Пьезокварцевые иммуносенсоры для определения биологически активных веществ и клинической диагностики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, доктор химических наук Калмыкова, Елена Николаевна

• Калмыкова, Елена Николаевна
• доктор химических наук
• 2007

Оглавление диссертации доктор химических наук Калмыкова, Елена Николаевна

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности функционирования пьезокварцевых иммуносенсоров в жидких средах.

1.2. Методы иммобилизации биорецепторных молекул.

1.2.1. Физическая сорбция.

1.2.2. Включение в матрицу.

1.2.3. Химическая сорбция.

1.3. Условия регенерации биоселектирующих покрытий.

1.4. Виды иммуноанализа с использованием пьезокварцевого сенсора.

1.4.1. Прямое детектирование.

1.4.2. Одностадийный непрямой/конкурентный анализ.

1.4.3. Альтернативный конкурентный анализ.

1.4.4. Двустадийный сэндвич-анализ.

1.4.5. Анализ с увеличением массы аналита.

1.4.6. Вытеснительный анализ.

1.5. Применение пьезокварцевых иммуносенсоров.

1.6. Химическое обоснование классификации грамотрицательных бактерий и роль структурных исследований в установлении их О-антигенной специфичности.

1.7. Современные серологические методы лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза и аутоиммунных заболеваний.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Химическое и иммунохимическое исследование

О-специфических полисахаридов У. еШегосоИИса.

2.1.1. Общие методы.

2.1.2. Наработка микробной массы и выделение липополисахаридов.

2.1.3. Кислотный гидролиз и получение производных моносахаридов для хромато-масс-спектрометрии.

2.1.4. Получение производных моносахаридов для иммунохимических исследований и газожидкостной хроматографии.

2.1.5. Выделение и очистка О-специфических полисахаридов.

2.1.6. Химическая модификация полисахаридов.

2.1.7. Антисыворотки и серологические методы.

2.2. Пьезокварцевое детектирование.

2.2.1. Характеристика объектов исследования, химических реагентов, биополимеров и иммунореагентов.

2.2.2. Установки для статического и проточно-инжекционного анализа жидкостей с применением пьезокварцевых иммуносенсоров.

2.2.3. Подготовка резонаторов и иммобилизация биорецепторных молекул.

2.2.4. Пробоподготовка образцов пищевых продуктов, объектов окружающей среды и биологических жидкостей.

УСТАНОВЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ

О-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПОЛИСАХАРИДОВ Y. enterocolitica. Ill

3.1. Выделение и общая характеристика липополисахаридов.

3.2. Установление химического строения О-специфических полисахаридов.

3.2.1. Химическая структура О-полисахарида серовара 0:3.

3.2.2. Химическая структура О-полисахаридов сероваров 0:5 и 0:5,27.

3.2.3. Химическая структура О-полисахарида серовара 0:6,30 и 0:6,31.

3.3. Иммунохимическое изучение липополисахаридов и их фрагментов

ФОРМИРОВАНИЕ БИОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ПОКРЫТИЙ ЭЛЕКТРОДОВ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ

РЕЗОНАТОРОВ.

4.1. Физическая сорбция.

4.2. Ковалентное прикрепление к подложкам на основе гидрофильных биомакромолекул.

4.3. Формирование подложки с использованием золь-гель метода и самособирающихся монослоев.

4.4. Иммобилизация дифильных макромолекул с направленной ориентацией антигенных детерминант.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФОРМАТОВ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ.

5.1. Кинетические исследования обратимых гетерогенных иммунохимических реакций.

5.2. Прогнозирование чувствительности определения и состава регенерирующего раствора.

5.3. Кросс-реактивность антител со структурными аналогами гаптенов.

5.4. Оценка перекрестных взаимодействий О-антигенов

У. еШегосоНИса с гомо- и гетерологичными антителами.

6. ЗАВИСИМОСТЬ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА СЕНСОРА ОТ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА.

6.1. Влияние состава и рН буферного раствора.

6.2. Влияние температуры, продолжительности экспонирования сенсора, скорости потока раствора-носителя.

6.3. Выбор растворов для регенерации биоселектирующего слоя сенсора.

7. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПТЕНОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.

7.1. Определение салицилатов в статических условиях.

7.2. Модернизация генератора и создание установки для проточно-инжекционного анализа.

7.3. Проточно-инжекционное определение салицилатов и сульфаниламидов в фармацевтических препаратах, объектах окружающей среды и пищевых продуктах.

7.3.1. Определение салициловой кислоты.

7.3.2. Определение сульф аметоксазола.

7.4. Определение нонилфенола.

7.5. Определение метаболита никотина- котинина в моче.

8. ПРИМЕНЕНИЕ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННЫХ И

ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

8.1. Определение антител к бактериям Г. еМегосоИйса 0:3 в сыворотке крови.

8. 2. Определение антител к ДНК в сыворотке крови.

8.3. Определение микроорганизмов - бактериофагов У. и бактерий У. еМегосоННса серовара 0:3 в водных растворах и пищевых продуктах.

ВЫВОДЫ.

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пьезокварцевые иммуносенсоры для определения биологически активных веществ и клинической диагностики»

Одним из успешно развивающихся направлений является создание сенсоров различной природы, в том числе пьезокварцевых иммуносенсоров (ПКИ). Отличительной особенностью этого вида аналитических устройств является уникальное сочетание высокой чувствительности (детектирование на уровне микро- и нанограммов) и селективности определений, связанной с использованием иммунореагентов в качестве распознающих молекул, что позволяет осуществлять регистрацию биохимических взаимодействий без дополнительного введения меток (флуоресцентных, ферментных, радиоактивных, люминесцентных и др). Наиболее изучены иммуносенсоры, чу ветви

12 тельные к изменению массы, которые известны как микро- или нановесы. Взаимодействие аналита с биочувствительным слоем приводит к изменению частоты, амплитуды и фазы колебаний пьезокварцевого преобразователя при изменении вязкости, плотности, упругости, проводимости и массы рецептор-ного слоя. Аналитическим сигналом пьезокварцевого иммуносенсора обычно служит уменьшение частоты колебаний сенсора, соответствующее увеличению массы рецепторного слоя при образовании на его поверхности иммунного комплекса.

Пьезокварцевые сенсоры характеризуются простотой аппаратурного оформления, легкостью в эксплуатации, портативностью, возможностью включения в мультисенсорные системы, а также системы автоматического сбора и обработки информации. По сравнению с иммунохимическими методами, используемыми при проведении клинических исследований, иммуно-сенсоры отличаются высокой экспрессностью и возможностью многоразового использования после регенерации биорецепторного слоя.

Исследования, связанные с созданием пьезокварцевых иммуносенсо-ров, вызывают неослабевающий интерес ученых практически во всех странах мира вот уже в течение более четверти века. Многие публикации выявили привлекательные стороны этих аналитических устройств и перспективы их дальнейшего развития и практического применения. Однако большинство работ носит разрозненный характер (посвящены созданию сенсоров для определения отдельных веществ, полученные данные нельзя распространить на определенный класс соединений) и ограничены модельными системами. Кроме того, до настоящего времени отсутствуют систематические исследования, связанные с особенностями формирования биослоя сенсора с заданными свойствами, что сдерживает более активное внедрение пьезокварцевых иммуносенсоров в практику биоаналитической химии. Известные к настоящему времени способы формирования рецепторного покрытия пьезоиммуно-сенсора, определяющие чувствительность, селективность и продолжительность использования иммуносенсора, связаны с применением белков (анти

13 тела, гаптен-белковые конъюгаты), реже - ДНК, РНК и их фрагментов. Расширение круга рецепторных молекул позволит развить новые подходы к получению биочувствительного слоя сенсора и унифицировать имеющиеся способы иммобилизации биомолекул с учетом цели проводимого иммуноа-нализа. Для выявления общих закономерностей и особенностей формирования биослоя с использованием различных по природе рецепторных молекул необходимо применение комбинированных приемов закрепления биомолекул на поверхности электрода пьезокварцевого иммуносенсора и проведение комплексных исследований с учетом физической и химической устойчивости, активности и массы иммобилизованных молекул.

Разработка методик анализа с применением гравиметрических иммуно-сенсоров (тест-средства, детекторы для проточно-инжекционного анализа) для осуществления контроля объектов окружающей среды, пищевых продуктов, лекарственных препаратов и биологических жидкостей, вызывает активный интерес исследователей практически во всех странах мира. К сожалению, в нашей стране изучение работы массочувствительных иммуносенсоров практически не проводится.

Цель исследования - развитие теоретических и методологических подходов к созданию экспрессных, высокочувствительных и селективных пьезокварцевых иммуносенсоров, предназначенных для определения биологически активных веществ и микроорганизмов в жидких средах в статических и проточных условиях.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить и теоретически обосновать новые способы формирования ре-цепторного слоя сенсора, которые обеспечивают устойчивость, сохранение активности и направленную иммобилизацию биомолекул различных классов: антител, гаптен-белковых конъюгатов, ДНК, бактериальных О-антигенных липополисахаридов (ЛПС);

• определить закономерности протекания обратимых гетерогенных иммунохимических реакций для обоснования выбора иммунореагентов, со

14 става регенерирующих растворов и прогнозирования чувствительности определения биологически активных веществ и микроорганизмов;

• установить зависимость величины аналитического сигнала пьезок-варцевого иммуносенсора от условий выполнения анализа (состав, рН буферного раствора, скорость потока раствора или продолжительность экспонирования сенсора в анализируемом растворе, температура проведения реакции);

• выделить липополисахариды и установить химическое строение О-специфических полисахаридов Yersinia enterocolitica серологических вариантов (сероваров) 0:3, 0:5, 0:5,27 и 0:6,31 для использования в качестве биораспознающих молекул сенсора;

• осуществить количественную оценку перекрестных специфических иммунохимических реакций иммобилизованных антигенов (гаптен-белковые конъюгаты, ЛПС, ДНК) с гомо- и гетерологичными антителами, а также антител с иммуногенами, гаптенами, их структурными аналогами и неспецифическими белками для характеристики селективности иммуносенсоров;

• разработать способы определения различных по природе и массе биологически активных веществ и микроорганизмов с применением пьезоквар-цевых иммуносенсоров для анализа пищевых продуктов, объектов окружающей среды, биологических жидкостей.

Научная новизна.

- Сформулированы теоретические положения и разработаны методологические приемы получения биорецепторного слоя сенсора, характеризующегося высокой устойчивостью, активностью и сохранением постоянной массы в течение 15-30 циклов измерений.

Развиты подходы к повышению чувствительности и селективности определения биологически активных веществ с использованием дифильных молекул липополисахаридов на основе регулирования ориентации антигенных детерминант биорецепторного слоя в зависимости от целей выполняемого анализа.

15

- Установлена взаимосвязь кинетических характеристик обратимых гетерогенных иммунохимических реакций (к0, кр) и констант аффинности (КАФ) биореагентов с оперативными характеристиками сенсоров. Результаты использованы для прогнозирования чувствительности и экспрессно-сти определения, а также для выбора регенерирующих растворов.

- Выявлены доминирующие факторы, влияющие на чувствительность определения биологически активных веществ и микроорганизмов (состав, ионная сила, рН буферного и регенерирующего растворов, температура, продолжительность контактирования иммунореагентов) при регистрации гетерогенных биохимических реакций в водных средах.

- Впервые установлены химические структуры О-специфических полисахаридов У еЫегосоИйса сероваров 0:3, 0:5, 0:5,27, и 0:6,31 для теоретического обоснования О-антигенной специфичности биорецепторных молекул липополисахаридов, необходимого при диагностической идентификации антител и серотипировании указанных бактерий.

- Показана возможность использования коэффициентов кросс-реактивности (КР, %) иммунохимических реакций для характеристики селективности биослоя сенсора и оценки специфичности антител при диагностике иерсиниоза.

- Разработан комплекс методик определения низкомолекулярных гаптенов, специфических антител и микроорганизмов в биологических жидкостях, пищевых продуктах, лекарственных препаратах и объектах окружающей среды в статических и проточных условиях с использованием пьезоквар-цевых иммуносенсоров.

Практическая значимость. • Разработаны и запатентованы способы формирования биорецепторного слоя пьезокварцевого сенсора и способы определения сульфопрепаратов, но-нилфенола и антител к бактериям У еЫегосо1Шса с использованием иммуносенсоров.

16

• Предложены методические рекомендации по выбору способов иммобилизации биораспознающих молекул на гидрофильных и гидрофобных подложках (конканавалин А, сульфатированные полисахариды, силоксаны, липиды и липоевая кислота), полученных с использованием самособирающихся монослоев, для направленной ориентации, сохранения активности и устойчивости биослоя при эксплуатации и длительном хранении.

• Оптимизированы условия и предложен алгоритм проведения анализа жидкостей в статическом и проточно-инжекционном режимах с использованием пьезокварцевых иммуносенсоров, включающий регистрацию аналитического сигнала сенсора и регенерацию биорецепторного покрытия.

• Модифицирована установка для выполнения проточно-инжекционного анализа жидкостей и конструкция генератора колебаний сенсора, что позволяет в 3-5 раз снизить расход иммунореагентов, в 3,5 раза соотношение сигнал/шум по сравнению с аналогичными устройствами зарубежного промышленного производства.

• Разработаны пьезокварцевые иммуносенсоры и методики их использования в качестве тест-средств и детекторов для проточно-инжекционного определения низкомолекулярных соединений: лекарственных веществ, токсикантов и метаболитов в пищевых продуктах, фармацевтических препаратах, биологических жидкостях и объектах окружающей среды.

• Показана возможность использования пьезокварцевых иммуносенсоров для клинической диагностики инфекционного иерсиниоза и некоторых аутоиммунных заболеваний. В отличие от применяемых для этих целей микробиологических, иммунохимических и молекулярно-генетических методов анализа, применение пьезокварцевых иммуносенсоров позволяет сократить продолжительность единичного измерения от нескольких часов до нескольких минут.

• Методики определения салициловой кислоты, сульфаниламидов, нонил-фенола и котинина в жидких средах внедрены в лабораторный практикум спецкурса «Химические и биосенсоры».

17

На защиту выносятся:

• методологические приемы формирования биорецепторного покрытия сенсора с заданными свойствами с использованием различных способов иммобилизации антител, гаптен-белковых конъюгатов, ДНК и липополисахаридов (прямое закрепление на металлической поверхности электродов; ковалентное присоединение к подложкам на основе конканавалина А, сульфатированного полисахарида, силоксанов и липоевой кислоты с помощью бифункциональных реагентов; иммобилизация липополисахаридов с направленной ориентацией биомолекул;

• взаимосвязь состава, рН буферного и регенерирующего растворов, температуры, скорости раствора-носителя или времени контактирования иммуно-реагентов с величиной аналитического сигнала сенсора и оптимизация условий проведения анализа жидких сред с использованием пьезокварцевых им-муносенсоров в качестве тест-средств и детекторов для проточно-инжекционного анализа;

• установление химической структуры бактериальных антигенов Y. entero-colitica сероваров 0:3, 0:5, 0:5,27 и 0:6,31 и обоснование возможности использования в качестве биорецепторных молекул пьезокварцевого иммуно-сенсора;

• взаимосвязь констант скорости образования, разрушения и аффинности иммунных комплексов и коэффициентов кросс-реактивности исследованных иммунореагентов с чувствительностью и селективностью определений;

• комплекс методик с использованием пьезокварцевого иммуносенсора для определения гаптенов, антигенов и микроорганизмов в водных растворах и реальных объектах (вода, почва, пищевые продукты, лекарственные препараты, биологические жидкости - молоко, урина, сыворотка крови).

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на Международных и Российских конференциях: VII Всесоюзная конференция (Пущино, 1982); 3-rd Conference of young scientists (Czechoslovakia, 1984); VII Молодежная конференция по синтетическим и физиологически активным со

18 единениям (Ереван, 1984); II Всесоюзная конференция «Иерсиниозы» (Ленинград, 1984); VII Всесоюзный съезд (Алма-Ата, 1985); I Всесоюзная научно-техническая конференция «Иерсиниозы» (Владивосток, 1986); XII-th International Symposium On Carbohydrate Chemistry (USA, 1986); International Symp. of Endotoxin (Japan, 1988); XIV International Carbohydrate Symposium (Japan, 1990); II Всероссийская конференция «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 1999); IV Региональная конференция «Проблемы региональной экологии» (Тамбов, 2000); VIII Региональная конференция «Проблемы химии и химтехнологии» (Воронеж, 2000); Всероссийская конференция «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2000); Всероссийский симпозиум «Тест-методы химического анализа» (Москва, 2001); International conference Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications (Moscow, 2002); III Съезд Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); Всероссийская конференция «Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, 2002); Международный форум «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); XIIV Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Казань, 2003); V Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды с международным участием «Экоана-литика - 2003» (Санкт-Петербург, 2003); I Региональная научная конференция «Химико-экологические проблемы Центрального региона России» (Орел, 2003); Всероссийская конференция по аналитической химии «Аналитика России» (Москва, 2004); II Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005); III Международная конференция «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005); Областная научно-техническая конференция (Липецк, 2005); IV Всероссийская научная конференция «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), The International Congress On Analytical Sciences ICAS-2006 (Москва, 2006), Всероссийская конференция «Фагран» (Воронеж, 2006).

Рис. 1. а - природная форма кварцевого кристалла; б - расположение осей в кварцевом кристалле АТ-среза; в - разновидности пьезокварцевых резонаторов

234853232323534853484848235348485348482323232353534823

20

Пьезоэлектрически активна только область между электродами, по мере удаления от центра массочувствительность пьезокварцевого резонатора существенно снижается. Наиболее часто используют кристаллы с диаметром кварцевой пластины 8-16 мм, с золотыми, реже — серебряными электродами, собственной частотой колебаний 5-15 МГц. В литературе имеются сообщения об отдельных случаях использования резонаторов с более высокими частотными характеристиками - 30 МГц [6', 7], 70 МГц и даже 110 МГц [8]. Авторы отмечают, что тонкие кристаллы, резонирующие при высоких частотах, более чувствительны к изменению массы, но их недостатком является хрупкость и значительный уровень сигналов «шума».

Воздействие переменного электрического потенциала между электродами вызывает внутреннее механическое напряжение, что приводит к появлению деформации кристалла (рис. 2). Резонансное колебание достигается

Пьезокристалл

Колебательное смещение частиц кристалла

Электроды

Рис. 2. Акустические колебания в пьезокварцевом преобразователе объемных волн [9].

К - колебательный волновой вектор, Е - вектор напряженности электрического поля

21 при включении кристалла в колебательный контур, где электрические и механические колебания совпадают с основной частотой кристалла. Собственная частота колебаний резонатора зависит от постоянных величин - размера и структуры пластины (толщины, плотности, шероховатости, формы и типа среза), а также изменяющихся параметров - массы металлических электродов и некоторых внешних факторов (плотность или вязкость газа или жидкости, в которых проводятся измерения; состав, ионная сила, рН растворов) [10-13]. Осциллирующая частота кристалла АТ- среза линейно уменьшается при увеличении массы материалов, осаждающихся на поверхности электродов, и выражается уравнением Зауэрбрея [14]:

АГ= - 2,3* {о2106Дш / А , где ДБ —изменение частоты колебаний кристалла, Нг, собственная частота колебаний кристалла, МГц, Аш - масса нанесенного на электрод рецепторно-го покрытия, г, А - площадь поверхности электрода, см2.

Это соотношение верно только для небольших приращений массы. Превышение оптимальной нагрузки не только снижает чувствительность определений, но и приводит к срыву сигнала, поэтому коммерческие пьезок-варцевые микровесы рассчитаны на диапазон измерений от ~ 1 нг/см2 до -100 мкг/см2.

Специфичность иммуносенсоров в газовых средах. Впервые использование антигенов в качестве покрытий электродов пьезокварцевых микровесов [15] было предложено в 1972 г., однако интерес исследователей к этому направлению возник несколько позднее. В 1986 г. появилось сообщение о высокочувствительном определении (на уровне ррЬ) пестицида паратиона в воздухе с помощью иммобилизованных на пьезокварцевом кристалле антител к паратиону [16]. Авторы отмечали, что следы влаги, присутствующие в тонкой пленке покрытия сенсора, обеспечивают протекание иммунохимиче-ской реакции в газовой фазе. Использование иммобилизованных белков (антител) было успешно апробировано при оценке атмосферных загрязнителей. Применение пьезокварцевых сенсоров для определения в воздухе таких со

22 единений как диоксид серы, оксид углерода, хлорид водорода, диоксид азота, аммиак, фосфорорганические пестициды и др. рассмотрены в работах [1720].

Однако в литературе имелись также сообщения, опровергающие утверждения о протекании специфических иммунохимических реакций в сухих пленках на основе антител, используемых в качестве покрытий сенсоров при определении концентрации пестицидов в воздухе [21]. Следует отметить, что в настоящее время для анализа газов пьезокварцевые иммуносенсоры практически не используются, что может быть обусловлено сложностью регистрации аналитического сигнала при незначительных изменениях массы покрытия сенсоров при прямом детектировании низкомолекулярных веществ.

Особенности функционирования сенсора в жидких средах. Ранние попытки применения пьезокварцевых сенсорных систем для измерений в жидких средах были неудачными, т.к. кристалл при погружении в раствор прекращал осциллировать. Для преодоления этой проблемы сенсор выдерживали в анализируемом растворе и после высушивания измеряли приращения массы в газовой фазе. В этом случае частотные сдвиги сенсора подчинялись уравнению Зауэрбрея. Метод известен как «окунуть и высушить» («dip and dry») [12, 15, 22, 23]. Другой путь состоял в разработке принципиально новой схемы возбуждения, предназначенной для анализа жидкости, и использовании проточной ячейки детектирования, обеспечивающей контакт с анализируемым раствором только одной стороны кристалла [5, 11].

На резонансную частоту кристалла, погруженного в раствор, существенное влияние оказывают характеристики жидкой фазы, и уравнение Зауэрбрея не выполняется. Унифицированного уравнения, учитывающего вклад всех факторов среды на величину отклика пьезокварцевого сенсора в жидкости, до настоящего времени не предложено. Сигнал, главным образом, зависит от существующей структуры межфазной границы, сформированной между покрытием сенсора и окружающим раствором. Эти пограничные эффекты

23 нивелируются при контактировании только одной стороны резонатора с раствором и использовании оптически отполированных кристаллов.

С учетом перечисленных выше ограничений возможны два варианта применения пьезокварцевых иммуносенсоров - как тест-средств и детекторов в проточно-инжекционном анализе.

Первые исследования с применением пьезокварцевых иммуносенсоров для сравнительной оценки активности и специфичности антител в жидкости были выполнены в 1972 г. способом «окунуть и высушить» [15]. Только с 1980-х годов это направление начало развиваться более активно - был предложен метод идентификации подклассов антител [24] и непрямой/конкурентный метод определения антигенов [25]. В 90-х годах перечень определяемых соединений значительно расширился, появились сенсоры для определения целого ряда микроорганизмов [26 - 36], клеток крови [37 - 40], альбумина [41], атразина [42, 43], человеческого трансферрина [44], инсулина [45], кокаина [46] и иммуноглобулина М (IgM) [47, 48]. Основные проблемы при выполнении анализа способом «окунания и высушивания» связаны с условиями экспонирования сенсора в исследуемом растворе и последующего высушивания, а также с влиянием природы растворителя пробы, удерживаемого покрытием.

Диапазон определяемых в жидких средах соединений с использованием пьезокварцевых сенсоров разнообразен - это высоко- и низкомолекулярные соединения, клетки. В работе [26] впервые предложен способ определения микроконцентрации Candida albicans в интервале (106-^ 5-108) клеток/мл. Высокую специфичность анализа подтверждало отсутствие взаимодействия сенсорного покрытия с другими видами дрожжей или другими типами антигенов. Такой подход был впоследствии развит при создании методик определения целого ряда бактерий: Salmonella typhimurium [28], Salmonella paraty-phy [29], Listeria monocytogenes [30, 31], Vibrio cholera^32]; вирусов: возбудитель диареи [33], герпес [34, 35], - и клеточных структур: гранулоцитов [37], Т-лимфоцитов [38] и эритроцитов человека [39, 40].

24

Несмотря на относительно невысокую воспроизводимость результатов, вследствие влияния гидратации и неодинакового удерживания растворителя рецепторной поверхностью, способ "окунание и высушивание" не потерял своей значимости и до настоящего времени, что продемонстрировали недавно опубликованные работы по определению некоторых микроорганизмов [29, 36, 49, 50], белков [51 - 53] и токсикантов [54, 55]. Преимущество этого способа состоит в возможности использования иммуносенсоров в качестве тест-средств, что удобно для осуществления анализа на месте при проведении внелабораторной диагностики. В этих условиях тест-средства применяются как быстродействующие инструменты при скрининге объектов окружающей среды. Надежность результатов определения повышается, а предел обнаружения снижается при увеличении времени экспонирования сенсора в анализируемой пробе, тщательном промывании и высушивании биослоя до постоянной массы.

Для нивелирования неспецифических взаимодействий компонентов пробы с рецепторным покрытием сенсора рекомендована система из двух сенсоров: индикаторного и сенсора сравнения [53].

Использование пьезокварцевых иммуносенсоров в проточно-инжекционном анализе более перспективно, поскольку в этом случае значительно сокращается время единичного определения (до нескольких минут) и регистрация сигнала осуществляется в режиме реального времени [56]. Кроме того, в этом случае существенно повышается воспроизводимость определения (регистрируется относительное изменение частотного сдвига), снижается влияние неспецифических взаимодействий (соединения, сорбированные покрытием, удаляются с поверхности сенсора буферным раствором-носителем), появляется возможность многократного использования сенсора после регенерации биочувствительного слоя в конце каждого этапа измерения.

При выполнении анализа используют проточную ячейку детектирования малого объема, пропуская через нее раствор с заданной скоростью при

25 помощи насоса. Обычно объем проточной ячейки составляет 35 -100 мкл [11, 57].

К настоящему времени разработано большое число проточных имму-носенсоров для определения как высокомолекулярных аналитов (микроорганизмы: - бактерии, вирусы, фаги; биологически активные макромолекулы: антитела, белковые антигены, нуклеиновые кислоты), так и низкомолекулярных веществ: лекарственных препаратов, метаболитов и экотоксикантов.

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Калмыкова, Елена Николаевна

260 ВЫВОДЫ

1. Использование комплексного подхода для характеристики рецепторных покрытий пьезокварцевого иммуносенсора, учитывающего массу и устойчивость биослоя, удельную сорбционную емкость подложки, чувствительность и селективность определения низко- и высокомолекулярных соединений и микроорганизмов, позволяет теоретически обосновать выбор способа иммобилизации биомолекул в зависимости от целей проводимого анализа. Установлено, что оптимальное сочетание высокой чувствительности и устойчивости рецепторного слоя достигается при ковалентном прикреплении белковых молекул (антител, гаптен-белковых конъюгатов) и ДНК с помощью глутарового альдегида к подложкам, полученным с использованием метода самособирающихся монослоев из низкомолекулярных веществ (силоксан, липоевая кислота, липиды). Показана возможность направленной ориентации антигенных детерминант молекул ЛПС при повышении гидрофобности подложки.

2. Изучены закономерности иммунохимических реакций, протекающих в прямом и обратном направлениях на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров. Рассчитаны константы скорости образования и разрушения иммунных комплексов, константы аффинности биореагентов, что позволяет прогнозировать состав регенерирующих растворов и чувствительность определения биологически активных веществ и микроорганизмов в жидких средах.

3. Выявлены доминирующие факторы, влияющие на оперативные характеристики сенсоров, используемых в статическом и проточном режимах (состав и рН буферного раствора, время контактирования иммунореагентов, скорость потока раствора). Предложен алгоритм выполнения проточно-инжекционного анализа с применением пьезокварцевых иммуносенсоров, что позволяет наблюдать за

261 протеканием биохимических реакций в режиме реального времени, автоматизировать анализ и повысить его производительность.

4. Установлено химическое строение О-специфических полисахаридов, выделенных из патогенных грамотрицательных бактерий 7. еШегосоШгса сероваров 0:3; 0:5; 0:5,27 и 0:6,31 для теоретического обоснования антигенной специфичности молекул ЛПС. Обоснованы новые области применения ЛПС в качестве рецепторных покрытий пьезокварцевого иммуносенсора для повышения чувствительности и селективности определения антител.

5. С целью прогнозирования селективности определений БАВ и микроорганизмов рассчитаны коэффициенты перекрестного взаимодействия иммобилизованных антигенов с гомо- и гетерологичными антителами и неспецифическими белками; а также поли- и моноклональных антител с антигенами, гаптенами и их структурными аналогами. Выявлена индивидуальная и групповая специфичность антител, использование которых позволяет создавать иммуносенсоры для определения индивидуальных компонентов или суммарного содержания близких по строению веществ.

6. Разработан комплекс методик высокочувствительного (на уровне нг/мл) определения низкомолекулярных веществ (сульфометоксазола, салициловой кислоты, нонилфенола, котинина) в объектах окружающей среды (вода, почва), пищевых продуктах (молоко, мясо, яйца), лекарственных препаратах и биологических жидкостях (молоко, урина), которые предназначены для выполнения анализа без предварительной сложной пробоподготовки.

7. Предложены сенсоры на основе иммобилизованных антител для экспрессного определения микроорганизмов (бактериофагов У. реБйя и бактерий У. еМегосоНИса) и оценки качества питьевой воды, свежих овощей и фруктов, рекомендуемые для санитарно-гигиенического контроля в очагах распространения инфекции. Минимальные

262 определяемые концентрации бактериофагов и бактерий составляют 0,2-105 и 0,1-Ю4 частиц/мл соответственно.

8. Предложены высокочувствительные и селективные ПКИ на основе иммобилизованных ДНК и ЛПС для прямого определения специфичных антител на уровне мкг/мл. Продемонстрирована возможность проточно-инжекционного определения специфичных антител для количественной характеристики активности сывороток крови в процессе ранней клинической диагностики иерсиниоза и некоторых аутоиммунных заболеваний (системной красной волчанки, гломерулонефрита и ревматоидного артрита), а также мониторинга состояния больных при лечении.

263

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Калмыкова, Елена Николаевна, 2007 год

1. О'Sullivan, С. К. Commercial quartz crystal microbalances theory and applications Text. / С. К. O'Sullivan, G. G. Guilbault // Biosens. Bioelectron. - 1999. - V. 14. - P. 663 - 670.

2. Steegborn, C. Construction and characterization of the direct piezoelectric immunosensor for atrazine operating in solution Text. / C. Steegborn, P. Skladal // Biosens. Bioelectron. 1997. - Y. 12. -P. 19-27.

3. Малов, В. В. Пьезорезонансные датчики Текст./ В. В. Малов. -М.: Энергоатомиздат, 1989. 272 с. - ISBN 5-283-01507-6.

4. Bizet, К. Biosensors based on piezolectric transducers Text./ K. Bizet, C. Gabrielli, H. Perrot// Analusis. 1999. - V. 27. - P. 609 - 616.

5. Saber, R. Glow-discharge treated piezoelectric quartz crystals as immunosensors for HAS detection Text./ R. Saber, S. Mutlu, E. Piskin// Biosens. Bioelectron. 2002. - V. 17. - P. 727 - 734.

6. Bizet, K. Validation of antibody-based recognition by piezoelectric transducers through electroacoustic admittance analysis Text. / K. Bizet, C. Gabrielli, H. Perrot, J. Therasse// Biosens. Bioelectron. -1998. -V. 13.-P. 259-269.

7. Lin, Z. Operation of an ultrasensitive 30-MHz quartz crystal microbalance in liquids Text. / Z. Lin, С. M. Yip, I. S. Joseph, M. D. Ward//Anal. Chem. 1993. - Y. 65,№ 11.-P. 1546- 1551.

8. Uttenthaler, E. Ultrasensitive quartz crystal microbalance sensors for detection of M13-Phages in liquids Text./ E. Uttenthaler, M. Schraml, J. Mandel, S. Drost// Biosens. Bioelectron. 2001. - V. 16. -P. 735 -743.

9. Дорожкин, Л. M. Акустоволновые химические газовые сенсоры

10. Текст. / JI. М. Дорожкин, И. А. Розанов// Журн. аналит. химии. -2001. Т. 56, № 5. - с. 455 - 479.

11. J.Rickert, G.L.Hayward, B.A.Cavic-Vlasak, M.Thompson, W.Gopel. In Sensors Update 5. (Eds H.Baltes, W.Gopel, J.Hesse). Wiley-VCH, Weinheim, 1999.-P. 105.

12. Thompson, M. Liquid-phase piezoelectric and acoustic transmission studies of interfacial immunochemistry Text. / M. Thompson, C. L. Arthur, G. K. Dhaliwal// Anal. Chem. 1986. - V. 58, № 6. -P. 1206 - 1209.

13. Bunde, R. L. Piezoelectric quartz crystal biosensors Text. / R. L. Bunde, E. J. Jarvi, J. J. Rosentreter // Talanta. 1998. - V. 46. -P. 1223 - 1236.

14. Cavic, B.A. Acoustic waves and the study of biochemical macromolecules and cells at the sensor-liquid interface Text. / B. A. Cavic, G. L. Hayward, M. Thompson// Analyst. 1999. -V. 124, № 10. - P. 1405 - 1420.

15. Sauerbrey, G.Z. Use a quartz vibration form weigh thin films on a microbalance Text. / G.Z. Sauerbrey II Z. Phys. 1959. - B. 155. -P. 206-210.

16. Shons, A. An immunospecific microbalance Text. / A. Shons, F. Dorman, J. Najarian// J. Biomed. Mater. Res. 1972. - V. 6. -P. 565 - 570.

17. Патент США 4242096. Immunoassay for antigens Text. / R. J. Olivera, S. F. Silver // G01N 033/16, 1980; заявл. 14.11.77; опубл. 30.12.80.

18. Muramatsu, H. Piezoelectric immuno sensor for the detection of Candida albicans microbes Text. / H. Muramatsu, K. Kajiwara, E. Tamiya, I. Karube // Anal. Chim. Acta. 1986. - V. 188. - P. 257 -261.

19. Muramatsu, H. Piezoelectric crystal biosensor system for detection of E. coli Text. / H. Muramatsu, Y. Watanabe, M. Hikuma, T. Ataka, I. Kubo, E. Tamiya, I. Karube // Anal. Lett. 1989. - Y. 22. - V. 2155 -2166.

20. Prusak-Sochaczewski, E. Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium Text. / E. Prusak-Sochaczewski, J. H. T. Loung, G. G. Guilbault // Enzyme

21. Jacobs, M. B. A piezoelectric biosensor for Listeria monocytogenes Text. / M. B. Jacobs, R. M. Carter, G. J. Lubrano, G. G. Guilbault // Am. Lab. 1995. - V. 27. - P. 26 - 28.

22. Minunni, M. A quartz crystal microbalance displacement assay for Listeria monocytogenes Text. / M. Minunni, M. Mascini, R. M. Carter, M. B. Jacobs, G. J. Lubrano, G. G. Guilbault/ Anal. Chim. Acta. 1996. V. 325.-P. 169- 174.

23. Carter, R. M. Quartz crystal microbalance detection of Vibrio cholerae Ol39 serotype Text. / R. M. Carter, J. J. Mekalanos, M. B. Jacobs, G. J. Lubrano, G. G. Guilbault // J. Immunol. Meth. 1995. - V. 187. -P. 121 - 125.

24. Konig, B. Detection of viruses and bacteria with piezoelectric immunosensors Text./ B. Konig, M. Gratzel // Anal. Lett. -1993. -V. 26. P. 1567- 1585.

25. Konig, B. Human granulocytes detected with a piezoimmunosensor Text. / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Lett. 1993. - V. 26. - P. 23132328.

26. Konig, B. Detection of human T-lymphocytes with a piezoelectric immunosensor Text. / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chim. Acta. -1993.-V. 281.-P. 13-18.

27. Konig, B. Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of human erythrocytes Text./ B. Konig, M. Gratzel// Anal. Chim. Acta. 1993. -V. 276. - P. 329-333.

28. Guilbault, G. G. A piezoelectric immunobiosensor for atrazine in drinking water Text. / G. G. Guilbault, B. Hock, R. Schimid// Biosens. Bioelectron. 1992. - V. 7. - P. 411 - 419.

29. Prusak-Sochazewski, E. Detection of Human Transferrin by the Piezoelectric Crystal Text. / E. Prusak-Sochazewski, J. Luong // Anal. Lett. 1990. - V. 23. - P. 183 - 194.

30. Suri, C.R. Development of piezoelectric crystal based microgravimetric immunoassay for determination of insulin concentration Text. / C. R. Suri, P. K. Jain, G. C. Mushra// J. Biotechnology. 1995. -V. 39.-P. 27-34.

31. Attili, B. S. A Piezoelectric Immunosensor for the Detection of Cocaine Text. / B. S. Attili, A. A. Suleiman// Microchem. J. 1996. - V. 54. -P. 174-179.

32. Suri, C.R. Determination of immunoglobulin M concentration by piezoelectric crystal immunobiosensor coated with protamine Text. / C. R. Suri, M. Raje, G. C. Mishra // Biosens. Bioelectron. 1994. -V. 9.-P. 325-332.

33. Su, X. Piezoelectric quartz crystal based veterinary diagnosis for Salmonella enteritidis infection in chicken and egg Text. / X. Su, S. Low, J. Kwang, V.H.T. Chew, S.F.Y. Li // Sens. Actuat. B: Chem. -2001.-V. 75.-P. 29-35.

34. Su, X. Self-Assembled Monolayer-Based Piezoelectric Crystal Immunosensor for the Quantification of Total Human Immunoglobulin E Text. / X. Su, F. T. Chew, S. F. Y. Li// Anal. Biochem. 1999. -V. 273.-P. 66-72.

35. Su, X. Piezoelectric quartz crystal based label-free analysis for allergy disease Text. / X. Su, F. T. Chew, S. F. Y. Li// Biosens. Bioelectron. -2000.-V. 15.-P. 629-639.

36. Tang, А. X. J. Immunosensor for okadaic acid using quartz crystal microbalance Text. / A. H. J. Tang, M. Pravda, G. G. Guilbault,

37. S. Piletsky, A. P. F. Turner // Anal. Chim. Acta. 2002. - V. 471. -P. 33-40.

38. Carter, R. M. Piezoelectric Detection of Ricin and Affinity-Purified Goat Anti-Ricin Antibody Text. / R. M. Carter, M. B. Jacobs, G. J. Lubrano, G. G. Guilbault// Anal. Lett. 1995. - V. 28. - P. 1379 -1386.

39. Babacan, S. Evaluation of antibody immobilization methods for piezoelectric biosensor application Text. / S. Babacan, P. Privarnik, S. Letcher, A.G. Rand// Biosens. Bioelectron. 2000. - V. 15. - P. 615 -621.

40. Barnes, C. A concanavalin A-coated piezoelectric crystal biosensor Text. / C. Barnes, C. D'Silva, J. P. Jones, T. J. Lewis // Sens. Actuat. B: Chem.-1991.-V. 3.-P. 295-304.

41. Skladal, P. Piezoelectric Quartz Crystal Sensors Applied for Bioanalytical Assays and Characterization of Affinity Interactions Text. / P. Skladal // J. Braz. Chem. Soc. 2003. -V. 14. - P. 491 -503.

42. Kennedy, J. F. In Solid Phase Biochemistry: Analytical and Synthetic Aspects Text./ J. F. Kennedy, J. M. S. Cabral. Wiley: New York, 1983.-P. 253.

43. Bulter, J. E. Adsorption-induced antigenic changes and their significance in ELISA and immunological disorders Text. / J. E. Bulter, P. Navarro, J. Sun // Immunol. Invest. 1997. - V. 26. - P. 39-54.

44. Ulbrich, R. Protein adsorption and leakage in carrier-enzyme systems Text. / R. Ulbrich, R. Golbik, A. Schellenberger // Biotechnol. Bioeng.- 1991.-V. 37.-P. 280-287.

45. Morrissey, B. W. The conformation of y-globulin adsorbed on polystyrene latices determined by quasielastic light scattering Text. /

46. B. W. Morrissey, С. C. Han // J. Colloid Interface Sei. 1978. -V. 65. -P. 423-431.

47. Davies, J. A scanning tunneling microscopy comparison of passive antibody adsorption and biotinylated antibody linkage to streptavidin on microtiter wells Text. / J. Davies, A. C. Dawkes, A. G. Haymes,

48. C. J. Roberts, R. F. Sunderland, M. J. Wilkins, С. M. Davies, S. J. B. Tendier, D. E. Jackson, J. C. Edvards // J. Immunol. Methods. -1994. V. 167. - P. 263 - 269.

49. Иммобилизованные ферменты Текст. /Под ред. И.В.Березина,

50. B.К.Антонова, К.Мартинека). М.: МГУ, 1976. - Т. I. - С. 266. Uttenthaler, Е. Quartz crystal biosensor for detection of the African Swine Fever disease Text. / E. Uttenthaler, C. Koeslinger, S. Drost// Anal. Chim. Acta. - 1998. - V. 362. - P. 91 - 100.

51. Koesslinger, C. Quartz crystal microbalance for immunosensing Text./

52. C. Koesslinger, S. Drost, F. Aberl, H. Wolf// Fresenius'! Anal. Chem.- 1994. V. 349. P. 349 - 354.

53. Aberl, F. HIV serology using piezoelectric immunosensors Text. / F. Aberl, H. Wolf, C. Koeslinger, S. Drost, P. Woias, S. Koch// Sens.

54. Actuat. B: Chem. 1994. - V. 18. - P. 271 - 275. R. J.Pei, J.M.Hu, Y.Hu, Y.E.Zeng. Gaodeng Xuexiao Huaxue Xuebao. - 1998. - V. 19. - P. 363 - Chem. Abstr.

55. Pei, R. J. A piezoelectric immunosensor for complement C4 using protein A oriented immobilization of antibody Text. / R. J. Pei, J. M. Hu, Y. Hu, Y. E. Zeng // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1998. -V. 73.-P. 59-63.

56. Davis, K. Continuous liquid-phase piezoelectric biosensor for kinetic immunoassays Text. / K. Davis, T. Leary// Anal. Chem. 1989. -V. 61, № 11. P. 1227- 1230.

57. Saha, S. Sandwich microgravimetric immunoassay: sensitive and specific detection of low molecular weight analytes using piezoelectric quartz crystal Text. / S. Saha, M. Raje, C. R. Suri // Biotechnol. Lett. 2002. V. 24.-P. 711-716.

58. Harsanyi, G. Polymer films in sensor application: a review of present uses and future possibilities Text. / G. Harsanyi // Sens. Rev. 2000. V. 20.-P. 98- 105.

59. Zhang, C. Development of a new kind of dual modulated QCM biosensor Text. / C. Zhang, G. Feng, Z. Gao // Biosens. Bioelectron. -1997.-V. 12.-P. 1219-1225.

60. Barie, N. Covalent bound sensing layers on surface acoustic wave (SAW) biosensors Text. / N. Barie, M. Rapp // Biosens. Bioelectron. -2001.-V. 16.-P. 979-987.

61. Shriver-Lake, L. C. Antibody immobilization using heterobifunctional crosslinkers Text. / L. C. Shriver-Lake, B. Donner, R. Edelstein, K. Breslin, S. K. Bhatia, F. S. Ligler // Biosens. Bioelectron. 1997. -V. 12. - P. 1101 - 1106.

62. Alfonta, L. Electrochemical and Quartz Crystal Microbalance Detection of the Cholera Toxin Employing Horseradish Peroxidase And GM1-Functionalized Liposomes Text. / L. Alfonta, I. Willner,

63. D. J. Throckmorton, A. K. Singh // Anal. Chem. 2001. - V. 73. -P. 5287 - 5295.

64. Attili, B.S. A Piezoelectric Immunosensor for the Detection of Cortisol Text. / B. S. Attili, A. A. Suleiman // Anal. Lett. 1995. - V. 28. -P. 2149-2159.

65. Wink, Th. Self-assembled Monolayers for Biosensors Text. / Th. Wink, S. J. van Zuilen, A. Bult, W. P. van Bennekom // Analyst. -1997. -V. 122. P. 43R-50R.

66. Skladal, P. Kinetic study of affinity interactions: comparison of piezoelectric and resonant mirror-based biosensors Text. / P. Skladal, J. Horacek //Anal. Lett. 1999. -V. 32. -P. 1519 - 1529.

67. Калмыкова, Е.Н. Определение сульфаметоксазола с помощью пьезокварцевого иммуносенсора Текст. / Е. Н. Калмыкова, Е. В. Мелихова, С. А. Еремин, Т. Н. Ермолаева // Антибиотики и химиотерапия. 2004. - Т. 49. - С. 8 - 13.

68. Schramm, W. Strategies for the Immobilization of Antibodies Text. / W. Schramm, S.-H. Paek, G. Voss // Immunomethods 1993. - V. 3. -P. 93-103.

69. Bartlett, P. N. In situ characterization of phospholipid coated electrodes Text. / P. N. Bartlett, K. Brace, E. J. Calvo, R. Etchenique// J. Mater. Chem. 2000. - V. l.-P. 149- 156.

70. Chou, S.-F. Development of an immunosensor for human ferritin, a nonspecific tumor marker, based on a quartz crystal microbalance Text. / S.-F. Chou, W.-L. Hsu, J.-M. Hwang, C.-Y. Chen // Anal. Chim. Acta. 2002. - V. 453. -P. 181 - 189.

71. Storri, S. Surface modifications for the development of piezoimmunosensors Text. / S. Storri, T. Santoni, M. Minunni,

72. Dupont-Filliard, A. Comparison by QCM and photometric enzymatic test of the biotin-avidin recognition on a biotinylated polypyrrole Text./ A. Dupont-Filliard, M. Billon, S. Guillerez, G. Bigan// Talanta. -2001.-V. 55.-P. 981 -992.

73. Skladal, P. In Direct Piezoelectric Immunosensors for Pesticides Text./ P. Skladal, J. Horacek, M. Malina. Kluwer Academic Publishers: Netherlands, 1998. - P. 145.

74. Chang, H.-C. Detection of lipopolysaccharide binding peptides by the use of a lipopolysaccharide-coated piezoelectric crystal biosensor Text. / H.-C. Chang, C.-C. Yang, T.-M. Yeh // Anal. Chim. Acta. -1997.-V. 340.-P. 49-54.

75. Бабкина, С. С. Определение аутоантител к ДНК с помощью биосенсора на основе комплекса Pt(II) с ДНК Текст. / С. С. Бабкина, Н. А. Улахович, Э. П. Медянцева, О. В. Климович // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. -Т. 34. - № 5-С. 572 - 575.

76. Halamek, J. Investigation of highly sensitive piezoelectric immunosensors for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid Text. / J. Halamek, M. Hepel, P. Skladal // Biosens. Bioelectron. 2001. - V. 16. - P. 253 -260.

77. Патент США 4314821. Sandvich immunoassay using piezoelectric oscillator Text./ Т. K. Rice// G01N 033/547, 1982, заявл. 28.07.80; опубл. 09.02.82.

78. Sakti S. P. Disposable HSA QCM-imrmmosensor for practicalmeasurement in liquid Text. / S. P. Sakti, P. Hauptmann,

79. B. Zimmermann, F. Buhling, S. Ansorge // Sens.Actuat. B: Chem. -2001.-V. 78. -P. 257-262.

80. Bao, L. A rapid method for determination of Proteus vulgaris with a piezoelectric quartz crystal sensor coated \v;th a thin liquid film Text. / L. Bao, L. Deng, L. Nie, S. Yao, W. Wei // Biosens. Bioelectron. -1996.-V. 11.-P. 1193 1198.

81. Патент 4847193 США. Signal amplification in assay employing apiezoelectric oscillator Text. / J. C. Richards, D. T. Bach// C12Q001/68, 1989; заявл. 18.06.87; опубл. 11.07.89.

82. Патент 5501986 США. A piezoelectric specific binding assay withamplified reagents Text. / M. D. Ward, R. C. Ebersole// GO IN033/531, 1996, заявл. 28.07.94; опубл. 26.03.96.

83. Mo, X.T. Microbalance-DNA probe method for the detection ofspecific bacteria in water Text. / X. T. Mo, Y. P. Zhow, H. Lei,

84. Deng // Enzyme Microb. Technol. 2002. - V. 30. - P. 583 - 589.

85. Bovenizer, J. S. The Detection of Pseudomonas aeruginosa Using the

86. Quartz Crystal Microbalance Text. / J. S. Bovenizer, M. B. Jacobs,

87. C. К. O'Sullivan, G. G. Guilbault // Anal. Lett. 1998. - V. 31. -P. 1287-1295.

88. Konig, В. A piezoelectric immunosensor for hepatitis viruses Text. / B. Konig, M. Gratzel // Anal. Chim. Acta. 1995. - V. 309. - P. 19

89. Susmel, S. Human cytomegalovirus detection by a quartz crystal microbalance immunosensor Text. / S. Susmel, C. K. O'Sullivan, G. G. Guilbault // Enzyme Microb. Technol. 2000. - V. 27. - P. 639 -645.

90. Hengerer, A. Quartz crystal microbalance (QCM) as a device for the screening of phage libraries Text. / A. Hengerer, J. Decker, E. Prohaska, S. Hauck, C. Kofilinger, H. Wolf // Biosens. Bioelectron. -1999.-V. 14.-P. 139 144.

91. Cann, J. In Principles of Molecular Virology Text. / J. Cann.-Academic Press: New York, 1993. P.666.

92. Harteveld, J. L. N. Detection of Staphylococcal Enterotoxin B employing a piezoelectric crystal immunosensor Text. / J. L. N. Harteveld, M. S. Nieuwenhuizen, E. R. J. Wils // Biosens. Bioelectron. 1997. - V. 12. - P. 661 - 667.

93. Wu, Z.-Y. A PEG piezoelectric immunoassay for the determination of transferrin in human serum Text. / Z.-Y. Wu, G.-L. Shen, L.-J. Xie,

94. Bang, G. S. A novel electrochemical detection method for aptamer biosensors Text. / G. S. Bang, S. Cho, B.-G. Kim // Biosens. Bioelectron. 2005. -V. 21. - P. 863 - 870.

95. Tombelli, S. Recent Advances on DNA Biosensors Text. / S. Tombelli, G. Marrazza, M. Mascini // Int. J. Environ. Anal. Chem. -2001.-V. 80.-P. 87-99.

96. Minunni, M. Biosensors as new analytical tool for detection of Genetically Modified Organisms (GMOs) Text. / M. Minunni, S. Tombelli, E. Mariotti, M. Mascini // Fresenius' J. Anal. Chem. -2001.-V. 369. -P. 589-593.

97. Minunni, M. A piezoelectric affinity biosensor for genetically modified organisms (GMOs) detection Text. / M. Minunni, S. Tombelli, S. Pratesi, M. Mascini, P. Piatti, P. Bogani, M. Buiatti // Anal. Lett. -2001.-V. 34.-P. 825 -840.

98. P.W.Walton, M.E.Bulter, M.R.O'Flaherty. Biochem. Soc. Trans.1991.-V. 19.-P. 44. Chem. Abstr. G.Y.Zhu, Y.Wang. Fenxi Huaxue. 1995. - V. 23. - P. 1095. Chem. Abstr.

99. Busch, К. Single molecule research on surfaces: from analytics to construction and back Text. / K. Busch, R. Tampe // Rev. Mol. Biotechnol. -2001. V. 82. - P. 3 - 34.

100. Nie, L.-H. Determination of sulpha-drugs with a piezoelectric sensor Text. / L.-H. Nie, Т. Wang, S. Yao // Talanta. 1992. - V. 39. -P. 155 - 158.

101. Dorsch, S. The VP 1-unique region of parvovirus В19: amino acid variability and antigenic stability Text. / S. Dorsch, В. Kauffman, U. Schaible, E. Prohaska, H. Wolf, S. Modrow // J. Gen. Virol. 2001. -V. 82.-P. 191 - 199.

102. Кауфман, Ф. Семейство кишечных бактерий Текст. / Ф. Кауфман. М.: Медгиз, 1959 - 354 с.

103. Uchida, T. Analysis of the serologic determinant groups of Salmonella

104. E groups О antigens Text. / T. Uchida, P.W. Robbins, S.E. Luria //

105. Biochemistry -1963 V. 2 - № 4 - P. 663 - 668.

106. Hellerquist, C.G. Structural studies of O-specific side chains of cellwall lipopoly saccharide from Salmonella muenster Text. /

107. C.G. Hellerquist, B. Lindberg, J. Lonngren, A.A. Lindberg //

108. Carbohydr. Res. 1971. - V. 16. - № 2. - P. 289 - 296.

109. Bagdian, G. In: Structure et effects biologiques des products bacteriensprovenant de germes gram négatifs Text. / G. Bagdian, M. Etievant,

110. A. M. Staub //Coll. Paris. 1967. - P. 161.

111. Jann, K. Microbial Polysaccharides Text./ К. Jann, О. Westphal // In: The Antigens (Ed. M. Sela) London New York - San Francisco. -1975.-V. 3.-P. 1 - 100.

112. Ляшенко, В. А. Молекулярные основы иммуногенности антигенов Текст. / В.А. Ляшенко, A.A. Воробьев. М: Медицина, 1982.-272 с.

113. Bjorndal, Н. Gas flussigkeits-chromatographie and massenspektro-metrie bei der methylie-rangsanalyse won Polysacchariden Text. / Bjorndal H., C.G. Hellerquist, B. Lindberg, S. Svensson // Angew. Chem. 1970. - V. 82. - № 16. - P. 643 - 652.

114. Калмыкова E.H. Необычные моносахариды в О-факторах липополисахаридов грамотрицательных бактерий Текст. / E.H. Калмыкова, Р.П. Горшкова, Ю.С. Оводов // Хим. природн. соедин. 1989. - № 6. - С. 743 - 763.

115. Шашков, A.C. Конформационная зависимость химического сдвига ангомерных атомов углеродв в олиго- и полисахаридах Текст. / A.C. Шашков // Биоорган. Химия. 1983. - Т. 9. - № 2. - С. 246 -253.1 -э

116. Westphal O. Chemistry and Immunochemistry of Bacterial lipopolysaccharides as cell wall antigens and endotoxins Text. /

117. О. Westphal, К. Jam, К. Himmelspach // In: Prog. Allergy (Eds Ishizaka K., Kallos P., Waksman B.H., de Wesk A.L.) Karger : Basel. -1983.-V. 33.-P. 9-39.

118. Смирнов, И. В. Возбудитель иерсиниоза и близкие к немумикроорганизмы Текст. / И.В. Смирнов // Клин, микробиол.антимикроб, химиотер. 2004. - Т. 6. - № 1. - С. 10-21.

119. Cherkassky, B.L. Food-related zoonosis in people of Russia Text. /

120. B.L. Cherkassky, L.G. Podounova, N.K. Akoulova // Ditto. P. 18 -19.

121. Ющенко, Г.В. Опыт клинического использованияродоспецифического иерсиниозного эритроцитарногодиагностикума для РНГА Текст. /Г.В. Ющенко // Эпидемиологияи инфекционные болезни 1998. - № 6. - С. 8 - 11.

122. Быданов, М. Л. Некоторые клинические особенности теченияиерсиниозной инфекции у детей Текст. / М.Л. Быданов //

123. Экология человека. 1999. - № 3. - С. 65 - 66.

124. Ценева, Г. Я. Псевдотуберкулез и иерсиниоз (эпидемиология,клиника, диагностика, терапия) Текст. / Г. Я. Ценева, Г. И.

125. Кокорина, Е. А. Воскресенская, О. А. Шендерович //

126. Методические рекомендации. СПб. 2005. - 50 с.

127. Koornhof H.J. Yersiniosis II: the pathogenesis of Yersinia infections

128. Text. / H.J. Koornhof, R.A. Smego, M.Jr. Nicol // Eur. J. Clin.

129. Microbiol. Infect. Dis.-1999.-V 18. -№87. -P. 112.

130. Butler, T. Yersinia species, including plague. Principles and Practice of1.fectious Diseases Text. / T. Butler, G.L. Mandell, J.E. Bennett, R. Dolin// 5th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone. 2000. -P.2101 -2111.

131. Di Genaro, M.S. Yersinia enterocolitica 0:8 and 0:5 lipopolysaccharide arthritogenicity in hamsters Text. / M.S. Di Genaro, E. Muffoz, C. Aguilera, A.M.S. de Guzman // Rheumatology. -2000-V. 39.-P. 73 -78.

132. Фоломеева, О. M. Тенденции в изменении показателей заболеваемости ревматическими болезнями населения Российской Федерации за 5-летний период (1999—2003гг.) Текст. / О.М. Фоломеева, Ш.Ф. Эрдес, В.А. Насонова // Терапевтический архив.-2005.-№5.-С. 18.

133. Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. СПб. НИИЭМ им. Пастера. - 2006. -С. 81 - 83.

134. Справочник практического врача Текст. / Под ред. А. И. Воробьева. М.: Медицина, 1981. - 656 с. http://www.stormed.ru/diseases/rhe/le.php http ://www. medeffect.ru/so/ arthritis-0038. shtml

135. Фримель, X. Основы иммунологии Текст. / X. Фримель, Й. Брок -М.: Мир. 1986.-254 с.

136. Давдариани, 3. JI. Методические особенности получения и иммунохимическая характеристика видо- и сероваро-специфических псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозныхдиагостических иммуноглобулинов Текст. / 3. JL Давдариани, В.

137. A. Федерова, Ж. Г. Самелия, Д. В. Уткин, Н. М. Ермаков, Н. Е. Терешкина // «Инфекции, обусловленные иерсиниями»: II Всеросс. науч.-практ. конф.- СПб. НИИЭМ им. Пастера. 2006. -С. 64-66.

138. Стенкова, А. М. Двухраундовая ПЦР для дифференциальной диагностики Y. Enterocolitica Текст. / A.M. Стенкова, М.П. Исаева, К.В. Гусев, О. Д. Новикова, Ф.Н. Шубин,

139. B. А. Рассказов // «Инфекции, обусловленные иерсиниями»: II Всеросс. науч.-практ. конф.- СПб. НИИЭМ им. Пастера. 2006. -С. 125 - 127.

140. Егоров, А. М. Теория и практика иммуноферментного анализа Текст. / A.M. Егоров. М.: Высш. Шк., 1991. - 288 с. - ISBN 5060006441.

141. Хроматография. Практическое применение метода. Текст./ Под ред. Э. Хефтмана (перевод с англ. Под ред. Березина). М.: Мир, 1986.-422 с.

142. Burtseva, Т. I. A method for separate quantitative determination of 2-keto-3-deoxyoctonate and 3,6-dideoxyhexoses in mixtures Text. / Т. I. Burtseva, L. I. Glebco, Yu. S. Ovodov // Anal. Biochem. 1975. -V. 64. №1.-P. 1 -4.

143. Бурцева, Т. И. Определение гептоз в бактериальных липополисахаридах Текст. / Т. И. Бурцева, Ю. С. Оводов // Химия природн. соедин. 1982. -№ 2. - С. 1 - 4.

144. Elson, L. A. Colorimetric method for determination of hexosamines Text. / L. A. Elson, W. Т.-J. Morgan // Biochem. J. 1933. - V. 27. -№ 11.-P. 265 -275.

145. Trutnovsky, H. Photometric microdetermination of acetyl groups inorganic compounds Text. / H. Trutnovsky, A. B. Sakla, S. A. Taleb //

146. Microchem. J. 1975. - V. 20. - № 4. - P. 415 - 420.

147. Спирин A.C. Спектрометрическое определение суммарногоколичества нуклеиновых кислот Текст. / А. С. Спирин //

148. Биохимия. 1958. - Т. 28. - № 5. - С. 656 - 662.

149. Ovodov, Yu. S. Chemical and immunochemical studies on Yersiniapseudotuberculosis lipopoysaccharides. II. Lipopolysaccharides fromtype IB microorganism Text. / Yu. S. Ovodov, R. P. Gorshkova,

150. S. V. Tomshich // Immunochemistry. 1974. - V. 11. - № 12. - P. 777-780.

151. Westphal, O. Uber die extraction von bacterien mit phenol/wasser Text. / O. Westphal, O. Luderitz, F. Bistier // Z. Naturforsch. 1952. -В. 7. -№ l.-P. 148- 155.

152. Savardeker, J. S. Quantitative determination of monosaccharides as their alditol acetates by gas-liquid chromatography Text. / J. S. Savardeker, J. H. Sloneker, A. R. Jeanes // Anal. Chem. 1965. -V. 37. - № 12. - P. 1602 - 1604.

153. Kaufmann, Н. Differenzierung samtlicher raumisomers 6-desoxy-hexosen, 3-0-Methyl-6-desoxy-hexosen und 6-desoxyhexulosen Text. / H. Kaufmann, P. Muhlradt, T. Reichstein // Helv. Chem. Acta. 1967. - V. 50. - № 8. - P. 2287 - 2298.

154. Hakomori, S. A rapid permethylation of glycolipid and polysaccharide catalysed by methylsulphinil carbanion in dimethylsulphoxide Text. / S. Hakomori // J. Biochem. (Tokyo). 1964. - V. 55. - № 1. - P. 205 -208.

155. Иммунохимический анализ Текст. / Под ред. JI.A. Зильбера. -1968.-295 с.

156. Кэбот, Е. Экспериментальная иммунохимия Текст. / Е. Кэбот, К М. Майер. М.: Медицина, 1968. - 608 с.

157. Патент РФ 2260900. Кварцевый генератор Текст. / М. В. Милонов, Л. А. Кузнецов, Т. Н. Ермолаева; заявл. 05.05.2004; опубл. 20.09.2005. Б. И. № 26.

158. Калмыкова, Е. Н. Пьезокварцевые иммуносенсоры. II. Селективное определение биологически активных веществ в жидких Текст. /

159. E. Н. Калмыкова, Т. Н. Ермолаева // Изв. вузов. Хим. и химтехнол. 2005. - Т. 48. - Вып. 12. - С. 92 - 95.

160. Eremin, S. A. Urinary cotinine fluoroimmunoassay for smoking status screening adapted to an automated analyzer Text. / S. A. Eremin, R. E. Coxon, D. L. Colbert, J. Landon, D. S. Smith // Analyst. 1992. -V. 117.-P. 697-699.

161. Hansel, M. S. Single-reagent polarisation fluoroimmunoassay for cotinine (a nicotine metab-olite) in urine Text. /М. S. Hansel,

162. F. J. Rowell, J. Landon, A. M. Sidki //Ann. Clin. Biochem. 1986. -V. 23.-P. 596-602.

163. Воробьева JI.A. Химический анализ почв Текст./ М.: МГУ. 1998. -272 с.

164. Crooks, S. Detection of levamisole residues in bovine liver and milk by immunobiosensor Text. / S. Crooks, B. McCarney, I. Traynor,

165. С. Thompson, S. Floyd, С. Elliott // Anal. Chim. Acta. 2003. -V. 483.-P. 181 - 186.

166. Ovodov, Yu. S. Chemical and Immunochemical Studies on LPS of Yersinia Species. A Review of Some Recent Inverstigations Text. / Yu. S. Ovodov, R. P. Gorshkova, S. V. Tomshich, N. A. Komandrova,

167. E. N. Kalmykova, V. A. Zubkov, V. V. Isakov // J. of Carbohydr. Chem. 1992. -№ 11.-P. 21 -35.

168. Michel, F. In : Chemie der zucker und polysaccharide Text. /

169. F. Michel, A. Klemer // Leipzig. 1956. P. 426.

170. Bjorndal, Н. Gas-liquid chromatography of partially methylated alditols as their acetates Text. / H. Bjorndal, B. Lindberg, S. Svensson // Acta Chem. Scand. 1967. - V. 21. -№ 7. - P. 1801 - 1807.13

171. Bock, K. A study of С- H coupling constant in pentopyranoses and some of their derivatives Text. / K. Bock, C. Padersen // Acta Chem.

172. Papin, J. P. Chromatographic sur couche mince des principaux cetoses Text./ J. P. Papin, M. Udiman // J. Chromatog. 1977. - V. 132. -P. 339-343.

173. Хайс, И. M. Хроматография на бумаге Текст. / И. М. Хайс, К. Мацек. М.: Ин. лит. - 1962. - 726 с.

174. Angyal, S. J. Conformational analysis in Carbohydrate chemistry. III. The 13 N.M.R. Spectra о the Hexuloses Text. / S. J. Angyal, G. S. Bethell // Aust. J. Chem. 1976. - V. 29. - № 6. - P. 1249 -1265.

175. Wilkinson, S.G. Isolation of D-threo-pent-2-ulose from the lipopolysaccharide Pseudomonas diminuta N.C.T.C. Text. / S. G. Wilkinson// Carbohrd. Res. 1981. - V. 88. - № 2. - P. 247 -252.

176. Raziuddin, S. Studies of the polysaccharide from the cell wall lipopolysaccharides (O-Antigens) of Vibrio cholerae Text. / S. Raziuddin // Indian J. Biochem. Biophys. 1977. - V. 14. - P. 262 -263.

177. Majimder, M. Structural investigation on the lipopolysacchareide from Vibrio cholerae Ogava G-2102 Text. / M. Majimder, A. K. Mukheijee, B. Guhathakurta, A. Dutta, D. Sasmal // Carbohyd. Res. 1982. -V. 103.-P. 269-278.

178. Sen, A. K. Studies on the partial structure of O-antigen of Vibrio cholerae Ynaba 569 В Text. / A. K. Sen, A. K. Mukherjee, B. Guhathakurta, A. Dutta, D. Sasmal // Carbohyd. Res. 1980. -V. 86. -№ l.-P. 1139- 1160.

179. Pozsgay, В. V. Approuch to the synthesis of the repeating units of immunodeterminant bacterial polysaccharides: synthesis and13

180. CN.M.R. analysis of D-galactopyranosyl-(l —> 3)-L-ramnopyranosyl-(1 —> 3)-L-rhamnopyranose Text. / В. V. Pozsgay, P. Nasasi, A. Neszmelyi // Chem. Comm. 1979. -№ 21. - P. 828 - 831. Книрель, Ю. А. Антигенные полисахариды бактерий. XI.13

181. Структура и спектр С-ЯМР О-специфического полисахарида Pseudomonas cepacia Текст. // Ю. А. Книрель, А. С. Шашков, Б. А. Дмитриев, Н. В. Кисянчук, И. Я. Захарова / Биоорган. Химия. 1980.-Т. 6. -№ 12.-С. 1851 - 1859.

182. Nunez, Н. A. Carbon-13 as a tool for the study of carbohydrate structures conformations and interactions Text. / H. A. Nunez, Т. E. Walker, R. Fuentes, J. O'Connor, A. Serianni, R. Barker // J. Supramol. Struct. 1977. -V. 6. -№ 4. - P. 535 - 550.

183. Кочетков, Н. К. Химия углеводов Текст. / Н. К. Кочетков,

184. A. Ф. Бочков, Б. А. Дмитриев, А. И. Усов, О. С. Чижов,

185. B. Н. Шибаев. М.: Химия, 1967. - 207 с.

186. Калмыкова, Е. Н. Структура О-специфического полисахарида из липополисахарида Yersinia enterocolitica 0:6,31 Текст. / Е. Н. Калмыкова, Р. П. Горшкова, В. В. Исаков, Ю. С. Оводов // Биоорган, хим. 1988. - Т. 14. - С. 652 - 657.

187. Perry, М. В. Structure of the lipopolysaccharide O-chain for Yersinia enterocollitica serotype 0:5,27 Text. / M. B. Perry, L. L. Maclean //

188. Biochem. Cell. Biol. 1987. -V. 65. - P. 1 - 7.

189. Ермолаева, Т. H. Пьезокварцевые иммуносенсоры. Аналитические возможности и перспективы Текст. / Т. Н. Ермолаева,

190. E. Н. Калмыкова // Успехи химии. 2006. - Т. 75. - №5. - С. 445 -459.

191. Sato, Т., Kawakami Т., Shirakawa N., Okahata Y. // Bull. Chem. Soc. Jpn. -1995. V. 68. P. 2701-2715.

192. Tombelli, S. A DNA-based piezoelectric biosensor: Stratigies for coupling nucleic acid to piezoelectric devices Text. / S. Tombelli, M. Minunni, A.Santucci, M. M. Spiriti, M. Mascini // Talanta. V. 68. -P. 806-812.

193. Калмыкова, E. H. Пьезокварцевые иммуносенсоры в анализеводных сред Текст./ Е. Н. Калмыкова, М. В. Струкова, С. А. Еремин, Т. Н. Ермолаева// Вестник ЛГТУ-ЛЭГИ. 2000. - Т. 6, №2.-С. 74-78.

194. Ulman, A. An introduction to ultra thin organic films from Langmuir-Blodgett to self-asembly Text./ A. Ulman// Academic Press. San Diego. - 1991.

195. Wibur, J. L. Scanning Force Microscopies Can Image Patterned Self-Assembled Monolayers Text./ J. L. Wilbur, H. A. Biebuyck, J. C. MacDonald, G. M. Whitesides// Langmuir. 1995. - V. 11. -P. 825-831.

196. Ohtsuka, T. Dynamic Ellipsometry of a Self-Assembled Monolayer of a Ferrocenylalkanethiol during Oxidation-Reduction Cycles Text. / T. Ohtsuka, Y. Sato, К Uosaki//Langmuir. 1994. - V. 10. - P. 3658 -3662.

197. Киселев, А. В. Молекулярные основы адсорбционнойхроматографии Текст./ А. В. Киселев, Д. П. Пошкус, Я. И. Яшин. -М.: Химия, 1986. С. 272.

198. B. В. Хоронько, С. А. Сергеева, В. Н. Каркищенко. Ростов-на-Дону. Феникс. 2001 384 с.

199. Калмыкова, Е.Н. Пьезокварцевые иммуносенсоры для анализа водных сред и биологических жидкостей Текст./ Е.Н. Калмыкова,

200. Haasnoot, W. Sulphonamide antibodies: from specific polyclonals to generic monoclonals Text./ W. Haasnoot, G. Cazemier, J. Du Pre, A. Kemmers-Voncken, M. Bienenmann-Ploum, R. Verheijen// Food. Agric. Immunol. 2000. - V. 12. - P. 15 - 30.

201. Biotechnol. -2004. V. 22. - P. 185 - 191.

202. Ермолаева, Т.Н. Пьезогравиметрический иммуносенсор для определения бактериофагов в жидких средах Текст. / Т. Н. Ермолаева, Е. Н. Калмыкова, Е. С. Дергунова // Сб. научных трудов преподавателей и сотрудников ЛГТУ. Липецк, 2003. -С. 59-61.

203. Шашканова, О. Ю. Проточные пьезокварцевые иммуносенсоры для определения фагов Текст./ О. Ю. Шашканова, Е. С. Дергунова, Е. Н. Калмыкова, Т. Н. Ермолаева// Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. - Т. 7. - № 4. - С. 548 -555.

204. Рис. 2. Градуировочный график для определения салициловой кислоты вводных растворах535353482353485323534848232323484848484823534823232348232353485323482348534853484848482323232323

205. Рис. 3-6. Градуировочные графики для определения сульфаметоксазола (а), сульфаметазина (Ь), сульфаметазина гемисукцината (с), стрептоцида (ф.3051. С нф , нг/глл

206. Рис. 7. Градуировочный график для определения нонилфенола по конкурентной схеме с использованием конъюгата НФ-ОУАс нф »нг/мл

207. Рис.8. Градуировочные графики для определения нонилфенола по конкурентной схеме с использованием конъюгата 4-АФ-ГА-БСА3073089977560 9977555 9977550 * 99775451. Ц9977540 9977535 99775300 40 80 120 160 200

208. Рис. 14. Градуировочные графики для определения бактерий У. еШегосоИйса серовара 0:3, способ 19-11. С 10 4, клеток/мл

209. Градуировочные графики для определения бактерий У еШегосоИНсасеровара 0:3,: способ 19-21. С-10"4, клеток/мл

210. Градуировочные графики для определения бактерий У еШегосоЫйсасеровара 0:3, способ 19-3310136 Н-,-Г—-10 0,2 0,4 0,6 0,8 С-10"4, кпеток/мл

211. Рис. 17. Градуировочные графики для определения бактерий У. еЫегосо1Шсасеровара 0:3, способ 201. С-10"4, клеток/мл

212. Рис. 18. Градуировочный график для определения бактерий К еШегосоИйсасеровара 0:3, способ 21