Ответ устойчивых к апоптозу трансформированных клеток на действие рентгеновского излучения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Шитикова, Жанна Валерьевна

• Шитикова, Жанна Валерьевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Шитикова, Жанна Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Этапы канцерогенеза

2.2. Тумор-супрессорные програмы клетки

2.3. Апоптоз

2.4. Клеточное старение

2.4.1. Старение как тумор-супрессорная программа клетки

2.4.2 Маркеры клеточного старения

2.4.3. Роль DDR-ответа в индукции старения

2.4.4. Молекулярные механизмы формирования фокусов DDR

2.4.5. Механизмы репарации повреждений ДНК

2.5. Аутофагия

2.5.1. Формирование аутофагосом

2.5.2. Роль mTOR в регуляции старения и аутофагии

2.6. Ингибиторы гистоновых деацетилаз как перспективные противоопухолевые препараты

2.7. Характеристика клеток El А+Е1В

2.8. Заключение

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Материалы

3.1.1. Клеточные линии, использованные в работе

3.1.2. Антитела, использованные в работе

3.2. Методы

3.2.1. Культивирование клеток, облучение и обработка бутиратом

натрия

3.2.2. Построение кривых роста

3.2.3. Оценка жизнеспособности клеток

3.2.4. Анализ эффективности клонирования в редком посеве

3.2.5. Проточная цитофлуориметрия

3.2.6. Морфологическая окраска клеток гемаотоксилином и эозином

3.2.7. Анализ активности асоциированной со старением

р-галактозидазы (8А-р-Оа1)

3.2.8. Анализ содержания ДНК в гигантских клетках с помощью

окраски по Фельгену и измерения интегральной оптической плотности

3.2.9. Иммуноблотинг

3.2.10. Иммунофлуоресцентная окраска клеток и конфокальная микроскопия

3.2.11. Имерение интенсивности флуоресценции

3.2.12. Анализ синтеза ДНК по включению ВгсЮ

3.2.13. Анализ синтеза ДНК по включения ЕсШ

3.2.14. Анализ разрывов ДНК с помощью щелочного гель-электрофореза одиночных клеток

3.2.15. Анализ нуклеосомной фрагментации ДНК

3.2.16. Статистический анализ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Устойчивые к апоптозу трансформанты Е1А+Е1В отвечают на облучение блоком С2/М и подавлением пролиферации,

но сохраненяют способность реплицировать ДНК

4.2. Сохранение репликативной активности при подавленной пролиферации приводит к формированию гигантских полиплоидных клеток с высокой генетической нестабильностью

4.3. Устойчивые к апотозу трансформанты Е1А+Е1В характеризуются нарушением организации ядерной ламины и хроматина

4.4. Облученные клетки Е1А+Е1В характеризуются нарушением ОБЯ-ответа и персистенцией фокусов ББЯ

4.5. Репарация ДНК в клетках Е1А+Е1В после облучения нарушена

4.6. В ответ на облучение устойчивые к апоптозу трансформанты Е1А+Е1В активируют обратимую программу старения

4.7. Активация обратимого старения, вызванного действием Ж, в устойчивых к апоптозу клетках Е1А+Е1В сопровождается экспрессией маркеров стволовых клеток

4.8. Обратимость индуцированного облучением старения в клетках Е1А+Е1В связана с подавлением активности тТХЖ и активацией аутофагии

4.9. Бутират натрия индуцирует необратимую программу клеточного старения в трансформантах Е1А+Е1В

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

AM® AAeH03HHM0H04>0c4)aT

AT® AfleH03HHTpH4)0C(|)aT

Atg Autophagy-related protein

AMPK 5' AMP-activated protein kinase

ATM Ataxia Telangiectasia Mutated

ATR Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein

BrdU 5-bromo-2'-deoxyuridine

BRCA1 Breast Cancer

BRCA2 Breast Cancer

53BP1 p53-Binding Protein

Cdk Cyclin-dependent kinase

Chk Checkpoint kinase

Cycl Cyclin

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DDR DNA damage response

DNA-PK DNA-dependent protein kinase

DNA-PKcs DNA-dependent protein kinase catalytic subunit

DNA-SCARS DNA segments with chromatin alterations reinforcing

senescence

DSB Double Strand Break

4EBP1 Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding

protein

EdU 5-3THHHJi-2'AeoKCHypHAHH

eIF4E Eukaryotic translation Initiation Factor 4E

ERK Extracellular Signal-regulated Kinase

GAPDH rjTHuepajn>flerHa-3-4>oc4)aT/iern^poreHa3a

HAT Histone Acetyl Transferase

HD AC Hystone Deacetylase

5

HDACI Hystone Deacetylase Inhibitor

HR Homologous Recombination

IL интерлейкин

IR ионизирующее излучение

LAMP Lysosomal-Associated Membrane Protein

LC3 Microtubule-associated protein 1А/IB-light chain

MDC1 Mediator of Damage Checkpoint protein

Mdm2 Mouse double minute

MRE11 Meiotic Recombination

mTOR mammalian Target Of Rapamycin

mTORCl mammalian Target Of Rapamycin Complex

mTORC2 mammalian Target Of Rapamycin Complex

NBS1 Nijmegen Breakage Syndrome

NHEJ Non-Homologous End Joining

PBS Phosphate Buffered Saline

PIKK phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases

PI3K Phosphoinositide 3-Kinase

pRb Retinoblastoma protein

ROS Reactive Oxygen Species

RPA Replication Protein A

S6K p70 Ribosomal Protein S6 Kinase

SA-ß-Gal Senescence Associated beta Galactosidase

SAHF Senescence-Associated Heterochromatine Foci

SASP Senescence-Associated Secretory Phenotype

SMAC/DIABLO Second Mitochondria-derived Activator of Caspases

ssDNA single strand DNA

TSC1 Tuberous Sclerosis

TSC2 Tuberous sclerosis

ULK Unc-51-Like Kinase

XRCC4 X-ray Repair Cross-Complementing protein 4

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ответ устойчивых к апоптозу трансформированных клеток на действие рентгеновского излучения»

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

Несмотря на значительный прогресс в борьбе с опухолевыми заболеваниями, они остаются, по данным Всемирной организации здравоохрания (ВОЗ), одной из основных причин смерти в мире.

Как правило, действие современных противоопухолевых препаратов направлено на индукцию апоптотической гибели клеток. Апоптоз, или программированная клеточная гибель, является важнейшей тумор-супрессорной программой, которая активируется в ответ на различные виды стресса для предотвращения пролиферации клеток с повреждениями ДНК, мутациями, или нарушениями событий клеточного цикла. В процессе неопластической трансформации или противоопухолевой терапии клетки приобретают устойчивость к апоптозу, что приводит к формированию некурабельных, агрессивных вариантов опухолей.

Альтернативной апоптозу тумор-супрессорной программой является клеточное старение, подавляющее пролиферацию клеток при внеплановой экспрессии онкогенов или повреждении ДНК. В опухолевых клетках старение может индуцироваться в ответ на действие генотоксических и дифференцировочных агентов, а также ремоделирование хроматина (Marks et al., 2004; Rodier and Campisi, 2011). Стареющие клетки необратимо останавливают полиферацию, однако сохраняют метаболическую активность и приобретают характерные морфо-функциональные признаки, включающие гипертрофию, распластывание клетки на субстрате, экспрессию ассоциированной со старением ß-галактозидазы (SA-ß-Gal), активацию компонентов ответа на повреждение ДНК (DNA Damage Response, DDR-ответ), а также экспрессию и секрецию факторов роста и воспаления (Campisi and d'Adda di Fagagna, 2007). Известно, что устойчивые к апоптозу клетки сохраняют способность реализовать программу клеточного старения (Roninson et al., 2003), в связи с этим активация старения рассматривается как

одна из наиболее перспективных стратегий подавления пролиферации опухолевых клеток.

К числу событий, решающих успех противоопухолевой терапии, относится активация аутофагии (Kondo and Kondo, 2006), являющейся эволюционно консервативным механизмом, обеспечивающим выживание клеток при различных видах стресса. Помимо цитопротекторного действия аутофагия может вызывать клеточную гибель (Majuri et al., 2007), что в случае устойчивых к апоптозу клеток приобретает первостепенное значение.

Координирующую роль в регуляции процессов старения, аутофагии и клеточной гибели играет фосфоинозитид-3-киназа (PIKK) mTOR, формирующая два комплекса mTORCl и mTORC2, различающиеся по структуре и функциям. Основная роль в регуляции программы старения принадлежит комплексу mTORCl (Blagosklonny, 2012), который служит сенсором энергетического состояния клетки. Он активируется питательными веществами и ростовыми факторами и регулирует синтез белков, биогенез рибосом, транскрипцию и аутофагию (Laplante and Sabatini, 2009).

Изучение закономерностей ответа устойчивых к апоптозу клеток на действие ДНК-повреждающих факторов, запускающих альтернативные апоптозу тумор-супрессорные программы, является важной задачей современной биологии, поскольку это необходимо для выяснения механизмов, приводящих к рецидивам опухолей и развитию устойчивости опухолевых клеток, а также поиска новых эффективных подходов противоопухолевой терапии.

1.2. Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей ответа на поврежедние ДНК при действии ионизирующего излучения (III) и возможности активации тумор-супрессорной программы старения в устойчивых к апоптозу опухолевых клетках, полученных путем переноса онкогенов Е1А и Е1В-19кДа в эмбриональные фибробласты крысы.

В задачи исследования входило:

1. Оценить антипролиферативное действие ГО. на устойчивые к апоптозу трансформированные клетки по способности вызывать блоки клеточного цикла, подавлять репликацию ДНК и пролиферацию.

2. Определить возможность активации программы клеточного старения в устойчивых к апоптозу трансформантах в ответ на действие ГО, и ее зависимость от длительности БОЯ-ответа и репарации ДНК.

3. Оценить обратимость программы старения и возможность активации аутофагии в устойчивых к апоптозу трансформантах в зависимости от активности комплекса тТСЖС 1 после облучения.

4. Сравнить эффективность активации программы клеточного старения в ответ на облучение или действие ингибитора гистоновых деацетилаз бутирата натрия на трансформированные клетки, устойчивые к апоптозу.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Этапы канцерогенеза

Превращение нормальной клетки в опухолевую является сложным многоступенчатым процессом, который включает в себя накопление мутаций, приводящих к активации сигнальных каскадов, способствующих выживанию и пролиферации опухолевых клеток, а также подавлению тумор-супрессорных механизмов, противостоящих опухолевой трансформации. В процессе трансформации клетки нарушается регуляция событий клеточного цикла, что приводит к неконролируемой пролиферации, не зависящей от наличия митогенных сигналов (Hanahan and Weinberg, 2000).

Деление клетки представляет собой ряд строго регулируемых последовательных событий, нарушение которых может привести к трансформации клетки и развитию опухли. На рисунке 1 представлена схема клеточного цикла, включающая основные компоненты его регуляции. Клетки, находящиеся в стадии покоя, называемой фазой GO клеточного цикла, получив сигнал к делению, вступают в фазу G1, где начинают синтез белков, необходимых для репликации ДНК и регуляции процесса деления. В этот период клетка принимает решение о дальнейшем прохождении или остановке клеточного цикла, так как практически до конца фазы G1 пролиферация зависит от присутствия ростовых факторов и только после прохождения точки рестрикции (R-point), находящейся на границе G1 и S фаз клеточного цикла процесс деления протекает независимо от внешних стимулов. Ключевыми регуляторами перехода из G1 в S фазу клеточного цикла являются транскрипционные факторы семейства E2F, обеспечивающие транскрипцию белков S-фазы, которые необходимы для репликации ДНК. В неактивном состоянии E2F находится в комплексе с белком pRB, однако при получении сигнала к делению этот комплекс диссоциирует, что приводит к высвобождению E2F и его активациии. В фазе S клеточного цикла происходит синтез ДНК, после чего в фазе G2 клетка подготавливается

ю

к делению и вступает в митоз (фаза М), в процессе которого формируются две дочерние клетки (Vermeulen et al., 2003).

Прохождение клетки по циклу реглируется комплексами циклинов (Cycl) и соответствующих циклин-зависимых киназ (Cdk) (Рис. 1). Негативными регуляторами активности Cdk являются ингибиторы циклин-зависимых киназ (Cdkl), включающие в себя два семейства: Ink4a и Cip/Kip. Известно, что повышенная экспрессия pl6/Ink4a, plMnk4d и p21/Wafl приводит к остановке в G1 фазе клеточного цикла, а также активации клеточного старения (Alcorta et al., 1996; Нага et al., 1996). Кроме этого, p21/Wafl, активация транскрипции которого зависит от тумор-супрессорного белка р53, отвечает за G2/M блок клеточного цикла. Нарушение экспрессии и делеция генов, кодирующих белки семейств Ink4a и Cip/Kip, часто наблюдаются в опухолевых клетках (Malumbres and Barbacid, 2001).

Нормальные клетки контролируют точность генетической информации на всех этапах клеточного цикла посредством остановок в сверочных точках, называемых чекпоинтами. На границе G1 и S фаз клеточного цикла перед началом синтеза ДНК клетка проверяет ее целостность. Правильность новосинтезированной ДНК проверяется на границе G2 и М фаз, а остановка в митозе необходима для проверки правильности прикрепления хромосом к веретену деления. При обнаружении дефектов в структуре ДНК клетка реализует остановку на границах G1/S и G2/M фаз клеточного цикла и осуществляет репарацию ДНК, после чего возобновляет прохождение по циклу. Если повреждения генома настолько велики, что репарация невозможна, клетки не могут выйти из блока, чтобы вновь приступить к делению, и гибнут апоптозом или активируют программу старения. Опухолевые клетки не способны осуществлять остановку пролиферации в ответ на удаление ростовых факторов и действие повреждающих агентов.

Рисунок 1. Схема регуляции клеточного цикла.

Они способны преодолевать чекпоинт-контроль и осуществлять деление даже при наличии нарушений в структуре ДНК. Это приводит к генетической нестабильности и дает возможность отбора наиболее устойчивых клеток, в результате чего формируются опухоли, резистентные к различным видам противоопухолевой терапии, включая облучение и цитостатические препараты (Malumbres and Barbacid, 2001).

В процессе эволюции опухолевые клетки преодолевают репликативное старение и приобретают неограниченный пролиферативный потенциал, а также устойчивость к апоптозу, являющемуся важнейшей тумор-супрессорной программой (Hanahan and Weinberg, 2000). Изменяется метаболизм и микроокружение опухолевой клетки, стимулируется неоангиогенез, активируется аутофагия, что позволяет ей получать питательные вещества, приобретать способность к инвазивному росту и метастазированию. (Hanahan and Weinberg, 2011).

2.2. Тумор-супрессорные програмы клетки

К числу клеточных программ, противостоящих опухолевой трансформации, относятся апоптоз, клеточное старение и некоторые виды неапоптотической гибели клеток, включая митотическую катастрофу, некроптоз (программируемый некроз) и в некоторых случаях аутофагию.

2.3. Апоптоз

Апоптоз явлется важнейшей тумор-супрессорной программой клетки. Он активируется в ответ на различные виды стресса для предотвращения пролиферации клеток, несущих повреждения ДНК, мутации, или утративших контроль за событиями клеточного цикла. Апоптотическая гибель клеток имеет важное значение в эмбриональном развитии организмов, иммунном и воспалительных ответах.

Клетки, активировавшие программу апоптоза, характеризуются специфическими морфологическими признаками: сжатие клетки, блеббинг

13

клеточной мембраны, конденсация хроматина и фрагментация ядра, которые позволяют отличить апоптоз от других типов клеточной гибели (Elmore, 2007; Galluzzi et al, 2012). Согласно принятым в настоящее время моделям, различают два типа апоптоза: митохондриальный и рецептор-зависимый (Рис. 2).

Митохондриальный путь контролируется внутриклеточными индукторами апоптоза и опосредуется активацией тумор-супрессорного белка р53. Такой тип апоптоза инициируется в ответ на повреждение ДНК и оксидативный стресс. При митохондриальном апоптозе активация проапоптотических компонентов Вах и Вак, связывающихся с антиапоптотическими белками Вс1-2 и Bcl-xl, находящимися на внешней мембране митохондрий, приводит к пермеабилизации митохондриальной мембраны и выходу в цитоплазму цитохрома С и белка SMAC/DIABLO. В результате высвобождения цитохрома С и SMAC/DIABLO происходит активация инициирующей каспазы 9 и эффекторной каспазы 3 (Desagher and Martinou, 200; Roucou et al., 2001; Galluzzi et al., 2012).

Активация апоптоза внеклеточными стимулами происходит без участия митохондрий и требует передачи апоптотических сигналов через клеточную мембрану с участием трансмембранных рецепторов клеточной гибели Death Receptors (Death-R), таких как FasL, TNFR и TRAIL. В результате связывания лигандов Death-L с Death-R происходит активация рецептора и взаимодействие его домена смерти (Death Domain) с внутриклеточным адаптером FADD или TRADD, что приводит к активации инициирующих каспаз 2, 8 и 10 и последующей активации эффекторных каспаз 3, 6 и 7 (Elmore, 2007; Galluzzi et al., 2012).

В процессе опухолевой трансформации клетки приобретают устойчивость к апоптозу. Это возможно за счет потери чувствительности к апоптотическим сигналам, гиперэкспрессии антиапоптотических и подавлению экспрессии про-апоптотических белков.

<< << « й н Ш?!Г «8Ш тш ! $ ^ 1' л

(ЩВДТМЩ

IV:' в Т. V £ 4 <' н 5 4X V; Л й £ л V} а V <■' а

СОСОСОСЮССОООСОС^^

Цитохром С

Активированная каспаэа-8

Бак

5МАС/ШАВШ

Активация эффекторных каспаз

Апоптоз

Рисунок 2. Активация митохондриального и рецептор-зависимого

путей апоптоза.

Такие клетки развивают устойчивость к противоопухолевой терапии и способствуют формированию более злокачественных вариантов опухоли.

Было показано, что в опухолевых клетках часто отмечается увеличение экспрессии антиапоптотических белков семейства Вс1-2 и мутации гена Вах. Нарушения регуляции рецептор-зависимого апоптоза, включающие подавление экспрессии и связывания Death-R и Death-L, помогают опухолевым клеткам избежать направленного против них действия иммунной системы, способствуют туморгенезу и развитию устойчивых вариантов опухолей. Кроме этого, в опухолевых клетках отмечаются мутации тумор-супрессоров р53, PUMA, NOXA, PTEN и других белков, участвующих в регуляции апоптоза, а также наблюдается гиперактивация PI3K/Akt и NF-K-B сигнальных каскадов, способствующих выживанию клетки (Reed et al., 1996; Lowe and Lin, 1999).

2.4. Клеточное старение

Клеточное старение впервые было описано Хейфликом и Мурхедом (Hayflickand Moorhead 1961), показавшими, что нормальные соматические клетки способны делиться только ограниченное число раз. Такой тип старения называется теломер-зависимым или репликативным, так как активируется в ответ на укорочение теломер. Теломеры представляют собой повторяющиеся дуплексные структуры с TTAGGG размером 15-20 тыс. пар оснований, находящиеся на концах хромосом. Теломеры защищают хромосомы от повреждения и гомологичной рекомбинации, а также участвуют в прикреплении хромосом к ядерной ламине и регуляции экспрессии генов. В результате недорепликации отстающей цепи ДНК теломеры укорачиваются с каждым циклом клеточного деления, пока их длина не достигает критического значения, что приводит к разрушению защитной структуры на конце теломеры - кэпа, и экспозиции ее открытого конца. Такие теломерные концы начинают вести себя как двойные разрывы ДНК, активируют DDR-сигнальный каскад и вызывают формирование

16

DDR-фокусов, содержащих уН2АХ, 53ВР1, MRE11, Rad50, BRCA1, ATM, ATR и другие компоненты DDR ответа (d'Adda di Fagagna et al., 2003). Это приводит к активации р53-сигнального пути, остановке клеточного цикла и активации программы старения.

Репликативное старение характерно для соматических клеток, тогда как половые, стволовые, а также опухолевые клетки способны восстанавливать длину теломер за счет активации фермента теломеразы, или путем альтернативного удлинения теломер с участием гомологичной рекомбинации между теломерами, вследствие чего такие клетки приобретают неограниченный репликативный потенциал.

Дальнейшие исследования показали, что нормальные клетки запускают программу старения в ответ на модификацию структуры хроматина, повреждение ДНК, оксидативный стресс, а также повышенную активацию онкогенов (Serrano et al., 1997; Di Micco et al., 2006; Dimauro et al., 2009; Pospelova et al., 2009; Fumagalli et al., 2012). Внешние факторы, такие как ионизирующее и ультрафиолетовое (UV) излучения, Н202 и избыток кислорода в атмосфере культивирования, а также различные внутриклеточные метаболические и сигнальные процессы приводят к образованию активных форм кислорода (ROS) и разрывов ДНК. В случае значительных повреждений и/или невозможности репарации ДНК, а также в результате повреждения внутриклеточных молекул, таких как ДНК, белки и липиды, вызыванных действием ROS, происходит активация старения или клеточной гибели (te Poele et al., 2002; Parrinello et al., 2003; Rodier et al., 2011a).

Одним из факторов, вызывающих активацию старения является нарушение организации ядерной ламины. В настоящее время известно, что белки ядерной ламины являются не только структурной основой ядерной оболочки, но также незаменимы в регуляции многочисленных функций ядра (Taimen et al., 2009). Они участвуют в организации хроматина, регуляции транскрипции, DDR-ответа и репарации ДНК, а также влияют

17

на эпигенетический статус клетки. Ламины относятся к типу V промежуточных филаментов и входят в состав ядерной оболочки, кроме того, небольшая фракция ламинов находится в цитоплазме. У млекопитающих обнаружены два типа ламина А - ламин А и С, и два основных ламина группы В - ламины В1 и В2. Тогда как ламины А и С синтезируются из продукта одного гена LMNA - преламина А в результате альтернативного сплайсинга, ламины В1 и В2 являются результатом экспрессии генов LMNB1 и LMNB2 соответственно.

Ламинопатии, ассоциированные с мутациями гена LMNA, такие как синдром прогерии Хатчинсона-Гилфорда (HGPS), характеризующийся экспрессией мутантного преламина А - прогерина, ассоциируются с ускоренным старением и характеризуются нарушенным DDR-ответом и репарацией ДНК (Dechat et al., 2008). Недавно стало известно, что при нормальном старении клетки здоровых пациентов начинают экспрессировать и накапливать прогерин, а ядра стареющих клеток приобретают морфологические характеристики, свойственные клеткам с ламинопатиями (Сао et al., 2011 а). В настоящее время роль ламинов группы В в старении остается малоизученной, однако было показано, что при различных типах старения в клетках происходит уменьшение содержание ламина B1 (Freund et al., 2012), которое также набдюдается в тканях пациентов HGPS и при нормальном старении (Dreesen et al., 2013).

2.4.1. Старение как тумор-супрессорная программа клетки

Клеточное старение наряду с апоптозом является одной из важнейших тумор-супрессорных программ, ограничивая пролиферацию клеток, несущих повреждения и способных к онкогенной трансформации. В настоящее время старение определяют как ответ клетки на различные виды стресса, заключающийся в необратимой остановке пролиферации, а также активации специфических маркеров старения. Стареющие клетки остаются метаболически активными, демонстрируют морфологические

18

и физиологические изменения и не экспрессируют гены, необходимые для пролиферации. Многочисленные эксперименты, показали, что подавление активности тумор-супрессорных генов, а также увеличение экспрессии онкогенов, приводят к активации программы старения (Serrano et al., 1997).

В 1997 году М. Серрано и коллеги впервые показали возможность индукции старения в фибробластах человека и мыши в ответ на гиперактивацию онкогена Ras (Serrano et al., 1997). В дальнейшем стало известно, что старение может быть вызвано повышенной активацией онкогенов Raf, Мус, МАР-киназ, транскрипционного фактора E2F1, и онкобелка PML (Collado and Serrano, 2010). Гиперактивация митогенных сигнальных каскадов вследствие амплификации или увеличения экспрессии онкогена, либо в результате нарушения его негативной регуляции представляет риск онкогенной трансформации, в связи с чем вызывает индукцию тумор-супрессорной программы старения для предотвращения дальнейшего развития опухоли. Известно, что экспрессия маркеров старения in vivo наблюдается в клетках, находящихся на пре-неопластической и начальной стадиях развития опухоли, тогда как на более поздних этапах маркеры старения отсутствуют (Collado and Serrano, 2010). Однако способность опухолевых клеток преодолевать старение, вызванное гиперактивацией онкогенов, еще не означает, что программа старения в них не может быть реактивирована.

Современная противоопухолевая терапия основывается на индукции клеточной гибели, однако ее эффективность ограничивается способностью опухолевых клеток активировать механизмы, способствующие выживанию. В настоящее время индукция старения рассматривается как перспективый подход в противоопухолевой терапии. В зависимости от типа опухолевых клеток старение может быть индуцированно различными препаратами, включая ДНК-повреждающие факторы (ионизирующее излучение, цитостатические препараты), вещества, восстанавливающие активность р53 (нутлин За), а также ингибиторы гистоновых деацетилаз (HDACIs) (Munro

19

et al., 2004; Marks et al., 2004; Efeyan et al., 2007; Rodier and Campisi, 2011). В связи с тем, что старение может быть активированно даже в устойчивых к апоптозу клетках (Roninson et al., 2003), эта тумор-супрессорная программа приобретает особенно важное значение, так как в процессе неопластической трансформации или противоопухолевой терапии опухолевые клетки приобретают устойчивость к апоптозу, в результате чего формируются некурабельные, агрессивные варианты опухолей.

2.4.2 Маркеры клеточного старения

В настоящее время известен широкий спектр маркеров клеточного старения (Рис. 3), но установлено, что ни один из них не является универсальным. Стареющие клетки не экспрессируют все известные маркеры старения одновременно, а скорее демонстрируют различные их комбинации (Rodier et al., 2011 б; Pospelova et al., 2013 а), в связи с чем при диагностике старения рекомендовано учитывать несколько маркеров.

Необратимая остановка пролиферации клеток

Главным маркером старения является необратимая остановка пролиферации, которая не может быть восстановлена при стимуляции ростовыми факторами, что отличает стареющие клетки от покоящихся. Однако при подавлении активности киназы mTOR (Mammalian Target of Rapamycin), подавлении экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ (Cdkl) pl6/Ink4a, а также при изменении активности тумор-супрессора р53, возможна реверсия различных типов старения in vitro и in vivo (Beausejour et al., 2003; Takahashi et al., 2006; Demidenko et al. 2009; Pospelova et al., 2012). Этот процесс характеризуется восстановлением пролиферативного потенциала, которое, однако, задержано во времени и наблюдается через некоторое время после удаления фактора, вызывающего старение (Demidenko et al., 2009; Pospelova et al., 2012). Таким образом, необратимость подавления пролиферации является необходимым, но не достаточным признаком старения.

ОСТАНОВКА | т

••• 1

ПРОЛИФЕРАЦИИ

8А8Р ••

ООИ-фокусы ЗАНР

Рисунок 3. Активация маркеров старения в клетках.

Гипертрофия и распластывание клеток

Отличия морфологии стареющих клеток от нормальных впервые были описаны Хейфликом в 1965 году (Hayflick, 1965), наблюдавшим, что при увеличении числа пассажей в культуре нормальных фибробластов происходит изменение формы клетки от веретенообразной у молодых фибробластов, до округлой у стареющих. Позднее было отмечено, что стареющие клетки значительно увеличиваются в размере и распластываются на субстрате, а также часто становятся многоядерными (Romanov et al., 2010; Шитикова и др., 2011; Blagosklonny et al., 2011, 2012). Как оказалось, стареющие клетки характеризуются гиперактиваций сигнальных каскадов, участвующих в регуляции метаболизма, среди которых в настоящее время наиболее изучен mTOR-каскад. Высокий уровень активности mTOR стимулирует белковый синтез и клеточный рост, что при подавлении деления приводит к значительному увеличению размеров клетки, а изменения организации цитоскелета, также контролируемые киназой mTOR, приводят к распластыванию клетки на субстрате (Sarbassov et al., 2006; Liu et al., 2010; Blagosklonny et al., 2012).

Ассоциированная со старением fi-галактозидазная активность

Экспрессия ассоциированной со старением Р-галактозидазы (SA-P-Gal) является наиболее часто используемым маркером старения, однако нужно отметить, что некоторые типы стареющих клеток не экспрессируют SA-p-Gal. Активация SA-P-Gal отмечается при старении клеток как in vitro, так и in vivo (Dimri et al., 1995). Хотя природа и роль активации SA-P-Gal в настоящее время до конца не определены, считается, что SA-P-Gal отражает увеличение лизосомной массы в стареющих клетках, а именно увеличение экспрессии и накопление лизосомной Р-галактозидазы (Lee et al., 2006). Важно отметить, что экспрессия SA-P-Gal в клетках независима

от репликативной активности и является маркером, характерным для стареющих, но не для покоящихся клеток.

Модификация хроматина

Старение ассоциируется с изменением степени конденсации хроматина, которое обеспечивается модификациями гистонов и приводит к изменению характера транскрипции генов. В процессе старения некоторые типы клеток накапливают определенный тип гетерохроматиновых фокусов, называемых «ассоциированные со старением гетерохроматиновые фокусы» - SAHF (Senescence associated heterochromatin foci). Эти фокусы представляют собой участки хроматина, обогащенные гистоном НЗ, триметилированным по лизину 9 (НЗК9МеЗ), а также гетерохроматиновым белком НР1у. Кроме того, они включают негистоновые белки, определяющие архитектуру хроматина. Эти модификации характерны для гетерохроматина и коррелируют с активацией DDR-сигналинга (Chandra and Narita, 2013).

Формирование SAHF специфично для онкоген-индуцированного старения и происходит при участии белка pRb (Kosar et al., 2011). Формирование SAHF часто происходит на промоторах генов, являющихся мишенями транскрипционного фактора E2F, приводя к подавлению транскрипции генов, требуемых для вхождения в S-фазу и прохождения по клеточному циклу (Narita et al., 2003). Экспериментально показано, что утрата pRb приводит к невозможности образования SAHF и подавлению Е2Р-зависимой транскрипции.

Образование SAHF может вызывать, либо отражать изменение общего паттерна транскрипции генов при старении и устанавливать определенный эпигенетический статус клетки. Однако зависимость формирования SAHF от типа клеток и воздействия ограничивает его применение в качестве маркера старения.

Активация маркеров ответа на повреждение ДНК

Одним из характерных, и в настоящее время широко используемым маркером старения, выявляемым in vitro и in vivo, является активация компонентов DDR-сигнального пути и формирование фокусов DDR (Sedelnikova et al., 2004; Mallette et al., 2007; d'Adda di Fagagna 2008; Pospelova et al., 2013 a).

Клетки, старение которых сопровождается персистенцией фокусов DDR, характеризуются формированием так называемых «ДНК-сегментов с нарушениями хроматина, способствующими старению» - DNA-SCARS (DNA segments with chromatin alterations reinforcing senescence). Они представляют собой локальные фокусы модифицированного хроматина, содержащие активированные белки DDR-сигнального каскада, но отличающиеся от сайтов истинных повреждений ДНК. DNA-SCARS могут содержать рАТМ, pATR, уШАХ, 53ВР1 и Chk2, но, в отличие от временных, быстро диссоциирующих фокусов истинных повреждений ДРЕК, в них отсутствуют ферменты репарации RPA и Rad51, а также не обнаруживается одноцепочечная ДНК и синтез ДНК (Rodier et al., 2011 б).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шитикова, Жанна Валерьевна, 2014 год

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Булавин Д.В., Тарарова Н.Д., Бричкина А.И., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Перенос онкогенов Е1А и £75-19 кДа в эмбриональные фибробласты крысы не отменяет способности клеток останавливаться в клеточном цикле после у-облучения//Молекуляр. биол. 2002. Т.36. № 1. С. 58-65.

2. Романов B.C., Бричкина А.И., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Влияние онкогена Е1А на способность ингибитора p21/Wafl регулировать блок G1/S в е1А-экспрессирующих трансформантах//Цитология. 2005. Т.47. № 12. С. 1063-1070.

3. Шитикова Ж.В., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. Индукция клеточного старения ингибитором гистоновых деацетилаз бутиратом натрия в трансформантах грызунов, устойчивых к апоптозу. Цитология//2011. Т.5. № 3. С. 235-242.

4. Acosta J.C., O'Loghleen A., Banito A., Guijarro M.V., Augert A., Raguz S., Fumagalli M., Da Costa M., Brown C., Popov N., Takatsu Y., Melamed J., d'Adda di Fagagna F., Bernard D., Hernando E., Gil J. Chemokine signaling via the CXCR2 receptor reinforces senescence//Cell. 2008. V.133. № 6. P. 1006-1018.

5. Alcorta D.A., Xiong Y., Phelps D., Hannon G., Beach D., Barrett J.C. Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor pl6 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts//Proc Natl Acad Sci U S A. 1996. V.93. № 24. P. 13742-13747.

6. Alexander A., Cai S.L., Kim J., Nanez A., Sahin M., MacLean K.H., Inoki K., Guan K.L., Shen J., Person M.D. Kusewitt D., Mills G.B., Kastan M.B., Walker C.L. ATM signals to TSC2 in the cytoplasm to regulate mTORC 1 in response to ROS//Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. V.107. № 9. P. 4153—4158.

7. Anisimov V.N., Zabezhinski M.A., Popovich I.G., Piskunova T.S., Semenchenko A.V., Tyndyk M.L., Yurova M.N., Anyoch M.P., Blagosklonny M.V. Rapamycin extends maximal lifespan in cancer-prone mice//Am J Pathol. 2010. V.176. № 5. P. 2092-2097.

8. Bartek J., Bartkova J., Lukas J. DNA damage signalling guards against activated oncogenes and tumour progression//Oncogene. 2007. V.26. № 56. P. 7773-7779.

9. d'Adda di Fagagna F. Living on a break: cellular senescence as a DNA-damage response//Nat Rev Cancer. 2008. V.8. № 7. P. 512-522.

10. d'Adda di Fagagna F., Reaper P.M., Clay-Farrace L., Fiegler H., Carr P., Von Zglinicki T., Saretzki G., Carter N.P., Jackson S.P. A DNA damage checkpoint response in telomere-initiated senescence//Nature. 2003. V.426. №6963. P. 194-198.

11. Bagchi S.W., Chellappan S.P., Horowitz J.M., Nevins J.R. The interaction of RB with E2F coincides with an inhibition of the transcriptional activity of E2F//Genes Dev .1992. V.6. № 2. P. 177-185.

12. Bagchi S., Raychaudhuri P., Nevins J.R. Adenovirus El A proteins can dissociate heteromeric complexes involving the E2F transcription factor: a novel mechanism for El A trans-activation//Cell. 1990. V.62. №4. P.659-669.

13. Bakkenist C.J., Kastan M.B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation//Nature. 2003. V.421. № 6922. P. 499-506.

14. Bandhakavi S., Kim Y.M., Ro S.H., Xie H., Onsongo G., Jun C.B., Kim D.H.., Griffin T.J. Quantitative nuclear proteomics identifies mTOR regulation of DNA damage response//Mol Cell Proteomics 2010;9(2):403-14.

15. Bannister A.J., Kouzarides T. Regulation of chromatin by histone modifications//Cell Res. 2011. V.21. № 3. P. 381-395.

16. Bartkova J., Rezaei N., Liontos M., Karakaidos P., Kletsas D., Issaeva N., Vassiliou L.V., Kolettas E., Niforou K., Zoumpourlis V.C., Takaoka M., Nakagawa H., Tort F., Fugger K., Johansson F., Sehested M., Andersen

119

C.L., Dyrskjot L., 0rntofl T., Lukas J., Kittas C., Helleday T., Halazonetis T.D., Bartek J., Gorgoulis V.G. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints//Nature. 2006. V.444.№ 7119. P. 633-637.

17. Beausejour C.M., Krtolica A., Galimi F., Narita M., Lowe S.W., Yaswen P., Campisi J. Reversal of human cellular senescence: roles of the p53 and pi 6 pathways//Embo J. 2003. V.22. № 16. P. 4212^222.

18. Ben-Porath I, Thomson M.W., Carey V.J., Ge R., Bell G.W., Regev A., Weinberg R.A. An embryonic stem cell-like gene expression signature in poorly differentiated aggressive human tumors//Nat Genet. 2008. V.40. № 5. P. 499-507.

19. Blagosklonny M.V. Aging-suppressants: cellular senescence (hyperactivation) and its pharmacologic deceleration//Cell Cycle. 2009. V.8. № 12. P. 1883-1887.

20. Blagosklonny M.V. Cell cycle is not senescence//Aging (Albany NY). 2011. V.3. № 2. P. 94-101.

21. Blagosklonny M.V. Cell cycle arrest is not yet senescence, which is not just cell cycle arrest: terminology for TOR-driven aging//Aging (Albany NY). 2012. V.4. №3.P. 159-165.

22. Braunstein S., Badura M.L., Xi Q., Formenti S.C., Schneider R.J. Regulation of protein synthesis by ionizing radiation//Mol Cell Biol. 2009. V.29. № 21. P. 5645-5656.

23. Bree R.T., Stenson-Cox C., Grealy M., Byrnes L., Gorman A.M., Samali A. Cellular longevity: role of apoptosis and replicative senescence//Biogerontology. 2002. №. 3. P. 195-206.

24. Boyd JM, Malstrom S., Subramanian T., Venkatesh LJEt., Schaeper U., Elangovan B., D'Sa-Eipper C., Chinnadurai G. Adenovirus E1B 19 kDa and Bcl-2 proteins interact with a common set of cellular proteins//Cell. 1994. v.79.№ 2. P. 341-51.

25. Bulavin D.V., Tararova N.D., Aksenov N.D., Pospelov V.A., Pospelova T.V. Deregulation of p53/p21Cipl/Wafl pathway contributes to polyploidy and apoptosis of ElA+cHa-ras transformed cells after gamma-irradiation//Oncogene. 1999. V.18. № 41. P. 5611-5619.

26. Burgess A, Ruefli A, Beamish H, Warrener R, Saunders N, Johnstone R, Gabrielli B. Histone deacetylase inhibitors specifically kill nonproliferating tumour cells//Oncogene. 2004. V.23. № 40. P. 6693-6701.

27. Campisi J., d'Adda di Fagagna F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells//Nat Rev Mol Cell Biol. 2007. V.8. № 9. P. 729-740.

28. Cao K., Blair C. D., Faddah D. A., Kieckhaefer J., E., Olive M., Erdos M., R., Nabel E. G., Collins F. S., Progerin and telomere dysfunction collaborate to trigger cellular senescence in normal human fibroblasts//J Clin Invest. 2011 (a). V.121. № 7. P. 2833-2844.

29. Cao K., Graziotto J.J., Blair C.D., Mazzulli J.R., Erdos M.R., Krainc D., Collins F.S. Rapamycin reverses cellular phenotypes and enhances mutant protein clearance in Hutchinson-Gilford progeria syndrome cells//Sci Transl Med. 2011 (6). V.3. № 89. 89ra58.

30. Chandra Т., Narita M. High-order chromatin structure and the epigenome in SAHFs//Nucleus. 2013. V.4. № 1. P. 23-28.

31. Chellappan S.P., Hiebert S., Mudryj M., Horowitz J.M., Nevins J.R. The E2F transcription factor is a cellular target for the RB protein//Cell. 1991. V.65. №6. P. 1053-1061.

32. Chang C.C., Shieh G.S., Wu P., Lin C.C., Shiau A.L., Wu C.L. Oct-3/4 expression reflects tumor progression and regulates motility of bladder cancer cells//Cancer Res. 2008. V.68. № 15. P. 6281-6291.

33. Chattopadhyay D., Ghosh M.K., Mai A., Harter M.L. Inactivation of p21 by El A leads to the inductionof apoptosis in DNA-damaged cells//J Virol. №. 75. P. 9844-9856.

34. Chen H., Ma Z., Vanderwaal R.P., Feng Z., Gonzalez-Suarez I., Wang S., Zhang J., Roti Roti J.L., Gonzalo S.. The mTOR inhibitor rapamycin

121

suppresses DNA double-strand break repair//Radiat Res. 2011. V.175. №2. P. 214-224.

35. Chen T., Shen L., Yu J., Wan H., Guo A., Chen J., Long Y., Zhao J., Pei G. Rapamycin and other longevity-promoting compounds enhance the generation of mouse induced pluripotent stem cells//Aging Cell. 2011. V.10. №5. P. 908-911.

36. Chiou S.H., Wang M.L., Chou Y.T., Chen C.J., Hong C.F., Hsieh W.J., Chang H.T., Chen Y.S., Lin T.W., Hsu H.S., Wu C.W. Coexpression of Oct4 and Nanog enhances malignancy in lung adenocarcinoma by inducing cancer stem cell-like properties and epithelial-mesenchymal transdifferentiation//Cancer Res .2010. V.70. № 24. P. 10433-10444.

37. Chikamatsu K., Ishii H., Murata T., Sakakura K., Shino M., Toyoda M., Takahashi K., Masuyama K. Alteration of cancer stem cell-like phenotype by histone deacetylase inhibitors in squamous cell carcinoma of the head and neck//Cancer Sci. 2013. V.104. № 11. P. 1468-1475.

38. Collado M., Serrano M. Senescence in tumours: evidence from mice and humans//Nat Rev Cancer. 2010. V.10. № 1. P. 51-57.

39. Comai L. The advantages and disadvantages of being polyploid//Nat Rev Genet. 2005. V.6. № 11. P. 836-846.

40. Coppe J.P., Desprez P.Y., Krtolica A., Campisi J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression//Annu Rev Pathol. 2010. №5. P. 99-118.

41. Daley J.M., Sung P. 53BP1, BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks//Mol Cell Biol. 2014. V.34. №8. P. 1380-1388.

42. Davis A.J., Chen D.J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Trans 1 Cancer Res. 2013; 2(3):130-143.Li X., Heyer W.D. Homologous recombination in DNA repair and tolerance//Cell Res. 2008. V.18. № l.P. 99-113.

43. Dechat T, Pfleghaar K, Sengupta K, Shimi T, Shumaker DK, Solimando L, Goldman RD. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin//Genes Dev. 2008. V.22. № 7. P. 832-53.

44. Demidenko Z.N., Zubova S.G., Bukreeva E.I., Pospelov V.A., Pospelova T.V., Blagosklonny M.V. Rapamycin decelerates cellular senescence//Cell Cycle 2009. V.8. № 12. P. 1888-1895.

45. Desagher S., Martinou J.C. Mitochondria as the central control point of apoptosis//Trends Cell Biol. 2000. V.10. № 9. P. 369-377.

46. Dimauro T. David G. Chromatin modifications: the driving force of senescence and aging? // Aging (Albany NY). 2009. V.l. № 2. P. 182-190.

47. Di Micco R., Fumagalli M., Cicalese A., Piccinin S., Gasparini P., Luise C., Schurra C., Garre' M., Nuciforo P.G., Bensimon A. Maestro R., Pelicci P.G., d'Adda di Fagagna F. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication//Nature. 2006. V.444. № 7119. P. 638-642.

48. Dimri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M., Scott G., Roskelley C., Medrano E.E., Linskens M., Rubelj I., Pereira-Smith O. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo//Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V.92. № 20. P. 9363-9367.

49. Douglas P., Sapkota G.P., Morrice N., Yu Y., Goodarzi A.A., Merkle D., Meek K., Alessi D.R., Lees-Miller S.P. Identification of in vitro and in vivo phosphorylation sites in the catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase//Biochem. J. 2002. № 368. P. 243-251.

50. Dreesen O., Chojnowski A., Ong P.F., Zhao T.Y., Common J.E., Lunny D., Lane E.B., Lee S.J., Vardy L.A., Stewart C.L., Colman A. Lamin B1 fluctuations have differential effects on cellular proliferation and senescence//J Cell Biol. 2013. V.200. № 5. P. 605-617.

51. Dreesen O., Ong P.F., Chojnowski A., Colman A. The contrasting roles of lamin B1 in cellular aging and human disease. Nucleus. 2013; V.4. №4. P. 283-290.

52. Feng Z., Zhang H., Levine A.J., Jin S. The coordinate regulation of the p53 and mTOR pathways in cells//Proc Natl Acad Sci USA. 2005. V.102. № 23. P. 8204-8209.

53. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death//Toxicol Pathol. 2007. V.35. № 4. P. 495-516.

54. Fernandez-Capetillo O., Chen H.T., Celeste A., Ward I., Romanienko P.J., Morales J.C., Naka K., Xia Z., Camerini-Otero R.D., Motoyama N. Carpenter P.B., Bonner W.M.,Chen J., Nussenzweig A. DNA damage-induced G2-M checkpoint activation by histone H2AX and 53BP1//Nat Cell Biol. 2002. V.4. № 12. P. 993-997.

55. Fong Y.W., Inouye C., Yamaguchi T., Cattoglio C., Grubisic I., Tjian R. A. DNA repair complex functions as an Oct4/Sox2 coactivator in embryonic stem cells//Cell. 2011. V. 147. № l.P. 120-131.

56. Freund A., Laberge R.M., Demaria M., Campisi J. Lamin B1 loss is a senescence-associated biomarker. Mol Biol Cell. 2012; V.23. № 11. P. 20662075.

57. Fumagalli M., Rossiello F., Clerici M., Barozzi S., Cittaro D., Kaplunov J.M., Bucci G., Dobreva M., Matti V., Beausejour CM and others. Telomeric DNA damage is irreparable and causes persistent DNA-damage-response activation. Nat Cell Biol//2012. V.14. № 4. P. 355-365.

58. Galluzzi L., Vitale I., Abrams J.M., Alnemri E.S., Baehrecke E.H., Blagosklonny M.V., Dawson T.M., Dawson V.L., El-Deiry W.S., Fulda S., Gottlieb E., Green D.R.,Hengartner M.O., Kepp O., Knight R.A., Kumar S., Lipton S.A., Lu X., Madeo F., Malorni W., Mehlen P., Nunez G., Peter M.E., Piacentini M., Rubinsztein D.C., Shi Y., Simon H.U., Vandenabeele P., White E., Yuan J., Zhivotovsky B., Melino G., Kroemer G. Molecular

definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death//Cell Death Differ. 2012. V.19. № 1. P. 107-120.

59. Glass E., Viale P.H. Histone deacetylase inhibitors: novel agents in cancer treatment//Clin J Oncol Nurs. 2013. V.17. № 1. P. 34-40.

60. González F., Georgieva D., Vanoli F., Shi Z.D., Stadtfeld M., Ludwig T., Jasin M., Huangfu D. Homologous recombination DNA repair genes play a critical role in reprogramming to a pluripotent state//Cell Rep. 2013. V.3. № 3. P. 651-660.

61. Gonzalez-Suarez I., Redwood A.B., Perkins S.M., Vermolen B., Lichtensztejin D., Grotsky D.A., Morgado-Palacin L., Gapud E.J., Sleckman B.P., Sullivan T., Sage J., Stewart C.L., Mai S., Gonzalo S. Novel roles for A-type lamins in telomere biology and the DNA damage response pathway//EMBO J. 2009 (a). V.28. № 16. P. 2414-2427.

62. Gonzalez-Suarez I., Redwood AB, Gonzalo S. Loss of A-type lamins and genomic instability//Cell Cycle. 2009 (6). V.8. № 23. P. 3860-3865.

63. Göttlicher M., Minucci S., Zhu P., Krämer O.H., Schimpf A., Giavara S., Sleeman J.P., Lo Coco F., Nervi C., Pelicci P.G., Heinzel T. Valproic acid defines a novel class of HD AC inhibitors inducing differentiation of transformed cells//EMBO J. 2001. V.20. № 24. P. 6969-6978.

64. Groselj B., Sharma N.L., Hamdy F.C., Kerr M., Kiltie A.E. Histone deacetylase inhibitors as radiosensitisers: effects on DNA damage signalling and repair//Br J Cancer. 2013. V.108. № 4. P. 748-754.

65. Hara E., Smith R., Parry D., Tahara H., Stone S., Peters G.. Regulation of pl6CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence//Mol Cell Biol. 1996. V.16. № 3. P. 859-67.

66. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer//Cell. 2000. V.100. № 1. P. 57-70.

67. Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of cancer: the next generation//Cell. 2011. V.144. № 5. P. 646-674.

68. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains//Exp Cell Res. 1965. №. 37. P. 614-636.

69. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains//Exp Cell Res. 1961. № 25. P. 585-621.

70. Howe J.A., Mymryk J.S., Egan C., Branton P.E., Bayley S.T. Retinoblastoma growth suppressor and a 300-kDa protein appear to regulate cellular DNA synthesis//Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. №. 87. P. 5883-5887.

71. Jeter C.R., Liu B., Liu X., Chen X., Liu C., Calhoun-Davis T., Repass J., Zaehres H., Shen J.J., Tang D.G.. NANOG promotes cancer stem cell characteristics and prostate cancer resistance to androgen deprivation//Oncogene. 2011. V.30. № 36. P. 3833-3845.

72. Jiang P., Mizushima N. Autophagy and human diseases//Cell Res. 2014. V.24. № l.P. 69-79.

73. Johnson D.G., Schwarz J.K., Cress W.D., Nevins J.R. Expression of transcription factor E2F1 induces quiescent cells to enter S phase//Nature. 1993. V.365. № 6444. P. 349-352.

74. Jowsey P., Morrice N.A., Hastie C.J., McLauchlan H., Toth R., Rouse J. Characterisation of the sites of DNA damage-induced 53BP1 phosphorylation catalysed by ATM and ATR//DNA Repair (Amst). 2007. V.6. № 10. P. 15361544.

75. Jung C.H., Ro S.H., Cao J., Otto N.M., Kim D.H. mTOR regulation of autophagy//FEB S Lett. 2010. V.584. № 7. P. 1287-1295.

76. Kim D.H., Sarbassov D.D., Ali S.M., King J.E., Latek R.R., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Sabatini D.M. mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery//Cell. 2002. V.110. №2. P. 163-175.

77. Keblusek P., Dorsman J.C., Teunisse A.F., Teunissen H., van der Eb A.J., Zantema A. The adenoviral El A oncoproteins interfere with the growth inhibiting effect of the cdk-inhibitor p21(CIPl/WAFl)//J Gen Virol. 1999. V.80. №2. P. 381-390.

78. Kolesnichenko M., Hong L., Liao R., Vogt P.K., Sun P. Attenuation of TORC1 signaling delays replicative and oncogenic RAS-induced senescence//Cell Cycle. 2012. V.ll. № 12. P. 2391-2401

79. Kondo Y., Kondo S. Autophagy and cancer therapy//Autophagy. 2006. V.2. № 2. P. 85-90.

80. Kosar M., Bartkova J., Hubackova S., Hodny., Lukas J., Bartek J. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of pl6(ink4a)//Cell Cycle. 2011. V.10. № 3. P. 457^168.

81. Kroemer G., Marino G., Levine B.. Autophagy and the integrated stress response//Mol Cell. 2010. V.40. № 2. P. 280-293.

82. Kuilman T., Michaloglou C., Vredeveld L.C., Douma S., van Doom R., Desmet C.J., Aarden L.A., Mooi W.J., Peeper D.S. Oncogene-induced senescence relayed by an interleukin-dependent inflammatory network//Cell. 2008. V.133.№ 6. P. 1019-1031.

83. Laplante M., Sabatini D.M. mTOR signaling at a glance//J Cell Sci. 2009. V.122. Pt. 20. P. 3589-3594.

84. La Thangue N.B., Rigby P.W.J. An adenovirus EIA-like transcription factor is regulated during the differentiation of murine embryonal carcinoma stem cells//Cell. 1987. № 49. P. 507-513.

85. Lee B.Y., Han J.A., Im J.S., Morrone A., Johung K., Goodwin E.C., Kleijer W.J., DiMaio D., Hwang E.S. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase//Aging Cell. 2006. V.5. № 2. P. 187-195.

86. Leontieva O., V., Demidenko Z.N., Blagosklonny M.V. S6K in geroconversion//Cell Cycle. 2013. V.12. № 20. P. 3249-3252.

87. Levine B, Yuan J. Autophagy in cell death: an innocent convict?// J Clin Invest. 2005. V.115. № 10. P . 2679-2688.

88. Li X., Heyer W.D. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance//Cell Res. 2008. V. 18. № 1. P. 99-113.

89. Liu L., Luo Y., Chen L., Shen T., Xu B, Chen W, Zhou H, Han X., Huang S.Rapamycin inhibits cytoskeleton reorganization and cell motility by suppres sing RhoA expression and activity//.! Biol Chem. 2010. V.285. №49. P. 38362-38373.

90. Lowe S.W., Lin A.W., Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 2000. V.21. № 3. P. 485-495.

91. Efeyan A., Ortega-Molina A., Velasco-Miguel S., Herranz D., Vassilev L.T., Serrano M. Induction of p53-dependent senescence by MDM2 antagonist nutlin-3a in mouse cells of fibroblast origin//Cancer Res. 2007. V.67. № 15. P. 7350-7357.

92. Majuri M.C., Zalckvar E., Kimchi A., Kroemer G. Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis//Nat Rev Mol Cell Biol. 2007. V.8. № 9. P. 741-52.

93. Mallette F.A., Gaumont-Leclerc M.F., Ferbeyre G. The DNA damage signaling pathway is a critical mediator of oncogene-induced senescence// Genes Dev. 2007. V.21. № 1. P. 43-8.

94. Malumbres M, Barbacid M. To cycle or not to cycle: a critical decision in cancer//Nat Rev Cancer. 2001. V. 1. № 3. P. 222-231.

95. Marks P.A., Richon V.M., Miller T., Kelly W.K. Histone deacetylase inhibitors//Adv Cancer Res. 2004. №. 9. P. 137-68.

96. Molina-Estevez F.J., Lozano M.L., Navarro S., Torres Y., Grabundzija I., Ivies Z., Samper E., Bueren J.A., Guenechea G. Brief report: impaired cell reprogramming in nonhomologous end joining deficient cells//Stem Cells. 2013. V.31. № 8. P. 1726-1730.

97. Mukhopadhyay S., Panda P.K., Sinha N., Das D.N., Bhutia S.K. Autophagy and apoptosis: where do they meet? //Apoptosis. 2014. V.19. № 4. P. 555566.

98. Munro J., Barr N.I., Ireland H., Morrison V., Parkinson E.K. Histone deacetylase inhibitors induce a senescence-like state in human cells

by apl6-dependent mechanism that is independent of a mitotic clock//Exp Cell Res. 2004. V.295. № 2. P. 525-538.

99. Murga M., Jaco I., Fan Y., Soria R, Martinez-Pastor B., Cuadrado M., Yang SM, Blasco MA, Skoultchi AI., Fernandez-Capetillo O. Global chromatin compaction limits the strength of the DNA damage response// J Cell Biol. 2007. V.178. № 7. P. 1101-1108.

100. Nakamura A.J., Chiang Y.J,. Hathcock K.S., Horikawa I., Sedelnikova O.A., Hodes R.J., Bonner W.M. Both telomeric and non-telomeric DNA damage are determinants of mammalian cellular senescence//Epigenetics Chromatin. 2008. V.l. № l.P. 6.

101. Narita M., Nünez S., Heard E., Lin A.W., Hearn S.A., Spector D.L., Hannon G.J., Lowe S.W. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence//Cell. 2003. V.l 13. № 6. P. 703716.

102. Nöda A., Hirai Y., Hamasaki K., Mitani H., Nakamura N., Kodama Y. Unrepairable DNA double-strand breaks that are generated by ionising radiation determine the fate of normal human cells//J Cell Sei. 2012. V.l25. №. 22. P. 5280-5287.

103. Noh K.H., Kim B.W., Song K.H., Cho H., Lee Y.H., Kim J.H., Chung J.Y., Hewitt S.M., Seong S.Y., Mao C.P. Wu T.C., Kim T.W. Nanog signaling in cancer promotes stem-like phenotype and immune evasion//J Clin Invest. 2012. V.122.№ 11. P. 4077^093.

104. Panier S., Boulton S.J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus//Nat Rev Mol Cell Biol. 2014. V.15. № 1. P. 7-18.

105. Parrinello S., Samper E., Krtolica A., Goldstein J., Melov S., Campisi J. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts//Nat Cell Biol. 2003. V.5. № 8. P. 741-747.

106. Pospelova T.V., Bykova T.V., Zubova S.G., Katolikova N.V., Yartzeva N.M., Pospelov V.A. Rapamycin induces pluripotent genes associated with

avoidance of replicative senescence//Cell Cycle. 2013 (6). V.12. №24. P. 3841-51.

107. Pospelova T.V., Chitikova Z.V., Pospelov V.A. An integrated approach for monitoring cell senescence//Methods Mol Biol. 2013 (a). №965.P.383^108.

108. Pospelova T.V., Demidenko Z.N., Bukreeva E.I., Pospelov V.A., Gudkov A.V., Blagosklonny M.V. Pseudo-DNA damage response in senescent cells//Cell Cycle. 2009. V.8. № 24. P. 4112-8.

109. Pospelova T.V., Leontieva O.V., Bykova T.V., Zubova S.G., Pospelov V.A., Blagosklonny M.V. Suppression of replicative senescence by rapamycin in rodent embryonic cells//Cell Cycle. 2012. V.l 1. № 12.P. 2402-7.

110. Puig P.E., Guilly M.N., Bouchot A., Droin N., Cathelin D., Bouyer F., Favier L., Ghiringhelli F., Kroemer G., Solary E. Martin F., Chauffert B. Tumor cells can escape DNA-damaging cisplatin through DNA endoreduplication and reversible polyploidy//Cell Biol Int. 2008. V.32. № 9. P. 1031^43.

111. Quinlan M.P., Grodzicker T. Adenovirus El A 12S protein induces DNA synthesis and proliferation in primary epithelial cells in both the presence and absence of serum//J Virol. 1987. V.61. № 3. P. 673-682.

112. Rao L, Debbas M, Sabbatini P, Hockenbery D, Korsmeyer S, White E. The adenovirus El A proteins induce apoptosis, which is inhibited by the E1B 19-kDa and Bcl-2 proteins//Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V.89. № 16. P. 7742-7746.

113. Rao L., Modha D., White E. The E1B 19K protein associates with lamins in vivo and its proper localization is required for inhibition of apoptosis//Oncogene. 1997. V. 15. № 13. P. 1587-1597.

114. Rao L., Perez D., White E. Lamin proteolysis facilitates nuclear events during apoptosis//J Cell Biol. 1996. V.135. № 6. Pt. 1. P. 1441-1455.

115.Rappold I., Iwabuchi K., Date T., Chen J. Tumor suppressor p53 binding protein 1 (53BP1) is involved in DNA damage-signaling pathways//J Cell Biol. 2001. V.153. № 3. P. 613-620.

116. Reed J.C., Miyashita T., Takayama S., Wang H.G., Sato T., Krajewski S., Aime-Sempe C., Bogrug S., Kitada S., Hanada M., BCL-2 family proteins: regulators of cell deathe involved in the patogénesis of cancer aand resistance to therapy//J Cell Biochem. 1996. V.60. № 1. P. 23-32.

117. Redwood A.B., Gonzalez-Suarez I., Gonzalo S. Regulating the levels of key factors in cell cycle and DNA repair: new pathways revealed by lamins//Cell Cycle. 2011. V.10. № 21. P. 3652-3657.

118. Relio-Varona S., Lissa D., Shen S., Niso-Santano M., Senovilla L., Mariño G., Vitale I., Jemaá M., Harper F., Pierron G., Castedo M., Kroemer G. Autophagic removal of micronuclei//Cell Cycle. 2012. V.ll. №1. P.170-176.

119. Rodier F., Campisi J. Four faces of cellular senescence//Cell Biol. 2011 (a). V.192. № 4. P. 547-556.

120. Rodier F., Coppé J.P., Patil C.K., Hoeijmakers W.A., Muñoz D.P., Raza S.R., Freund A., Campeau E., Davalos A.R., Campisi J. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion//Nat Cell Biol. 2009. V.l 1. № 8. P. 973-979.

121. Rodier F., Muñoz D.P., Teachenor R., Chu V., Le O., Bhaumik D., Coppé J.P., Campeau E., Beauséjour C.M., Kim S.H., Davalos A.R., Campisi J. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion//J Cell Sci. 2011 (6). V.124.№ l.P. 68-81.

122. Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., Bonner W.M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139//J Biol Chem. 1998. V.273. № 10. P. 5858-5868.

123. Romanov V.S., Abramova M.V., Svetlikova S.B., Bykova T.V., Zubova S.G., Aksenov N.D., Fornace A.J. Jr, Pospelova T.V., Pospelov V.A. p21(Wafl) is required for cellular senescence but not for cell cycle arrest induced by the HDAC inhibitor sodium butyrate//Cell Cycle. 2010. V.9. № 19. P. 39453455.

124. Roninson I.B., Broude E.V., Chang B.D. If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells//Drug Resist Updat. 2001. V.4.№5.P. 303-313.

125. Roucou X., Antonsson B., Martinou J.C. Involvement of mitochondria in apoptosis//Cardiol Clin. 2001. V. 19. № 1. P. 45-55.

126. Salmina K., Jankevics E., Huna A., Perminov D., Radovica I., Klymenko T., Ivanov A., Jascenko E., Scherthan H., Cragg M., Erenpreisa J. Up-regulation of the embryonic self-renewal network through reversible polyploidy in irradiated p53-mutant tumour cells//Exp Cell Res. 2010. V.316. № 13. P. 2099-2112.

127. Sarbassov D.D., Ali S.M., Kim D.H., Guertin D.A., Latek R.R., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Sabatini D.M. Rictor, a novel binding partner of mTOR, defines a rapamycin-insensitive and raptor-independent pathway that regulates the cytoskeleton//Curr Biol. 2004. V.14. № 14. P. 1296-1302.

128. Sarbassov D.D., Ali S.M., Sengupta S., Sheen J.H., Hsu P.P., Bagley A.F., Markhard A.L., Sabatini D.M., Prolonged rapamycin treatment inhibits mTORC2 assembly and Akt/PKB//Mol Cell. 2006. V.22. № 2. P. 159-158.

129. Sarnow P., Ho Y.S., Williams J., Levine A.J. Adenovirus Elb-58kd tumor antigen and SV40 large tumor antigen are physically associated with the same 54 kd cellular protein in transformed cells//Cell. 1982 .V.28. № 2. P. 387-94.

130. Sedelnikova O.A., Horikawa I., Zimonjic D.B., Popescu N.C., Bonner W.M., Barrett J.C. Senescing human cells and ageing mice accumulate DNA lesions with unrepairable double-strand breaks//Nat Cell Biol. 2004. V.6. № 2. P. 168170.

131. Sedelnikova O.A., Pilch D.R., Redon C., Bonner W.M. Histone H2AX in DNA damage and repair//Cancer Biol Ther. 2003. V.2. № 3. P. 233-235.

132. Serrano M., Lin A.W., McCurrach M.E., Beach D., Lowe S.W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a//Cell. 1997. V.88. № 5. P. 593-602.

133. Shiloh Y., Ziv Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more//Nat Rev Mol Cell Biol. 2013. V.14. № 4. P. 197210.

134. Scholer H.R., Ciesiolka T., Gruss P. A nexus between Oct-4 andElA: implications for gene regulation in embryonic stem cells//Cell. 1991. V.66. № 2. P. 291-304.

135. Stankov M.V., El Khatib M., Kumar Thakur B., Heitmann K., Panayotova-Dimitrova D., Schoening J., Bourquin J.P., Schweitzer N., Leverkus M., Welte K., Reinhardt D., Li Z., Orkin S.H., Behrens G.M., Klusmann J.H. Histone deacetylase inhibitors induce apoptosis in myeloid leukemia by suppressing autophagy//Leukemia. 2014. V.28. № 3. P. 577-588.

136. te Poele R.H., Okorokov A.L., Jardine L., Cummings J., Joel S.P. DNA damage is able to induce senescence in tumor cells in vitro and in vivo// Cancer Res. 2002. V.62. № 6. P. 1876-1883.

137. Taimen P., Pfleghaar K., Shimi T., Moller D., Ben-Harush K., Erdos M.R., Adam S.A., Herrmann H., Medalia O., Collins F.S., Goldman A.E., Goldman R.D. A progeria mutation reveals functions for lamin A in nuclear assembly, architecture, and chromosome organization//Proc Natl Acad Sci USA. 2009. V.106. № 49. P. 20788-20793.

138. Takahashi A., Ohtani N., Yamakoshi K., Iida S.,Tahara H., Nakayama K., Nakayama K.I., Ide T., Saya H., Hara E. Mitogenic signalling and the pl6INK4a-Rb pathway cooperate to enforce irreversible cellular senescence//Nat Cell Biol. 2006. V.8.№ 11. P. 1291-1297.

139. Thompson L.H. Recognition, signaling, and repair of DNA double-strand breaks produced by ionizing radiation in mammalian cells: the molecular choreography//Mutat Res .2012. V.751. № 2. P. 158-246.

140. Vermeulen K., Van Bockstaele D.R., Berneman Z.N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer//Cell Prolif. 2003. V.36. № 3. P. 131-149.

141. Waldman T, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B. Uncoupling of S phase and mitosis induced by anticancer agents in cells lacking p21//Nature. 1996. V.381. №6584. P. 713-716.

142. Wang E. Senescent human fibroblasts resist programmed cell death,

and failure to suppress bcl2 is involved//Cancer Res. 1995. №. 55. P.2284-2292.

143. Watanabe M., Ohnishi Y., Inoue H., Wato M., Tanaka A., Kakudo K., Nozaki M. NANOG expression correlates with differentiation, metastasis and resistance to preoperative adjuvant therapy in oral squamous cell carcinoma. Oncol Let. 2014. V.7. № 1. P. 35-40.

144. White E. Regulation of p53-dependent apoptosis by E1A and E1B//Curr Top Microbiol Immunol. 1995. V.199. № 3. P. 34-58.

145. White E., Cipriani R. Specific disruption of intermediate filaments and the nuclear lamina by the 19-kDa product of the adenovirus E1B. Oncogene//Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V.86. № 24. P. 9886-9890.

146. Willis-Martinez D., Richards H.W., Timchenko N.A., Medrano E.E. Role of HDAC1 in senescence, aging and cancer//Exp Gerontol. 2010. V.45. №4. P. 279-285.

147. Whyte P., Buchkovich K.J., Horowitz J.M., Friend S.H., Raybuck M., Weinberg R.A., Harlow E. Association between an oncogene and an anti-oncogene: the adenovirus E1A proteins bind to the retinoblastoma gene product//Nature. 1988. V.334. № 6178. P. 124-129.

148. Yang Z.J., Chee C.E., Huang S., Sinicrope F.A. The role of autophagy in cancer: therapeutic implications//Mol Cancer Ther. 2011. V.10. № 9. P. 1533-1541.

149. Young A.R., Narita M., Ferreira M., Kirschner K., Sadaie M., Darot J.F., Tavare S., Arakawa S., Shimizu S., Watt F.M. Autophagy mediates the mitotic senescence transition//Genes Dev. 2009. V.23. № 7. P. 798-803.

150. Zou L. Single- and double-stranded DNA: building a trigger of ATR-mediated DNA damage response//Genes Dev. 2007. V.21. № 8. P. 879-885.

Zheng L., Dai H., Zhou M., Li X., Liu C., Guo Z., Wu X., Wu J., Wang C., Zhong J. Huang Q., Garcia-Aguilar J., Pfeifer G.P., Shen B. Polyploid cells rewire DNA damage response networks to overcome replication stress-induced barriers for tumour progression//Nat Commun. 2012. № 3. P. 815.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я благодарю моего научного руководителя Татьяну Викторовну Поспелову за внимательное отношение к моей работе, плодотворные научные дискуссии и вдохновение. Я благодарна руководителю лаборатории Валерию Анатольевичу Поспелову за неоценимую помощь в работе и поддержку. Большое спасибо сотрудникам нашей лаборатории Татьяне Вадимовне Быковой, Светлане Зубовой, Сергею Гордееву, Елене Кочетковой за помощь в экспериментальной работе, а также создание теплой атмосферы в лаборатории. Я выражаю благодарность Николаю Аксенову за помощь в проведении экспериментов по проточной цитометрии, Борису Николаевичу Кудрявцеву, Григорию Израеливичу Штейну и Михаилу Воробьеву за помощь при освоении новых методов и анализе изображений. Большое спасибо членам моей семьи и друзьям за поддержку.