Патогенетические аспекты нарушения рецептивности эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами и методы их коррекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.01, доктор наук Мелкозерова Оксана Александровна

• Мелкозерова Оксана Александровна
• доктор наук
• 2018

Оглавление диссертации доктор наук Мелкозерова Оксана Александровна

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................6

ГЛАВА 1. НАРУШЕНИЕ РЕЦЕПТИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ У ЖЕНЩИН С БЕСПЛОДИЕМ И НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).................................................19

1.1. Влияние внутриутробных эпигенетических факторов на становление тканевой рецептивности органов репродуктивной системы........................20

1.2. Патогенетические аспекты нарушения имплантации человеческого эмбриона...................................................................................................................25

1.3. Роль стромального ремоделирования эндометрия в генезе нарушений имплантации и инвазии трофобласта.....................................................................36

1.4. Роль эндотелиальной дисфункции в нарушении системы внутриматочной микроциркуляции.............................................................................39

1.5. Значение регуляции сосудистого ремоделирования эндометрия в период имплантации и инвазии трофобласта....................................................41

1.6. «Тонкий» эндометрий - как патологический симптомокомплекс нерецептивного эндометрия...............................................................46

1.7. Проблемы терапии нерецептивного эндометрия.................................57

ГЛАВА 2. ПРОГРАММА, КОНТИНГЕНТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................................68

2.1. Материал и программа исследования..............................................68

2.2. Методы исследования.......................................................................79

2.2.1. Клинико-статистический анализ..................................................79

2.2.2. Ультразвуковое исследование органов малого таза с доплерометрией сосудов малого таза.........................................................................81

2.2.3. Микробиологические методы исследования....................................83

2.2.4. Гистологическое исследование эндометрия....................................85

2.2.5. Иммуногистохимическое исследование эндометрия.........................86

2.2.6. Сканирующая электронная микроскопия эндометрия........................88

2.2.7. Молекулярно-генетические методы исследования............................89

2.2.8. Иммуноферментный анализ........................................................90

2.2.9. Масс-спектрометрический метод.................................................91

2.2.10. Математические методы..........................................................92

ГЛАВА 3. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ЖЕНЩИН....................................................................................95

3.1. Клиническая характеристика девочек-подростков с нарушением становления менструальной функции по типу аномальных маточных кровотечений пубертатного периода.....................................................95

3.2. Клиническая характеристика женщин с маточным фактором в генезе

нарушений репродуктивной функции.................................................104

ГЛАВА 4. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ЖЕНЩИН ОБСЛЕДОВАННЫХ ГРУПП...................................................................................................................139

4.1. Особенности гормональной регуляции, функционального состояния эндотелиальной системы и ангиогенеза у пациенток с эндометриальной дисфункцией................................................................................139

4.2. Молекулярно-генетические механизмы формирования нарушений рецептивности эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами....................................................................................146

4.3. Морфологическая характеристика «тонкого» эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами................................................................183

4.4. Ультраструктурная характеристика тканевой рецептивности эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами...........................................191

4.5. Результаты иммуногистохимического исследования молекулярных

маркеров рецептивности «тонкого» эндометрия....................................200

ГЛАВА 5. ОБОСНОВАНИЕ КОНЦЕПЦИИ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ

НАРУШЕНИЕМ РЕЦЕПТИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ, У ПАЦИЕНТОК

С РЕПРОДУКТИВНЫМИ НЕУДАЧАМИ.........................................220

5.1. Оптимизация диагностики нарушений рецептивности эндометрия......220

5.1.1. Создание морфологической панели рецептивности эндометрия.........220

5.1.2. Оптимизация ультразвуковой диагностики нерецептивного эндометрия.............................................................................................................229

5.1.3. Диагностическая значимость исследования микрофлоры из полости матки в определении возможных причин нарушения рецептивности эндометрия..................................................................................234

5.1.4. Обоснование и определение показаний к проведению лечебно-диагностической гистероскопии при подозрении на заболевания,

сопровождающиеся нарушением рецептивности эндометрия....................236

5.2. Обоснование персонифицированной программы терапии и реабилитации пациенток с нарушением рецептивности эндометрия..............................239

5.2.1. Индивидуализация циклической гормональной терапии у пациенток с репродуктивными неудачами, связанными с «тонким» эндометрием..........239

5.2.2. Обоснование антибактериальной политики у пациенток с репродуктивными неудачами, обусловленными нарушением рецептивности эндометрия..................................................................................243

5.2.3. Обоснование применения в комплексе терапии «тонкого» эндометрия препаратов группы антикоагулянтов...................................................245

5.2.4. Обоснование применения энергии низкочастотного ультразвука в виде кавитированных лекарственных растворов для орошения полости матки у пациенток с репродуктивными неудачами, обусловленными «тонким» эндометрием.................................................................................247

5.2.5. Разработка и создание аппарата для ультразвукового кавитационного орошения полости матки с гистероскопической ассистенцией..................251

5.2.6. Обоснование кратности процедур ультразвукового кавитационного орошения полости матки.................................................................252

5.2.7. Обоснование применения некоторых лекарственных препаратов для кавитационного орошения полости матки у пациенток с «тонким» эндометрием.................................................................................257

5.2.8. Масс-спектрометрический анализ влияния ультразвука низкой частоты (25 кГц) на состояние молекул лекарственных веществ Filgrastim® и Ингарон® в эксперименте in vitro......................................................259

5.2.9. Описание индивидуализированной программы терапии пациенток с репродуктивными неудачами, обусловленными гипоплазией эндометрия... .261

ГЛАВА 6. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗРАБОТАННОЙ КОНЦЕПЦИИ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЕМ РЕЦЕПТИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ, У ПАЦИЕНТОК С РЕПРОДУКТИВНЫМИ НЕУДАЧАМИ................................................................................................268

6.1. Сравнительный анализ данных клинического обследования и жалоб пациенток групп наблюдения в динамике стандартной и индивидуализированной программ терапии..........................................269

6.2. Оценка ультразвуковой картины эндометрия, цветового доплеровского картирования и спектральной допплерометрии сосудов матки в динамике стандартной и индивидуализированной программ терапии......................273

6.3. Оценка состояния микробиоты половых путей женщин с репродуктивными неудачами, ассоциированными с гипоплазией эндометрия в динамике терапии..........................................................................281

6.4. Оценка изменений морфологической картины эндометрия в динамике различных программ терапии пациенток с репродуктивными неудачами на фоне «тонкого» эндометрия..............................................................286

6.5. Сравнительный анализ состояния тканевой рецептивности эндометрия у пациенток в группах наблюдения в динамике терапии............................294

6.6. Сравнительный анализ молекулярных маркеров рецептивности эндометрия у женщин с бесплодием и привычным невынашиванием беременности, ассоциированными с «тонким» эндометрием, в динамике комплексной терапии......................................................................299

6.7. Сравнительный анализ эффективности стандартной и индивидуализированной программ терапии «тонкого» эндометрия в

восстановлении фертильности женщин...............................................311

ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.......................................320

ВЫВОДЫ.....................................................................................371

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................375

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................377

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................378

ПРИЛОЖЕНИЕ А.

415

ВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Состояние репродуктивного здоровья населения России является фактором ее национальной безопасности. В стране сформировались реальные предпосылки для депопуляции за счет сокращения числа и ухудшения качества здоровья женщин репродуктивного возраста, высокой распространенности бесплодия и невынашивания беременности, ухудшения здоровья и уменьшения численности девочек-подростков - потенциальных матерей [37, 57].

Значительные успехи репродуктивной медицины, достигнутые за последние десятилетия, не изменили проблему снижения демографических ресурсов нашей страны. По данным Всемирной организации здравоохранения частота бесплодных браков в России превышает 15%, что считается критическим уровнем для воспроизводства населения нации [55, 402, 255]. Более чем тридцатилетняя история существования методов вспомогательной репродукции не привела к снижению распространенности бесплодного брака, а эффективность программ экстракорпорального оплодотворения не меняется уже многие годы и остается на уровне 30-40 % [71, 77, 118]. «Последним непреодолённым рубежом» вспомогательных репродуктивных технологий, по мнению их создателя -Роберта Эдвардса, является нерецептивный эндометрий, и ситуация не изменилась за прошедшие десять лет с момента провозглашения этого постулата [220]. Маточный фактор бесплодия остается основной причиной репродуктивных неудач ЭКО при переносе эмбрионов хорошего качества, определяя до 70% в их структуре [23].

Частота самопроизвольного прерывания беременности в России продолжает оставаться стабильно высокой, занимая от 15 до 23% всех зарегистрированных беременностей, при этом около 50% выкидышей приходится на долю привычного невынашивания беременности [57].

В структуре ранних репродуктивных потерь неразвивающаяся беременность занимает доминирующее положение, определяя не только масштабы репродуктивных потерь, но и неблагоприятный репродуктивный прогноз [50, 115].

Российская Федерация занимает лидирующие позиции в мире по распространенности неблагоприятных в отношении эндометрия медицинских практик, которые в том числе касаются завершения беременности хирургическим путем, при помощи кюретки. Производимое количество абортов в России в десятки раз превышает показатели стран с развитой системой планирования семьи [55, 402, 255]. При этом, несмотря на ряд фундаментальных отечественных научных исследований в России отсутствует рутинная практика постабортной реабилитации, как и реабилитации женщин после неразвивающейся беременности, повторных неудач ВРТ и единый четкий алгоритм их обследования. Предопределенность дальнейших репродуктивных неудач у таких пациенток вне полноценной комплексной патогенетически выверенной стратегии связана с крайне высоким риском формирования нарушений рецептивности эндометрия на фоне хронического эндометрита, являющегося отправной точкой патогенеза данных осложнений.

Назрела высокая необходимость систематизации большого массива данных о патологии рецептивности эндометрия, как причине нарушений репродуктивной функции женщин, изучения патогенетических механизмов ее формирования, клинических аспектов ее реализации с целью объективизации критериев диагностики нерецептивного эндометрия и создания персонифицированных клинических рекомендаций по лечению данной патологии.

Малоизучены вопросы влияния внутриутробных эпигенетических факторов на реализацию рецептивности эндометрия в репродуктивном возрасте. По данным Глобального Исследования ВОЗ ежегодно в мире рождается около 20 миллионов детей с низкой массой тела (<2500 г), из которых около 10,2 миллионов младенцев рождаются с низкой массой тела в доношенном сроке

(LBW - low birth weight) [172, 294]. Это составляет 27% от всех родившихся живыми. Последние систематические обзоры подтверждают, что метаболические эффекты, связанные с низким весом при рождении проявляются в очень молодом возрасте и сохраняются в течение жизни. Доказано развитие у людей, рожденных с низкой массой тела, метаболического синдрома, ожирения, артериальной гипертензии, сахарного диабета 2 типа и эндотелиальной дисфункции [163, 191, 224]. Существуют единые эпигенетические механизмы формирования данной патологии, предопределяемые внутриутробно программируемым гиперметилированием промотерных областей ряда генов и модификацией гистонов [271,194], которые во взрослом возрасте способны оказывать влияние на функционально-регенераторные возможности различных тканей человека, в том числе процессы пролиферации, сосудистого стромального ремоделирования, рекрутинга иммунокомпетентных клеток, неоангиогенеза и регенерации в эндометрии. Подобных работ в мировой литературе немного и требуются дальнейшие исследования, подтверждающие эти положения.

В мире отсутствует единая методология определения рецептивности эндометрия и персонификации «имплантационного окна». Диагностические маркеры рецептивности эндометрия не стратифицированы по информативности, имеют недостаточную доказательную базу в плане интерпретации результатов, трудно воспроизводимы в рутинной клинической практике, и многие из них пока используются только в научных целях [26, 83, 94, 99, 101, 131, 169, 238].

Серьезнейшей проблемой является отсутствие мер воздействия на нерецептивный эндометрий. Описанные в литературе способы повышения рецептивности эндометрия разрозненны и имеют весьма низкую доказательную базу. Эффективность гормональной терапии нерецептивного эндометрия недостаточна [109]. Средства, улучшающие микроциркуляцию и реологию крови, действуют на системном уровне. Проблема связана с отсутствием точки приложения для лечебного воздействия - изменения паттерна экспрессии рецепторных белков эндометрия [99, 413].

Резюмируя обширную, но нередко противоречивую и фрагментарно изложенную информацию о различных аспектах проблемы репродуктивных неудач, связанных с нарушением рецептивной функции эндометрия, отметим, что эффективное восстановление фертильности и преодоление невынашивания беременности возможно лишь при комплексном подходе, предусматривающем объективный и четкий диагностический алгоритм, патогенетически обоснованную тактику лечения и реабилитации с позиций персонифицированной медицины.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Патогенетические аспекты нарушения рецептивности эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами и методы их коррекции»

Цель работы

Улучшение репродуктивных исходов на основании применения патогенетически аргументированной системы лечебно-диагностических мероприятий у пациенток с репродуктивными неудачами, обусловленными нарушением рецептивности эндометрия.

Задачи исследования

1. Определить клинико-анамнестические детерминанты, в том числе роль низкого веса при рождении, и нозологические формы гинекологических заболеваний, приводящие к нарушению рецептивности эндометрия.

2. Изучить молекулярно-генетические механизмы нарушения регуляции рецептивности эндометрия на основании обследования одноаллельных полиморфизмов генов рецепторов половых стероидов, регуляции ангиогенеза, эндотелиальной функции и тромбофилии у пациенток с репродуктивными неудачами, обусловленными «тонким» эндометрием.

3. Оценить морфофункциональные и ультраструктурные особенности «тонкого» эндометрия у пациенток с бесплодием и привычным невынашиванием беременности.

4. Исследовать молекулярно-биологические механизмы нарушений стромальной секреторной трансформации, сосудистого ремоделирования и

миграции иммунокомпетентных клеток в «тонком» рефрактерном эндометрии у пациенток с повторяющимися репродуктивными неудачами и определить предикторы оценки рецептивности эндометрия.

5. Разработать патогенетически обоснованную программу диагностических и лечебных мероприятий у пациенток с бесплодием и ранними репродуктивными потерями, обусловленными «тонким» эндометрием.

6. Оценить эффективность разработанной персонифицированной программы терапии и реабилитации пациенток с репродуктивными неудачами, обусловленными нарушением рецептивности эндометрия.

Методология и методы исследования

Методология данной работы была основана на принципах доказательной медицины и складывалась из пяти этапов. На первом этапе предпринято проспективное сравнительное контролируемое исследование девочек-подростков с нарушением становления менструальной функции. Методология второго этапа - открытое проспективное стратифицированное контролируемое исследование, предусматривающее комплексное обследование женщин репродуктивного возраста с маточным фактором бесплодия и невынашивания беременности. На третьем этапе проведено ретроспективное сравнительное когортное исследование, включающее изучение механизмов нарушения имплантации при неразвивающейся беременности. Четвертый этап исследования - проспективное двойное слепое контролируемое исследование, направленное на изучение влияния энергии низкочастотного ультразвука на восстановление биологических параметров эндометрия. Пятый этап работы - сравнительное проспективное контролируемое исследование, предполагал оценку эффективности разработанной концепции лечебно-диагностических мероприятий.

Для реализации поставленных в работе цели и задач использовался комплексный подход, включающий клинико-анамнестические, молекулярно-генетические, молекулярно-биологические, ультразвуковые, доплероме-

трические, бактериологические, бактериоскопические, патоморфологические, иммуногистохимические, электронно-микроскопические, масс-спектро-метрический, статистические методы исследования, а так же клинический метод проведения терапии по предложенному алгоритму, включающему медикаментозное лечение и местное применение физических факторов, с последующей оценкой эффективности лечения.

Степень достоверности, апробации результатов, личное участие автора

Исследование проводилось в соответствии с принципами доказательной медицины. Достоверность результатов работы обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений с использованием рекомендуемых статистических методик и прикладных статистических пакетов программ SPSS 16.0.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих мероприятиях: VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине Казахстанской Ассоциации Репродуктивной Медицины «Современные подходы к лечению бесплодия. ВРТ: настоящее и будущее» (Алматы, 2014), VI Общероссийском семинаре «Репродуктивный потенциал России: версии и контраверсии» (Сочи, 2013, 2015, 2017), Научно-практической конференции с международным участием «Нерешенные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии» (Екатеринбург, 2014), I Общероссийской конференции с международным участием «Перинатальная медицина: от предгравидарной подготовки к здоровому материнству и детству», (Санкт-Петербург, 2014), Общероссийской школе «Замершая беременность: от проблем к решениям» в рамках конгрессов: II, III, IV Общероссийского научно-практического семинара «Репродуктивный потенциал России: уральские чтения», (Екатеринбург 2015, 2017), «Ранние сроки беременности. Проблемы ВРТ», (Москва, 2015); Международном конгрессе «Репродуктивный потенциал семьи - гарантия безопасности государства» IV Конгресса акушеров-гинекологов Уральского

Федерального округа (Екатеринбург, 2015); II Научно-практической конференции с международным участием «Национальный и международный опыт охраны репродуктивного здоровья детей и подростков» (Москва, 2016), II Малышевских чтениях, посвященных 100-летию присвоения статуса "Повивально-гинекологического института" (Екатеринбург, 2016), Международной конференции «Неклассическое ЭКО: пути решения» (Екатеринбург, 2017), Научно-практической конференции акушеров-гинекологов УрФО «НИИ ОММ - 140 лет на страже здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург, 2017), Научно-практической конференции акушеров-гинекологов УФО «Перинатальная медицина: достижения и пути развития» (Челябинск, 2017), 17th World Congress of the Academy of Human Reproduction (Rome, 2017), BIT'S Vth International Congress of Gynecology and 0bstetrics-2017 (Prague, 2017).

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с научным консультантом, д.м.н., проф. Н.В.Башмаковой. Дизайн исследования разработан лично диссертантом. Автором лично проведено обследование и лечение женщин групп наблюдения, получение и интерпретация результатов исследования.

Инструментальные исследования проводились совместно с отделением биофизических и лучевых методов исследования ФГБУ «Уральский НИИ ОММ» МЗ РФ, зав. отделением к.м.н. Косовцова Н.В. Лабораторные исследования осуществлялись совместно с лабораторией генетики ФГБУ «Уральский НИИ ОММ» МЗ РФ, зав. отделением к.м.н. Третьякова Т.Б., лабораторией патоморфологии, иммунологии и клинической микробиологии ФГБУ «Уральский НИИ ОММ» МЗ РФ, зав. отделением д.м.н., проф. Чистякова Г.Н. Статистическая обработка первичных данных, интерпретация и анализ полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации,

представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях осуществлялись соискателем лично.

Положения, выносимые на защиту

1. Клиническими предикторами заболеваний, приводящих к нарушению рецептивности эндометрия, являются неблагоприятные перинатальные факторы, органические поражения матки и/или травма эндометрия, хронический эндометрит, определяющие рецидивирующий характер ранних репродуктивных потерь с последующим развитием маточной формы вторичного бесплодия, резистентного к проведению вспомогательных репродуктивных технологий.

2. Генная сеть, включающая систему генов рецепторов половых стероидов, регуляторов ангиогенеза, эндотелиальной функции, гемостаза, регулирует процессы рецептивности эндометрия. Полиморфизм генов, входящих в эту систему, нарушение межгенных взаимодействий может определять изменение параметров рецептивности эндометрия и приводить репродуктивным потерям.

3. Структурными маркерами нарушения рецептивности эндометрия являются морфологические признаки хронического воспаления и его исходов, либо диспластические процессы, сопровождающиеся нарушением формирования и созревания пиноподий, разобщения плотных межклеточных контактов и дисплазией клеток микроокружения.

4. Функциональными маркерами нарушения рецептивности эндометрия являются отсутствие полноценной стромальной секреторной трансформации, сосудистого ремоделирования и нарушение популяционного состава иммунокомпетентных клеток в имплантационном эндометрии.

5. Существует два патогенетических варианта формирования синдрома рефрактерного эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами: на фоне хронического воспаления - воспалительный путь и на фоне регенераторно-пластической недостаточности, ассоциированной с внутриутробно-программируемой эндотелиальной дисфункцией - диспластический путь.

6. Программа диагностических мероприятий нерецептивного эндометрия должна сочетать единство и последовательность ультразвукового, доплерометрического, морфологического, иммуногистохимического исследования с обязательной гистероскопической визуализацией эндометрия.

7. Разработанная программа терапии, включающая хирургическую коррекцию органической патологии матки, персонифицированный подход к выбору гормональной терапии, элиминацию патогенной микрофлоры и внутриматочные орошения кавитированнымии растворами, с клинически обоснованным выбором лекарственного препарата, позволяет добиться функциональной полноценности эндометрия в 85,9 % при снижении ранних репродуктивных потерь в 3,3 раза и реализации репродуктивной функции у 69,34% женщин.

Научная новизна исследвования

Впервые продемонстрировано влияние низкого веса при рождении на формирование к периоду пубертатного возраста высоких темпов и дисгармоничного характера физического и полового развития, которые сохраняются на протяжении жизни женщин и определяют ее соматическое и репродуктивное здоровье.

Доказано значение генетически детерминированного синдрома эндотелиальной дисфункции у девочек-подростков и женщин, рожденных с низким весом, в генезе нарушений функции эндометрия.

Определены ряд молекулярно-генетических предикторов формирования «тонкого» эндометрия у пациенток с бесплодием и невынашиванием беременности, образующих генную сеть посредством межгенных ассоциаций (NOS3 786 T>C, ESR1 397Т>С, VEGF 2578 C>A, VEGF-А 634 G>C, VEGF-А 936С>Т, PAI-1 675 5G>4G).

Выявлено, что межгенные взаимодействия генов эндотелиальной NO-синтазы (NOS3 786T>C, 894G>T) и генов рецепторов-альфа к эстрадиолу ESR1

(ESR1 351A>G, 397T>C) носят сильный синергический характер, что определяет роль эндотелиальной дисфункции в нарушении стероидной рецепции к эстрогенам.

Определена ассоциация молекулярно-генетических (VEGF-А 936С>Т -936 Т; VEGF-А 634 G>C -634С) и морфологических (гиповаскуляризация и аваскуляризация ворсин хориона) предикторов нарушения формирования маточно-плацентарной зоны эндометрия при неразвивающейся беременности.

Впервые проанализированы и описаны нормальные и патологические формы развития пиноподий и клеток микроокружения имплантационного эндометрия по данным сканирующей электронной микроскопии при различных видах нарушений репродуктивной функции женщин.

Установлены патоморфологические и ультраструктурные параллели в нарушении тканевой рецептивности эндометрия у женщин с бесплодием и невынашиванием беременности.

Впервые выявлены функциональные особенности нарушений рецептивности эндометрия (изменение соотношения экспрессии стероидных рецепторов, индукторов пролиферации, апоптоза и ангиогенеза, изменение популяции маточных киллеров) у женщин с репродуктивными неудачами, рожденных с низким весом.

Раскрыты два патогенетических варианта формирования нарушений рецептивности эндометрия у женщин с маточным фактором бесплодия и невынашивания беременности. Первый вариант связан с нарушением рецептивности эндометрия на фоне течения хронического эндометрита -воспалительный путь. Второй вариант обусловлен формированием его гипоплазии на фоне регенераторно-пластической недостаточности, ассоциированной с внутриутробно-программируемой эндотелиальной дисфункцией - диспластический путь.

Впервые исследованы молекулярные эффекты низкочастотной ультразвуковой кавитации при воздействии на ткань эндометрия in vivo. Показана активация неоангиогенеза, восстановление паттерна рецепторных

белков, уменьшение воспалительной реакции стромы, восстановление баланса иммунокомпетентных клеток, элиминация патогенных и условно-патогенных возбудителей и восстановление рецептивности эндометрия при орошении полости матки кавитированными ультразвуком низкой частоты растворами.

Разработана и научно обоснована программа лечебно-диагностических мероприятий по реабилитации женщин с репродуктивными неудачами, обусловленными нарушением рецептивности эндометрия, основанная на понимании патогенетических механизмов развития данной патологии, которая позволяет восстановить функциональные свойства и показатели рецептивности эндометрия у 85,9% женщин.

Теоретическая и практическая значимость работы

Расширены представления о роли одноаллельных полиморфизов генов эндотелиальной NO-синтазы, половых стероидных рецепторов ERa и PR, сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF-A, тканевого ингибитора активатора плазминогена 1 типа PAI-1, а так же фенотипических особенностей функции эндотелиальной системы, экспрессии рецепторов половых стероидов, регуляторов ангиогенеза в развитии нарушений рецептивности эндометрия.

Разработан и сконструирован аппарат для проведения ультразвукового кавитационного орошения полости матки с гистероскопической ассиситенцией, который сочетает возможность терапевтического воздействия на эндометрий кавитированных низкочастотным ультразвуком жидких лекарственных сред с прямой визуализацией патологического процесса в эндометрии (Патент № RU 2606495 C2 17.01.2017).

На основании исследования молекулярных маркеров рецептивности эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами и фертильных здоровых женщин разработан способ оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» (Приоритетная справка № 2017120910 от 14.06.2017).

Проведен научный эксперимент, доказывающий на основании масс-

спектрометрического исследования сохранение стабильности молекул гранулоцитарного колоне-стимулирующего фактора и интерферона гамма под воздействием ультразвука низкой частоты (25кГц) с экспозицией воздействия 5 минут.

Предложен способ лечения нарушений рецептивности эндометрия у пациенток с маточной формой бесплодия с применением кавитированного раствора гранулоцитарного колоне-стимулирующего фактора роста (Приоритетная справка № 2017120906 от 14.06.2017).

Предложен способ лечения нарушений рецептивности эндометрия у пациенток с привычным невынашиванием беременности на фоне хронического эндометрита хламидийной, микоплазменной и вирусной этиологии с применением кавитированного низкочастотным ультразвуком лекарственного раствора интерферона гамма (Приоритетная справка №2017120908 от 14.06.2017).

Расширены представления о характере микробиома эндометрия и обнаружена корреляционная взаимосвязь его состава с вагинальной микробиотой женщины.

Эффективность комплексной персонифицировнанной программы терапии подтверждена на основании глубокого динамического анализа данных клинического, молекулярно-биологического, морфологического,

ультраструктурного, бактериологического и инструментального методов исследования, что демонстрирует уменьшение в 17 раз частоты клинических проявлений нарушения менструальной функции, снижением ранних репродуктивных потерь в 3,3 раза, восстановлением фертильности у 69,34% женщин с маточной формой бесплодия и завершения беременности живорождением у 50,5% женщин.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты проведенной работы внедрены в клиническую практику ФГБУ

«Уральский НИИ Охраны материнства и младенчества» МЗ РФ (Екатеринбург), АО «Международный Центр репродуктивной медицины» (Санкт-Петербург), КГБУЗ «Краевая клиническая больница» (Барнаул), ГБУ «Курганская больница №2», МБУ ЦГБ №7 (Екатеринбург), МЦ «Гармония» (Екатеринбург), МЦ «Женская клиника» (Екатеринбург), используются в учебном процессе в программах постдипломного обучения в ФГБУ «Уральского НИИ Охраны материнства и младенчества» МЗ РФ, кафедры акушерства и гинекологии и кафедры акушерства и гинекологии ФПК и ПП ГБОУ ВПО «Уральского государственного медицинского университета».

Публикации

Соискатель имеет 67 опубликованных работ, из них по теме диссертации -32 научных работы, в том числе 1 монография в соавторстве, 19 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а так же 4 статьи в зарубежных научных изданиях, цитируемых SCOPUS и РИНЦ. Соискателю выданы 1 патент и 3 заявки на изобретения. По теме работы опубликовано 1 учебное пособие и 1 практическое руководство для врачей, 4 работы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов, 1 публикация в электронных научных изданиях.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 424 страницах машинописного текста, иллюстрирована 69 рисунками и 85 таблицами и состоит из введения, обзора литературы, семи глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиографический указатель включает 433 источников, из них 146 — отечественных и 287 — зарубежный источник.

ГЛАВА 1

НАРУШЕНИЕ РЕЦЕПТИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ У ЖЕНЩИН С БЕСПЛОДИЕМ И НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Проблемы репродуктивных неудач, включающие бесплодный брак и привычное невынашивание беременности, являются наиболее актуальными в современном акушерстве и гинекологии, поскольку имеют не только медицинское, но большое социальное значение. Это связано с наметившейся в последние годы неблагоприятной демографической тенденцией, связанной со снижением рождаемости населения нашей страны [103]. В настоящее время в пору репродуктивного возраста вступили молодые люди, рожденные в 90-е годы прошлого столетия, когда фиксировался демографический провал в рождаемости населения нашей страны. С другой стороны, по данным Всемирной организации здравоохранения частота бесплодных браков в России превышает 15%, что считается критическим уровнем для воспроизводства населения нации [109, 255, 402].

С внедрением вспомогательных репродуктивных технологий наметилась устойчивая тенденция к изменению лидирующего фактора бесплодия: доминирующее положение теперь занимает маточный фактор, который составляет до 62% в структуре непреодолённых причин женского бесплодия в популяции российских женщин [46,118].

Несмотря на многочисленные научные изыскания, остается весьма актуальной проблема ранних репродуктивных потерь. Частота самопроизвольного прерывания беременности в России остается высокой - от 15 до 23% всех зарегистрированных беременностей, при этом около 50% выкидышей приходится на долю привычного невынашивания беременности [57]. Неразвивающаяся беременность занимает доминирующее положение в структуре ранних репродуктивных потерь [115]. Актуальность этой проблемы связана не только с масштабами репродуктивных потерь, но и с

неблагоприятным репродуктивным прогнозом. По данным Доброхотовой Ю.Э. в 27,4% случаях после перенесенной неразвивающейся беременности отмечается бесплодие и привычное невынашивание [50].

Нарушение полноценной имплантации человеческого эмбриона в связи с нерецептивным эндометрием является наиболее значимой причиной репродуктивных неудач ВРТ, занимая в их структуре до 70% [118, 23], а также ранних репродуктивных потерь беременности. Потому в последние годы в фокусе научного интереса находятся исследования, посвященные изучению рецептивности эндометрия при патологии имплантации, связанной с бесплодием и привычным невынашиванием беременности.

1.1. Влияние внутриутробных эпигенетических факторов на становление тканевой рецептивности органов репродуктивной системы

Правильное формирование функционально полноценного эндометрия, способного в дальнейшем адекватно презентовать паттерн рецептивности у фертильных женщин, начинается еще на этапе внутриутробного развития.

В антенатальный период формирование репродуктивной системы происходит под действием как генетических, так и эпигенетических факторов [44]. Определяющее значение в формировании пола играют генетические факторы, действующие с момента зачатия. Эпигенетические факторы подразделяются на внутренние (ферментные системы, индукторы генома, гормоны) и внешние (воздействие окружающей среды, физические, химические, инфекционные и др.) [80].

К доминирующим эпигенетическим факторам, действующим на более поздних этапах эмбриогенеза и влияющим на формирование рецептивности органов женской репродуктивной системы во внутриутробном периоде, относят хроническую фетоплацентарную недостаточность (ХФПН) с исходом в синдром задержки роста плода (СЗРП).

Синдром задержки роста плода - это совокупность нарушений морфологического и функционального состояния плода, развивающихся вследствие изменений обменных процессов в фетоплацентарной системе [18, 133]. СЗРП диагностируют у детей, имеющих недостаточную массу тела и/или длину тела ниже 10% перцентилия при данном сроке беременности, и (или) если морфологический индекс зрелости отстает на две и более недель от истинного гестационного возраста [59].

Плацентарная гипоперфузия при развитии плацентарной недостаточности имеет двойной генез - недостаточность второй волны инвазии цитотрофобласта в устья спиральных артерий (14-17 неделя беременности) и неполноценная морфофункциональная перестройка спиральных артерий. Часть спиральных артерий при ХФПН сохраняет свой мышечный слой и способность к спазму в ответ на эндогенные и экзогенные стимулы (нервные сигналы, вазоконстрикторы эндотелиального происхождения), что ведет к плацентарной ишемии в результате плацентарной гипоперфузии с нарушением темпов роста плода [78].

Доказана роль дисфункции эндотелия в патогенезе плацентарной недостаточности и развитии СЗРП [87, 284]. Идея о том, что в основе патогенеза осложнений гестации лежит патология эндотелия, принадлежит Roberts и соавторам. (1989). Они обнаружили гломерулоэндотелиоз у беременных с преэклампсией — морфологическое изменение, не встречающееся ни при какой другой форме гипертензии и представляющее собой увеличение гломерулы вследствие гипертрофии эндотелия [21]. Дефекты плацентации на этапе имплантации и формирования плаценты приводят в дальнейшем к нарушению маточно-плацентарного кровотока и к развитию ишемии плаценты.

Плацентарный ангиогенез определяют продуцируемые эндотелием вазоактивные факторы и медиаторы: VEGF, HIF-1a, ангиогенин, NO, тромбоксан, эндотелин и др. [88,177]. Имеются данные, что именно с изменением их продукции при дисфункции эндотелия связано развитие плацентарной недостаточности, СЗРП и преэклампсии [261,320,348].

С другой стороны, убедительно доказана роль полиморфизма генов NOS3 и VEGF в развитии плацентарной недостаточности и преэклампсии [284, 289].

Таким образом, у матерей, родивших девочек с СЗРП на фоне ХФПН, определяется высокая частота неблагоприятных мутаций в генах, отвечающих за функционирование эндотелиальной системы с фенотипическими проявлениями в виде осложнений гестации [34, 284, 289]. Это, в свою очередь, дает возможность предположить наличие у девочек, рожденных с СЗРП, определенного полиморфизма генов, унаследованных от матери и реализующихся фенотипически в синдром эндотелиальной дисфункции. В литературе малоизучена роль генетически детерминированной дисфункции эндотелия в нарушении становления менструальной функции. Недостаточно освещены вопросы тканевой гипоксии, как следствия эндотелиальной дисфункции, в онтогенетическом развитии эндометрия.

Снижение уровня глюкозы в крови плода является триггером, повышающим уровень глюкокортикоидов, сигнализирующих о внутриутробном стрессе и подготавливающих плод к возможному преждевременному рождению. По данным литературы, глюкокортикоиды в полной мере способны осуществлять внутриутробное программирование [240]. Их воздействие меняет экспрессию генов, определяющих рецептивность клеток, функцию внутриклеточных энзимов, влияет на развитие нейронных структур гипоталамуса. В результате меняется цитоархитектоника клеток, чувствительность их к гормонам и биологически активным веществам и параметры межклеточного взаимодействия и проницаемость тканей. Таким образом, можно считать, что нейроэндокринная система плода непосредственно вовлечена в адаптационные изменения органов и тканей при ограничении трансплацентарного транспорта кислорода и питательных веществ, программирует развитие определенной патологии после рождения [78,138]. Эти изменения затрагивают и репродуктивную систему.

Внутриутробное отставание в развитии оказывает отрицательное влияние на становление репродуктивного потенциала девочек, снижая овариальный

резерв и нарушая становление менструальной функции в период полового созревания [40,47]. Действие неблагоприятных эпигенетических факторов в период эмбриогенеза, связанных с недостаточной плацентарной перфузиией и тканевой гипоксией на фоне ХФПН, приводит к изменению паттерна экспрессии целого ряда регуляторных белков, осуществляющих дифференцировку клеток, синтез сигнальных молекул и межклеточные взаимодействия. Неблагоприятные условия внутриутробного развития могут нарушить динамику развития тканей гениталий, что сказывается в последующем на функциональном состоянии репродуктивной системы взрослой женщины, причем степень выраженности патологического процесса находится в прямой зависимости от длительности воздействия повреждающего фактора и времени этого воздействия по отношению к срокам органогенеза [45].

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Мелкозерова Оксана Александровна, 2018 год

Источник кривой

Железы в фазе

пролиферации

Строма плотная

Выраженность

сосудистого компонента

стромы

Микрополипы

Лимфоидные

инфильтраты

Опорная линия

Рисунок 27 - Анализ ROC-кривых значимых гистологических параметров

эндометрия в распознавании его рецептивности

Таблица 59 - Площадь под ROC-кривой AUC (Area Under Curve) для

выбранных гистологических параметров

Асимптотический 95%

Переменные результата проверки Стандартная Ошибкаа Асимптотическ доверительный интервал

Область ая знчь Нижняя граница Верхняя граница

Железы в фазе пролиферации ,655 ,044 ,000 ,568 ,742

Строма плотная ,805 ,035 ,000 ,736 ,873

Выраженность сосудистого ,289 ,038 ,000 ,215 ,363

компонента стромы

Микрополипы ,656 ,044 ,000 ,571 ,741

Лимфоидная инфильтрация ,717 ,037 ,000 ,644 ,789

стромы

a. В соответствии с непараметрическим предположением

Ь. Нулевая гипотеза: = действительная площадь = 0,5

Исследование апикальной поверхности мембран эндометрия в период «имплантационного окна» методом СЭМ обладает несомненной диагностической ценностью, однако в настоящее время весьма ограничено в плане воспроизведения в повседневной клинической практике и представляет в основном научный интерес. Данное обстоятельство определило проведение корреляционного анализа данных СЭМ с иммуногистохимическими, гистологическими и некоторыми клиническими параметрами (таблица 60).

ROC Кривые

1 - Специфичность

Диагональные сегменты, сгенерированные связями.

Таблица 60 - Информативные параметры корреляционного анализа данных СЭМ, иммуногистохимического и морфологического исследований

имплантационного эндометрия (n=210)

Отсутствие пиноподий, ровная апикальная поверхность Зрелые пинопо-дии Беремен ность

ER железы Корреляция Пирсона ,012 -,108 -,175**

Знач. ,850 ,090 ,006

PR железы Корреляция Пирсона -,125* -,100 ,119

Знач. ,050 ,117 ,043

ER/PR строма Корреляция Пирсона ,166** -,061 -,088

Знач. ,009 ,336 ,166

ER/PR железы Корреляция Пирсона ,129* ,054 ,091

Знач. ,043 ,401 ,155

CD34строма Корреляция Пирсона ,131* ,146* ,014

Знач. ,039 ,022 ,821

CD3строма Корреляция Пирсона -,015 ,161* -,072

Знач. ,818 ,011 ,257

CD95строма Корреляция Пирсона -,198** ,045 ,241**

Знач. ,002 ,477 ,005

Ki67строма Корреляция Пирсона ,033 ,233** ,057

Знач. ,604 ,000 ,369

VEGF-А Корреляция Пирсона -,176** ,031 ,145*

Знач. ,006 ,632 ,022

MCSF строма Корреляция Пирсона -,159* ,042 -,082

Знач. ,012 ,513 ,196

MCSF железы Корреляция Пирсона -,004 ,101 -,213**

Знач. ,947 ,114 ,001

HIF1 а^астрома Корреляция Пирсона ,047 -,003 -,184**

Знач. ,463 ,959 ,004

LIF-R железы Корреляция Пирсона -,168** ,240 ,043

Знач. ,008 ,005 ,505

LIF строма Корреляция Пирсона ,041 ,236 ,022

Знач. ,524 ,005 ,724

LIF железы Корреляция Пирсона ,127* ,097 ,073

Знач. ,046 ,127 ,252

Соответствует фазе цикла Корреляция Пирсона -,197** ,013 ,154*

Знач. ,002 ,842 ,015

Равномерность распределения желез Корреляция Пирсона -,182** -,034 ,070

Знач. ,004 ,594 ,273

Продолжение таблицы 60

Железы в фазе поздней пролиферации Корреляция Пирсона ,114 -,022 -,155*

Знач. ,073 ,733 ,015

Железы в фазе ранней секреции Корреляция Пирсона ,202** ,014 -,050

Знач. ,001 ,823 ,430

Строма рыхлая Корреляция Пирсона -,185** ,093 ,147*

Знач. ,003 ,144 ,020

Строма плотная Корреляция Пирсона ,188** -,089 -,229**

Знач. ,003 ,164 ,000

Определение пиноподий при световой микроскопии при увел. х 400 Корреляция Пирсона -,063 ,220 ,085

Знач. ,319 ,006 ,184

Полипы Корреляция Пирсона ,045 ,083 -,222**

Знач. ,477 ,195 ,000

Гипоплазия пиноподий Гладкая Апикальная поверхность по данным СЭМ Корреляция Пирсона ,013 -,247** -0,184

Знач. ,845 ,000 ,004

Спокойный эпителий по данным СЭМ Корреляция Пирсона 1,000 ,194** -,079

Знач. ,002 ,212

Нарушение межклеточных контактов по данным СЭМ Корреляция Пирсона ,322** -,036 ,060

Знач. ,000 ,569 ,350

Зрелые пиноподии по данным СЭМ Корреляция Пирсона -,194** 1,000 ,152**

Знач. ,002 ,004

Созревающие пиноподии по данным СЭМ по данным СЭМ Корреляция Пирсона -,270** -,298** ,011

Знач. ,000 ,000 ,860

Зона интенсивной секрециии по данным СЭМ Корреляция Пирсона ,012 -,274** -,055

Знач. ,854 ,000 ,387

Приложение: Уровень значимости **р<0,01; *р<0,05.

Как представлено в таблице 60, имеют место сильные корреляционные связи между структурной перестройкой апикальной поверхности мембран (наличие либо отсутствие пиноподий) и наступлением беременности в результате лечения (наличие зрелых пиноподий г=0,152; р=0,004 и соответственно отсутствие зрелых пиноподий г= -0,179; р=0,012). Из иммуногистохимических маркеров достоверные корреляционные связи с наступлением беременности отмечены для уровня экспрессии БЯ в железах (г= -0,175; р=0,006), РЯ в железах (г=0,119; р=0,043), СБ95+ в строме (г=,0,241; р=0,005), УБОБ-А в строме (г=0,145; р=,022), О-СББ в железах (г=

-0,213; р=,001); НШ1а строма (г= -0,184; р=,004). Для морфологических критериев достоверные корреляции выявлены со следующими параметрами: Соответствие развития желез фазе менструального цикла (г=0,154; р=0,015), наличие желез в фазе поздней пролиферации , что являет собой выраженный дисхронизм созревания желез (г= -0,155; р=0,015), наличие рыхлой стромы (г=0,147; р=0,020), наличие плотной стромы (г= -0,229; р=0,0001); наличие микрополипов (г= -0,222; р=0,0001).

Отсутствие пиноподий обратно коррелировало с экспрессией РЯ в железах (г=- 0,125; р=0,049); ER/PR строма (г=0,166; р=0,009), ЕЯ/РЯ железы (г=0,129; р=0,043), СБ95+ в строме (К=-0,198; р=0,02), CD34 строма (г=0,131; р=0,039), УЕОБ-А строма (г= -0,176; р=0,006), M-CSF строма (г=0,127; р=0,046). Среди морфологических параметров значимые корреляции при отсутствии пиноподий получены со следующими параметрами: равномерность распределения желез (г= -0,159; р=0,012); железы в фазе ранней секреции (г= -0,168; р=0,008), рыхлая строма (г=-0,185; р=0,003), плотная строма (г=0,188; р=0,003), выраженность сосудистого компонента стромы (г= -0,178; р=0,005).

Напротив, наличие зрелых пиноподий коррелировало с небольшим числом иммунногистохимических показателей: уровнем экспрессии СЭ34 в строме (г=0,146; р=0,022), Ki67строма (г=0,233; р=0,0001), LIF строма (г=0,236; р=0,005), ЬШ-К железы (г= 0,240; р=0,005).

Важно, что обнаружение пиноподий при световой микроскопии на уровне увеличения х 400 достоверным образом коррелировало с наличием зрелых пиноподий при СЭМ (г=0,220; р=0,006).

При построении ЯОС-кривой признак отсутствия зрелых пиноподий в период «имплантационного окна» - единственный прогностически значимый неблагоприятный критерий математической дифференцировки выборок по принципу наступления беременности (Площадь под ЯОС-кривой АиС 0.726±0.048 95%СЬ [0.631-0.021]; р=0,001 (Рисунок 28). Другие структурные показатели созревания пиноподий по данным СЭМ не имели статистического

значения при классификации по признаку частоты наступления беременности. Вследствие чего для диагностики рецептивности эндометрия достаточно определения пиноподий при световой микроскопии при увеличении х 400.

Рисунок 28 - ЯОС-анализ чувствительности и специфичности показателей СЭМ в прогнозировании рецептивности эндометрия

5.1.2. Оптимизация ультразвуковой диагностики нерецептивного

эндометрия

С целью изучения диагностической значимости некоторых параметров УЗИ в оценке рецептивности эндометрия проведен корреляционный анализ исследованных ультразвуковых критериев эндометрия и клинических, гистологических и ультраструктурных характеристик эндометрия, определяющих его рецептивность (таблица 61).

При изучении корреляций между толщиной маточного эха не получено достоверных связей со степенью диссинхронизма в созревании желез эндометрия. Несвоевременное созревание желез эндометрия не связано с толщиной маточного эха, но, как было показано выше, является важным критерием рецептивности эндометрия (таблица 61).

Таблица 61 - Корреляционный анализ исследованных ультразвуковых, гистологических и ультраструктурных параметров имплантацонного

эндометрия(n=210)

УЗИ М-ЭХО, мм УЗИ Junctinal zone, структура УЗИ Наличие признаков синехий УЗИ наличие субэндоме трального кровотока УЗИ Нарушение эхо-структуры эндометрия УЗИ наличие перистальт ики эндометрия

УЗИ М-ЭХО r 1,000 0,013 -,219** ,210** -,225** 0,155*

Р 0,865 0,003 0,004 0,002 0,037

Junctinal zone, структура r 0,013 1,000 0,134 -0,010 ,295** 0,158**

p 0,865 0,072 0,890 0,000 0,009

УЗИ Наличие синехии r -,219** 0,134 1,000 -0,010 ,453** 0,048

p 0,003 0,072 0,888 0,000 0,522

УЗИ наличие субэндометрального кровотока r ,210** -0,010 -0,010 1,000 -0,007 0,331**

p 0,004 0,890 0,888 0,929 0,000

УЗИ Нарушение эхо-структуры эндометрия r -,225** ,295** ,453** -0,007 1,000 -0,057

p 0,002 0,000 0,000 0,929 0,443

Соответствует фазе цикла по данным гистологии r ,172* 0,133 0,049 ,262** 0,079 0,718**

p 0,020 0,073 0,512 0,000 0,289 0,000

Равномерность распределения желез по данным гистологии r 0,044 0,119 -0,001 ,226** -0,100 0,319**

p 0,559 0,110 0,990 0,002 0,179 0,000

Железы в фазе поздней пролиферации по данным гистологии r -0,032 -0,074 ,180* -0,091 ,232** -0,210**

p 0,669 0,318 0,015 0,222 0,002 0,004

Железы в фазе ранней секрециипо данным гистологии r -0,118 -0,093 -0,120 -,277** -,166* -0,631**

p 0,112 0,211 0,106 0,000 0,025 0,000

Железы в фазе средней секреции по данным гистологии r ,155* 0,058 0,048 ,331** 0,126 0,211**

p 0,037 0,439 0,522 0,000 0,090 0,000

Железы в фазе поздней секреции по данным гистологии Строма рыхлая по данным гистологии r 0,050 -0,002 ,154* 0,139 -0,027 0,043

p 0,506 0,974 0,038 0,061 0,719 0,566

r 0,044 0,076 0,045 0,038 -0,026 ,340**

p 0,551 0,306 0,548 0,606 0,724 0,000

Строма плотная по данным гистологии r -0,061 -0,097 0,062 0,055 0,038 -0,210**

p 0,413 0,195 0,405 0,465 0,610 0,004

Сосуды стромы сужены по данным гистологии r -0,087 -,148* 0,129 -0,014 ,197** -0,011

p 0,243 0,047 0,083 0,849 0,008 0,878

Выраженность сосудистого компонента стромы по данным гистологии r 0,016 ,229** -,152* -0,014 -0,037 0,091

p 0,833 0,002 0,041 0,847 0,620 0,224

Пиноподии по данным гистологии r 0,074 0,139 -0,100 ,155* -,174* 0,360**

p 0,323 0,062 0,180 0,037 0,019 0,000

Продолжение таблицы 61

Полипы по данным гистологии г 0,064 0,059 -,232** -0,063 -0,133 -0,002

Р 0,389 0,428 0,002 0,398 0,074 0,981

Лимфоцитарные перигландулярные стромальные инфильтраты г 0,102 -0,115 0,032 -0,279** 0,043 -0,320**

Р 0,170 0,123 0,669 0,001 0,567 0,000

Гипоплазия пиноподий по данным СЭМ г 0,052 -,163* -,184* -0,041 -,210** -0,009

Р 0,485 0,028 0,013 0,585 0,004 ,903

Гладкая апикальная поверхность по данным СЭМ г -0,051 -0,012 -0,084 -0,121 -,202** -0,245**

Р 0,493 0,868 0,259 0,105 0,006 0,001

Гетероморфные секреторные клетки по данным СЭМ г -,175* -,149* ,150* 0,024 -0,023 -0,175*

Р 0,018 0,044 0,044 0,749 0,753 0,018

Акселерация и асинхронность созревания пиноподий по данным СЭМ г 0,002 -,185* -0,093 0,018 -,193** -0,017

Р 0,976 0,013 0,210 0,814 0,009 0,824

Нарушение межклеточных контактов по данным СЭМ г 0,063 -0,044 -0,144 -0,136 -0,048 -0,261**

Р 0,401 0,552 0,052 0,067 0,516 000,0

Во-вторых, не получено достоверных корреляционных связей между толщиной М-Эхо и состоянием стромального компонента эндометрия. Таким образом, толщина М-Эхо не определяет структуру стромы эндометрия. В то же время плотность стромы, как показано выше, является наиболее информативным гистологическим параметром рецептивности эндометрия.

В третьих, не получено достоверных корреляционных связей между толщиной маточного эха и наличием/отсутствием зрелых пиноподий как по данным УЗИ, так и по данным СЭМ.

Таким образом, толщина М-Эхо не может считаться достаточным критерием, определяющим состояние рецептивности эндометрия.

Бо'льшую диагностическую ценность имеет определение эхо-структуры эндометрия в период «имплантационного окна». Наличие должной трехслойной эхоструктуры эндометрия положительно коррелировало со своевременным созреванием желез, и напротив, отрицательно коррелировало с признаками диссинхронизма (отставание/опережение) в созревании желез эндометрия (таблица 61). Кроме

того, нормальная для данной фазы цикла эхо-структура эндометрия имела положительную корреляцию с васкуляризацией стромы и наличием зрелых пиноподий по данным световой микроскопии (таблица 61). Дотстоверные отрицательные корреляции получены с гипоплазией и асинхронизмом в созревании пиноподий по данным СЭМ. Таким образом, трехслойная эхо-структура эндометрия может свидетельствовать о правильном ритме созревания желез эндометрия и структурных перестройках апикальной поверхности мембран желез эндометрия в период «имплантационного окна».

Важным показателем функционального сосотояния стромы является ультразвуковая картина Junctional Zone (JZ). Получены достоверные положительные корреляции между равномерной структурой JZ и выраженностью сосудистого комопнента стромы, негативные корреляции с суженным просветом сосудов стромы по данным микроскопии и гипоплазией и дисхронизмом в созревании пиноподий по данным СЭМ (Таблица 61).

Наличие субэндометрального кровотока по данным цветовой доплерометрии сильно положительно коррелировало с толщиной маточного эха, синхронностью и равномерностью созревания желез и наличием пиноподий по данным световой микроскопии. Отрицательная корреляция между наличием субэндометрального кровотока и лимфоидно-гистиоцитарной инфильтрацией стромы носила сильный характер (таблица 61). Это подтверждает понимание роли воспалительного процесса в формировании фиброза и склероза стромы эндометрия с обеднением сосудистого компонента стромы.

Наибольшее диагностическое значение в интерпретации рецептивных свойств эндометрия по данным ультразвукового исследования имеет перистальтика эндометрия. Именно с этим показателем получено наибольшее количество корреляционных связей с морфологическими и ультраструктурными маркерами рецептивности эндометрия. Наличие перистальтики эндометрия сильно положительно коррелировало с толщиной

М-эхо, структурой и толщиной JZ, секреторной трансформацией желез эндометрия, выраженностью сосудистого компонента стромы и ультраструктурными характеристиками пиноподий (таблица 61). Таким образом, именно наличие правильной перистальтической волны (от внутреннего зева к дну матки) при проведении ультразвукового исследования сильно коррелирует с рецептивными свойствами эндометрия.

Точность верификации по данным УЗИ внутриматочной патологии, влияющей на рецептивность эндометрия, представляет определенные трудности. Если в плане диагностики миомы матки, аденомиоза, пороков развития матки, метод УЗИ имеет чувствительность и специфичность более 90%, то в отношении синехий в полости матки, ситуация не столь оптимистическая. По данным нашего исследования чувствительность метода УЗИ в выявлении синехий в полости матки в сравнении с гистероскопической верификацией составила 26,31% (10/38). Специфичность метода составила 64,8% (рисунок 29). Площадь под ROC-кривой составила 0,64±0,059 95% CL[0,524-0,756]; р=0,008.

Слабая диагностическая способность УЗИ в определении внутриматочных синехий диктует необходимость проведения гистероскопии для верификации диагноза при подозрении на любую внутриматочную органическую патологию.

Roc-анализ чувствительности и специфичности "УЗИ в определении синехий в полости матки

_ROC Кривые_

и I—

m

о.о-Г-■-1-л-■-

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 ,0

1 - Специфичность

Диагональные сегменты, сгенерированные связями.

Рисунок 29 - Яое-анализ чувствительности и специфичности УЗИ в определении синехий в полости матки

5.1.3. Диагностическая значимость исследования микрофлоры из полости матки в определении возможных причин нарушения

рецептивности эндометрия

Результаты посевов из полости матки пациенток с репродуктивными неудачами основных групп наблюдения (n=210), полученные бактериоскопическим методом, были классифицированы на три когорты. Первая когорта пациенток имела в посевах Lactobaccilus, вторая - флору, отличную от Lactobaccillus, третья - не имела роста микрофлоры.

При многомерном факторном анализе распределения частот встречаемости микроорганизмов в эндометриальной и вагинальной микробиоте методом X не было получено достоверных отличий (%2=0,710; р>0,05). Отсюда следует два вывода: во-первых, эндометрий не является стерильным, несмотря на то, что у половины пациенток микрофлора в нем не верифицирована. Во вторых, отсутствуют достоверные различия в структуре микробиома влагалища и матки у пациенток с нерецептивным эндометрием (рисунок 30).

Х2=0,710; р>0,05

Clebsiella pneumoni

■ Esherichia Colli Staphilococcus hemolyticus

■ Gardnerella vaginslis

■ Роста нет

■ Lactobacillus

■ Enterococcus fecalis

■ Streptococcus agalactice

■ Staphilococcus epidermalis

■ Staphilococcus hominis

Рисунок 30 - Сравнительный анализ вагинальной и эндометриальной микробиоты у пациенток с гипопплазией эндометрия, (п=210)

Структура микробиоты эндометрия пациенток в зависимости от репродуктивных исходов представлена на рисунке 31. По данным

многомерного факторного анализа выявлена достоверная зависимость репродуктивных исходов пациенток групп наблюдения от характера микробиоты эндометрия (%2=30,27; р<0,001). Наличие бактерий не-Lactobacillus в эндометрии коррелирует с негативными последствиями для репродуктивной функции и может рассматриваться как отдельная причина нарушения рецептивности эндометрия, неудач имплантации и потерь беременности.

100% 90% 80% 70°% 60°% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

32,43% (24)

25,18% (35)

55,7%

20,27% (15)

17,99% (25)

56,83 % (76)

X-30,27; р<0,001

Роста нет

ЬаСюЬассПиБ

не-ЬаСюЬасШиБ

Беременность

Нет беременности

Рисунок 31 - Сравнительный анализ микробиоты эндометрия в зависимости от репродуктивных исходов, (п=210)

Представленные данные диктуют необходимость исследования микробиома эндометрия при проведении р1ре11е Ьюрв1а в комплексе диагностических мероприятий по поводу нарушения рецептивности эндометрия. В случае контрольных исследований после лечебных мероприятий, достаточно определения вагинальной микробиоты в связи с наличием выявленных корреляций вагинальной и эндометриальной микробиоты. Повторное исследование микробиома эндометрия оправдано в случае отсутствия клинического эффекта от терапии и негативных результатах обследования вагинальной микрофлоры.

5.1.4. Обоснование и определение показаний к проведению лечебно-диагностической гистероскопии при подозрении на патологию, сопровождающуюся нарушением рецептивности эндометрия

В нашем исследовании мы сравнили две группы пациенток из числа женщин основных групп наблюдения. Группы рандомизированы слепым методом. Первая группа - пациентки, которым была проведена гистероскопия на предгравидарном этапе (п=101), вторая группа -пациентки, которым не проводилась гистероскопия (п=81). Анализировались случаи наступления беременности в выделенных группах. В первой группе частота наступления беременности составила 29,7% (30/101), во второй

л

группе - 14,81% (12/81). Таким образом, при использовании метода % получено достоверное отличие в частоте наступления беременности в

л

выделенных группах наблюдения (х2=5,613; OR=2,430 [1,151 - 5,128]; р<0,05). Шанс наступления беременности после проведения гистероскопии в 2,43 раза выше, чем в отсутствие данной операции (рисунок 32).

100% 80% 60% 40°% 20°% 0%

70,3% (71) 85,18% (69)

OR= 2.43 (1.15-5.12)

29,7% (30) р < 0,05

14,82% (12)

□ Беременность -■ Беременность +

Гистроскопия +

Гистроскопия -

Рисунок 32 - Отношение шансов частот наступления беременности в зависимости от проведения гистероскопии на предгравидарном этапе (п=182) При сравнении диагностической ценности TV-УЗИ и диагностической гистероскопии в выявлении внутриматочной патологии мы сравнили заключения TV-УЗИ, гистероскопии с результатами гистологического исследования эндометрия у пациенток с гипоплазией эндометрия, страдающих бесплодием или невынашиванием беременности Как следует из таблицы 62 при проведении гистероскопии у пациенток с

гипоплазией эндометрия наиболее частой выявляемой патологией являлся хронический эндометрит (32,67%). Чувствительность гистероскопии в выявлении хронического эндометрита составила 98,9%, специфичность -75,6%, в связи с тем, что отмечалось 11 ложноположительных гистероскопических заключений о хроническом эндометрите, которые не были подтверждены гистологическими исследованиями. Показатель специфичности гистероскопии в диагностике хронического эндометрита несколько ниже, чем у TV-УЗИ (95,45%). Напротив, внутриматочные синехии, которые были диагностированы у 23,76% женщин с гипоплазией эндометрия, выявлялись на УЗИ только у 9,93% обследованных женщин (таблица 62). Метод TV-УЗИ имел более низкую чувствительность и специфичность в отношении выявления внутриматочных синехий (р<0,01). Таким же образом, по нашим данным чувствительность TV-УЗИ в отношении выявления микрополипов эндометрия достоверно ниже, чем гистероскопии, без достоверных отличий в специфичности методов (р<0,05). Таблица 62 - Диагностическая ценность TV-УЗИ и офисной гистероскопии в выявлении внутриматочной патологии (п=101)

Патология ГУ-УЗИ Гистеро -скопия Гист ологи я Чувствительность, % УЗИ Чувствительность, % Ш Специфичность, % УЗИ Специфичность, % Ш 2 X р

абс. (%) абс. (%) абс. (%)

Микрополипы эндометрия 6,93 (7) 12,87 (13) 13,86 (14) * 50,0 92,86 95,4 90,3 4,38 <0,05

Внутриматочные синехии 9,93 (10) 23,76 (24) 23,76 (24) * 37,5 100 83,3 100 23,17 <0,01

Признаки эндометрита 22,77 (23) 32,67 (33) 21,78 (22) 92,5 98,9 95,45 75,6 2,498 >0,05

Таким образом, гистероскопия обладает более высокой чувствительностью и специфичностью в выявлении внутриматочной патологии в сравнении с TV-УЗИ. Достоинством гистероскопии является также эффект повышения вероятности наступления беременности после ее проведения в спонтанных циклах и в циклах ЭКО. Полный алгоритм

обследования пациенток представлен ниже (рисунок 33).

Рисунок 33 - Алгоритм обследования пациенток с маточным фактором бесплодия и невынашивания беременности

5.2. Обоснование персонифицированной программы терапии и реабилитации пациенток с нарушением рецептивности эндометрия

На основании проведенных исследований нами разработаны дифференциальные лечебно-диагностические алгоритмы в зависимости от фенотипических, молекулярно-биологических, генетических,

морфологических и иммунологических особенностей пациенток с репродуктивными неудачами, ассоциированными с гипоплазией эндометрия.

Следует отметить, что выбор лечебной тактики определялся ведущим звеном патогенеза нарушения рецептивности эндометрия, который в каждой группе имел определенные особенности. Тем не менее, общими критериями для всех женщин обследованных групп были:

- особенности внутриутробного развития пациенток, программирующие на этапе эмбрио-и-фетогенеза определенные темпы и характер метаболических процессов в течение жизни;

- молекулярно-генетические особенности экспрессии стероидной рецепции, эндотелиальной функции и регуляции ангиогенеза;

- вид нарушений репродуктивной функции;

- наличие воспалительных процессов в эндометрии;

- структурно-функциональные и рецепторные изменения эндометрия;

- органические нарушения миометрия и эндометрия;

- общие и локальные нарушения иммунологической реактивности.

5.2.1. Индивидуализация циклической гормональной терапии у пациенток с репродуктивными неудачами, связанными с «тонким» эндометрием

С целью обоснования персонифицированного подхода к назначению циклической гормональной терапии были систематизированы данные о функциональном состоянии эндометрия 412 пациенток групп наблюдения, изложенные в предыдущих главах.

Изменение пула рецепторов к эстрадиолу относительно показателей контрольной группы отмечалось только у пациенток с бесплодием, причем данные изменения носили разнонаправленный характер у пациенток, с нормальным и низким весом при рождении. Наиболее низкий уровень экспрессии рецепторов к эстрадиолу в строме эндометрия отмечался у пациенток, рожденных с низким весом (82,5±22,01 баллов против 126,65±11,06 баллов; р=0,029). Напротив, у пациенток с бесплодием и «тонким» эндометрием, рожденных с нормальным весом, в железах имплантационного эндометрия отмечалась гиперэкспрессия рецепторов к эстрадиолу (231,91±9,31 баллов против 196,03±13,56 баллов; р=0,014). Отсутствовали достоверные различия в уровне экспрессии рецепторов к эстрадиолу в строме и железах эндометрия у пациенток с привычным невынашиванием беременности, ассоциированным с «тонким» эндометрием. У данной когорты пациенток в имплантационном эндометрии значимо ниже в сравнении с контрольными образцами была выражена стромальная экспрессия рецепторов к прогестерону (147,97±10,17 баллов против 263,47±17,13 баллов; р=0,012). У пациенток с бесплодием, рожденных с низким весом экспрессия рецепторов к прогестерону в строме эндометрия также была достоверно ниже, чем в контрольных образцах эндометрия (238,25±9,57 баллов против 263,47±17,13 баллов; р=0,017).

Вышеизложенные данные явились основанием к следующей схеме индивидуализации доз циклической гормональной терапии для пациенток с «тонким» эндометрием:

1. Пациентки с бесплодием, ассоциированным с «тонким» эндометрием, рожденные с низким весом при низкой стромальной экспрессии ERa менее 90 баллов Н-Бсоге и соотношении ERa/PR в строме эндометрия менее 0,3:

• Трансдермально эстрадиол 2-4 мг/сут (максимально до 6 мг/сутки) с 5 по 25 день цикла;

• Дидрогестерон 20 мг/сут либо микронизированный прогестерон 200-400 мг/сут с 14 по 25 день цикла;

2. Пациентки с бесплодием, ассоциированным с «тонким» эндометрием, рожденные с нормальным весом, при соотношении ERa/PR в строме более 0,5:

• Трансдермально эстрадиол 1-2 мг/сут с 5 по 25 день цикла

• Дидрогестерон 20 мг/сут либо микронизированный прогестерон 200-400 мг/сут с 14 по 25 день цикла

3. Пациентки с невынашиванием беременности, ассоциированным с «тонким» эндометрием, рожденные с низким весом, при соотношении ERa/PR в строме менее 0,3 и низком уровне PRв строме эндометрия менее 200 баллов H-Score:

• Трансдермально эстрадиол 2-4 мг/сут с 5 по 25 день цикла

• Дидрогестерон 30-40 мг/сут либо микронизированный прогестерон 400-600 мг/сут с 14 по 25 день цикла

4. Пациентки с невынашиванием беременности, ассоциированным с «тонким» эндометрием, рожденные с нормальным весом при соотношении ERa/PR в строме более 0,5:

• Трансдермально эстрадиол 1-4 мг/сут с 5 по 25 день цикла

• Дидрогестерон 30-40 мг/сут либо микронизированный прогестерон 400-600 мг/сут с 14 по 25 день цикла.

5. В случае нормального соотношения ERa/PR в строме (от 0,3 до 0,5) применение эстрадиола не показано. Назначают только дидрогестерон или микронизированный прогестерон с 14 по 25 день цикла. При PR в строме менее 200 баллов H-Score - в дозе дидрогестерон 30-40 мг/сут либо микронизированный прогестерон 400-600 мг/сут; при PR в строме более 200 баллов H-Score в дозе дидрогестерон 20 мг/сут либо микронизированный прогестерон 200-400 мг/сут с 14 по 25 день цикла.

Выбор трансдермальной формы введения эстрогенов обусловлен высокой биодоступностью препарата в совокупности с более низким по

сравнению с пероральными формами уровнем возможных известных побочных эффектов эстрогенов, в особенности при длительном их применении [109, 121, 146, 285, 408].

В нашем исследовании проанализирована зависимость длительности применения гормональной терапии от совокупного уровня успеха в достижении толщины эндометрия более 8 мм у пациенток обследованных групп. Корреляционный анализ показал, что у пациентов с более тонким начальным уровнем М-Эхо требуется значительно более длительная продолжительность лечения (г=0,762; р = 0,002). На рисунке 34 показана взаимосвязь между продолжительностью лечения и совокупным уровнем успеха: частотой восстановления толщины эндометрия более 8 мм на 20-22 день цикла.

Как представлено на рисунке, выраженная линейная зависимость между продолжительностью лечения эстрогенами и совокупным уровнем успеха отмечается при продолжительности приема препаратов эстрадиола в среднем до 135 дней (4,5 месяца). Большая продолжительность терапии эстрогенами не приводит к повышению эффективности лечения (рисунок 34).

В целом, эффективность циклической гормональной терапии по нашим данным составила 38,1% среди пациенток с бесплодием и 46,7% среди пациенток с привычным невынашиванием беременности.

Таким образом, описанный уровень эффективности препаратов циклической гормональной терапии, накопленный опыт их применения для лечения «тонкого» эндометрия в отечественной и зарубежной медицине, возможность индивидуализации доз, пути введения и продолжительности приема препаратов позволяет рассматривать циклическую гормональную терапию как базовую терапию в лечении патологии, сопровождающихся нарушением рецептивности эндометрия.

го

X

<и с

и >

.0

<и

I-

го т го а: О с

.0 X

с

>

а:

о ш о

и

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

00% п 00% -00% 00% -00% -00% -00% -00% -00% -00% -00%

-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1

30 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

Продолжительность терапии эстрогенами (дни)

Рисунок 34 - Зависимость между продолжительностью лечения эстрогенами и совокупным уровнем успеха в достижении М-Эхо более 8 мм

5.2.2. Обоснование антибактериальной политики у пациенток с репродуктивными неудачами, обусловленными нарушением рецептивности эндометрия

Доминирующее положение в структуре нозологических причин рефрактерного эндометрия принадлежит хроническому эндометриту.

В нашем исследовании частота выявления хронического эндометрита в группах наблюдения составила 54,3% - 70,9% (рисунок 35).

Как было показано в результатах исследования, в целом частота выявления облигатных патогенных микроорганизмов из полости матки в группах наблюдения составила 38,6%. Было доказано, что наличие бактерий не^аСюЬасШш в эндометрии в диагностически значимом титре коррелирует с негативными последствиями для репродуктивной функции и может рассматриваться как отдельная причина нарушения рецептивности эндометрия.

Рисунок 35 - Распространенность хронического эндометрита в группах наблюдения, (п=182)

Поскольку в нашем исследовании была выявлена достоверная зависимость репродуктивных исходов пациенток групп наблюдения от характера микробиоты эндометрия (%2=30,27; р<0,001) (рисунок 30), считаем обоснованным проведение антибактериальной терапии пациенткам с репродуктивными неудачами, ассоциированными с «тонким» эндометрием, в случае выявления у них при бактериологическом исследовании отделяемого из полости матки и/или цервикального канала в диагностически значимом титре (более 104 КОЕ/мл) облигатных патогенных микроорганизмов. Выбор препарата должен быть индивидуализирован в зависимости от чувствительности к нему патогенного микроорганизма (рисунок 36).

Рисунок 36 - Индивидуализация выбора антибактериальной терапии для лечения хронического эндометрита

Облигатная курсовая антибактериальная терапия препаратами широкого спектра действия должна проводиться сразу после завершения неразвивающейся беременности и после внутриматочной хирургии по поводу синдрома Ашермана.

Проведение антибактериальной терапии должно сопровождаться мероприятиями по восстановлению нормобиоценоза репродуктивного тракта и эндометриальной функции.

5.2.3. Обоснование применения в комплексе терапии «тонкого» эндометрия препаратов группы антикоагулянтов

Существует как минимум три аргумента, обосновывающих применение антикоагулянтной терапии у пациенток с гипоплазией эндометрия, сопровождающейся репродуктивными неудачами.

Во-первых, по данным проведенных нами молекулярно-генетических исследований в группах наблюдения выявлены следующие маркеры генетически обусловленных тромбофилии и эндотелиальной дисфункции:

• Высокий уровень носительства полиморфного аллеля 4G в локусе 675 гена PAI 5G>4G ингибитора активатора плазимногена 1 типа у пациенток с бесплодием (OR = 2,44; О 95% [1,7-11,6]; р=0,022) и привычным невынашиванием беременности (OR = 4,016; О 95% [1,69-16,45]; р=0,001), рожденных с нормальным весом.

• Высокая частота встречаемости генотипа NOS3 786 содержащего полиморфный аллель С в локусе 786 гена NOS3 Т>С эндотелиальной NO- синтазы у пациенток с бесплодием (OR = 8,246; О 95% [2,15-21,25]; р=0,001) и привычным невынашиванием беременности (OR = 4,901; О 95% [1,69-14,09]; р=0,003), рожденных с низким весом для своего гестационного возраста.

• Высокая частота носительства полиморфного аллеля А в локусе ^699947 гена VEGF 2578 С>А ассоциирована с риском формирования гипоплазии эндометрия у пациенток с бесплодием (OR=2,73; О 95% [1,36-

5,45]; р=0,01) и невынашивнием беременности (OR=4,61; а 95% [2,19-9,71]; р=0,01).

Во-вторых, по данным иммуногистохимического исследования, в «тонком» эндометрии отмечается достоверное снижение уровня экспрессии индуктора ангиогенеза VEGF-A и повышение уровня экспрессии ингибитора ангиогенеза VEGF-R у пациенток с бесплодием в сравнении с фертильными здоровыми женщинами (рисунок 37).

Рисунок 37 - Экспрессия VEGF-A и VEGF-R в имплантационном эндометрии женщин с бесплодием в сравнении с фертильными здоровыми женщинами, (п=210)

«Тонкий» эндометрий в период имплантационного окна показал низкий уровень экспрессии маркера CD34+, отражающего уровень стромальной васкуляризации функционального слоя эндометрия (таблица 54). В-третьих, длительность применения эстрадиола в составе циклической гормональной терапии составляет 3-6 месяцев и сопряжена с рисками тромбо-геморрагических и сосудистых осложнений за счет протромботического и прокоагулянтного действия.

Данные об использовании ацетилсалициловой кислоты для коррекции нарушений микроциркуляции у пациенток с «тонким» эндометрием в мировой литературе противоречивы [245].

Вышеизложенные аргументы диктуют обоснование к применению в составе комплексной терапии «тонкого» эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами, являющихся носителями неблагоприятных полиморфных аллелей генов PAI 675 4G>5G, NOS3 786 Т>С, VEGF-A 2578

C>A, препаратов группы гепариноидов под контролем коагулограммы. Данный класс препаратов обладает доказанными антикоагулянтным, антитромботическим, фибринолитическим и ангиопротективным эффектами. Описанные эффекты определяют целесообразность применения гепариноидов в целях улучшения ангиогенного потенциала, микроциркуляции и реологических свойств крови, ангиопротекции при эндотелиальной дисфункции у пациенток с репродуктивными неудачами, ассоциированными с гипоплазией эндометрия в случае наличия у них соответствующих изменений по данным коагулограммы.

Дозы препаратов должны подбираться индивидуально, в зависимости от гемокоагуляционных нарушений и корректироваться с учетом общего свертывающего потенциала крови (интегральный показатель коагуляции) [39]. Терапия гепариноидами проводится на предгравидарном этапе непрерывно в течение не менее 3 месяцев под контролем коагулограммы и интегрального показателя коагуляции. Средние дозы препарата сулодексид ® составляют 500 - 1000 МЕ/сутки. В случае недостаточного эффекта монотерапии гепариноидами, заключающегося в отсутствии снижения общего свертывающего потенциала крови по данным интегрального показателя гемокоагуляции, возможна комбинация противотромботических препаратов (гепариноиды + низкомолекулярные гепарины и/или дезагреганты).

5.2.4. Обоснование применения низкочастотного ультразвука в виде кавитированных лекарственных растворов для орошения полости матки у пациенток с репродуктивными неудачами, обусловленными

«тонким» эндометрием

Использование кавитированных низкочастотным ультразвуком лекарственных растворов для восстановления эндометрия решает следующие задачи:

1. Противовоспалительный и антибактериальный эффект, разрушение бактериальных биопленок.

2. Активация неоангиогенеза в строме функционального и базального слоя эндометрия, способствующая регенерации тканей и улучшению циркадного ритма преобразований эндометрия за счет улучшения доставки мессенджеров.

3. Локальный иммуномодулирующий эффект за счет изменения популяции состава клеточного состава лимфоцитов, присутствующих в эндометрии.

В нашем исследовании проведен эксперимент, целью которого было изучение глубины проникновения в эндометрий лекарственных растворов, кавитированных ультразвуком низкой частоты 25 кГц.

В качестве экспериментальной модели болезни были выбраны 7 пациенток с атрофией эндометрия в постменопаузе (средний период постменопаузы составил 5,7±1,2 лет). Пациентки не имели в анамнезе пролиферативных заболеваний эндометрия и миометрия и поступили в гинекологическую клинику для проведения оперативного лечения по поводу генитального пролапса. Средний возраст пациенток составил 62,5±1,7 лет. Средний показатель М-эхо по данным ультразвукового исследования органов малого таза составлял 3,4 ± 1,2 мм. Планируемый объем оперативного лечения включал гистерэктомию и реконструкцию тазового дна с применением сетчатых имплантатов. Все пациентки предварительно подписали информированное согласие на участие в эксперименте.

В ходе эксперимента в день операции непосредственно перед ее началом пациенткам проводилось ультразвуковое кавитационное орошение полости матки 0,5% водным раствором йодопирона в течение 5 минут, с частотой ультразвуковых колебаний 25 кГц, скоростью потока раствора 100 мл/мин. После удаления матки проводилось макроскопическое аутопсийное прижизненное исследование и гистологическое исследование препарата.

По данным макроскопии отмечалось равномерное распределение красителя по поверхности эндометрия и его проникновение в функциональный слой эндометрия, а так же эндоцервикса (Рисунок 38 А, В).

Рисунок 38 - Макроскопическое аутопсийное прижизненное исследование матки, после орошения полости кавитированным водным 0,5% раствором йодопирона. На рисунке А виден равномерный характер распределения красителя по поверхности эндометрия. На рисунке В показано проникновение красителя в функциональный слой эндометрия

В ходе эксперимента не зафиксировано случаев аллергических реакций, у всех пациенток послеоперационный период прошел без осложненеий и они были выписаны на 5-6 сутки после операции.

Наилучшим образом степень проникновения красителя в глубину эндометрия демонстрируют данные микроскопии при увеличении х 400. На фотографиях микропрепаратов видно, что краситель достаточно равномерно проникает в строму функционального слоя эндометрия на всю его глубину, достигая уровня базальной мембраны. Отмечено проникновение контраста в строму эндоцервикса (рисунок 39).

Рисунок 39 - Распределение красителя в строме функционального слоя эндометрия (А, Б, В) и эндоцервикса (Г)

Результаты эксперимента убедительно показывают

фонофоретический эффект ультразвуковуковых волн низкой частоты в «тонком» эндометрии с относительно плотной стромой и низким функциональным слоем. Красящий пигмент под действием кавитации равномерно распределяется в функциональном слое эндометрия и эндоцервикса. Данный эксперимент доказывает возможность альтернативной доставки лекарственных веществ в эндометрий, минуя общий кровоток, что имеет большое значение в случае атрофических и гипопластических процессов, связанных с обеденением микроциркуляторного русла эндометрия, фиброзом и склерозом стромы, дисфункцией базальной мембраны эндометрия (junctional zone).

5.2.5. Разработка и создание аппарата для ультразвукового кавитационного орошения полости матки с гистероскопической ассистенцией

Недостатком современных аппаратов для кавитационных орошений является отсутствие визуализации полости матки при проведении процедуры ультразвукового кавитационного орошения. В связи с тем, что процедура проводится «вслепую», нет возможности контролировать направление и интенсивность воздействия озвученных сред на эндометрий.

Как указано выше, обязательным диагностическим этапом при гипоплазии эндометрия является проведение диагностической/лечебно-диагностической гистероскопии. Этот факт послужил основанием для применения кавитационного орошения полости матки и гистероскопии.

Целью изобретения явилось создание аппарата для низкочастотного ультразвукового кавитационного орошения полости матки на основе операционного гистероскопа, который сочетает возможность терапевтического воздействия на эндометрий кавитированных низкочастотным ультразвуком жидких лекарственных сред с прямой визуализацией патологического процесса в эндометрии.

Разработанный аппарат для ультразвукового кавитационного орошения полости матки с гистероскопической ассистенцией, включает в себя два узла: модифицированный операционный гистероскоп и прибор для ультразвуковой санации полостей тела, имеющий внутренний ирригационный канал в акустическом узле и волноводе, который посредством стального проводника соединяется с инструментальным каналом модифицированного гистероскопа, что позволяет проводить ультразвуковое кавитационное орошение полости матки под визуальным контролем патологических процессов эндометрия (рисунок 40).

Рисунок 40 - Общий вид аппарата для ультразвукового кавитационного орошения полости матки с гистероскопической ассистенцией: 1 - операционный модифицированный гистероскоп; 2 - инструментальный канал модифицированного гистероскопа; 3 - металлический проводник для подачи кавитированных растворов; 4 - акустический узел

Получен патент на полезную модель «Аппарат для ультразвукового кавитационного орошения полости матки с гистероскопической ассистенцией» RU 2606495 C2 от 17.01.2017.

5.2.6. Обоснование кратности процедур ультразвукового кавитационного орошения полости матки

Для обоснования эффективного количества процедур ультразвукового кавитационного орошения полости матки пациентки групп набллюдения (п=182) были разделены в зависимости от количества проведенных процедур. Используя метод многофакторного математического анализа, метод х2 исследованы основные критерии эффективности терапии в зависимости от числа курсов терапии (один, два или три) в группах наблюдения. Выявлены следующие особенности.

Средняя величина М-Эхо по данным ультразвукового исследования до начала кавитационной терапии достоверно не отличалась в группах наблюдения. После кавитационной терапии толщина М-Эхо увеличилась во всех группах наблюдения, независимо от числа курсов орошения, при этом

уровень достоверности отличий до и после лечения достигнут только в группе пациенток с привычным невынашиванием беременности, получивших три курса орошений (от 5,02±0,25 мм до 10,67±0,56; р<0,05) (таблица 63). Немаловажный интерес представляет показатель прироста величины М-эхо на фоне кавитационной терапии в зависимости от кратности процедур орошения полости матки. Выявлено, что достоверные отличия величины прироста М-Эхо получены только после трех курсов процедур как у пациенток с бесплодием (3,93±1,01мм после двух курсов против 5,28±0,62мм после трех курсов; р<0,05), так и с привычным невынашиванием беременности (3,93±1,01мм после двух курсов против 5,28±0,62 мм после трех курсов).

Следует отметить, что с увеличением кратности процедур кавитационного орошения полости матки увеличивается ее эффективность. Наилучший результат по критерию величины М-Эхо диагностирован у пациенток с бесплодием после трех курсов ультразвукового кавитационного орошения полости матки (92,31%). У пациенток с невынашиванием беременности после трех курсов процедур 85,7% женщин достигли целевого значения толщины М-Эхо. Наименьшая эффективность кавитационной терапии по критерию величины М-Эхо отмечалась после единственного курса орошений у пациенток с привычным невынашиванием беременности: только 62,5% женщин после лечения имели М-Эхо более 8 мм.

При исследовании ультразвуковых признаков нарушения структуры эндометрия выявлено, что среди пациенток с бесплодием до начала терапии данные признаки верифицируются достоверно чаще у тех женщин, которые получали трехкратный курс орошений (65,38±0,06% против 18,75±0,05%; р=0,003; и против 17,64±0,07%; р=0,001). Это может объясняться тем, что эти пациентки имели более глубокие нарушения эндометриальной функции, что потребовало более длительного лечения. Достоверное улучшение структуры эндометрия по данным серошкальной эхографии отмечено во всех группах пациенток, независимо от кратности терапии (таблица 63).

Таблица 63 - Обоснование кратности ультразвуковой кавитационной терапии

Показатель Бесплодие п=92 Невынашивание п=90

1 курс п=32 2 курса п=34 1 курс п=32 2 курса п=34 1 курс п=32 2 курса п=34

1 2 3 4 5 6 7

М-Эхо до терапии, мм 5,51±0,51 5,11±0,65 4,73±0,46 4,69±0,23 5,41±0,18 5,02±0,25

М-эхо после терапии, мм 9,14±0,33 9,32±0,21 10,02±0,82 8,01±0,47 8,03±0,56 10,67±0,56*

Прирост величины М-Эхо после терапии, мм 3,62±0,54 3,93±1,01 5,28±0,62* 3,4±0,37 2,63±0,55 5,57±0,58*

Количество женщин, имеющих после терапии М-эхо>8 мм 78,12% (25) 85,29% (29) 92,31% (24) 62,5% (20) 76,19% (32) 85,7% (14)

Нарушения структуры эндометрия по данным УЗИ до лечения (%, абс) % (абс) 18,75±0,05% (6) 17,64±0,07% (6) 65,38±0,06% (18) 15,63±0,07% (5) 13,28±0,04% (6) 31,25±0,12% (5)

р между группами р1-2 ^ р2-з =0,001 р1-з =0,003 р1-2 NS р2-з NS рх-э NS

Нарушения структуры эндометрия по данным УЗИ после лечения % (абс) 0 0 11,5±0,04% (3) 0 0 6,25±0,09% (1)

р до-после р=0,03 р=0,03 р=0,002 р=0,02 р=0,01 р=0,04

Таблица 64 - Обоснование кратности ультразвуковой кавитационной терапии

Показатель Бесплодие п=92 Невынашивание п=90

1 курс п=32 2 курса п=34 3 курса п=26 1 курс п=32 2 курса п=42 3 курса п=16

1 2 3 4 5 6 7

Частота выявления морфологических признаков хронического эндометрита до лечения (%; абс) %(абс) 31,25±0,08% (10) 29,41±0,09% (10) 50,0±0,1% (13) 15,63±0,06% (5) 26,16±0,07% (11) 50,0±0,13% (8)

р между группами р1-2 N8 р2-з N8 р1-3 N8 р1-2 N8 р2-3 N8 Р1-3 = 0,04

Частота выявления морфологических признаков хронического эндометрита после лечения (%; абс) %(абс) 15,63±0,05% (5) 11,76±0,08% (4) 3,84±0,08% (1) 6,25±0,03% (2) 7,14±0,01% (3) 0,0% (0)

р до-после N8 N8 р=0,004 N8 р=0,03 Р1_3=0,002

Частота обнаружения зрелых пиноподий до лечения (%; абс) %(абс) 46,88±0,06% (15) 58,82±0,09% (20) 15,38±0,12% (4) 59,37±0,08% (19) 40,47±0,07% (17) 25,0±0,11% (4)

р между группами р1-2 N8 Р2-3 =0,008 Р1-3 =0,03 р1-2 N8 р2-3 N8 р1-3 N8

Частота обнаружения зрелых пиноподий после лечения (%; абс) %(абс) 59,37±0,08% (19) 79,41±0,07% (27) 72,28±0,10% (18) 75,00±0,12% (24) 80,95±0,07% (34) 62,5±0,07% (10)

р до-после N8 N8 р=0,005 N8 р=0,006 р=0,03

Количество беременностей завершившихся родами %(абс) 12,5%±0,06% (4) 14,71±0,06% (5) 46,15±0,08%* (12) 25,0±0,08% (8) 52,38±0,07%* (22) 62,5±0,12%* (10)

р между группами р1-2 N8 Р2-3 = 0,014 Р1_3 = 0,012 Р1-2 = 0,013 р2-3 N8 Р1_3 = 0,001

Статистически значимое снижение частоты выявления морфологических признаков эндометрита по данным биопсии эндометрия наблюдалось только после трех курсов орошения у пациенток с бесплодием (50,0±0,1% против 3,84±0,08%; р=0,004) и уже после двух курсов орошения у пациенток с невынашиванием беременности (26,16±0,07% против 7,14±0,01%; р=0,03), при этом после трех курсов орошения морфолоических признаков эндометрита не зафиксировано ни у одной пациентки (таблица 64).

Частота обнаружения зрелых пиноподий в имплантационном эндометрии по данным СЭМ достоверно увеличивается только после трех курсов кавитационного орошения полости матки у пациенток с бесплодием (15,38±0,12% до лечения против 72,28±0,10% после трех курсов терапии; р=0,005) и уже после двух курсов орошения у пациенток с привычным невынашиванием беременности (40,47±0,07% до лечения против 80,95±0,07% после двух курсов терапии; р=0,006) (таблица 64).

Показатель числа беременностей, закончившихся рождением живых детей (rate take home baby) среди пациенток с бесплодием и «тонким» эндометрием, достоверно увеличивался после трех курсов кавитационного орошения полости матки (46,15±0,08% против 12,5%±0,06%; р=0,012), тогда как у пациенток с привычным невынашиванием и «тонким» эндометрием уже после двух курсов процедур кавитационного орошения полости матки отмечался достоверный прирост данного показателя (52,38±0,07% против 25,0±0,08% р=0,013), а дальнейшие курсы орошения статистически значимо не влияли на данный показатель (52,38±0,07% против 62,5±0,12%; р>0,05) (таблица 64).

Таким образом, приведенный анализ п целесообразность применения для восстановления эндометриальной функции и фертильности не менее трех курсов кавитационного орошения полости матки для пациенток с бесплодием, ассоциированным с гипоплазией эндометрия, и не менее двух курсов кавитационного орошения полости матки для пациенток с привычным невынашиванием беременности, ассоциированным с «тонким» эндометрием.

5.2.7. Обоснование применения некоторых лекарственных препаратов для кавитационного орошения полости матки у пациенток с «тонким» эндометрием

Целью дальнейших наших исследований явился поиск «терапевтического окна» воздействия на нерецептивный эндометрий, не демонстрирующий признаки активного воспалительного процесса по данным морфологического, бактериологического и иммуногистохимического исследований, однако остающийся рефрактерным к экзогенным и эндогенным гормональным стимулам, имеющий низкий рост и имплантационный потенциал.

Ключевой точкой воздействия на эндометрий в аспекте восстановления его рецептивности представляется популяция натуральных маточных киллеров CD56+bright, которые являются наиболее многочисленной популяцией клеток в строме секреторного эндометрия и децидуальной ткани в период ранних сроков беременности.

Важной проблемой является затруднение проникновения в матку из периферической крови маточных киллеров в условиях выраженного снижения сосудистого стромального компонента «тонкого» эндометрия, фиброзирования juctional zone, а метод кавитации позволяет транспортировать лекарственные препараты непостредственно в ткани за счет фонофоретического эффекта.

Фонофоретического эффект воздействия ультразвука на биологические ткани послужил основанием разработки нового метода лечения нарушений рецептивности «тонкого» эндометрия у пациенток с бесплодием.

Согласно результатам нашего исследования у пациенток с «тонким» рефрактерным эндометрием и бесплодием отмечалось достоверное снижение уровня экспрессии CD56+bright в эндометрии в сравнении с фертильными здоровыми женщинами (рисунок 41).

Рисунок 41 - Экспрессия СD56+ в эндометрии пациенток с бесплодием

Метод лечения у пациенток с бесплодием основан на орошении полости матки лекарственным раствором гранулоцитарного колонестимулирующего фактора (Filgrastim®), предварительно озвученным ультразвуком низкой частоты в дозе 300 мкг/мл при разведении на 200 мл 5% раствора глюкозы. Доза препарата Filgrastim® в приготовленном растворе составляет 3 мкг/мл. Процедура проводится в период «имплантационного окна» на 7 день после овуляции при 28-дневном менструальном цикле, что соответствует периоду «окна имплантации», длительность процедуры 3-5 минут. Получена приоритетная справка на изобретение № 2017120906 от 14.06.2017.

Исследование уровня экспрессии CD56+bright в эндометрии группы женщин с привычным невынашиванием беременности показало значимое его повышение в сравнении с фертильными здоровыми пациентками (рисунок 42).

CD56+ bfgh' у гэц/ентокс прив^шныг/ невынаш/БЭ-ием беоеме-но^ти

Невынашивание

Контроль

□ Среднее

|~| Среднее±Стош.

Т Среднее±1,96*Ст.ош.

Рисунок 42 - Экспрессия СD56+bright в эндометрии пациенток с привычным невынашиванием беременности

Метод улучшения рецептивности и имплантационного потенциала эндометрия у пациенток с привычным невынашиванием беременности отличающийся тем, что применяется кавитированный ультразвуком низкой частоты раствор интерферона гамма (Ингарон®) для орошения полости матки. Ультразвуковое низкочастотное орошение полости матки производится в первую фазу менструального цикла, начиная с 7-9 дня 28-дневного менструального цикла. В качестве озвученной среды применяется раствор интерферона гамма (Ингарон®) в дозе 500 000 МЕ в разведении на 400 мл физиологического раствора, выполняется курс из пяти процедур. Длительность процедуры 3-5 минут со скоростью инфузии лекарственного препарата 100 мл\мин. Получена приоритетная справка на изобретение №2017120908 от 14.06.2017.

5.2.8. Масс-спектрометрический анализ влияния ультразвука низкой частоты (25 кГц) на состояние молекул лекарственных веществ Filgrastim® и Ингарон® в эксперименте in vitro

С целью изучения влияния ультразвука низкой частоты 25кГц на стабильность химической молекулы действующего вещества лекарственных препаратов Filgrastim® и Ингарон® был проведен эксперимент in vitro. Молекулы лекарственных веществ были исследованы с помощью масс-спектрометрического анализа до и непосредственно после воздействия на них ультразвука частотой 25 кГц в течение 5 минут.

Анализ растворов проводился методом прямой инжекции анализируемых смесей в режиме электрораспылительной ионизации при детектировании положительных ионов. В масс-спектре отрицательных ионов целевое соединение не было обнаружено.

Состав 1 мл раствора Filgrastim® согласно данным производителя:

Филграстим (300 мкг), Уксусная кислота 0,6 мг, Гидроксид натрия (1Н до pH 4), Сорбитол 50 мг, Полисорбат 80 (0,04 мг).

Состав 1 флакона Ингарон® согласно данным производителя:

Интерфероон гамма 500 000 МЕ, Маннит 2 000 000 МЕ. Значимых различий в масс-спектрах не отмечается как для молекулы Filgrastim®, так и для молекулы Интерферона гамма (Ингарон®). Различия в интенсивностях пиков объясняются недостаточной стабильностью условий съёмки масс-спектров (Рисунки 43 А и Б, 44 А и Б).

Рисунок 43 - Фрагмент сравнения масс-спектров Filgrastim® при увеличении по шкале масс и интенсивностей до (А - зеленый график) и после (Б - розовый график) воздействия ультразвуковых волн 25 кГц.

IFN eJNGARON031116.H20rt0.8-ACN«0.8-240_020517.DU-ESI-POS.3129 1135.d: +MS, 3.8-4.1mln #226-246

1726.0465

И

1843.9450