным количеством плазмидоваров микроба у каждого из сероваров.

2. Штаммы каждого из изученных сероваров Salmonella enterica subsp. enterica, принадлежащие к одному плазмидовару, представляют собой однородную группу по биохимической активности и антибиотикорезистентности.

3. Популяция S. enteritidis в Приморском крае характеризуется наличием доминирующих плазмидоваров - 38 MDa, 38 : 1,4 MDa, 38 : 2,3 MDa. Штаммы доминирующих плазмидоваров S. enteritidis помимо плазмиды вирулентности 38 MDa, содержат и низкомолекулярные плазмиды - 1,4 MDa в плазмидоваре 38: 1,4 MDa и 2,3 MDa - в 38 : 2,3 MDa. Идентичность низкомолекулярных плазмид одинаковой молекулярной массы в: штаммах данных плазмидоваров вне зависимости от места, времени и источника выделения подтверждает клональность происхождения этих плазмидоваров.

4. Динамический мониторинг за сальмонеллезами выявил вариабельность значимости доминирующих плазмидоваров S. enteritidis в этиологии инфекции не только по годам, но и по месяцам. Установлено три типа их участия в этиологии болезни, характеризующиеся преобладанием в течение года одного, двух или всех трех плазмидоваров.

5. Устрновлено существование различий между штаммами S. typhimurium возбудителями пищевой и госпитальной инфекции.

Большинство штаммов S. typhimurium зоонозного происхождения характеризуются наличием плазмиды вирулентности массой 60 MDa и, как следствие, их высокой патогенностью для белых мышей, а также чувствительностью к антибиотикам. Для госпитальных штаммов характерна сниженная вирулентность для белых мышей, обусловленная отсутствием плазмиды вирулентности, и наличие коньюгативной R-плазмиды массой 80 MDa, обеспечивающей полиантибиотикорезистентность.

6. Штаммы S. typhimurium зоонозного происхождения дополнительно дифференцируются с помощью рестрикционного анализа плазмид в комплексе с ПЦР-тестированием j/JvC-гена на штаммы, содержащие плазмиду вирулентности, и штаммы с криптической плазмидой такой же молекулярной массы.

7. Установлена высокая эффективность длительного централизованного микробиологического мониторинга за сальмонеллами, основанного на анализе их плазмидных характеристик. Осуществление мониторинга позволяет оценивать этиологическую значимость доминирующих плазмидоваров; проводить дифференциацию возбудителей, вызывающих госпитальную и пищевую сальмонеллезную инфекцию; устанавливать источники и факторы передачи инфекции.

Заключение *

Сальмонеллезы - главная, значительно возрастающая? причина пищевых отравлений повсюду в мире. Количество случаев сальмонеллезной инфекции? прогрессивно растет. Значительную актуальность приобрел и госпитальный сальмонеллез, который нередко проявляется крупными; вспышками инфекции в хирургических, родильных и педиатрических отделениях и стационарах: Эти вспышки характеризуются длительностью; течения? и высокой смертностью [7, 79]: Данный; тип сальмонеллезной инфекции; существенно; отличается характером: эпидемического процесса, биологическими- особенностями < возбудителя и клиническим1 течением, инфекции [2, 4].

Однако; как показала практика, для изучения характеристик популяций возбудителей; болезней использование традиционных фенотипических тестов * (биотипирование, фаготипирование, колицинотипирование, изучение-антигенной структуры и; антибиотикорезистентности) оказалось, недостаточным [98, 262]. Объясняется это, прежде всего, тем, что один■и тот же фенотипический признак может кодироваться разными генетическими-структурами: Поэтому, применение даже исключительно* сложного ш трудоемкого метода нумерической таксономии, основанного на сотнях фенотипических признаков микроорганизма, не позволяет оценить, степень генетического родства сравниваемых между собой штаммов»микроба одного вида [16, 75, 233]. Развитие молекулярно-генетических методов в последние годы позволило по-новому взглянуть на проблему сальмонеллеза; Прежде всего, возникла потребность исследования характеристик популяций! микроорганизмов. I

В последние годы эти эпидемиологические; исследования были« усовершенствованы применением молекулярно-генетических приемов; таких как анализ плазмидного профиля, рестрикционный анализ плазмидной и хромосомной ДНК и;мультилокусный энзимный электрофорез. Различные исследователи используют комбинации плазмидного анализа с другими молекулярно-генетическими методами. Наиболее часто используют сочетание плазмидного анализа с пульс-электрофорезом хромосомной ДНК [113, 201, 212, 220, 248], с 18200-типированием [230, 239], с риботипированием [181], с рестрикционным анализом хромосомы [138] и RAPD-типированием [189]. Ценность этих новых методов типирования микроорганизмов заключается в том, что они позволяют оценить степень генетических различий между штаммами бактерий одного и того же вида и проследить направление эволюции видов.

В настоящее время плазмидный анализ в комплексе традиционными методами типирования бактерий получил широкое распространение. В литературе имеются примеры эффективного использования плазмидного анализа для внутривидового типирования микроба [12, 28, 101], что было использовано для решения практических задач эпидемиологии болезни: установления источников и факторов передачи [96, 99, 113], а также расшифровки вспышек внутрибольничных инфекций [35, 93]. Однако мы не нашли сведений* о попытках применения плазмидного анализа в; системе длительного централизованного микробиологического мониторинга. Во всех случаях исследовалась либо коллекция штаммов за несколько лет, либо штаммы, собранные за определенный период времени в определенном месте (чаще на территории госпиталя или в месте возникновения вспышки) [221, 222,223,236].

Исследования, проведенные нами в 1995-2000 г.г., позволили составить представление о гетерогенности популяции сальмонелл различных сероваров в Приморском крае, их плазмидной характеристике. Выявлены плазмидовары S. enteritidis, играющие основную роль в этиологии болезни. Установлены основные различия между штаммами S. typhimurium, вызывающими пищевой и госпитальный сальмонеллезы. В своей работе мы предприняли попытку расширить область применения плазмидного анализа, а именно использовать его в системе: длительного централизованного микробиологического молекулярно-генетического мониторинга при сальмонеллезе.

Для изучения; характеристики структуры популяции: сальмонелл мы дополнили традиционные методы типирования изучением спектра плазмид в штаммах микроба с. исследованием отдельных плазмид в рестрикционном анализе и ПЦР-диагностикой плазмид вирулентности. Выбор этих методов обусловлен тем, что плазмидный анализ, дополненный при необходимости рестрикционным анализом либо ПЦР, является достаточно специфичным и информативным методом [26, 73, 146]. Сущность этого метода заключается в изучении плазмидного спектра у исследуемых штаммов. Для этого проводится электрофоретическое разделение выделенных и очищенных плазмидных молекул в агарозном геле, что позволяет установить количество и молекулярную массу содержащихся в исследуемых штаммах плазмид.

Изучение 3020 штаммов сальмонеллезного микроба, изолированного в разных городах и районах края от больных людей, животных, из продуктов и объектов окружающей среды? в: период с 1995 по 2000 год, показало, что большинство штаммов i (2572, 85,2 %) принадлежит к серовару S. enterítidis, 208. штаммов > (6,9 %) - к S. typhimurium. Остальные 240 штаммов (7,9 %) относились к 77 сероварам.

Исследование состава плазмид показало, что S. enterítidis характеризуется наличием вариабельного количества плазмид, но подавляющее большинство штаммов (96,3 %) содержат плазмиду с молекулярной ; массой 38 MDa. Одним1 из наиболее часто е выявляемых во всех странах плазмидоваров S. enterítidis, явились штаммы, несущие единственную плазмиду молекулярной массой 38 MDa (57 kb), которая является плазмидой вирулентности (плазмида pSEV) [126, 134, 140; 156, 161]. Штаммы данного плазмидного варианта в Приморском крае принадлежат к доминирующему плазмидовару и занимают второе место по выделению от больных, что составило 29,1%

748 штаммов). Ряд авторов [161, 169] связывают наличие данной плазмиды с увеличением вирулентности штаммов для белых мышей.

Дополнительные плазмиды находились в штаммах в виде тех или иных наборов, что позволило нам выделить 59 плазмидных вариантов микроба. Используя плазмидный анализ, как метод внутривидового типирования 8. е^егШсНэ, мы получили возможность проанализировать структуру популяции „ микроба, которая характеризуется, прежде всего, гетерогенностью. В популяции 8. етегШсНБ выделены доминирующие варианты микроба, изолируемые чаще, чем остальные. Плазмидный анализ позволил дифференцировать в структуре возбудителя 3 доминирующих плазмидовара со следующим набором плазмид: 38 МБа; 38 : 1,4 МБа; 38 : 2,3 МБа. Их доля составила 83 % от общего количества штаммов. Близкие результаты получены и в других странах, ряд авторов« сообщает о применении плазмидного анализа для внутривидового типирования сальмонелл, в результате чего были также выделены доминирующие плазмидовары [221, 222, 223; 224]. Например, в США была исследована коллекция из 154 культур, изолированных от людей и животных в период с 1979 по 1989 г. Было выявлено 16 плазмидоваров. Из них два (38 МБа и 38 : 3,1 МБа) объединили; 76 % всех представленных штаммов [223]. В Испании аналогично при исследовании коллекции из 255 "вспышечных" и спорадических штаммов при анализе плазмидного состава было выделено 15 групп. Так же лишь два плазмидовара (38 МБа и 38 : 30 МБа) объединили большинство представленных культур [221, 222].

Общность биохимических свойств и антибиотикочувствительности штаммов доминирующих плазмидоваров указывают на высокую степень фенотипической однородности 8. еп1егк!с11з. Штаммы доминирующих плазмидоваров 8. е^егШсПБ, имеющие идентичный набор плазмид, генетически близкородственны и имеют общее клональное происхождение. Это подтверждается наличием высоко консервативной плазмиды вирулентности массой 38 MDasво всех штаммах, высокая степень гомологии которой показана в литературе [150] и исследованиями в нашейf лаборатории [65]j а также выявленной нами идентичностью низко^молекулярных плазмид массой 1,4 MDa в штаммах плазмидовара 38 : 1,4 MDa- и идентичностью плазмид 2,3 MDa в штаммах плазмидовара 3 8 : 2,3 MDa.

Динамический мониторинг за сальмонеллезами выявил вариабельность значимости доминирующих плазмидоваров S. enteritidis в этиологии' инфекции? не только по годам, но и по месяцам. Выявлено! три этиологических типа; популяции: — с ежегодным; преобладанием одного плазмидовара, двух или с участием в этиологии болезни; всех трех плазмидоваров с периодическим увеличением роли каждого из них.

В настоящее время« сальмонеллез,. вызванный; S. typhimurium, имеет небольшой удельный; вес в заболеваемости; населения, но: актуальность инфекции; определяется! возможностью: реализации госпитального сальмонеллеза. Микробиологический? мониторинг за: S.typhimurium в Приморском крае, основанный; на; изучении биотипа, антибиотикорезистентности ■ ш плазмидной характеристики; штаммов микроба, позволил дифференцировать два типа штаммов - зоонозные и госпитальные: Плазмидный анализ; выявил высокую степень гетерогенности* штаммов данного серотипа. Обе группы штаммов были дифференцированы по составу плазмид.

Штаммы S; typhimurium! возбудителя; зоонозного сальмонеллеза характеризуются, как правило, чувствительностью; к антибиотикам, присутствием плазмиды вирулентности: массой; 60 MDa и высокой; вирулентностью для белых мышей: Среди штаммов возбудителя пищевой инфекции выявлено 25 плазмидоваров. Большинство штаммов, помимо плазмиды вирулентности, содержало;ряд плазмид молекулярной массой от 1,1 MDa до 95 MDa: Однако надо отметить, что плазмида вирулентности S. typhimurium содержалась только у 67 % исследованных штаммов зоонозного происхождения. Эти данные подтверждаются данными и других авторов [119, 148,225].

Применение рестрикционного анализа плазмид массой 60 МБа в совокупности с тестированием этих же плазмид при помощи, ПЦРГ на наличие в них С-гена, позволило дополнительно дифференцировать штаммы микроба зоонозного происхождения, содержащие плазмиду вирулентности, от штаммов, содержащих криптические плазмиды с такой же молекулярной массой: Рестрикционный профиль А объединил большинство плазмид массой 60 МБа в этих штаммах (при их расщеплении ферментом ЕсоШ образовалось 9 линейных фрагментов). Кроме того; исследование плазмид с данным рестрикционным профилем на наличие в них $/п>С-гена с помощью ПЦР, показало, что все они являются плазмидами вирулентности; Рестрикционные профили В (13 фрагментов) и С (8 фрагментов) отличались и друг от друга и от профиля А разным количеством линейных фрагментов и их молекулярной массой. Кроме того, в штаммах с плазмидами, принадлежащими рестрикционным профилям В и С, фрагмент $руС-гена (571 п.о.) не амплифицировался, и, следовательно, эти плазмиды не являются плазмидами вирулентности. Таким образом, использование рестрикционного анализа плазмид открывает дополнительную возможность дифференциации штаммов Б; 1урЫтипиш зоонозного происхождения на основе функционального значения плазмид массой 60 МБа.

Возбудитель госпитального сальмонеллеза, в отличие от зоонозного, устойчив к, антибиотикам, содержит коньюгативную Я-плазмиду массой 80 МБа, у него снижена вирулентность для белых мышей , что указывает на отсутствие плазмиды вирулентности. Среди госпитальных штаммов выявлено 11 плазмидоваров. У штаммов, вызвавших госпитальный сальмонеллез, выявлен доминирующий плазмидовар - 80 : 40 : 4,8 МБа. Похожие результаты были получены при исследовании госпитальных штаммов в Иркутске, где вспышка была вызвана штаммами одного плазмидовгра 75 : 4,8 МБа [12], в Чите, где при исследовании госпитальных штаммов Б. 1урЫтипит выявлены три плазмидовара - 82 : 36 : 4,8 МБа, 82 : 4,8 МБа и 82 МБа [35] и в Нальчике, где в начале 90-х годов вспышка госпитального сальмонеллеза была вызвана штаммами, которые содержали две плазмиды - крупная с мол. массой 80-100 МБа и мелкая, массой 5-10 МБа [36].

Более высокая гетерогенность штаммов зоонозного происхождения определяется, по-видимому, тем, что эти штаммы вызывают только спорадическую заболеваемость.

Долу остальных сероваров, которые мы назвали редко выявляемыми, в этиологии сальмонеллезов в Приморском крае невелика. Однако их многообразие вызывает интерес в плане установления источников инфекции, а также путей их проникновения в Приморский край. Единичными штаммами были представлены 40 сероваров микроба, 65 % из них содержали плазмиды. Остальные 37 сероваров представлены несколькими культурами -от 2 до 21. Штаммы большинства сероваров оказались гетерогенными по составу плазмид, что позволило дифференцировать их внутри сероваров на плазмидные варианты. Штаммы части сероваров выделялись только из продуктов и объектов окружающей среды. Другая группа сероваров изолировались только от людей - больных и бактерионосителей. В третью группу включены штаммы сероваров, которые выделялись как от людей, так и из пищевых продуктов. В этой группе генетическое родство штаммов пяти сероваров объединенных общим временем выделения и идентичным плазмидным спектром, указывает на связь заболевания людей с определенным пищевым продуктом. По нашему мнению, более интенсивное обследование пищевых продуктов позволило бы выявить те дополнительные серовары, штаммы которых выделялись только от людей.

Так кглс практически все серовары оказались, в большинстве своем, однородными по своим биохимическим характеристикам, плазмидный анализ можно считать высоко эффективным методом внутривидового типирования сальмонелл, пригодным для осуществления на его основе длительного динамического слежения за возбудителем.

Изучение антибиотикорезистентности штаммов; различных сероваров показало, что штаммы S. enteritidis, а также штаммы редко выявляемых сероваров, за небольшим исключением, представляют собой однородную группу бактерий чувствительную ко - всем исследованным: антибиотикам. Дифференциация по отношению к антибиотикам оказалась возможна лишь для штаммов S. typhimurium. Госпитальные штаммы, несущие R-плазмиду, обладали устойчивостью к широкому спектру антибиотиков — от 8 до 19. Однако небольшое количество штаммов S. typhimurium зоонозного происхождения, как и некоторые, штаммы S. enteritidis так же несли R-плазмиды, кодирующие устойчивость к тем или иным антибиотикам.

Накопленные и: обобщенные: данные о: структурных характеристиках популяции Salmonella enterica subsp. enterica в Приморском крае позволило нам подойти к решению: вопроса об организации системы микробиологического молекулярно-генетического мониторинга за возбудителями! сальмонеллезов. Организация подобной системы предполагает,, в первую; очередь, длительное, динамическое наблюдение, основанное на плазмидном анализе изолированных штаммов, рестрикционном анализе ДНК отдельных плазмид и ПЦР-диагностике плазмид вирулентности.

Применение микробиологического молекулярно-генетического мониторинга выявило его высокую эффективность при решении конкретных вопросов, эпидемиологии. Сведения о плазмидной характеристике сальмонелл успешно использованы для решения вопроса об источнике сальмонеллезной инфекции, для выявления завозных случаев болезни, для дифференциации клонов сальмонелл, возбудителей зоонозного и госпитального (антропонозного) сальмонеллезов.

В целом, проведенные исследования позволили сформулировать задачи мониторинга - изучение плазмидных характеристик (плазмидоваров) возбудителей; оценка этиологической значимости доминирующих плазмидоваров; раннее выявление новых плазмидоваров бактерий, способных вызывать повышенную заболеваемость; дифференциация возбудителей, вызывающих госпитальную и пищевую сальмонеллезную инфекцию; установление источников и факторов ее передачи; установление или исключение эпидемиологической связи между случаями болезни.

Таким образом, микробиологический молекулярно-генетический мониторинг является важной структурной частью эпидемиологического надзора, реальной основой оптимизации профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ковальчук, Наталья Ивановна, 2004 год

1. Акимкин В. Г. Нозокомиальный сальмонеллез как' самостоятельная нозологическая форма инфекционной патологии человека// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1998.- №4.- С.106-110.

2. Акимкин В. Г. Нозокомиальный сальмонеллез как самостоятельная нозологическая форма инфекционной патологии человека// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1998. - №2. — С.49-54.

3. Акимкин В. Г. Роль медицинского персонала в поддержании очага нозокомиального сальмонеллеза// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. -1997.-№4.-С.36.

4. Акимкин В. Г. Характерные эпидемиологические черты нозокомиального сальмонеллеза в лечебно-профилактических учреждениях для взрослых// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол./- 1998. №3. - С.27-31.

5. Акимкин В. Г. Эпидемиология и профилактика нозокомиального сальмонеллеза в стационарах для взрослых// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1998. - №3. - С. 18-24.

6. Акимкин В. Г., Беляков В. Д. Сальмонеллезная инфекция в крупном многопрофильном стационаре// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1996. - №6. - С.32-36.

7. Акимкин В. Г., Покровский В. И. Нозокомиальный сальмонеллез взрослых. М.: РАМН, 2002. 30с.

8. Аксенов М. Ю., Гинцбург А. Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции// Мол. генетика, микробиолог, и вирусол. 1993. - №4. - С.-38.

9. Арбузова В. А. Дезентирия, ишхериозы, сальмонеллезы. Л.: Мысль, 1978. 92-97с.

10. Арбузова В.А. Современное состояние вопроса о внутрибольничных сальмонеллезныхч инфекциях// Острые кишечные инфекции. Респ. сб. -Ленинград. Выпуск 2. - 1978. - С.31-38 (20).

11. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологии. Л.: Медицина, 1962.- 256с.

12. Беляков В. Д., Акимкин В. Г. Клинико-эпидемиологические особенности нозокомиального сальмонеллеза// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. -1997. №4. - С.34-36. '

13. Беляков В. Д., Голубев Д. Б., Каминский Г. Д., Тец В. В. Саморегуляция паразитарных систем (молекулярно-генетические механизмы)* Л.: Медицина, 1987.- 139с.

14. Беляков В. Д., Ряпис Л:.А., Каминский Г. Д. Типирование возбудителей инфекционных болезней на современном этапе// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1990. - №3. - С. 98-103.

15. Блохина Н. FL, Бруснигина Н. Ф., Скобло Л. Е., Мазепа В. Н., Барышева Н. Н. Применение молекулярной гибридизации для изучения энтеротоксигенных свойств сальмонелл// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1990, - №6.-С.20-23.

16. Бойченко М. Н. Сальмонеллез: распространение возбудителя в организме// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1984.- №10. -С.3-5.

17. Бойченко М. Н., Воробьев А. А. Генетическая регуляция вирулентности бактерий рода Salmonella!7 Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. — 1990.-№2.- С.68-74.

18. Бондаренко В. М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. -1997.- №4.- С.20-26.

19. Бородулина О. В., Доморадский И. В., Барсанова Т. Г., Осадчая А. В., Рудченко О. Н., Вучетич Л. В. Ферментация инозита бактериями рода Salmonella!I Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол./ — 1988. №2.- С.8-10.

20. Брода П. Плазмиды. М.: Мир, 1982. - 222с.

21. Бродов Л. Е., Малеев В. В., Ющук Н. Д., Клиника и патогенез осложнений пищевых токсикоинфекций (сальмонеллез)// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол.- 1996. - №2. - С.95-97.

22. Бродов Л. Е., Малеев В. В., Ющук Н. Д., О нозопаразитической форме сальмонеллеза// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1996. - №1. -С.78-80.

23. Бруснигина Н. Ф., Волчкевич Ж. А., Дегтева Г. К., Белова Т. Н. Белки наружной мембраны в характеристике сальмонелл различного происхождения// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1988. - №8. -С. 10-13.

24. Вартанян М. К., Казанчян А. Ф., Амирханова Л. М., Агабалян А. С., Захарян Р. А. Плазмидные ДНК Salmonella derby// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол.; 1982. - №8. - С.42-45.

25. Ведьмина Е. А., Власова И. В., Гившталь Н. И. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Методическиеуказания4. М:: МЗ СССР,5 ЦОЛИУВ, -1979: 43с.

26. Габрилович И. М., Цуканова А. М. Эпидемиологическое маркирование -> штаммов Salmonella typhimurium// Журн. микробиол., эпидемиол., ииммунол. 1999: - №6. - С. 84-85.

27. Гриднев В. А. Влияние приобретенной лекарственной устойчивости на фаговар сальмонелл//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1987.-№6.-С. 159-116.

28. Гриднев В: А. Микробиологическая и генетическая- характеристика лекарственноустойчивых возбудителей сальмонеллезов: Автореф. дис. докт. мед. наук. М:, 1990. — 27с.

29. Гриднеь В. А., Ливкина Е. Г., Назарова В; С., ПашковаГ. К., Батуренко Л.

30. Mi, Бадерина Л. В. Биологические свойства культур сальмонелла тифимуриум, выделенных при различных эпидемических ситуациях/Юстрые кишечные инфекции. Л; Выпуск 2. - 1978. - С. 61-65.

31. Домарадский И. В. О «побочных» эффектах; плазмид (R-плазмиды и вирулентность)// Молекул, ген., микробиол. и вирусол. — 1987. № 6. - С. 3-9.

32. Домбровский А. М. Границы биохимической изменчивости выделенных от людей сальмонелл и возможность их идентификации// Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунол. — 1982. №11. - С.55-58.

33. Жарков Л. П., Лапа С. Э., Шаликова Г. Г., Крюкова Э. А. и соавт. О некоторых результатах слежения за спектром плазмид штаммов

34. Salmonella typhimurium, изолированных в лечебно-профилактических учреждениях г. Читы в 1997-99гг.// Сб., поев. 60-летию Центра ГСЭН в Читин. об. Чита. - 2000. - С. 125-126.

35. Жугова Т. Ч., Казаков А. М., Кягова J1. JL, Нагоев Б. G. Ппазмидный состав клинических штаммов сальмонелл// Бактериальные плазмиды: Тез. докл. научн. конф. Нальчик. - 1990. - С.- 106-107.

36. Зарицкий А. М. Сальмонеллезы. Киев: Здоровья, 19881 -160с.

37. Ильина T. С. Структурная организация и механизмы перемещений генных кассет, кодирующих резистентность к антибиотикам и факторы вирулентности бактерий// Молекул, генетика^- 2001. №1. - С. 3-12.

38. Калуцкий П. В., Бельский В. В. Влияние состояний иммунной системы организма* на структуру популяции Salmonella typhimurum по признакам ; антибиотикорезистентности и вирулентности// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1989. - №5. - С.8-12.

39. Каменская. И Н., Маркина Е. Ю., Чернышева HI А., Ермоленко 3. Н. Биологические особенности: Salmonella typhimurium, полученные из разных источников в 1975-1980гг.// Журн. микробиол., эпидемиол. m иммунол.- 1983. -№3. С.26-31.

40. Каминский Г. Д., Крупенко М. А. Гетерогенность плазмид штаммов Shigella Sonnei I и II фаз// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. -1989.-№1К-С. 28-32.

41. Кафтырева JI. А. Исследование по проблеме кишечных инфекций в институте имени Пастера// Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Тез. докл. второй межд. конф. С. П6.-1998. - С 123а-123б. (.

42. Кафтырева JI. А. Эпидемиологическое значение этиологического фактора при сальмонеллезах// Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Тез. докл. второй межд. конф. С. Пб. -1998. - С 135.

43. Кафтырева JI. А., Нарвская О. В., Борисов JI. Б., Хазенсон JI. Б. Влияние плазмид множественной устойчивости, к антибиотикам на изменениефаговара Salmonella typhimurum// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1984. - №10. - С. 49-52.

44. Килессо В. А., Чиракадзе И. Г., Худченко Г. В. Фаготипирование штаммов ' S^ typhimurium, выделенных при различных эпидемических ситуациях, сприменением двух схем типирования// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1981.-№10.-С. 110-111.

45. Лебедев Н. И., Плахотя Л. П. Значение серовара сальмонелл и биологических свойств возбудителей в эпидемическом процессе сальмонеллезов// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол.— 1986. №8.- С.24-28.

46. Магдей М. В., Слюсарь В. Н., Рожнова С. Ш. Особенности сальмонеллезов в республике Молдова в разные периоды эпидемического неблагополучия// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1993. - №3.- С.43-48.

47. Магдей М. В., Слюсарь В. Н., Рожнова С. Ш. Анализ групповой заболеваемости сальмонеллезами в республике Молдова// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1993. - №4. - С.47-52.

48. Медицинская микробиология. / Под. ред. В. И. Покровского, О. К. Поздеева. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, - 1999. - 1200с.

49. Милютина Л: И., Рожнова С. Ш., Цешковский И. С. Клинические аспекты лекарственной * резистентности сальмонелл// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1998. - №1. - С.33-37.

50. Пак С. Г., Турьянов М. X., Пальцев М. А. Сальмонеллез. М: Медицина, 1988.- 5с.

51. Петровская В. Г. Проблемы вирулентности бактерий.-Л.: Наука, 1967.-52с.

52. Петрюк В. А., Пилипенко Т. Д., Архипова Н. М., Арапова В. И. и др. Особенности этиологической структуры сальмонеллеза на территории Карачаево-Черкесии в 1985-1994 г.г.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1996. - №6. - С.75-76.

53. Плазмиды. Методы., Бергквист П., Харди К., Оудега Б., Панайотатос Н., Пагсли С., Томас К., Янгмен Ф. М.; под ред. К Харди: М.: Мир, 1990. -11с.

54. Покровский В. И., Килессо В. А., Ющук Н. Д. Сальмонеллезы, результаты и перспективы научных исследований-М.: Сов. мед., 1981. - С. 3-8.

55. Раков А. В. Микробиолого клинические параллели при сальмонеллезной инфекции: Диссертация канд. мед. наук. 03.00.07/ НИИЭМ СО РАМН.-Владив.-2002.-142с.

56. Рачковская Ю. К. Некоторые аспекты эпидемиологического надзора за сальмонеллезами// Острые кишечные инфекции: сб. науч. тр. НИИЭМ им. Пастера, Л., - 1980. - Вып. 4. - С. 43-48.

57. Ревина Г. В. Рестрикционный анализ плазмид как метод внутривидового типирования сальмонелл// Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Тез. докл. науч. конф., -Новосиб., 1998. - С. 64-65.

58. Рожнова С. Ш. Биологические свойства S. typhimurium, выделенных при различных эпидемических ситуациях: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1979.- 135с.

59. Рожнова С. Ш. Сальмонеллезы: проблемы и решения// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1999. - №2. - С.39-41.

60. Рожнова С. Ш., Кафтырева JI. А. Значение плазмид в эволюции возбудителей и эпидемического процесса внутрибольничных сальмонеллезов// Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 2000. - №5. - С.25-27.

61. Рожнова С. Ш., Килессо В. А., Александрова Н. 3. Этиологическая структура сальмонеллезов и серотиповой пейзаж сальмонелл, выделенных на отдельных территориях страны в 1980-1982гг.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1985.- №11. - С.60-64.

62. Рожнова С. Ш., Сечкарова А., Яноушкова Ю., Приказка В., Глотова Е., Соловьева Н. К. Некоторые аспекты лекарственной устойчивости сальмонелл// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1991. - №8. -С.27-30.

63. Романова Ю. М., Ильина Т. С., Гинцбург А. Л. Мобильные генетические элементы и их роль в эволюции патогенных бактерий// Вест: Российск. Академии Наук, М.: Медицина, 2001.- С. 15-20.

64. Рябченко Л. Е., Рашидов А. М., Ряпис JI. А. Скрининг и рестрикционный анализ плазмидных ДНК штаммов Salmonella enteritidis// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1994. - №5: - С. 17-19.

65. Ряпис JI. А. Клональность, фазовая изменчивость бактериальных видов и их связь с проявлениями эпидемического процесса// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1995. - №1*, - С.109-111.

66. Ряпис JI. А., Беляков В. Д. Проблемы номенклатуры и классификации сальмонелл и сальмонеллезов//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1995.-№4.-С. 115-118.

67. Ряпис JI. Я., Липницкий А. В. Микробиологические и популяционно-генетические аспекты патогенности бактерий// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1998. - №6. - С.109-113.