Острые лейкозы с транслокациями гена MLL1, лейкозные стволовые клетки, эпигенетические изменения и новые терапевтические возможности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Кривцов Андрей Владимирович

• Кривцов Андрей Владимирович
• доктор наук
• 2022

Оглавление диссертации доктор наук Кривцов Андрей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели исследования

Объекты исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Структура работы

Апробация работы

Публикации

Основные материалы

Основные методы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Глава 1. Трансформация ГМП в СКЛ инициированное MLL-химерным белком MLL-AF9

Глава 2. Клетка происхождения определяет клинически значимые подтипы MLL-r ОМЛ15

Глава 3. Метилирование гистонов при лейкозах с MLL-транслокациями

Глава 4. Зависимость лейкозов с MLL1-транслокациями от метилтрансферазы DOT1L

Глава 5. Фармакодинамика ингибирования DOT1L клетках от образцов пациентов

Глава 6. Создание коллекции ксенотрансплантов острых лейкозов (PDX) для

доклинической оценки эффективности низкомолекулярных соединений

Глава 7. Новые ингибиторы DOT1L показывают антилейкозную активность в PDX

Глава 8.VTP-50469 новый ингибитор взаимодействия MLL1-Menin с высокой и

специфичной антилейкозной активностью

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги выполненного исследования

Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы

СПИСОК НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ, В КОТОРЫХ ИЗЛОЖЕНЫ ОСНОВНЫЕ

НАУЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ChIP - иммунопреципитация хроматина (chromatin immunoprecipitation)

ChIP-chip - иммунопреципитация хроматина с последующей гибридизацией ДНК

фрагментов с микроматрицами (microarrays)

ChIP-seq - иммунопреципитация хроматина с последующим анализом ДНК фрагментов секвенированием

DOT1L - метилтрансфераза. Фермент, метилирующий лизиновый остаток 79 в гистоне Н3 (Disruptor of telomeric silencing 1-like)

FACS - fluorescent activated cell sorting, проточная цитометрия GSEA - Анализ обогащения транскрипционных программ H3K79me2 - деметилирование гистона H3 по остатку лизина

MLL1 - ген или белок продукт гена лейкоза смешанных линий 1 (Mixed Lineage Leukemia

1), другое название KMT2A

MLL1-r - геномная транслокация гена MLL1

MLL-AF9 - химерный онко-белок, состоящий из N-конца MLL1 и C-конца AF9 MLL-AF4 - химерный онко-белок, состоящий из N-конца MLL1 и C-конца AF4 NSG - мыши с дефектами иммунной системы у которых отсутствуют натуральные киллеры, B- и T-клетки и дефектные дендритные клетки и макрофаги

PDX - образцы ксенотрансплантантов от пациентов, patient derived xenotransplants

SRAS - self-renewal associated signature или транскрипционная программа, ассоциированная

с самообновлением

SVA - соматический вариантный аллель

АГК - Анализ Главных Компонентов, (PCA, principle component analysis)

B-ОЛЛ - В клеточный - острый лимфобластный лейкоз

ГМП - гранулоцитарно-макрофагальный предшественник (GMP)

ОЛ - острый лейкоз

ГИММ - генно-инженерные мышиные модели

кшРНК (shRNA)-короткая шпилька РНК shorthairpinRNA

ЛСК - лейкозная стволовая клетка (LSC, Leukemia Stem Cells)

Л-ГМП - лейкозный гранулоцитарно-макрофагальный предшественник (L-GMP)

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз

ОЛСЛ - острый лейкоз смешанных линий

ОМП - Общий миелоидный предшественник или Клетка предшественник миелопоэза (CMP, common myeloid progenitor)

ПМЭ - Предшественник мегакариобластов и эритроцитов (MEP, megakaryocyte-erythroidprogenitor)

СКК - стволовая кроветворная клетка (HSC, hematopoietic stem cell) СКЛ - стволовая лейкозная клетка СО - самообновление, self-renewal СНТ - сайт начала транскрипции

Транслокация— тип хромосомных мутаций, при которых происходит перенос участка хромосомы на негомологичную хромосому

ТП - транскрипционная программа или сигнатура (gene expression signature)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Транслокации гена MLL1 (1Ц23) или KMT2A обнаруживаются примерно в 90% случаев острого лимфобластного лейкоза B-клеток (Б-ОЛЛ) младенцев (возраста 0-2 г). Острые лейкозы взрослых с хромосомными перестройками гена MLL1 составляют 5-10% от общего количества случаев. Присутствие хромосомных транслокаций гена MLL1 коррелирует с неблагоприятным клиническим исходом и высокой вероятностью рецидива заболевания. Транслокации гена MLL1 выражаются в экспрессии химерных онко-белков, состоящих из протеина, кодируемого первыми от 8-и до 11-ти экзонами гена MLL1 на №конце и произвольного остатка гена-партнера на Оконце. Экспрессия MLL-химерных белков запускает онкологическую трансформацию гемопоэтических предшественников. Несмотря на то, что MLL1 является гистон-метилтрансферазой, сами MLL-химерные белки практически всегда не имеют ферментативной активности, которую можно было бы подавить с помощью специфичных ингибиторов. Нахождение путей для таргетной терапии этого смертельного заболевания -приоритетная задача.

Цели исследования - идентификация и изучение свойств стволовых клеток лейкоза (СКЛ) с транслокациями гена MLL1. Характеристика изменения программы транскрипции и выявление механизма активации транскрипции, а так же возможных путей влияния на эти изменения с помощью малых молекул. В соответствии с поставленными целями основные задачи исследования заключались в следующем:

1. Разделение (FACS) фракций клеток лейкоза вызванного химерным онко-белком MLL-AF9 и определение их лейкозогенности в мышах. Сравнение транскрипционных программ гемопоэтических предшественников, СКК и СКЛ. Изучение влияния клетки происхождения на клинические характеристики лейкоза;

2. Создание мышиной модели МКЬ-АБ4 В-ОЛЛ и изучение механизма изменения транскрипционной программы клетки онко-белком МКЬ-АБ4;

3. Тестирование чувствительности мышиной модели МКЬ-АБ9 ОМЛ к ингибитору метилтрансферазы DOT1L;

4. Исследование влияния дозировки ингибитора метилтрансферазы DOT1L на молекулярные маркеры в первой стадии клинических испытаний;

5. Создание коллекции образцов лейкозов пациентов, способных колонизировать гемопоэтическую систему мышей без иммунной системы (PDX);

6. Оценка доклинических характеристик новых ингибиторов метилтрансферазы DOT1L и ингибиторов взаимодействия МКЬ1 с геном Мешп, используя PDX ОЛ с транслокациями МКЬ1

Объекты исследования - образцы острых лейкозов человека и модельный

организм - мышь.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. ЛСК с транслокациями гена МКЬ1 (МГЬ1-г) имеют иммунофенотип, более сходный с миелоидными предшественниками (ГМП, GMP), чем со стволовыми кроветворными клетками (СКК, HSC) и присутствуют в костном мозге с частотой примерно 1:120. Экспрессия онкобелка МКЬ-АБ9 в ГМП активирует транскрипционную программу самообновления (SRAS), характерную для СКК, но при этом ЛСК в целом имеет транскрипционную программу, сходную с ГМП. Экспрессия SRAS может быть использована для мониторинга противолейкозной активности лекарственных препаратов.

2. Создана мышиная генетическая модель В-ОЛЛ, индуцированного онко-белком МКЬ-АБ4. Показано, что транскрипционная программа клеток в мышиной модели острого лейкоза МКЬ-АБ4 повторяет клинические случаи этой болезни. Экспрессия МКЬ-АБ4

ведет к повышению метилирования гистона Ю по остатку лизина 79 у генов-мишеней MLL1. Созданная мышиная модель может использоваться для тестирования противолейкозной активности лекарственных препаратов.

3. Исследование фармакокинетических параметров показали активность ингибитора метилтрансферазы DOT1L EPZ-5676 в образцах пациентов, собранных на 28-день применения в рамках первой стадии клинических испытаний;

4. Создана коллекция из 119 образцов острых лейкозов пациентов, способных к колонизации (PDX) гемопоэтической системы иммунодефицитных мышей (NSG). Наличие такой коллекции позволило тестировать противолейкозную активность лекарственных препаратов;

5. Используя PDX показана высокая активность и отсутствие общей токсичности в доклинических испытаниях ингибитора взаимодействия MLL1 и Menin VTP-50469, что позволило начать клинические испытания этого класса ингибиторов.

Научная новизна работы :

• в ходе выполнения данной работы впервые доказано, что СКЛ это не редкие клетки в костном мозге, а достаточно распространенные;

• доказано, что СКЛ имеет сходство с миелобластом, а не с СКК;

• впервые идентифицирована транскрипционная программа, описывающая самовоспроизведение ЛСК и СКК;

• впервые получена мышиная генетическая модель MLL-AF4 B-ОЛЛ, воспроизводящая заболевание человека как на транскрипционном, так и на эпигенетических уровнях;

• впервые доказано, что ингибиторы эпигенетических факторов эффективны в подавлении развития MLL1-химерных лейкозов.

Теоретическая и практическая значимость работы :

Идентифицирована транскрипционная программа самообновления (SRAS), которая может использоваться для скрининга малых соединений, подавляющих активность СКЛ, получен патент. Создана мышиная модель заболевания человека, на которой можно испытывать противолейкозные лекарственные препараты. Показано, что таргетирование эпигенетических факторов может быть использовано терапевтически. Разработана методология и измерена фармокинетическая активность EPZ-5676 в первой фазе клинических испытаний. Создана и охарактеризована коллекция PDX, которая использовалась для определения доклинической эффективности противолейкозных лекарственных препаратов. Проведены доклинические испытания новых ингибиторов метилтрансферазы DOT1L и взаимодействия Menin с MLL1, начаты клинические испытания.

Структура работы :

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Острые лейкозы с транслокациями гена MLL1, лейкозные стволовые клетки, эпигенетические изменения и новые терапевтические возможности»

Апробация работы

Результаты работы представлены на международных конференциях: American Society of Hematology 46th Annual Meeting, (San Diego, CA, 2004); American Society of Hematology

47th Annual Meeting (Atlanta, GA 2005); American Society of Hematology 48th Annual Meeting (Orlando FL, 2006); Keystone Symposia on Stem Cells (Whistler BC, 2006); Children's Hospital Research Day, (Boston, MA 2006); International Society Stem Cell Research 4th annual meeting, (Toronto ON, 2006); American Society of Hematology 49th Annual Meeting (Atlanta GA, 2007); American Society of Hematology 50th Annual Meeting (San Francisco, CA 2008); Keystone conference (Snowmass CO, 2008); ISEH 38th annual meeting (Athens, 2009); EHA 15th annual congress, (Barcelona, 2010); American Association for Cancer Research annual meeting (Chicago IL, 2018).

Декларация личного участия автора. Основное участие автора (не менее 60%) заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их экспериментальной реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и их внедрения в практику. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично произведен сбор, аналитическая и статистическая обработка материалов исследований, а также научное обоснование и обобщение полученных результатов. Экспериментальные материалы, использованные в диссертационной работе, получены автором лично. Автор самостоятельно осуществлял выделение/сортировку мышиных СКК и миелоцитов, инфекцию ретровирусом для экспрессии онкобелка MLL-AF9 с последующей трансплантацией модифицированных клеток мышам. Автор выделял РНК, выделял материал для гибридизации с микрочипами и анализировал данные. Большинство данных было получено коллективами исследователей, что указано в начале разделов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 47 печатных работ: 2 главы в книгах и 45 работ в международных рецензируемых журналах, из них 4 обзора. Получен 1 патент. С 2012 по 2021 годы опубликовано 33 статьи в международных рецензируемых журналах с рейтингом Q1-Q2.

Основные материалы. В работе использованы ретровирусные вектора для экспрессии MLL-AF9, полученные от проф. Jay Hess (Индианаполис, США). Для создания мышиных моделей ОЛ человека использовались мыши линии C57B1/6. Для трансплантации ОЛ человека использовались иммунодефицитные мыши NSG. Образцы клеток острых лейкозов пациентов были получены при информированном согласии от пациентов, проходящих лечение в Мемориальном Слоан-Кетеринг Онкологическом Центре (Нью-Йорк, США) и медицинском центре при Колумбийском Университете (Нью-Йорк, США) и типированы гистологически на основании классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [WHO classification of leukemia and lymphoma, 2008]. Низкомолекулярные ингибиторы DOT1L и Menin-MLL1 произведены и предоставлены для работы фармацевтическими компаниями Новартис (Novartis) и Синдакс (Syndax).

Основные методы. Сортировка гемопоэтических предшественников и СКК мыши и клеток лейкозов человека производилась после окрашивания клеток специфическими антителами на клеточном сортере (FACS Aria). Культивирование клеток мыши, инфицирование клеток мыши ретровирусами. Выделение РНК, выделение ДНК и хроматина из клеток крови и лейкозов, синтез кДНК, ПЦР, количественная ПЦР, электрофорез в ПААГ и агарозном геле, ChIP-seq, разделение белковых комплексов в градиенте глицерина. Проведен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, применены основные статистические методы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Глава 1. Трансформация ГМП в СКЛ инициированное МЬЬ-химерным белком МЬЬ-ЛГ9

Накопленные данные свидетельствуют о том, что острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) неоднородны и организованы в виде иерархии, происходящей из клетки, которая имеет высокий пролиферативный потенциал и способность к самообновлению. Эта клетка, часто называемая стволовой клеткой лейкоза (СКЛ), обладает свойствами, похожими на СКК. Степень, в которой СКЛ зависит от аналогичных программ самообновления, как СКК, представляет вопрос огромного интереса. Если СКЛ больше зависят от определенных программ для поддержания своего потенциала самообновления, чем СКК, то эти программы представляют потенциальные пути для терапевтического вмешательства. Современные данные свидетельствуют о том, что в некоторых случаях СКК и СКЛ зависят от активации сходных путей. Например, генетическая инактивация гена Вть1 приводит к дефектам самообновления у СКК и ЛСК. Более того, сигнальный путь Wnt/p-cateшn [1], по-видимому, важен для определенных аспектов функции СКК и для некоторых лейкозов. Таким образом, очевидно, что в некоторых случаях лейкозного самообновления и самообновления СКК используются сходные сигнальные пути. Исследования показали, что ретровирусная экспрессия ЫКЬ-химерного белка в коммитированных гематопоэтических предшественниках способствует развитию лейкоза из клеток, которые исходно не обладали присущими им свойствами самообновления. Это говорит о том, что некоторые онкогенные химерные онкобелки действительно способны активировать достаточный пролиферативный потенциал, чтобы вызвать лейкозы. Важно, что другие онкогенные химерные онкобелки, такие как онкоген BCR-ABL, образующийся при транслокации t (9; 22), способен вызывать лейкоз только при экспрессии в контексте СКК. Таким образом, онкогены, по-видимому, делятся на два класса, одни из которых обладают способностью вызывать достаточное

самообновление в коммутированных клетках-предшественниках, а другие требуют программ самообновления, активных только в СКК [2-4]. Таким образом, актуальным явилось определение программ и путей экспрессии генов, активируемых во время перехода от нормальных коммитированных гематопоэтических клеток-предшественников к СКЛ. Чтобы ответить на этот вопрос, мы трансдуцировали мышиные Lln"CD127"Sca1-CD117+CD34+CD16/32hl предшественники гранулоцитов и макрофагов (ГМП, GMP) ретро-вирусами, кодирующими MLL-AF9, и трансплантировали трансдуцированные клетки в сингенных (syngeneic) мышей-реципиенты [5]. Это приводило к развитию олигоклонального ОМЛ в течение 80-90 дней в 100% случаев.

Рисунок 1. А Анализ предшественников лейкоза MLL-AF9. Л-ГМП выделены с помощью клеточной сортировки для инъекции мышам (вторичным реципиентам) или для анализа экспрессии генов. Б. Кривые выживаемости мышей, которым вводили различные количества Л-ГМП, показывают, что четыре клетки могут переносить лейкоз. Эксперимент повторили трижды с аналогичными результатами. В. Иерархическая кластеризация с использованием 9100 фильтрованных наборов зондов демонстрирует, что Л-ГМП обладают профилем экспрессии генов, наиболее сходным с ГМП.

Из костного мозга мышей, у которых был клинически очевидный лейкоз, выделяли популяцию клеток, несущих маркеры Lin-CD127-Sca-1-СD117+CD34+CD16/32+, которую мы назвали Л-ГМП (рисунок 1А) [6]. Трансплантация всего 4 Л-ГМП клеток вторичным реципиентам могла вызвать лейкоз, тогда как около 120 несортированных лейкозных клеток КМ необходимо для передачи лейкоза вторичным мышам-реципиентам (рисунок 1Б) [6].

Последовательно очистив популяцию, обогащенную ЛСК, мы использовали гибридизацию с микрочипами, чтобы анализировать профили экспрессии генов для оценки

общей клеточной идентичности, и охарактеризовали изменения, которые происходят во время онкотрансформации от коммитированного предшественника в ЛСК. Чтобы сравнить профили экспрессии генов между нормальными предшественниками и ЛСК, мы выделили из КМ C57BL/6 мышей следующие популяции, используя маркеры на клеточной поверхности: обогащенную СКК LmCD127"Sca1+CD117+; общие миелоидные предшественники (ОПМ), как Lin-CD127"Sca1"CD117+CD34+СD16/32низк; предшественников мегакариоцито-эритроидных клеток (МЭП) CD127"Lin"Sca1XD117+CD34XD16/32-; и ГМП. Главный вопрос, на который мы искали ответ, был - остались ли сигнатуры экспрессии генов СКЛ аналогичными нормальным ГМП, из которых они возникли, или произошло полное клеточное перепрограммирование во время онкотрансформации.

Анализ данных с использованием иерархической кластеризации продемонстрировал, что ЛСК имеют стабильную программу экспрессии генов, которая отличается от любой из нормальных популяций СКК или предшественников, но наиболее похожа на ГМП, из которой они произошли (рисунок 1В). Кластерный анализ выявил большую группу генов, которые демонстрируют высокий уровень экспрессии в нормальных ГМП по сравнению с другими нормальными предшественниками и СКК, а также экспрессию, которая дополнительно повышается в популяции Л-ГМП (рисунок 2). Эти данные показывают, что ЛСК может сохранять глобальную идентичность, наиболее похожую на дифференцирующуюся миелоидную клетку, что согласуется с другими данными.

Особенно интересная группа генов, которая продемонстрировала высокий уровень экспрессии в популяции СКК, также демонстрирует сниженную экспрессию в коммитированных предшественниках и повторно реактивирована в СКЛ. Эта сигнатура содержит 363 гена, которые высоко экспрессируются в популяциях с потенциалом самообновления (СКК и СКЛ). Следует отметить, что 363 гена, которые более высоко экспрессируются в СКК и Л-ГМП, представляют собой только подмножество генов, обычно

высоко экспрессируемых в СКК по сравнению с коммутированными предшественниками. Присутствие ряда факторов транскрипции, которые важны для нормального гемопоэтического развития и онкогенеза, опосредованного МКЬ-химерами, включая множественные гены кластера Ноха, подтверждает актуальность этой транскрипционной программы (ТП). Эти данные показывают, что приобретение высокого пролиферативного потенциала у коммитированных предшественников связано с активацией части программы, активно экспрессируемой в нормальных СКК.

Рисунок 2. А. Основные кластеры экспрессии генов в гемопоэтических предшественниках (СКК; общие миелоидные предшественники (ОМП); мегакариоцит-эритроидные предшественники (ПМЭ); ГМП), идентифицируемые методом К-средних (указано К = 10), помеченные слева. Б. показаны 50 лучших наборов зондов для генов, которые демонстрируют повышенную экспрессию в популяции СКК и Л-ГМП. Тестирование перестановок демонстрирует 420 наборов зондов (363 гена) в этой ТП (р<0,001).

Описанные выше данные демонстрируют, что программа самообновления стволовых клеток может быть активирована в контексте дифференцирующейся миелоидной клетки, что вызывает ряд вопросов, на которые теперь можно напрямую ответить с помощью этой системы. Например, возникает вопрос, могут ли СКЛ, генерируемые экспрессией МКЬ-химерного белка в СКК, также оказаться глобально подобными более дифференцированным клеткам. Альтернативно, может случиться так, что введение МКЬ-химерного белка в СКК может привести к развитию СКЛ с гораздо более незрелыми характеристиками. Эти вопросы важны, потому что предполагается, что природа программ стволовых клеток и стадия дифференцировки, обнаруженная в СКЛ, вероятно, влияют на такие свойства, как агрессивность лейкоза и, возможно, ответ на терапию. Более того, учитывая данные,

демонстрирующие, что СКК более восприимчивы к онкогенезу, индуцированному МКЬ-химерными белками, чем более дифференцированные клетки-предшественницы. Наконец, описанная выше система может быть использована для определения того, могут ли другие онко-белки и нижестоящие сигнальные пути, такие как гены кластера НОХА, индуцировать лейкозное самообновление в клетках-предшественницах [7-9].

Глава 2. Клетка происхождения определяет клинически значимые подтипы МЬЬ-г ОМЛ

Мы были заинтересованы в анализе различий в транскрипционных программах СКЛ, которые происходят из СКК и ГМП [10, 11]. Для ответа на этот вопрос мы выделили из КМ C57BL/6 мышей СКК или ГМП, экспрессировали с помощью ретровирусной инфекции МКЬ-АБ9 и трансплантировали клетки в сингенных мышей-реципиентов. Когда у мышей развились клинические признаки лейкоза, мы выделили из КМ ЛСК (ЛСК-СКК и ЛСК-ГМП) и сравнили их транскрипцию с транскрипцией в гемопоэтичесих клетках-предшественницах. Используя метод кластеризации главных компонент (АГК) ТП, было определено, что глобально СКЛ-СКК и СКЛ-ГМП имеют сходство между собой и наиболее напоминают ТП ГПМ (рисунок 3А) [12, 13]. Это означало, что независимо от клетки происхождения, СКЛ обладает иммунофенотипом коммитированного миелоидого предшественника. Более того, очевидно, что существуют различия в ТП СКЛ-СКК и СКЛ-ГМП. А именно, СКЛ-СКК имеют большее сходство с СКК, чем СКЛ-ГМП. Более подробный анализ ТП выявил субтранскрипционные программы (сТП), специфические как для СКЛ-СКК (ЛС+/-), так и для СКЛ-ГМП (ЛГ+/-)[14].

Рисунок 3. Двумерная проекция (АГК) изображенная как КГ2 и ГК3 8000 наборов зондов, экспрессируемых в гемопоэтических предшественниках (СКК; общие миелоидные предшественники (ОМП); мегакариоцит-эритроидные предшественники (ПМЭ); ГМП), СКЛ-CKK и СКЛ-ГМП демонстрируют, что СКЛ сохраняют уникальные программы экспрессии генов клетки предшественника.

Чтобы оценить потенциальную клиническую значимость программ экспрессии генов, связанных с клетками происхождения [15] для полученного лейкоза, мы проверили корреляцию экспрессии сигнатур ЛГ и ЛС с клиническим исходом в группе из 35 взрослых пациентов с диагнозом MLL-r ОМЛ, для которого были доступны два набора данных микрочипов. 72 из 121 сТП ЛС и 113 из 162 сТП генов ЛГ присутствовали в объединенном наборе данных человека, которые затем использовались для кластеризации образцов. Иерархическая кластеризация профилей экспрессии генов у 35 пациентов использовалась для разделения на пациентов с высоким и низким уровнем экспрессии сигнатур ЛС или ЛГ. Анализ кривых выживаемости методом Каплана-Мейера продемонстрировал, что пациенты с низким уровнем экспрессии сТП СКЛ-СКК+ имеют более длительную безрецидивную выживаемость, чем пациенты с высоким уровнем экспрессии СКЛ-СКК+ (рисунок 4А). Выражение сигнатуры ЛГ было меньше связано с безрецидивной выживаемостью у одних и тех же пациентов, хотя наблюдалась тенденция к лучшей выживаемости для пациентов с лейкозами, что выражало более высокие уровни сигнатуры СКЛ-ГМП (рисунок 4Б). Далее мы оценили корреляцию сигнатур СКЛ-СКК и СКЛ-ГМП с клиническим исходом в двух ранее опубликованных наборах данных MLL-ОМЛ. Аналогичным образом иерархическая кластеризация использовалась для разделения профилей экспрессии генов от пациентов

Детской исследовательской больницы Сент-Джуд (SJCRH) и Медицинского центра Университета города Эразмуса (EUMC) на пациентов с высоким и низким уровнем экспрессии сигнатуры ЛС. Безрецидивная выживаемость, изображенная методом Каплан-Мейера, продемонстрировала тенденцию к более длительной безрецидивной выживаемости для пациентов, у которых лейкозы имели более низкую экспрессию сТП ЛГ, чем у пациентов с более выраженной экспрессией [14].

Рисунок 4. Анализ Каплана-Мейера кривых выживаемости без рецидива, сравнивающий подгруппы пациентов образцы лейкоза которых имели высокий и низкий уровни экспрессии ТП ЛСК-CKK обозначения по оси ординат Безрецидивная выживаемость в днях. А. или высокий и низкий уровни экспрессии ТП ЛСК-ГМП. Б. р-значение рассчитывалось с использованием лог-рангового теста.

До наших исследований было неясно, может ли экспрессия онкогена в различных типах онтогенетических клетках в пределах ткани влиять на фенотип возникающего лейкоза и ЛСК. Полученные данные напрямую отвечают на этот вопрос и демонстрируют, что клетка, в которой экспрессируется MLL-AF9, влияет на поведение, экспрессию генов и эпигенетические программы ЛСК, даже если иммунофенотип лейкоза и ЛСК аналогичен.

Таким образом, ЛСК, происходящие из СКК или ГМП, более всего схожи с миелоидными клетками-предшественниками, вероятно, представляющими собой клетку, расположенную непосредственно ниже в ряду дифференцировки ГМП. Несмотря на то, что иммунофенотип аналогичен для ЛСК, полученных из клеток разного происхождения, существуют различия в экспрессии генов. Например, Evi1, c-jun, Fos1, Bcl6, Gsr1, Nedd9, и

Zfp36 экспрессируются на более высоком уровне в ЛСК, происходящих из СКК, но не в ЛСК, происходящих из ГМП [1, 16]. Таким образом, доказано, что клетка, в которой первоначально экспрессируется онкоген, может влиять на окончательную программу экспрессии генов ЛСК, даже если ЛСК представляет собой стадию дифференцировки ниже СКК. Иными словами, экспрессия MLL-AF9 в ГМП активирует программу, связанную со стволовыми клетками, которая достаточна для индукции лейкоза, но экспрессия МКЬ-АБ9 в СКК позволяет поддерживать более обширную программу, полученную из стволовых клеток, что влияет на поведение ЛСК.

Наши данные дают представление о разнообразии экспрессии генов при ОМЛ. Мы смоделировали МКЬ-ОМЛ высокого риска, возникающий в результате хромосомной транслокации в СКК [10, 11]. Наши данные предполагают, что, вероятно, другие МКЬ-ОМЛ с лучшим прогнозом течения болезни пациентов возникают из более дифференцированных миелоидных предшественников.

Глава 3. Метилирование гистонов при лейкозах с ИЬЬ-транслокациями

Несмотря на то, что было разработано множество ретровирусных и генно-инженерных мышиных моделей ОМЛ, опосредованных МКЬ-химерными белками, создание модели В-ОЛЛ до 2007 г. не было успешным [3]. Мы создали модель регулируемого включения гена, в которой кДНК АБ4 вставлена в 8 экзон гена МШ, ниже кассеты остановки транскрипции, фланкированной сайтами 1охР (рисунок 5).

Рисунок 5. Схематическое изображение генно-инженерной аллели Mll-AF4stop. Экзоны Mill пронумерованы от 4 до 9. Показан сайт полиаденилирования (pA) и кассета устойчивости к пуромицину (puro). Показаны сайты EcoRl (RI) и BamHl (BI), а также сенс (F) и антисенс (R) праймеры Mill, используемые для обнаружения РНК MII-AF4 химеры.

При регулируемой активации либо ретровирусной трансдукцией рекомбиназы сге,

либо индукцией Mx1-сre, индуцированной pI-pC, у мышей развивается ОМЛ (~ 50%) или В-ОЛЛ (~ 50%). Среднее время развития лейкоза при ретровирусной доставке сге составляло примерно 75 дней. В то время как среднее время развития лейкоза в Мх1-Сге экспериментах было примерно 130 дней (таблица 1).

Таблица 1. Характеристика заболеваний вызванных экспрессией ММ-АР4

Латентность, д (сред., разб-с) Вес СЗ, мг (сред., разб-с) БКК хЮОО/мкл (сред., разб-с) Гкт, % (сред., разб-с) Трб. хЮОО/мкл (сред., разб-с) % лекоза в КМ (сред., разб-с)

Контроль 70-110 5-10 45-47 800-1400

Тран. КМ (37)

ОЛЛ (11) 122.8(71-220) 425.5 (200-670) 138.0(17-^76) 32.1 (20-40.9) 447.9 (144-920) 85.3 (52-99)

ОМЛ (23) 75.6(25-221) 404.8 (150-800) 124.8(8-389) 24.7 (8.9-41) 310.3 (70-824) 86.0 (54-98)

ОСЛ (3) 92(81-105) 666.7 (390-810) 224.3(155-281) 23.7 (17.7-26) 201 (99-312) 59 (39-75)

Тран. Лин- (7)

ОЛЛ (4) 67.5 (62-75) 287.5 (200-450) 459.8 (236-748) 25.5 (16.1-39) 373.5 (251-496) 88.3 (67-98)

ОМЛ (2) 103(98-108) 515(470-560) 72.5(23-122) 33.6 (29.9-37) 394.5 (367-422) 83.5 (80-87)

живы (3)

Мх1:сге ¡22)

ОЛЛ (8) 152.3 (120-242) 691 (260-2100) 43.0 (5-92.6) 30.3 (5.2-44) 640(102-1683) 46.6 (24-86)

ОМЛ (6) 143.5 (67-240) 485.0 (300-910) 84.3 (6-279) 23.5 (10.4-40) 732 (400-1463) 92.2 (84-98)

нет лейкоза (3)

живы (5)

Тран. трансплантация; СЗ, селезенка; БКК, белые клетки крови; .Гтк, гематр.крит; Трб, тромбоциты; КМ, костный мозг

Обнаружено, что программа экспрессии генов в мышиной модели Mll-AF4 В-ОЛЛ совпадает с программой экспрессии генов в образцах клеток В-ОЛЛ человека с МКЬ-рекомбинациями. Таким образом, созданная нами мышиная модель воспроизводит МКЬ-АБ4 В-ОЛЛ человека как с точки зрения фенотипа заболевания, так и с точки зрения активных транскрипционных программ (рисунок 6).

Было известно, что химерный онкобелок МКЬ-АБ10 напрямую рекрутирует гистонметилтрансферазу DOT1L к генам-мишеням МКЬ1 посредством прямого взаимодействия между DOT1L и АБ10 [17]. Кроме того, DOT1L также была обнаружена в комплексах с АБ4, АБ9, АБ10 и ЕКЬ, все из которых могут образовывать химеры с МКЬ1. Это привело нас к гипотезе, что как минимум некоторые из М^-химерных белков могут рекрутировать DOT1L как часть механизма онкогенеза.

Рисунок 6. Анализ обогащения набора генов (GSEA) в B-ОЛЛ человека с MLL1-транслокациями (п = 20) по сравнению с B-ОЛЛ с нативным MLL1 (п = 40) с использованием 386 генов, с наибольшей транскрипцией в мышином MИ-AF4 B-ОЛЛ. Слева: график обогащения GSEA. Справа: 50 основных генов, демонстрирующих повышенную экспрессию при лейкозах с MLL-транслокациями человека.

Поскольку АБ4 ассоциируется с метилтрансферазой DOT1L, которая метилирует гистон Н3 по остатку лизину 79 (Н3К79), нас интересовало, может ли эта ферментативная активность быть частью механизма, с помощью которого MLL-AF4 вызывает аберрантную экспрессию генов. Предыдущее исследование взаимодействия MLL1 геномной ДНК с помощью иммунопреципитации хроматина (СЫР) с последующим анализом на микроматрицах (СЫР-сЫр) продемонстрировала ассоциацию MLL1 с промоторами тысяч генов [18]. Мы задались вопросом - влияет ли экспрессия MLL-AF4 на особый набор генов, например гены кластера Ноха, или есть более широко распространенные аномалии метилирования гистонов при М11-ЛБ4 В-ОЛЛ. В связи с этим, нами использован СЫР-сЫр анализ для оценки уровней диметилирования Н3К79 (Н3К79те2) в мышиных М11-АБ4 В-ОЛЛ по сравнению с нормальными пре-В-клетками. Обнаружено увеличение Н3К79те2в

кластере генов Hoxa в лейкозных клетках. Расширенный поиск геномных позиций выявил множество локусов с повышенным уровнем H3K79me2 в лейкозных клетках в сравнении с нормальными пре-Б-клетками (рисунок 7) [19].

рге-В

ИI -■--«41 I « » N I ^ 4 1 • М « ■■

А1 А2 М М Л; А6 А7 аэ а10 А1Э

Рисунок 7. Геномные треки анализа ChIP-чипа, представляющие локусы кластера Ноха в нормальных клетках рге-Б (п = 3) и Б-рг ОЛЛ (п = 3), представленные в одинаковом масштабе.

В клетках млекопитающих наличие Н3К79те2 коррелирует с активной транскрипцией. Многие активно транскрибируемые гены имеют Н3К79те2 на всей протяженности гена, а также на промоторе. Имеется контраст с триметилированием гистона Н3 по остатку лизину 4 (Н3К4те3), которое также коррелирует с положительной регуляцией транскрипции, однако обычно обнаруживается только на промоторах генов. Эти данные, в сочетании с тем фактом, что метилтрансфераза DOT1L может быть обнаружена в комплексах с РНК-полимеразой II, предполагают, что Н3К79те2 либо участвует в элонгации, либо является сигналом к элонгации. Таким образом, мы исследовали, проявляют ли гены, связанные с повышенным Н3К79те2, увеличенную экспрессию в лейкозных клетках, индуцированных М11-АБ4, и обнаружили, что существует тесная корреляция между повышенным Н3К79те2 и повышенной экспрессией генов в нашей модели Б-ОЛЛ (рисунок 8).

Рисунок 8. Анализ GSEA генетической программы (369 генов) с повышенным содержанием H3K79me2, обнаруженной как в MLL-r B-ОЛЛ человека, так и в мышином B-ОЛЛ, продемонстрировал обогащение сигнатуры экспрессии гена в MLL-r B-ОЛЛ по сравнению с MLL-r B-ОЛЛ (NES = 1,63; p <0,019). Слева: график обогащения GSEA. Справа: тепловая карта экспрессии для 50 лучших наборов зондов в MLL-р ОЛЛ по сравнению с ОЛЛ с нативным MLL1.

Далее изучено, существуют ли аналогичные нарушения в метилировании H3K79 в B-ОЛЛ человека с MLL1-r. Использован ChIP-chip анализ набора MLL-r B-ОЛЛ и сравнивались их профили H3K79me2 с предшественниками человеческих B-клеток (Ьт-CD34+ CD19+). Мы обнаружили увеличенное H3K79me2, на многих генах HOXA кластера, подобное тому, которое наблюдается при лейкозах мышей. Также была измерена H3K79me2 по всему геному. Было обнаружено множество локусов с повышенным H3K79me2 в лейкозных клетках в сравнении с нормальными клетками. Эти локусы, как правило, имеют более высокий уровень транскрипции в лейкозных клетках. Использование метода АГК показало, что B-ОЛЛ с MLL1-транслокациями сильно отличаются от B-ОЛЛ с нативным MLL1 а также предшественников B-клеток (рисунок 9).

Рисунок 9. Анализ главных компонентов (АГК, PCA) 5438 генов, связанных с H3K79me2, отделяет MLL-r B-ОЛЛ (красный) от B-ОЛЛ с нативным MLL1 (черный) и клеток предшественников B-клеток (Ьш-CD34+ 19+) (зеленый).

В совокупности полученные данные демонстрируют, что аберрантное H3K79me2 происходит при Mll-AF4 и других ЫЬЬ-г лейкозах. Кроме того, ингибирование DOT1L может быть эффективным для ингибирования пролиферации лейкозных клеток, опосредованной Mll-AF4 [20]. Разработка точной модели MLL-AF4 B-ОЛЛ позволило детально охарактеризовать механизмы онкогенеза, опосредованного MLL-AF4, и, в частности, роль эпигенетических модификаций при этом заболевании. Кроме того, теперь появилась возможность оценить предполагаемые терапевтические средства в четко определенной модельной системе [19].

Глава 4. Зависимость лейкозов с МЬЫ-транслокациями от метилтрансферазы БОТ1Ь

В связи с тем, что обнаружена зависимость уровня транскрипции от H3K79me2, актуальным стало изучение вопроса: требуется ли присутствие метилтрансферазы DOT1L, ответственной за метилирование по Ю^9, для поддержания аберрантной экспрессии генов кластера HOXА и других генов-мишеней MLL-химерных белков [21, 22]. Дальнейшие эксперименты позволили оценить метилтрансферазу DOT1L как потенциальную терапевтическую мишень при острых лейкозах с MLL1-транслокациями. Разработаны две кшРНК (shRNA) для разрушения мРНК, кодирующей DOT1L, доставляемых в клетку с помощью лентивирусных векторов. Были инфицированы две линии клеток,

экспрессирующие MLL-AF4. Через 48 часов после трансфекции измерялась экспрессия

DOT1L РНК с помощью количественной ОТ-ПЦР. Подавление Экспрессия DOT1L РНК была подавлена на 70-80% от контроля. Наблюдалось также похожее по уровню уменьшение количества DOT1L белка (рисунок 10) [19].

Рисунок 10. Клетки SemK2 (В-ОЛЛ), экспрессирующие MLL-AF4, инфицировали либо контрольной кшРНК, либо одной из двух различных кшРНК, нацеленными на DOT1L. Экспрессию РНК DOT1L оценивали с помощью количественной ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга клеток через 48 часов после трансдукции (врезка). Погрешность выражена как ± стандартное отклонение дубликатов в одном из двух независимых экспериментов.

Через 96 часов после инфекции клеток измерялось Н3К79те2 на кластере HOXA, в результате чего обнаружилось 30-50% уменьшение ЮК79те2 в клетках, инфицированных DOT1L-направленной кшРНК (рисунок 11).

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Кривцов Андрей Владимирович, 2022 год

ф го

p0

75mg/kg, PO

75mg/kg, IP

Ж

0 2 4 6 8 time post oral gavage (h)

PDX-sample #1:

0 2 4 6 8 time post i.p.-injection (h)

PDX-sample #2:

К

Л

10 20 days of dosing

compund 10, PDX-sample #1:

М

vehicle

comp.10, 50mg/kg PO bid comp.10, 100mg/kg PO bid 6 9 12 15 18 21 24 days of dosing

З

100

sl

8 75

§ 50 D

4 25 0

compound 10 (PDX1+2):

И

compound 10 (PDX1+2):

11..

spleen compound 11 (PDX1+2):

bone marrow

peripheral blood

) 200 )g

Г 150

th g

J 100

ngra 50 or

0

i

100

sl

el 75

c

5+ 4 50

D

< >

h 25

spleen

compound 11 (PDX1+2):

....

bone marrow

spleen

peripheral blood

) 400 g)

Г 300

th g

| 200

§ 100 or

0

i

4

spleen

Н

MEIS1:

H0XA10:

О

5' 4'

i 3' * 2 1 0

n=4

i

WBC

it

HB

1000 800 -J 600

2 400 200 0

Î

r

2.5x104 ^2.0*104' S 1.5*104

JD

g 1.0*104° 5.0K103 0.0'

C

0.04 -,

1

~ 0.03-| 0.02 iS 0.01

e

! 0.00

0.15-| 0.100.05-0.00

£

H3K79 me2

H3

PLT

bone marrow (4 weeks)

PBMC (d14) PBMC (d14)

10

5

4

3

2

0

0

Рисунок 19. Оценка активности соединений 10 и 11 в доклинических испытаниях. А. Схема испытания на мышах с использованием корма с добавлением соединения 10 (0,05%). Б. Кинетика клеток периферической крови (РВ) CD45+ человека, измеренная с помощью проточной цитометрии во время добавления соединения 10 в пищу (0,05%). В. Концентрации соединения 10 в плазме крови при пероральном введении с пищей (0,05%) утром по сравнению с днем, что указывает на различные уровни лекарственного средства, основанные на кормовой активности животных. Г. Оценка токсичности соединения 10, измеренная по массе тела мыши во время введения через желудочный зонд (два раза в день) в дозах 50 и 100 мг/кг. Лечение было прекращено между 3 и 5 днями из-за токсичности, наблюдаемой при дозировке 100 мг / кг. Д. Концентрации в плазме крови соединения 10 (слева) и соединения 11 (справа) после перорального и внутрибрюшинного (1Р) введения,

соответственно. Это фармакокинетическое исследование было выполнено через 14 дней лечения два раза в день, чтобы отразить уровни лекарственного средства в PB во время продолжающегося приема. Оба препарата были растворены в Kolliphor HS 15 перед введением. Е. Схема испытания PDX на мышах с использованием 2 различных образцов, полученных от пациентов, и 2 новых ингибиторов DOT1L, как указано. Оба графта PDX использовались и ранее были опубликованы нашей лабораторией: PDX 1 и PDX 2. (G-H) Кинетика PB-клеток CD45 человека, измеренная с помощью проточной цитометрии во время обработки соединением 10 Ж. или соединением 11 К. Статистические данные проводили в конечной точке эксперимента (4 недели лечения), сравнивая леченных и необработанных животных с использованием непарного t-критерия. З. Клетки CD4 51 человека, измеренные с помощью проточной цитометрии в костном мозге, селезенке и периферической крови в конечной экспериментальной точке (4 недели лечения; те же животные, что показаны на рисунке). Ж-К. после лечения соединением 10 (вверху) или соединением 11 (внизу). И. Вес селезенки (в мг) в экспериментальной конечной точке после обработки соединением 10 (вверху) или соединением 11 (внизу). Л. Подсчет клеток крови в когорте PDX1, обработанной соединением 10, в конечной точке эксперимента. М. Поверхностная экспрессия CD11b на человеческих клетках CD45+ в костном мозге мышей, получавших соединение 10, в конечной точке эксперимента. Н. Экспрессия генов MEIS1 и HOXA10 в лейкозных клетках в периферической крови мышей группы PDX 1, обработанных соединением 10, через 14 дней после начала лечения. Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили с использованием проверенных анализов Taqman. О. Вестерн-блоттинг H3K79me2 и общего H3 в качестве контроля в клетках PDX из костного мозга каждой из 2 репрезентативных мышей (PDX 1), обработанных соединением 10 или носителем. Статистические данные для всех сравнений проводились с использованием непарного t-критерия. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** Р<0.0001. HB - гемоглобин; PBMC - мононуклеарные клетки периферической крови; PLT - тромбоциты; вОМЛ - вторичный ОМЛ; WBC- белые кровяные клетки.

Глава 8.VTP-50469 новый ингибитор взаимодействия MLL1-Menin с высокой и специфичной антилейкозной активностью

Взаимодействие MLL-химерных белков с белком Menin необходимо для онкогенной трансформации. Разрушение этого взаимодействия с помощью малых молекул -перспективный метод для лечения этого заболевания. VTP-50469 это низкомолекулярный ингибитор взаимодействия белков Menin-MLL, который был разработан компанией Syndax с использованием итеративного дизайна лекарств на основе структуры с помошью алгоритма Contour и данных рентгеновской кристаллографии. Структура с разрешением 1,90A ко-кристалла показывает VTP-50469, связанный в кармане Menin-MLL, и ключевые особенности его связывания, включая закрепляющие водородные связи с Y276 и W341 и пи-катион, взаимодействующий с боковыми цепями Y319 и W323 Menin (рисунок 20).

Рисунок 20. Кристаллическая структура УТР-50469, находящегося в «кармане» Мети, с разрешением 1.9А. Структура зарегистрирована в PDB под номером 6РКС.

Сначала измерялся ингибирующий эффект VTP-50469 на пролиферацию клеточных линий с транслокациями MLL1, ОМЛ (MOLM13, THP1, NOMO1, ML2, EOL1 и мышиные MLL-AF9) и B-ОЛЛ (KOPN8, HB11; 19, MV4; 11, SEMK2 и RS4; 11) используя либо подсчет живых клеток, либо окрашивание метаболическим красителем CellTiter-Glo. Воздействие VTP-50469 привело к значительному снижению пролиферации клеток в зависимости от концентрации VTP-50469, в тоже время клетки с нативным MLL1 (HL-60, REH, K562 и мышиный MOZ-TIF2) были не чувствительны к VTP-50469 (таблица 4).

Клеточная линия тип онкоген день измерения IC5o, нМ

HL-60 ОМЛ PML-RARa 12 »2000

NB4 ОПМЛ PML-RARa

К562 CML BCR-ABL 6 >500

MOLM13 ОМЛ MLL-AF9 3-12 13+/-9

ТНР1 ОМЛ MLL-AF9 12 37+/-21

N0M01 ОМЛ MLL-AF9 14 30+/-12

ML2 ОМЛ MLL-AF6 14 16+/-9

EOL1 ОМЛ MLL-PTD 14 20+/-10

REH В-ОЛЛ TEL1-RUNX1 4 »2000

KOPN8 в-олл MLL-ENL 4 15+/-10

НВ11 ;19 В-ОЛЛ MLL-ENL 4 36+/-12

MV4;11 В-ОЛЛ MLL-AF4 4 17+/-10

SEMK2 В-ОЛЛ MLL-AF4, AF4-MLL 4 27 +/-11

RS4;11 В-ОЛЛ MLL-AF4, AF4-MLL 4 25+/-12

Таблица 4. 14 клеточных линий лейкозов, с указанием типа онкогенного фактора и значений 1С50 для УТР-50469. 1С50 определяли на указанный день путем подсчета жизнеспособных клеток с помощью проточной цитометрии, (исключение мертвых клеток путем окрашивания DAPI).

Эти эксперименты показывают, что УТР-50469 обладает сильной антипролиферативной активностью в отношении клеток, несущих транслокации МКЬ1, с половинной максимальной ингибирующей концентрацией (1С50) в диапазоне низких наномолярных концентраций.

Предыдущие исследования показали, что ингибирование взаимодействия Мешп-МКЬ приводит к подавлению экспрессии генов кластера НОХА9 и МЕК1, так же как и других

генов-мишеней MLL-химер лейкозных клетках. Мы обрабатывали клетки MOLM13 и RS4;11 в течение 2 и 7 дней VTP-50469 или DMSO с последующим анализом секвенирования РНК (RNA-seq). В клетках MOLM13 экспрессия 153 и 160 генов показала более чем 2-кратное их снижение ф <0,05) соответственно на 2-й и 7-й день (рисунок 2^-B). Точно так же, в клетках RS4;11 61 и 475 отмечено снижение экспрессии генов более чем в 2 раза соответственно через 2 и 7 дней. Многие из генов, экспрессия которых снизилась, были четко определенными генами-мишенями для MLL-химерных белков, включая MEIS1, MEF2C, JMJD1C и PBX3, все из них, как ранее было показано, имеют важное значение для пролиферации MLL-r ОМЛ. В то время как гены кластера HOXA снизили экспрессию после обработки VTP-50469, эти изменения были гораздо менее выражены и не достигали статистической значимости (рисунки 21 А-Б) [45, 46].

MOLM13 Б MOLM13

day 2 day 7 day 2 day 7

Рисунок 21. Изменение транскрипции после обработки клеток VTP-50469 A. график по типу volcano-plot данных РНК-seq, полученных для клеток MOLM13, обработанных VTP-50469 или контролем DMSO. Помечены некоторые гены-мишени MLL-AF9. Б. Тепловая карта 20 генов с наиболее сниженной транскрипцией после 2- и 7-дневной обработки VTP-50469 в клетках MOLM13. Помечены некоторые гены-мишени MLL-AF9.

Затем, используя анализ обогащения набора генов (GSEA), мы определили степень, в которой гены-мишени MLL-химер изменили экспрессию на 2 и 7 дни. Экспрессия целевых генов-мишеней MLL-AF9 и MLL-AF4 значительно снизилась в клетках MOLM13 и RS4; 11 соответственно, ко 2-му дню и в еще большей степени к 7-му дню. Следовательно, обработка VTP-50469 приводит к быстрому подавлению экспрессии генов-мишеней MLL-химер; однако, такие гены как, MEIS1, PBX3 и MEF2C, более чувствительны к воздействию, чем гены HOXA.

Поскольку обработка VTP-50469 приводила к диссоциации комплексов белков, связанных с Мешп и нарушению экспрессии генов-мишеней МКЬ-химер далее исследовали связывание Мешп с хроматином и модификации гистонов. Использовали секвенирование иммунопреципитации хроматина (ChIP-seq) для оценки сайтов и динамики взаимодействия Мешп, МКЬ1 и БОТШ с хроматином в MOLM13, RS4;11 и МЬ2 клетках после 3-х дневной обработки VTP-50469. Обработка VTP-50469 приводит к потере связывания Мешп с хроматином в MOLM13, RS4;11 и ML2 (рисунки 22 А-Б). Обнаружили снижение, но не полную потерю взаимодействия БОТШ с хроматином после обработки VTP-50469 в клетках MOLM13, RS4;11 и ML2. Более тщательный анализ показал полную потерю связывания БОТШ многих, но не всех генов-мишеней MLL-AF9. Например, гены кластера НОХА, MYB и GAPDH сохранили существенное количество связанного БОТШ. Примечателен факт, что не наблюдается заметная потеря глобального уровня Н3К79те2 с помощью ChIP-seq (рисунок 22 А).

А Мешп М1_1-1п ООТИ. К79те2 Б

___,__, _ , _, ,_,__, _г__,__, ,____,____НОХДЗ-11 МУВ вДРОН МЕР2С МЕ1Э1 ЛЛЮ1С

зоз-з о з -з оз-з а з-з с з-з а з-зоз-з о з

Рисунок 22. Ремоделирование MLL-химерных комплексов с хроматином при обработки УТР-50469. А. Данные ChIP-seq Menin, MLL1n, DOT1L и И3К79ше2 ChIP-seq в клетках MOLM13, обработанных VTP-50469 или DMSO, были нанесены в виде графиков тепловой карты/торнадо сайта начала транскрипции (Т88) ± 3 т.п.н. Б. Генные треки сигналов ChIP-seq Menin, MLL1n, DOT1L и И3К79ше2 на выбранных генах-мишенях MLL-AF9 в клетках MOLM13, обработанных У1Р-50469.

Выявлено, что обработка VTP-50469 глобально не вытесняет MLL1 из хроматина в клетках MOLM13, RS4;11 и ML2 (рисунок 22A). Следует отметить, что антитело, используемое для MLL ChIP-seq, распознает N-конец MLL (MLL1n) и, таким образом, распознает нативный MLL1 и MLL-химерные белки. Чтобы это контролировать, в эксперимент были включены клетки ML2, поскольку они экспрессируют только химерный белок MLL-AF6, но утратили оставшуюся нативную аллель MLL1. Таким образом, все сигналы MLL1n в клетках ML2 происходят от MLL-AF6. Прямое сравнение сайтов и величины потери MLL1n в геноме было сходным для клеток MOLM13, RS4;11 и ML2. Когда оценивалась связанность MLL1n с конкретными локусами-мишенями MLL-химер, последовательно обнаружилась более чем 2-кратная потеря сигнала MLL1n в локусах MEIS1, MEF2C и JMJD1C, тогда как другие гены-мишени MLL-химер, такие как гены HOXA и MYB, показали, что не теряют связанный MLL1n ни в MOLM13, ни в RS4 и 11 клеточных линиях (рисунок 22Б). Используя GSEA мы показали, что существует корреляция между потерей Menin, MLL1n или DOT1L на хроматине и изменениями в экспрессии генов. В целом, потеря связывания Menin с хроматином не приводит к глобальной потере связывания с хроматином MLL-химер. Тем не менее, потеря Menin на хроматине ведет к диссоциации MLL, DOT1L, H3K79me2 на отдельных локусах. Это, в свою очередь, приводит к ослаблению экспрессии набора этих генов-мишеней MLL-химер (например, MEF2C, MEIS1 и JMJD1C). Тогда как другие гены-мишени MLL-химер (например, HOXA и MYB) гораздо менее чувствительны к потере взаимодействия Menin-MLL.

Далее, в рамках доклинических испытаний, используя образцы ОМЛ PDX взрослых, был изучен терапевтический потенциал VTP-50469. Два образца ОМЛ PDX с MLL-химерами трансплантировали в мышей (NSG). Когда лейкозные клетки достигли концентрации 0.1% в крови животных, мышей разделили на 2 группы и кормили либо контрольным кормом, либо кормом с содержанием 0.1% VTP-50469. После 2-х недель

получения VTP-50469 с пищей у мышей наблюдалось понижение и через 4 недели практически исчезновение лейкозных клеток из периферической крови, в сравнении с мышами, получавшими контрольный корм (рисунок 23). Более того, лейкозные клетки, выделенные из мышей, получавших корм с VTP-50469, имели повышенную экспрессию CD11b на клеточной поверхности, что указывает на их дифференцировку. Анализ экспрессии генов в периферической крови мышей, получавших VTP-50469, по сравнению с контрольной диетой на 3-й неделе лечения выявил 5-кратное снижение экспрессии MEIS1, что указывает на целевую активность этого лекарственного средства [45, 46].

Рисунок 23. Дозировка мышей VTP-50469 снижает концентрацию лейкозных клеток. Процент (%) hCD45+ клеток в периферической крови ^В) мышей N80, которым трансплантировали MLL-r ОМЛ PDX (68552 или 40315) либо в контрольную, либо в 0,1% корм для мышей УГР-50469. Вертикальные скобы представляют собой стандартное отклонение.

Анализ инфильтрации органов после смерти мышей выявил значительное снижение присутствия лейкозных клеток в костном мозге и селезенке, так же как существенное снижение веса селезенок у мышей, получавших VTP-50469 с кормом. Мыши, получавшие VTP-50469 и контрольную диету, одинаково прибавили в весе, и явных признаков токсичности не было обнаружено на протяжении всего лечения. Количество лейкоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов, а также концентрация гемоглобина в периферической крови мышей на контрольной диете и рационе VTP50469 были аналогичными.

После наблюдения впечатляющей противолейкозной активности VTP-50469 в отношении моделей MLL-химерных PDX ОМЛ мы оценили его активность в отношении детских В-ОЛЛ с MLL-химерными белками PDX. Были использованы три разные модели В-ОЛЛ PDX с MLL-химерными белками. Когда концентрация лейкозных клеток в крови

мышей достигла 0.1%, их разделили на 2 группы, где одна группа получала корм, содержащий 0.1% VTP-50469, а вторую группу кормили контрольным кормом.

Процент лейкозных клеток в крови начал снижаться через 2-3 недели после начала лечения. В двух третях случаев опухолевые клетки были едва обнаруживаемыми (менее чем уровень чувствительности или 0,1%) через 28 дней (рисунок 24). После 4 недель лечения присутствие лейкозных клеток значительно снизилось как в костном мозге, так и в селезенке.

В общей сложности протестирована активность VTP-50469 на 12 PDX ОМЛ и В-ОЛЛ. Лечение мышей с помощью VTP-50469 приводило к практическому исчезновению лейкозных клеток в 11 PDX из 12. По результатам этих и других доклинических испытаний компания Syndaх начала клинические испытания аналога VTP-50469 - SNDX-5613 в 2019 году [45, 46, 47].

Рисунок 24. Процент (%) ИСБ45+ клеток в периферической крови (РВ) мышей N80, которым трансплантировали 10 MLL-r от детей и 1 контрольный BCR-ABL (ALL-56) В-ОЛЛ РБХ в процессе лечения с помощью перорального 100мг/кг УТР-50469. Стандартное отклонение по оси Y.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги выполненного исследования

1. Острые лейкозы с химерным онкобелком MLL-AF9 имеют концентрацию стволовых клеток лейкоза (СКЛ) значительно выше, чем ранее предполагалось: 1:120, а не 1:10.000. СКЛ имеют иммунофенотип и транскрипционную программу, имеющую сходство не со стволовыми кроветворными клетками, а с миелоидными клетками-предшественницами.

2. Транскрипционная и эпигенетические программы клетки-мишени онкотрансформации сохраняются и влияют на транскрипционную и эпигенетическую программу MLL-AF9 лейкоза и клиническую картину заболевания. Лейкозы, происходящие из стволовых кроветворных клеток, менее восприимчивы к химиотерапии.

3. Разработана мышиная модель Mll-AF4 В-ОЛЛ, которая воспроизводит транскрипционные и эпигенетические особенности В-ОЛЛ человека. Доказано, что повышенное метилирование гистона Н3 по И3К79 является уникальной особенностью лейкозов с MLL-химерами.

4. Идентифицирован фермент гистон-метилтрансфераза DOT1L как потенциальная мишень для маломолекулярного воздействия на ОМЛ и В-ОЛЛ с MLL-химерами.

5. Доказано, что ингибирование ферментативной активности DOT1L с помощью селективного ингибитора EPZ-5676 недостаточно для терапевтического эффекта у пациентов.

6. Создана коллекция образцов острых лейкозов пациентов, способных приживаться в иммунодефицитных мышах (PDX) для доклинических испытаний противолейкозных препаратов.

7. Используя данную PDX коллекцию, проведены доклинические испытания новых ингибиторов DOT1L и Menin-MLL1.

Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы

Безусловно, самой интересной разработкой данной темы будет завершение первой и начало второй стадии клинических испытаний ингибитора Menin-MLL1. Хотя, из предыдущего опыта применения специфичной таргетной терапии в онкологии мы знаем, что с течением времени у подгруппы пациентов может выработаться устойчивость к этой таргетной терапии и, соответственно, возникнуть потребность замены терапии. В этой связи очень важно начать исследовать потенциальные механизмы развития резистентности к ингибитору Menin-MLL1, используя клеточные модели с хронической экспозицией к ингибитору. Мы не можем предугадать, будет ли появляться резистентность к ингибитору Menin-MLL1 до окончания клинический испытаний. Необходимо исследовать совместное применение новых ингибиторов метилтрансферазы DOT1L и ингибитора Menin-MLL1 на лейкозах с геномными транслокациями гена MLL1. Такие эксперименты уже ведутся в нашей лаборатории. Так же важно опробовать применение ингибитора Menin-MLL1 в других генетически детерминированных моделях лейкозов и, возможно, твердых опухолей. Более того, так как мы показали, что комплексы, включающие химерные белки MLL, могут различаться на разных генах-мишенях, необходимо установить композицию таких комплексов, используя ген-специфичную преципитацию с dead Cas9.

Развитие фармакологии показало, что для некоторых белков-мишеней может быть предпочтительна таргетная деградация, а не ингибирование. Как развитие этой работы будет важно попробовать сконструировать молекулярные дегроны Menin и исследовать их действие на лейкозах с геномными транслокациями гена MLL1.

СПИСОК НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ, В КОТОРЫХ ИЗЛОЖЕНЫ ОСНОВНЫЕ НАУЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ

1. Wang, Y., A. V. Krivtsov, A. U. Sinha, T. E. North, W. Goessling, Z. Feng, L. I. Zon, and S. A. Armstrong. "The Wnt/Beta-Catenin Pathway Is Required for the Development of Leukemia Stem Cells in Aml." Science 327, no. 5973 (Mar 26 2010): 1650-3. Q1

2. Wang, J., H. Iwasaki, A. Krivtsov, P. G. Febbo, A. R. Thorner, P. Ernst, E. Anastasiadou, J. L. Kutok, S. C. Kogan, S. S. Zinkel, J. K. Fisher, J. L. Hess, T. R. Golub, S. A. Armstrong, K. Akashi, and S. J. Korsmeyer. "Conditional Mll-Cbp Targets Gmp and Models Therapy-Related Myeloproliferative Disease." Embo j 24, no. 2 (Jan 26 2005): 368-81. Q1

3. Krivtsov, A. V. and S. A. Armstrong. "Mll Translocations, Histone Modifications and Leukaemia Stem-Cell Development." Nat Rev Cancer 7, no. 11 (Nov 2007): 823-33. Q1

4. Krivtsov, A. V., Z. Feng, and S. A. Armstrong. "Transformation from Committed Progenitor to Leukemia Stem Cells." Ann N Y Acad Sci 1176 (Sep 2009): 144-9. Q1

5. Zimmer, S. N., Q. Zhou, T. Zhou, Z. Cheng, S. L. Abboud-Werner, D. Horn, M. Lecocke, R. White, A. V. Krivtsov, S. A. Armstrong, A. L. Kung, D. M. Livingston, and V. I. Rebel. "Crebbp Haploinsufficiency in Mice Alters the Bone Marrow Microenvironment, Leading to Loss of Stem Cells and Excessive Myelopoiesis." Blood 118, no. 1 (Jul 7 2011): 69-79. Q1

6. Krivtsov, A. V., D. Twomey, Z. Feng, M. C. Stubbs, Y. Wang, J. Faber, J. E. Levine, J. Wang, W. C. Hahn, D. G. Gilliland, T. R. Golub, and S. A. Armstrong. "Transformation from Committed Progenitor to Leukaemia Stem Cell Initiated by Mll-Af9." Nature 442, no. 7104 (Aug 17 2006): 818-22. Q1

7. Stubbs, M. C., Y. M. Kim, A. V. Krivtsov, R. D. Wright, Z. Feng, J. Agarwal, A. L. Kung, and S. A. Armstrong. "Mll-Af9 and Flt3 Cooperation in Acute Myelogenous Leukemia: Development of a Model for Rapid Therapeutic Assessment." Leukemia 22, no. 1 (Jan 2008): 66-77. Q1

8. Faber, J., A. V. Krivtsov, M. C. Stubbs, R. Wright, T. N. Davis, M. van den Heuvel-Eibrink, C. M. Zwaan, A. L. Kung, and S. A. Armstrong. "Hoxa9 Is Required for Survival in Human Mll-Rearranged Acute Leukemias." Blood 113, no. 11 (Mar 12 2009): 2375-85. Q1

9. Gekas, C., K. E. Rhodes, L. M. Gereige, H. Helgadottir, R. Ferrari, S. K. Kurdistani, E. Montecino-Rodriguez, R. Bassel-Duby, E. Olson, A. V. Krivtsov, S. Armstrong, S. H. Orkin, M. Pellegrini, and H. K. Mikkola. "Mef2c Is a Lineage-Restricted Target of Scl/Tal1 and Regulates Megakaryopoiesis and B-Cell Homeostasis." Blood 113, no. 15 (Apr 9 2009): 3461-71. Q1

10. Ng, C. E., A. Sinha, A. Krivtsov, S. Dias, J. Chang, S. A. Armstrong, and D. Kalaitzidis. "Kras(G12d)-Evoked Leukemogenesis Does Not Require B-Catenin." Leukemia 28, no. 3 (Mar 2014): 698-702. Q1

11. Placke, T., K. Faber, A. Nonami, S. L. Putwain, H. R. Salih, F. H. Heidel, A. Krämer, D. E. Root, D. A. Barbie, A. V. Krivtsov, S. A. Armstrong, W. C. Hahn, B. J. Huntly, S. M. Sykes, M. D. Milsom, C. Scholl, and S. Fröhling. "Requirement for Cdk6 in Mll-Rearranged Acute Myeloid Leukemia." Blood 124, no. 1 (Jul 3 2014): 13-23. Q1

12. Altschuler, G. M., O. Hofmann, I. Kalatskaya, R. Payne, S. J. Ho Sui, U. Saxena, A. V. Krivtsov, S. A. Armstrong, T. Cai, L. Stein, and W. A. Hide. "Pathprinting: An Integrative Approach to Understand the Functional Basis of Disease." Genome Med 5, no. 7 (2013): 68. Q1

13. Ho Sui, S. J., K. Begley, D. Reilly, B. Chapman, R. McGovern, P. Rocca-Sera, E. Maguire, G. M. Altschuler, T. A. Hansen, R. Sompallae, A. Krivtsov, R. A. Shivdasani, S. A. Armstrong, A. C. Culhane, M. Correll, S. A. Sansone, O. Hofmann, and W. Hide. "The Stem Cell Discovery Engine: An Integrated Repository and Analysis System for Cancer Stem Cell Comparisons." Nucleic Acids Res 40, no. Database issue (Jan 2012): D984-91. Q1

14. Krivtsov, A. V., M. E. Figueroa, A. U. Sinha, M. C. Stubbs, Z. Feng, P. J. Valk, R. Delwel, K. Döhner, L. Bullinger, A. L. Kung, A. M. Melnick, and S. A. Armstrong. "Cell of Origin Determines Clinically Relevant Subtypes of Mll-Rearranged Aml." Leukemia 27, no. 4 (Apr 2013): 852-60. Q1

15. Krivtsov, A. V. and S. A. Armstrong. "Cancer. Can One Cell Influence Cancer Heterogeneity?" Science 338, no. 6110 (Nov 23 2012): 1035-6. Q1

16. Bindels, E. M., M. Havermans, S. Lugthart, C. Erpelinck, E. Wocjtowicz, A. V. Krivtsov, E. Rombouts, S. A. Armstrong, E. Taskesen, J. R. Haanstra, H. B. Beverloo, H. Döhner, W. A. Hudson, J. H. Kersey, R. Delwel, and A. R. Kumar. "Evi1 Is Critical for the Pathogenesis of a Subset of Mll-Af9-Rearranged Amls." Blood 119, no. 24 (Jun 14 2012): 5838-49. Q1

17. Deshpande, A. J., A. Deshpande, A. U. Sinha, L. Chen, J. Chang, A. Cihan, M. Fazio, C. W. Chen, N. Zhu, R. Koche, L. Dzhekieva, G. Ibänez, S. Dias, D. Banka, A. Krivtsov, M. Luo, R. G. Roeder, J. E. Bradner, K. M. Bernt, and S. A. Armstrong. "Af10 Regulates Progressive H3k79 Methylation and Hox Gene Expression in Diverse Aml Subtypes." Cancer Cell 26, no. 6 (Dec 8 2014): 896-908. Q1

18. Brien, G. L., E. Healy, E. Jerman, E. Conway, E. Fadda, D. O'Donovan, A. V. Krivtsov, A. M. Rice, C. J. Kearney, A. Flaus, S. S. McDade, S. J. Martin, A. McLysaght, D. J. O'Connell, S. A. Armstrong, and A. P. Bracken. "A Chromatin-Independent Role of Polycomb-Like 1 to Stabilize P53 and Promote Cellular Quiescence." Genes Dev 29, no. 21 (Nov 1 2015): 2231-43. Q1

19. Krivtsov, A. V., Z. Feng, M. E. Lemieux, J. Faber, S. Vempati, A. U. Sinha, X. Xia, J. Jesneck, A. P. Bracken, L. B. Silverman, J. L. Kutok, A. L. Kung, and S. A. Armstrong. "H3k79 Methylation Profiles Define Murine and Human Mll-Af4 Leukemias." Cancer Cell 14, no. 5 (Nov 4 2008): 355-68. Q1

20. Kühn, M. W., M. J. Hadler, S. R. Daigle, R. P. Koche, A. V. Krivtsov, E. J. Olhava, M. A. Caligiuri, G. Huang, J. E. Bradner, R. M. Pollock, and S. A. Armstrong. "Mll Partial Tandem Duplication Leukemia Cells Are Sensitive to Small Molecule Dot1l Inhibition." Haematologica 100, no. 5 (May 2015): e190-3. Q1

21. Krivtsov, A. V., T. Hoshii, and S. A. Armstrong. "Mixed-Lineage Leukemia Fusions and Chromatin in Leukemia." Cold Spring Harb PerspectMed 7, no. 11 (Nov 1 2017). Q1

22. Mar, B. G., S. H. Chu, J. D. Kahn, A. V. Krivtsov, R. Koche, C. A. Castellano, J. L. Kotlier, R. L. Zon, M. E. McConkey, J. Chabon, R. Chappell, P. V. Grauman, J. J. Hsieh, S. A. Armstrong, and B. L. Ebert. "Setd2 Alterations Impair DNA Damage Recognition and Lead to Resistance to Chemotherapy in Leukemia." Blood 130, no. 24 (Dec 14 2017): 2631-41. Q1

23. Bernt, K. M., N. Zhu, A. U. Sinha, S. Vempati, J. Faber, A. V. Krivtsov, Z. Feng, N. Punt, A. Daigle, L. Bullinger, R. M. Pollock, V. M. Richon, A. L. Kung, and S. A. Armstrong. "Mll-Rearranged Leukemia Is Dependent on Aberrant H3k79 Methylation by Dot1l." Cancer Cell 20, no. 1 (Jul 12 2011): 66-78. Q1

24. Ye, M., H. Zhang, H. Yang, R. Koche, P. B. Staber, M. Cusan, E. Levantini, R. S. Welner, C. S. Bach, J. Zhang, A. V. Krivtsov, S. A. Armstrong, and D. G. Tenen. "Hematopoietic Differentiation Is Required for Initiation of Acute Myeloid Leukemia." Cell Stem Cell 17, no. 5 (Nov 5 2015): 611-23. Q1

25. Stubbs, M. C., W. Kim, M. Bariteau, T. Davis, S. Vempati, J. Minehart, M. Witkin, J. Qi, A. V. Krivtsov, J. E. Bradner, A. L. Kung, and S. A. Armstrong. "Selective Inhibition of Hdac1 and Hdac2 as a Potential Therapeutic Option for B-All." Clin Cancer Res 21, no. 10 (May 15 2015): 2348-58. Q1

26. Stein, E. M., G. Garcia-Manero, D. A. Rizzieri, R. Tibes, J. G. Berdeja, M. R. Savona, M. Jongen-Lavrenic, J. K. Altman, B. Thomson, S. J. Blakemore, S. R. Daigle, N. J. Waters, A. B. Suttle, A. Clawson, R. Pollock, A. Krivtsov, S. A. Armstrong, J. DiMartino, E. Hedrick, B. Löwenberg, and M. S. Tallman. "The Dot1l Inhibitor Pinometostat Reduces H3k79 Methylation and Has Modest Clinical Activity in Adult Acute Leukemia." Blood 131, no. 24 (Jun 14 2018): 2661-69. Q1

27. Stubbs, M. C. and A. V. Krivtsov. "Murine Retrovirally-Transduced Bone Marrow Engraftment Models of Mll-Fusion-Driven Acute Myelogenous Leukemias (Aml)." Curr Protoc Pharmacol 78 (Sep 11 2017): 14.42.1-14.42.19. Q1

28. Wang, K., M. Sanchez-Martin, X. Wang, K. M. Knapp, R. Koche, L. Vu, M. K. Nahas, J. He, M. Hadler, E. M. Stein, M. S. Tallman, A. L. Donahue, G. M. Frampton, D. Lipson, S. Roels, P. J. Stephens, E. M. Sanford, T. Brennan, G. A. Otto, R. Yelensky, V. A. Miller, M. G. Kharas, R. L. Levine, A. Ferrando, S. A. Armstrong, and A. V. Krivtsov. "Patient-Derived Xenotransplants Can

Recapitulate the Genetic Driver Landscape of Acute Leukemias." Leukemia 31, no. 1 (Jan 2017): 15158. Q1

29. Wang, S. P., Z. Tang, C. W. Chen, M. Shimada, R. P. Koche, L. H. Wang, T. Nakadai, A. Chramiec, A. V. Krivtsov, S. A. Armstrong, and R. G. Roeder. "A Utx-Mll4-P300 Transcriptional Regulatory Network Coordinately Shapes Active Enhancer Landscapes for Eliciting Transcription." Mol Cell 67, no. 2 (Jul 20 2017): 308-21.e6. Q1

30. Kucine, N., S. Marubayashi, N. Bhagwat, E. Papalexi, P. Koppikar, M. Sanchez Martin, L. Dong, M. S. Tallman, E. Paietta, K. Wang, J. He, D. Lipson, P. Stephens, V. Miller, J. M. Rowe, J. Teruya-Feldstein, C. G. Mullighan, A. A. Ferrando, A. Krivtsov, S. Armstrong, L. Leung, S. O. Ochiana, G. Chiosis, R. L. Levine, and M. Kleppe. "Tumor-Specific Hsp90 Inhibition as a Therapeutic Approach in Jak-Mutant Acute Lymphoblastic Leukemias." Blood 126, no. 22 (Nov 26 2015): 2479-83. Q1

31. LaFave, L. M., W. Béguelin, R. Koche, M. Teater, B. Spitzer, A. Chramiec, E. Papalexi, M. D. Keller, T. Hricik, K. Konstantinoff, J. B. Micol, B. Durham, S. K. Knutson, J. E. Campbell, G. Blum, X. Shi, E. H. Doud, A. V. Krivtsov, Y. R. Chung, I. Khodos, E. de Stanchina, O. Ouerfelli, P. S. Adusumilli, P. M. Thomas, N. L. Kelleher, M. Luo, H. Keilhack, O. Abdel-Wahab, A. Melnick, S. A. Armstrong, and R. L. Levine. "Loss of Bap1 Function Leads to Ezh2-Dependent Transformation." Nat Med 21, no. 11 (Nov 2015): 1344-9. Q1

32. Pelish, H. E., B. B. Liau, Nitulescu, II, A. Tangpeerachaikul, Z. C. Poss, D. H. Da Silva, B. T. Caruso,

A. Arefolov, O. Fadeyi, A. L. Christie, K. Du, D. Banka, E. V. Schneider, A. Jestel, G. Zou, C. Si, C.

C. Ebmeier, R. T. Bronson, A. V. Krivtsov, A. G. Myers, N. E. Kohl, A. L. Kung, S. A. Armstrong, M. E. Lemieux, D. J. Taatjes, and M. D. Shair. "Mediator Kinase Inhibition Further Activates Super-Enhancer-Associated Genes in Aml." Nature 526, no. 7572 (Oct 8 2015): 273-76. Q1

33. Guryanova, O. A., K. Shank, B. Spitzer, L. Luciani, R. P. Koche, F. E. Garrett-Bakelman, C. Ganzel,

B. H. Durham, A. Mohanty, G. Hoermann, S. A. Rivera, A. G. Chramiec, E. Pronier, L. Bastian, M. D. Keller, D. Tovbin, E. Loizou, A. R. Weinstein, A. R. Gonzalez, Y. K. Lieu, J. M. Rowe, F. Pastore, A. S. McKenney, A. V. Krivtsov, W. R. Sperr, J. R. Cross, C. E. Mason, M. S. Tallman, M. E. Arcila, O. Abdel-Wahab, S. A. Armstrong, S. Kubicek, P. B. Staber, M. Gönen, E. M. Paietta, A. M. Melnick, S.

D. Nimer, S. Mukherjee, and R. L. Levine. "Dnmt3a Mutations Promote Anthracycline Resistance in Acute Myeloid Leukemia Via Impaired Nucleosome Remodeling." Nat Med 22, no. 12 (Dec 2016): 1488-95. Q1

34. Lee, S. C., H. Dvinge, E. Kim, H. Cho, J. B. Micol, Y. R. Chung, B. H. Durham, A. Yoshimi, Y. J. Kim, M. Thomas, C. Lobry, C. W. Chen, A. Pastore, J. Taylor, X. Wang, A. Krivtsov, S. A. Armstrong, J. Palacino, S. Buonamici, P. G. Smith, R. K. Bradley, and O. Abdel-Wahab. "Modulation of Splicing Catalysis for Therapeutic Targeting of Leukemia with Mutations in Genes Encoding Spliceosomal Proteins." Nat Med 22, no. 6 (Jun 2016): 672-8. Q1

35. Micol, J. B., A. Pastore, D. Inoue, N. Duployez, E. Kim, S. C. Lee, B. H. Durham, Y. R. Chung, H. Cho, X. J. Zhang, A. Yoshimi, A. Krivtsov, R. Koche, E. Solary, A. Sinha, C. Preudhomme, and O. Abdel-Wahab. "Asxl2 Is Essential for Haematopoiesis and Acts as a Haploinsufficient Tumour Suppressor in Leukemia." Nat Commun 8 (May 18 2017): 15429. Q1

36. Vu, L. P., C. Prieto, E. M. Amin, S. Chhangawala, A. Krivtsov, M. N. Calvo-Vidal, T. Chou, A. Chow, G. Minuesa, S. M. Park, T. S. Barlowe, J. Taggart, P. Tivnan, R. P. Deering, L. P. Chu, J. A. Kwon, C. Meydan, J. Perales-Paton, A. Arshi, M. Gönen, C. Famulare, M. Patel, E. Paietta, M. S. Tallman, Y. Lu, J. Glass, F. E. Garret-Bakelman, A. Melnick, R. Levine, F. Al-Shahrour, M. Järäs, N. Hacohen, A. Hwang, R. Garippa, C. J. Lengner, S. A. Armstrong, L. Cerchietti, G. S. Cowley, D. Root, J. Doench, C. Leslie, B. L. Ebert, and M. G. Kharas. "Functional Screen of Msi2 Interactors Identifies an Essential Role for Syncrip in Myeloid Leukemia Stem Cells." Nat Genet 49, no. 6 (Jun 2017): 86675. Q1

37. Brown, F. C., E. Still, R. P. Koche, C. Y. Yim, S. Takao, P. Cifani, C. Reed, S. Gunasekera, S. B. Ficarro, P. Romanienko, W. Mark, C. McCarthy, E. de Stanchina, M. Gonen, V. Seshan, P. Bhola, C. O'Donnell, B. Spitzer, C. Stutzke, V. P. Lavallée, J. Hébert, A. V. Krivtsov, A. Melnick, E. M. Paietta, M. S. Tallman, A. Letai, G. Sauvageau, G. Pouliot, R. Levine, J. A. Marto, S. A. Armstrong, and A.

Kentsis. "Mef2c Phosphorylation Is Required For chemotherapy Resistance in Acute Myeloid Leukemia." Cancer Discov 8, no. 4 (Apr 2018): 478-97. Q1

38. Chu, S. H., E. J. Song, J. R. Chabon, J. Minehart, C. N. Matovina, J. L. Makofske, E. S. Frank, K. Ross, R. P. Koche, Z. Feng, H. Xu, A. Krivtsov, A. Nussenzweig, and S. A. Armstrong. "Inhibition of Mek and Atr Is Effective in a B-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Driven by Mll-Af4 and Activated Ras." BloodAdv 2, no. 19 (Oct 9 2018): 2478-90. Q1

39. Cusan, M., S. F. Cai, H. P. Mohammad, A. Krivtsov, A. Chramiec, E. Loizou, M. D. Witkin, K. N. Smitheman, D. G. Tenen, M. Ye, B. Will, U. Steidl, R. G. Kruger, R. L. Levine, H. Y. Rienhoff, Jr., R. P. Koche, and S. A. Armstrong. "Lsdl Inhibition Exerts Its Antileukemic Effect by Recommissioning Pu.1- and C/Ebpa-Dependent Enhancers in Aml." Blood 131, no. 15 (Apr 12 2018): 1730-42. Q1

40. Ramaswamy, K., L. Forbes, G. Minuesa, T. Gindin, F. Brown, M. G. Kharas, A. V. Krivtsov, S. A. Armstrong, E. Still, E. de Stanchina, B. Knoechel, R. Koche, and A. Kentsis. "Peptidomimetic Blockade of Myb in Acute Myeloid Leukemia." Nat Commun 9, no. 1 (Jan 9 2018): 110. Q1

41. Verma, N., H. Pan, L. C. Doré, A. Shukla, Q. V. Li, B. Pelham-Webb, V. Teijeiro, F. González, A. Krivtsov, C. J. Chang, E. P. Papapetrou, C. He, O. Elemento, and D. Huangfu. "Tet Proteins Safeguard Bivalent Promoters from De Novo Methylation in Human Embryonic Stem Cells." Nat Genet 50, no. 1 (Jan 2018): 83-95. Q1

42. Boettcher, S., P. G. Miller, R. Sharma, M. McConkey, M. Leventhal, A. V. Krivtsov, A. O. Giacomelli, W. Wong, J. Kim, S. Chao, K. J. Kurppa, X. Yang, K. Milenkowic, F. Piccioni, D. E. Root, F. G. Rücker, Y. Flamand, D. Neuberg, R. C. Lindsley, P. A. Jänne, W. C. Hahn, T. Jacks, H. Döhner, S. A. Armstrong, and B. L. Ebert. "A Dominant-Negative Effect Drives Selection of Tp53 Missense Mutations in Myeloid Malignancies." Science 365, no. 6453 (Aug 9 2019): 599-604. Q1

43. Park, S. M., H. Cho, A. M. Thornton, T. S. Barlowe, T. Chou, S. Chhangawala, L. Fairchild, J. Taggart, A. Chow, A. Schurer, A. Gruet, M. D. Witkin, J. H. Kim, E. M. Shevach, A. Krivtsov, S. A. Armstrong, C. Leslie, and M. G. Kharas. "Ikzf2 Drives Leukemia Stem Cell Self-Renewal and Inhibits Myeloid Differentiation." Cell Stem Cell 24, no. 1 (Jan 3 2019): 153-65.e7. Q1

44. Perner, F., J. Y. Gadrey, Y. Xiong, C. Hatton, B. K. Eschle, A. Weiss, F. Stauffer, C. Gaul, R. Tiedt, J. A. Perry, S. A. Armstrong, and A. V. Krivtsov. "Novel Inhibitors of the Histone Methyltransferase Dot1l Show Potent Antileukemic Activity in Patient-Derived Xenografts." Blood 136, no. 17 (Oct 22 2020): 1983-88. Q1

45. Krivtsov, A. V., K. Evans, J. Y. Gadrey, B. K. Eschle, C. Hatton, H. J. Uckelmann, K. N. Ross, F. Perner, S. N. Olsen, T. Pritchard, L. McDermott, C. D. Jones, D. Jing, A. Braytee, D. Chacon, E. Earley, B. M. McKeever, D. Claremon, A. J. Gifford, H. J. Lee, B. A. Teicher, J. E. Pimanda, D. Beck, J. A. Perry, M. A. Smith, G. M. McGeehan, R. B. Lock, and S. A. Armstrong. "A Menin-Mll Inhibitor Induces Specific Chromatin Changes and Eradicates Disease in Models of Mll-Rearranged Leukemia." Cancer Cell 36, no. 6 (Dec 9 2019): 660-73.e11. Q1

46. Uckelmann, H. J., S. M. Kim, E. M. Wong, C. Hatton, H. Giovinazzo, J. Y. Gadrey, A. V. Krivtsov, F. G. Rücker, K. Döhner, G. M. McGeehan, R. L. Levine, L. Bullinger, G. S. Vassiliou, and S. A. Armstrong. "Therapeutic Targeting of Preleukemia Cells in a Mouse Model of Npm1 Mutant Acute Myeloid Leukemia." Science 367, no. 6477 (Jan 31 2020): 586-90. Q1

47. Juszczynski P, Rodig SJ, Ouyang J, O'Donnell E, Takeyama K, Mlynarski W, Mycko K, Szczepanski T, Gaworczyk A, Krivtsov A, Faber J, Sinha AU, Rabinovich GA, Armstrong SA, Kutok JL, Shipp MA. MLL-rearranged B lymphoblastic leukemias selectively express the immunoregulatory carbohydrate-binding protein galectin-1. Clin Cancer Res. 2010 Apr 1;16(7):2122-30. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-09-2765. PMID: 20332322; PMCID: PMC2920144. Q1

БЛАГОДАРНОСТИ: Автор выражает глубокую благодарность профессору

Скоту Армстронгу за постоянный интерес к данным исследованиям и их поддержку, за обсуждение результатов представленных в диссертационной" работе, за полезные критические замечания. Автор выражает искреннюю благодарность всем сотрудникам, аспирантам и студентам, работавшим в лабораториях в период с 2004 по 2021 годы, а также всем коллегам, в сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа.