ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТАБОЛИТОВ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ С ЛИГАНДАМИ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, доктор наук Рыскина Елена Анатольевна

• Рыскина Елена Анатольевна
• доктор наук
• 2017

Оглавление диссертации доктор наук Рыскина Елена Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биомолекулярные и взаимодействия между ними

1.2. Групповые антигены системы АВ0 человека, животных и растений

1.3. Белок-лигандные взаимодействия: влияние минорных компонентов

1.4. Стратегия взаимодействия белков с эндогенными и экзогенными малыми и средними молекулами

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Определение группы крови по системе АВ0

2.2.2. Система антиген-антитело АВ0 - модельдля изучения белок-лигандного взаимодействия

2.2.3. Биохимические методы исследования

2.2.4. Компьютерное предсказание биологической активности соединений

2.2.5. Методы визуализации антиген-антительного взаимодействия

2.2.5.1. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

2.2.5.2. Проточная цитофлуориметрия

2.2.6. Статистическая обработка результатов исследований

ГЛАВА 3. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА -МОДУЛЯТОРЫ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

3.1. Влияние пирувата и этанола на антигены А и В эритроцитов крови

3.2. Влияние пирувата и этанола на естественные антитела плазмы

3.3. Влияние пирувата и этанола на моноклональные антитела

3.4. Характер влияния лактата на антигены А и В эритроцитов крови, естественные антитела плазмы и моноклональные антитела

3.5. Влияние этанола на каталитическую активность дегидрогеназ

ГЛАВА 4. ПРОГНОЗИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ПИРУВАТА, ЛАКТАТА, ЭТАНОЛА И АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ А И

В

4.1. Прогнозирование спектра биологической активности пирувата

4.2. Прогнозирование спектра биологической активности лактата

4.3. Прогнозирование спектра биологической активности этанола

4.4. Возможные биологические активности и механизмы действия антигенной детерминанты антигена А

4.5. Возможные биологические активности и механизмы действия антигенной детерминанты антигена В

ГЛАВА 5. ВИЗУАЛИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ МЕТОДАМИ ОПТИЧЕСКОГО БИОИМИДЖИНГА

5.1. Визуализация и количественная оценка антиген-антительного

взаимодействия в условиях действия пирувата и этанола с использованием

конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

5.2. Количественная оценка антиген-антительного взаимодейтсвия в условиях

действия пирувата методом проточной цитофлуориметрии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТАБОЛИТОВ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ С ЛИГАНДАМИ»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Характерной чертой биомедициских исследований начала постгеномной эры стало возникновение и развитие ряда новых научных дисциплин - геномики, транскриптомики, протеомики и метаболомики, использующих в исследованиях системный подход и комплекс соответствующих технологий. Новые научные дисциплины стали важнейшими источниками новых знаний о генах, транскриптомах, белках и метаболитах человека, которые необходимы для развития фундаментальной биологии и медицины, поскольку на основе этих знаний формируются и детализируются представления о молекулярных основах биологических процессов в норме и патологии, а также расширяются диагностические возможности современной медицины. Но независимо от того, каким образом получены данные, они будут обрабатываться, и интерпретироваться с помощью методов биоинформатики, играющей роль цементирующего начала. Компьютерное моделирование белковых структур и межмолекулярных взаимодействий стало неотъемлемой частью многих областей исследования в биомедицине, так как оно позволяет сформировать математически обоснованные предположения о структуре и биологической активности участников биохимических процессов в организме человека.

В настоящее время установлено, что межмолекулярные взаимодействия играют важнейшую роль в реализации жизненно важных функций в клетке, в органе и в организме в целом. Решающими практически во всех основных билогических процессах, таких как: клеточная регуляция, биосинтез и биодеградация, передача сигнала, процессы транскрипции и трансляции,

образование олигомеров и мультимолекулярных комплексов, упаковка вирусов и иммунный ответ, являются белок-лигандные взаимодействия (Чернов Н.Н., 1996; Терентьев А.А. и соавт., 2009; Kastritis P.L. et al., 2012). Полифункциональность белков обусловлена их способностью изменять конформацию молекулы при взаимодействии с лигандами. Белки могут взаимодействовать практически со всеми типами молекул: от небольших соединений - вода, ионы металлов, углеводы, жирные кислоты, фосфолипиды клеточных мембран - до высокомолекулярных белков и нуклеиновых кислот (Chebotareva N.A. и соавт., 2015; Du X. et al., 2016). Нарушение взаимодействий между белками лежит в основе некоторых заболеваний (Muronetz V.I. et al., 2016).

Вследствие революционного прогресса в изучении протеомики в настоящее время сложилось более точное представление о количестве белков, синтезируемых в организме, но явно недостаточны знания о лигандах, с которыми белки могут взаимодействовать. Эндогенные метаболиты составляют большинство молекул в клетке, а многочисленные взаимодействия белок-метаболит являются самыми распространенными (Clements M. et al., 2011). Метаболиты могут выступать не только в качестве субстратов и продуктов ферментативных реакций, но и служить регуляторами сигнальных путей и модуляторами функций, как отдельных молекул, так и биохимических каскадов (Cantelmo A.R. et al., 2015). Малые и средние молекулы метаболитов действуют быстро и связываются обратимо, что позволяет эффективно изменять функции белков (Castoreño A.B. et al., 2011). Актуальность изучения регуляции белок-лигандных взаимодействий обусловлена появлением новых взглядов на роль метаболитов и их ключевым значением в процессах жизнедеятельности.

На сегодняшний день имеющиеся в арсенале науки методы исследования позволяют получить информацию о состоянии базовых метаболических путей в организме. Однако практически отсутствует система данных для выявления индивидуальных молекулярных основ метаболизма, факторах эндогенной природы, определяющих физиологический уровень обмена и специфику

индивидуальной реакции. Важная роль в специфической защите организма, энергетическом, метаболическом обеспечении принадлежит крови и прежде всего эритроцитам, участвующим в поддержании динамического гомеостаза организма (Гильмиярова Ф.Н. и соавт., 2007). Примером структурного и функционального полиморфизма у человека служат антигены эритроцитов системы АВ0. Создание теоретической и экспериментальной базы данных о функциональной специфике антигенов системы АВ0 станет основой для выяснения причин индивидуальной реакции на экзогенные и эндогенные факторы обладателей различных групп крови, что имеет большое значение для дальнейшего развития персонализированной медицины.

Таким образом, представляется актуальным изучение особенностей влияния низкомолекулярных соединений, участвующих в метаболических процессах, таких как пируват, лактат и этанол, на белок-лигандные взаимодействия, что позволит найти новые пути к выяснению механизмов различных превращений, включая иммунологические, в основе которых лежат процессы межмолекулярного узнавания.

Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной программы: «Взаимодействие биологически активных веществ растительного и животного происхождения с системами жизнедеятельности организма с учетом биологической вариабельности метаболизма, ассоциированной с групповой принадлежностью крови» (номер гос. регистрации 0120.0809698).

Степень разработанности темы исследования. Белок-лигандные взаимодействия управляют множеством сигнальных путей в клетке, которые регулируют гомеостаз и отвечают на внешние и внутренние раздражители. В классическом понимании биохимии многие белок-лигандные взаимодействия рассматриваются как реакция между ферментами и субстратами. Последние технологические достижения позволили выявить ранее неизвестные воздействия метаболитов, которые, связываясь неспецифически, могут оказывать влияние на функцию белка. В настоящее время значительные усилия исследователей направлены на изучение свойств малых и средних молекул,

которые связываются с определенными белками, изменяя их функции (Dai F. et al., 2012).

В последнее десятилетие изучение взаимодействий белков с малыми молекулами, в частности метаболитами, запаздывало по сравнению с изучением других типов взаимодействий, таких как белок-белковое, белок-ДНК и белок-РНК (Li X. et al., 2013). Только в 2009 году появились первые публикации о неспецифических взаимодействиях белок-метаболит. Сведения о роли таких эндогенных метаболитов, как пируват, лактат и этанол, участвующих в неспецифических взаимодействиях белок-метаболит и модулирующих функции белков, явно недостаточны.

Цель исследования: изучить влияние низкомолекулярных естественных метаболитов: пирувата, лактата, этанола на белок-лигандные взаимодействия и охарактеризовать их регуляторные возможности.

Задачи исследования:

1. Разработать модельную систему для выявления влияния низкомолекулярных метаболитов (пирувата, лактата, этанола) на межмолекулярные взаимодействия с использованием антигенов и антител системы АВ0 крови.

2. Изучить особенности действия пирувата, лактата и этанола на антиген-антительное взаимодействие в модельных вариантах экспериментов: с антигенами А и В эритроцитов человека A(II), B(III) и AB(IV) групп крови; с естественными анти-А и анти-В антителами плазмы; с анти-А и анти-В моноклональными антителами.

3. Изучить влияние этанола на белок-лигандные взаимодействия ферментов: глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфат-дегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в гемолизате цельной крови и в изолированной среде.

4. Охарактеризовать спектр вероятной биологической активности пирувата, лактата, этанола и антигенных детерминант антигенов А и В системы

АВ0 методом молекулярного моделирования с использованием программы Prediction of Activity Spectra for Substances (PASS).

5. Визуализировать и количественно оценить взаимодействия группоспецифических антигенов с антителами системы АВ0 в условиях действия пирувата и этанола методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

6. Количественно оценить взаимодействие антиген-антитело системы АВ0 в условиях действия пирувата методом проточной цитофлуориметрии.

Научная новизна. Впервые для изучения белок-лигандного взаимодействия в качестве тест-системы использована антиген-антительная система АВ0, а в качестве факторов воздействия - пируват, лактат и этанол. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о модификации взаимодействий антигена с антителом при добавлении пирувата, лактата и этанола, что приводит к регистрируемому изменению степени и скорости агглютинации. Выявлена специфика белок-лигандного взаимодействия, связанная с АВ0-группоспецифическими структурными особенностями.

Для подтверждения регуляторной роли этанола на белок-лигандные взаимодействия были испытаны фермент-субстратные системы дегидрогеназ. Установлено, что активность глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы как в гемолизате цельной крови, так и в изолированной среде повышалась под влиянием этанола.

Впервые предсказаны многопрофильные биологические активности и оценен резерв метаболических свойств пирувата, лактата и этанола, а также антигенных детерминант антигенов А и В системы АВ0 с использованием новых технологий компьютерного моделирования. Экспериментально оценить биологическую активность антигенных детерминант антигенов А и В невозможно технически, реальная возможность появилась с разработкой новых технологий компьютерного моделирования. Благодаря многообразию спрогнозированных биологических эффектов, антигены системы АВ0

открываются с новой перспективной стороны как биологически активные соединения, а не только как группоспецифические антигены, обеспечивающие защиту клеток крови.

Впервые использован новый подход для визуализации межмолекулярного взаимодействия антиген-антитело в условиях влияния биологически активных соединений эндогенного происхождения. С целью количественной оценки результатов взаимодействия антигенов и антител при введении малых молекул в систему впервые использованы методы конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитофлуориметрии.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные новые экспериментальные данные свидетельствуют о характере влияния метаболитов, в частности пирувата, лактата и этанола, на процессы межмолекулярного взаимодействия. Доказана информативность использования антиген-антительной системы АВ0 и дегидрогеназной фермент-субстратной системы для количественной оценки белок-лигандного взаимодействия, а также влияния на эти процессы биогенных веществ. Исследуемые низкомолекулярные компоненты метаболизма способны взаимодействовать с различными белками: антигенами, антителами, каталитическими белками, изменяя их функциональную активность, что может быть использовано для поиска путей коррекции нарушений метаболизма при различных заболеваниях.

Проведенные эксперименты in vitro, исследования in silico служат основанием для заключения о регуляторном потенциале низкомолекулярных метаболитов, способных создавать новые особенности антиген-антительных и метаболических процессов.

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры биохимии им. академика Березова Т.Т. Медицинского института РУДН, кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государственного медицинского университета, кафедры биохимии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского, кафедры биологической химии с курсом медицинской,

фармацевтической и токсикологической химии Красноярского государственного медицинского университета им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого, кафедры биохимии Казанского государственного медицинского университета и используются в практической работе клинико-диагностической лаборатории Клиник Самарского государственного медицинского университета.

Методология диссертационного исследования. Диссертационная работа носит экспериментальный характер. Использованы биохимические, иммунологические, высокотехнологичные методы исследования -конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и проточная цитофлуориметрия, компьютерные методы исследования и статистические методы обработки данных. Работа включала несколько этапов:

- анализ функционирования модели антиген-антитело системы АВ0 крови под влиянием низкомолекулярных метаболитов;

- оценка функционирования фермент-субстратной системы при зондировании малыми молекулами (метаболитами) в естественном тканевом микроокружении и в изолированном гомогенном состоянии;

- изучение спектра биологической активности пирувата, лактата, этанола и антигенных детерминант системы АВ0, предсказанного методом молекулярного моделирования;

- визуализация антиген-антительного взаимодействия и количественная оценка влияния низкомолекулярных метаболитов на взаимодействие антиген-антитело системы АВ0 методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитофлуориметрии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 . Для изучения белок-лигандного взаимодействия разработана новая модельная система, представленная антигенами и антителами системы АВ0. Показано влияние пирувата, лактата и этанола на антиген-антительное

взаимодействие и специфика межмолекулярного узнавания группоспецифическими антигенами антител системы АВ0 крови.

2. Продемонстрировано влияние этанола на белок-лигандные взаимодействия дегидрогеназ: глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в гемолизате цельной крови и в изолированной среде.

3. Выявлен широкий спектр биологической активности пирувата, лактата, этанола и детерминант антигенов А и В системы АВ0 крови методом компьютерного моделирования.

4. Установлена возможность использования конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитофлуориметрии для визуализации и количественной оценки межмолекулярных взаимодействий в условиях влияния биологически активных веществ эндогенного происхождения.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора. Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций основываются на достаточном числе наблюдений и адекватной статистической обработке результатов с помощью пакета компьютерных программ Statistical Package for the Social Science SPSS 10.0.

Результаты исследований были представлены на Российской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009); на II Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); XVI Международной научной конференции «Здоровье семьи в XXI веке» (Будапешт, 2012); Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Казань, 2012, 2014); 7th International Food Factory for the Future Conference (Sweden, 2014); Всероссийской научной конференции «Медицинская лабораторная диагностика: будущее и новации» (Санкт-Петербург, 2014); Российской

научно-практической конференции «Медицинская биохимия: достижения и перспективы» (Казань, 2015); XXI Всероссийской научно-практической конференции «Качество лабораторных исследований - условие безопасности пациентов» (Москва, 2016), BIT's 8th Annual International Congress of Antibodies (КНР, Далянь, 2016); V Съезде биохимиков России (Сочи, 2016).

Диссертационная работа прошла апробацию на кафедре биохимии им. академика Т.Т. Березова Медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» и на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет».

По материалам диссертационной работы опубликовано 40 печатных работ, в том числе 17 статей, входящих в перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК РФ. Получены патент и 2 свидетельства о государственной регистрации программы для ЭВМ.

Личный вклад автора в получение научных результатов, изложенных в диссертации, состоял в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщения данных литературы по теме диссертационной работы, формулировке цели и задач, а также проведении экспериментов in vitro и in silico по оценке влияния пирувата, лактата и этанола на белок-лигандные взаимодействия. Участие автора в сборе первичного материала и его обработке - более 80%, обобщении, анализе и внедрении в практику результатов работы -100%. Самостоятельно проведена статистическая обработка результатов, написан текст диссертации, сформулированы выводы и практические рекомендации.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биомолекулы и взаимодействия между ними

Миллионы различных молекул участвуют в составлении сложной внутренней структуры клетки, органа и организма в целом. Каждая молекула содержит характерный набор химических элементов, имеет определенную структуру и способна к избирательному и специфическому связыванию с другими молекулами. Многие биологические молекулы представляют собой макромолекулы, т.е. полимеры с молекулярной массой больше 5000. В цитоплазме каждой клетки растворены тысячи различных малых и средних органических молекул, которые имеют молекулярную массу от 50 до 500. Все эти молекулы растворимы в воде, присутствуют в микроколичествах, полярны или заряжены. Единый набор малых молекул в клетках живых организмов является проявлением универсальности и эволюционного консерватизма метаболических процессов.

Во всех классах полимеров имеется сходная структурная иерархия: макромолекулы образуются из мономерных звеньев определенного строения с помощью разных химических связей. Макромолекулы имеют возможность создавать надмолекулярные комплексы и органеллы, которые осуществляют метаболические процессы в клетках (Putnam C.D. et al., 2007). Трехмерная структура биологических молекул - структура с учетом конфигурации и конформации, поддерживается многочисленными нековалентными взаимодействиями. Конфигурация молекул может изменяться с разрывом химической связи, а конформация трансформируется путем вращения атомов вокруг химических связей, без их разрыва (Vollhardt К.Р. et al., 2002). Нековалентные взаимодействия играют важнейшую роль в расположении и свойствах липидов в мембранах, в проявлении активности ферментов, во взаимодействии азотистых оснований в составе нуклеиновых кислот. Основные типы нековалентных взаимодействий имеют первостепенное значение в биологических взаимодействиях между антигеном и антителом, субстратом и

ферментом, гормоном и рецептором. Например, в связывании фермента с субстратом могут быть задействованы гидрофобные, ионные, водородные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия (ОДе^ C.I. et al., 2012). Данные взаимодействия являются слабыми, они постоянно появляются и разрушаются, но общий эффект от действия этих сил может быть огромным. Образование слабых связей между ферментом и субстратом понижает энергию активации и запускает ферментативную реакцию. Пространственное соответствие структур участков двух реагирующих биомолекул (комплементарность) означает возможность взаимодействий между заряженными, гидрофобными или полярными группами на их поверхности (Jencks W.P., 1987; Fersht A. 1999; Frey P.A., 2002). Связывание антигенов и специфических к ним антител зависит от суммарного эффекта множества слабых взаимодействий (Gutteridge A. et al., 2005).

Функции многих биомолекул часто связаны с избирательными взаимодействиями с другими компонентами, которые регулируются тонкими изменениями конформации. Большая часть взаимодействий быстротечна, тем не менее, они являются основой сложных биохимических процессов, таких как перенос кислорода, сокращение мышц, иммунные реакции (Xing Q. et al., 2014). Например, в функционировании белков важную роль играет обратимое соединение с лигандом. Лигандом могут быть любые молекулы - липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, какие-либо другие органические соединения или макроэлементы. Связывание белка с лигандом часто сопровождается такими конформационными изменениями в молекуле белка, которые повышают совместимость и способствуют более прочному связыванию этих молекул (Koshland D.E. et al.,1996).

Самой сложной и координированной системой взаимодействия между разными классами молекул является иммунная система. Обратимое связывание отдельных белков и лигандов при формировании иммунного ответа служит примером того, как строится специфическая, очень чувствительная биохимическая система (Cooper M.D. et al., 2006). Главным элементом

иммунитета являются растворимые белки - иммуноглобулины (антитела). Иммуноглобулины соединяются с вирусами, бактериями и разными чужеродными молекулами, которые должны быть уничтожены. В организме человека производится 100 миллионов различных антител, каждое их которых специфическим образом связывает молекулы с определенной химической структурой (Мейл Д. и соавт., 2007). Такое огромное разнообразие делает возможным узнавание и связывание любой чужеродной клетки, т.е. антигена. Сложный антиген может взаимодействовать сразу с несколькими антителами. Антитело связывает антиген в конкретном месте с определенной молекулярной структурой, которая называется антигенной детерминантой, или эпитопом. Иммунная система, как правило, слабо реагирует на молекулы с молекулярной массой меньше 500, которые могут быть конечными или промежуточными продуктами клеточного метаболизма (Davies D.R. et al., 1990, 1993).

Все антитела делятся на 5 классов - IgG, Ig M, Ig A, Ig D и Ig E. Структура иммуноглобулинов была определена Д. Эдельманом и Р. Портером. IgG - это основной класс иммуноглобулинов: в сыворотке крови на IgG приходится значительная часть от общего белка. Эти антитела построены из четырех полипептидных цепей - двух больших, называемых тяжелыми цепями, и двух легких цепей, которые связаны между собой нековалентными связями и дисульфидными мостиками в крупный комплекс. На N-конце тяжелой и легкой цепей имеется вариабельная область размером более 100 аминокислотных остатков, которая формирует антигенную детерминанту, непосредственно связывающую антиген. Остальная часть иммуноглобулина G называется константной, так как не зависит от вида иммуноглобулина (Irani V. et al., 2015). Иммунный комплекс, который образуется при связывании IgG с антигеном, может стимулировать макрофаги - клетки, способные разрушать патогенные бактерии и активировать другие элементы иммунного ответа (Nardin A. et al., 1999).

Антигенсвязывающий участок иммуноглобулинов характеризуется большой изменчивостью, т.е. является гипервариабельным. Высокая

специфичность взаимодействия определяется химической комплементарностью антигена к центру его связывания на молекуле антитела, а именно формой молекулы, наличием и расположением заряженных, неполярных и образующих водородные связи групп. Так, если участок связывания имеет отрицательно заряженную группу, то он может связывать антиген с положительным зарядом в определенной позиции. В некоторых случаях, в результате взаимного влияния центра связывания антитела и антигена по мере их сближения и достигается их комплементарность (Kihdt T.J. et al., 2006). Конформационные изменения, возникающие при этом в молекулах антитела и антигена, позволяют соответствующим группам связываться между собой. На примере взаимодействия между пептидом ВИЧ и IgG хорошо заметны конформационные изменения, приводящие к индуцированному соответствию между антигеном и антителом (рис. 1).

Конформация без Конформация при Связывание антигена

связанного антигена связывании антигена (сам антиген не показан)

Рисунок 1. Индуцированное соответствие при связывании антигена с IgG. Изображена поверхность фрагмента IgG, с ним связывается пептид вируса иммунодефицита человека. Два остатка тяжелой цепи IgG выделены синим цветом, а один остаток легкой цепи - красным (Davies D.R. et al., 1990)

Наглядным примером биологического взаимодействия служит связывание антигенов групп крови с антителами. Антигены системы АВ0 по биохимической структуре представляют собой гликопротеины, углеводная часть которых представлена олигосахаридными цепями, состоящими из L-фукозы, D-галактозы и D-N-ацетилгалактозамина (Оловникова Н.И. и соавт.,

2001; Льюис С.М. и соавт., 2009). Минимальные антигенные детерминанты могут состоять из ди- и трисахаридов. Естественные анти-А- и анти-В-антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса М, а антитела, выработанные в процессе иммунизации, называются иммунными и относятся к иммуноглобулинам класса G (Sant'Anna Gomes B.M. et al., 2010; Wahrmann M. et al., 2012). При взаимодействии антигена А или антигена В системы АВ0 с антителом образуются иммунные комплексы, в которых соединение антигенной детерминанты с участком связывания иммуноглобулина обеспечивают различные нековалентные связи (Attanasio P. et al., 2007; Arend P., 2011; Sundlov J.A. et al., 2012). Антигенные детерминанты, содержащие группы с сильным положительным или отрицательным зарядом, наиболее прочно соединяются с иммуноглобулинами. С помощью метода спектрополяриметрии выявлено, что при антиген-антительном взаимодействии оба соединения оказывают взаимное влияние на конформацию молекул (Tormey C.A. et al. 2009; Соколова Ю.В. и соавт., 2010; Obukhova P. et al., 2011).

Ферменты, как известно - главные участники любых биохимических процессов, таких как расщепление питательных веществ, получение энергии, синтез и распад биомолекул. Отличительной особенностью всех ферментативных реакций является то, что они происходят в активном центре фермента. Образование комплекса «фермент-субстрат» - важная точка в представлениях о механизме и кинетике катализа и ключевой этап ферментативного превращения (Hammes-Schiffer S., 2006). Слабые взаимодействия, возникающие между ферментом и субстратом, наиболее удобны для протекания ферментативной реакции, т.к. активный центр фермента комплементарен не самому субстрату, а тем переходным химическим состояниям, которые имеет субстрат в процессе своего превращения в продукт (Schramm V.L., 1998). Молекула фермента содержит функциональные группы, обеспечивающие ионные, водородные, ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Необходимость во множестве слабых взаимодействий объясняет большие размеры белкового катализатора (Frey P.A. et al., 2007).

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Рыскина Елена Анатольевна, 2017 год

р - - - -

Показано, что после инкубации с пируватом время начала агглютинации эритроцитов А(П) и В(Ш) групп крови увеличилось на 16,6%. Однонаправленный характер сдвига демонстрируют антигены А и В, образующие АВ(1У) группу крови, время начала агглютинации увеличилось на 25% по сравнению с контрольными значениями. Хотелось бы отметить, что эритроциты ЛВ(1У) группы крови реагировали на действие пирувата более значительным увеличением времени начала агглютинации, чем эритроциты Л(П) и В(Ш) групп крови. Таким образом, реакция агглютинации группоспецифических антигенов эритроцитов Л(П), В(Ш) и ЛВ(1У) групп крови с антителами под действием пирувата протекала медленнее, чем в контрольных образцах.

Установлено, что время начала агглютинации уменьшилось как с алкоголизированным антигеном А А(П) группы крови, так и с алкоголизированным антигеном В В(Ш) группы крови. Этанол не влиял на время начала агглютинации эритроцитов АВ(1У) группы крови.

Полученные результаты свидетельствуют о разнонаправленном действии пирувата и этанола на время начала агглютинации группоспецифических антигенов эритроцитов с антителами (рис. 19).

Антиген А А(11) Антиген В В(111) Антиген А АВ(!У) Антиген В АВ(!У)

Рисунок 19. Действие пирувата и этанола на время начала агглютинации группоспецифических антигенов эритроцитов А(11), В(Ш) и ДВ(1У) групп крови с антителами

Под влиянием пирувата увеличилось время начала агглютинации эритроцитами А(11), В(Ш) и АВ(1У) групп крови. Противоположный эффект наблюдается под действием этанола, время начала агглютинации эритроцитов А(11) и В(Ш) групп крови уменьшилось. С чем связано выявленное нами разнонаправленное действие метаболитов? Можно предположить, что пируват взаимодействует с ионогенными группами антигенных детерминант, что ведет к замедлению узнавания антиген-антитело. Химические свойства пирувата обусловлены наличием в его составе карбоксильной группы, определяющей

кислые свойства и отрицательный заряд молекулы. Характерной особенностью этанола является то, что имеющаяся в его составе гидроксильная группа в некоторых реакциях может замещаться или отщепляться. Молекула этанола имеет иные химические свойства, и она не заряжена. В норме эритроциты несут отрицательный заряд и отталкиваются друг от друга, вероятно, инкубация эритроцитов с отрицательно заряженным пируватом воздействует на характер взаимодействия антиген-антитело более значительно, чем полярный этанол. Обращает на себя внимание тот факт, что пируват наибольшее влияние оказывает на время начала агглютинации эритроцитов АВ(1У) группы крови, на поверхности которых присутствуют оба антигена - А и В, а этанол максимально воздействует на время начала агглютинации эритроцитов А(П) и В(Ш) групп крови с одним антигеном А или В на поверхности мембраны.

Изменение показателей агглютинации эритроцитов под влиянием исследуемых соединений, возможно, связано с конформационной модификацией антигенов в связи с изменившимся микроокружением, что может и определять их реакционную способность. Хочется отметить, что антигены А и В имеют разные эпитопы, и их связывание с паратопом антител будет несколько отличаться (Согеапа F. et а1., 2002, Лgostino М. et а1. 2010).

В литературе встречаются данные о влиянии различных соединений на антиген-антительное взаимодействие. При изучении влияния адреналина на время начала агглютинации эритроцитов выявлено уменьшение данного показателя агглютинации эритроцитов у людей со Л(11), В(Ш) и ЛВ(1У) группами крови (Циркин В.И. и соавт., 2008). В исследованиях А.И. Володченко установлено, что адреналин способен изменять время начала агглютинации эритроцитов женщин, как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения, в зависимости от гормонального фона исследуемых (Володченко А.И. и соавт., 2013). В исследованиях О.М. Безмельцевой показано, что окситоцинореактивность эритроцитов человека, определяемая по изменению времени начала агглютинации эритроцитов, зависит от пола и дозы воздействия и предположительно связана с эффективностью активации окситоциновых

рецепторов миометрия и других клеток, являющихся мишенью для окситоцина (Безмельцева О.М. и соавт., 2014). Способность ацетилхолина уменьшать время начала агглютинации эритроцитов связана с активацией М-холинорецепторов и объясняется уменьшением поверхностного отрицательного заряда вследствие повышения выхода К+ из эритроцитов и роста микровязкости их мембран (Циркин В.И. и соавт., 2013). Агглютинация эритроцитов, как известно, представляет собой склеивание антигеннесущих эритроцитов с помощью специфических антител, относящихся к классам ^М и IgG. Она заканчивается образованием хлопьев, или осадка - агглютината. Время начала агглютинации преимущественно зависит от величины отрицательного заряда поверхности эритроцитов: при его снижении время начала агглютинации уменьшается, так как уменьшается действие сил, способствующих отталкиванию эритроцитов друг от друга, и увеличивается вероятность их взаимодействия (Жибурт Е.Б., 2002; Шамратова В.Г., 2002).

В настоящее время установлено, что специфичность групповых веществ зависит от находящихся на периферии молекул олигосахаридных цепей, которые являются иммунологическими детерминантами, чья индивидуальность определяется химическим составом, типом гликозидных связей и остатками, находящимися в ближайшем окружении (Делевский Ю.П., 2008а). В литературе встречаются сведения об обнаружении изоэлектрических различий у А- и В-гликоконъюгатов, связанных как с липидами, так и с белками эритроцитарных мембран. Появились основания предполагать, что изменение заряда гликопротеинов или гликолипидов, вопреки ранее высказанному мнению об отсутствии заряженных групп у антигенов, представляющих группоспецифические вещества, является одним из весомых факторов в изменении агглютининлабильности эритроцитов (Делевский Ю.П., 2008б).

Оценка результатов проведенного нами исследования позволила прийти к заключению, что пируват и этанол могут модифицировать молекулу антигена, тем самым оказывая значительное влияние на процесс узнавания и взаимодействие антигена с антителом системы АВ0 крови.

3.2. Влияние пирувата и этанола на антитела плазмы крови

Анти-А и анти-В антитела относятся к естественным антителам, принадлежат к классу иммуноглобулинов М или G, образуются в организме без введения антигенов. Иммуноглобулины M представляет собой один из основных классов иммуноглобулинов в организме, являются первой линией защиты от вирусов и грамотрицательных бактерий, участвуют в активации комплемента и реакции агглютинации группоспецифических антигенов эритроцитов, усиливают фагоцитоз и способны облегчать удаление апоптотических клеток (Ehrenstein M.R. et al., 2010). Молекулярная масса мономерного иммуноглобулина составляет 190 кДа, он имеет гликопротеиновую структуру Y-образной формы и два сайта связывания с антигенами. Содержит 10-12% углеводов. Мономеры объединены в единую пентамерную молекулу дисульфидными связями и J-цепью. Пентамер имеет 10 активных центров связывания антигена, благодаря чему образуется агглютинат эритроцитов (Boes М. et al., 1998). Мономер любого класса иммуноглобулина состоит из 2 тяжелых (Н) и 2 легких (L) цепей, концевые участки которых достаточно вариабельны. Вариабельные домены тяжелых и легких цепей образуют антигенсвязывающий сайт, а константные - эффекторный (Perkins S.J. et al., 1991; Климович В.Б., 2011).

Иммуноглобулины M, циркулирующие в крови, обладают повышенной авидностью, т.е. с высокой степенью прочности связывают антиген и антитело (Kaveri S.V. et al., 2012). Разнообразие сочетаний антигенраспознающих сайтов обеспечивает иммуноглобулинам широкий спектр видов и, соответственно, широкий диапазон действия. Взаимодействие антиген-антитело обеспечивается комплементарностью антигенсвязывающего центра антитела - паратопа с антигенной детерминантой - эпитопом. Эти конкретные сайты связывания принято называть сайты или интерфейсы эпитоп-паратоп взаимодействия (Nisius В. et a!., 2012) (рис. 20).

HOOG COQH

Рисунок 20. Схема строения антитела, где CH1, CH2, CH3 - константные домены тяжелой цепи, CL - константный домен легкой цепи, VH -ариабельный домен тяжелой цепи, VL - вариабельный домен легкой цепи (Perkins S.J. et al., 1991)

В образовании эпитоп-паратоп интерфейса участвует множество нековалентных связей, образующихся между отдельными аминокислотными остатками гипервариабельных участков паратопа с эпитопом антигена, а именно: водородные связи, гидрофобные взаимодействия, ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Эти взаимодействия весьма слабы, но при большом их количестве суммарная энергия связывания получается немалой. Специфичность реакции антиген-антитело определяется действием именно этих сил (Weidenhaupt М. et al., 2002).

В вычислительных исследованиях N. Sinha показано, что связывание антигена с антителом обусловлено электростатической оптимизацией антигенсвязывающего сайта, что приводит к более высокой специфичности антител, а гидрофобные взаимодействия способствуют конформационной гибкости и реактивности иммуноглобулинов (Sinha N. et al., 2002). Последующие работы с использованием метода молекулярной динамики также подтвердили важность электростатических сил в ассоциации антиген-антитело (Mohan S. et al., 2003; Sinha N. et al., 2007). Антитела узнают, конечно, не

только отдельные химические группы, но и пространственную конфигурацию антигенных детерминант. Так, при изучении взаимодействия между лизоцимом и антилизоцимными антителами было показано, что поверхности эпитопа и паратопа комплементарны и за пределами антигенсвязывающих сайтов, а также были обнаружены молекулы воды в области интерфейса, образующие водородные связи между антителом и антигеном (Davies D.R. et al., 1996).

Показано, что одна или несколько мутаций в генах, отражающиеся на химической структуре сайтов связывания, часто приводит к большим изменениям аффинности антител (Smith D.J. et al., 2004; Tharakaraman K. et al., 2013). Это может соответствовать двум интересным явлениям в антиген-антительном взаимодействии, а именно - антигены могут изменять состав аминокислот, чтобы произвести новый эпитоп путем постоянного «антигенного дрейфа», и антитела могут распознать миллионы различных антигенов через незначительные изменения аминокислот в области паратопа (Sun J. et al., 2011; Corti D. et al., 2013). Поэтому, чем точнее характеристика интерфейса антиген-антительного взаимодействия, а также влияния окружающей среды на это взаимодействие, тем понятнее будет механизм ассоциации между этими биологическими макромолекулами.

Нами было проведено исследование влияния пирувата и этанола на естественные антитела крови с целью проверки их способности связываться с группоспецифическими антигенами А и В, что отображается в реакции гемагглютинации. В ходе проведенного исследования мы определяли степень агглютинации. Постановка эксперимента заключалась в предварительной инкубации с пируватом или этанолом (раздельно) цельной крови, дальнейшее ее разделение методом центрифугирования на плазму и форменные элементы и постановку реакции агглютинации с плазменными антителами.

Процесс агглютинации изменяется: при взаимодействии с неинкубированными анти-А и анти-В антителами степень агглютинации эритроцитов была ниже максимальной величины - 12 pt, которая наблюдалась в

ранее поставленных опытах с группоспецифическими антителами эритроцитов (табл. 16).

Таблица 16. Влияние пирувата на степень агглютинации анти-А и анти-В антител плазмы крови с антигенами системы АВ0 (р^

Статистический показатель (п=30) Контроль Анти-А Анти-А Контроль Анти-В Анти-В

М±SD 10,0±0,32 10,0±0,33 8,0±0,30 10,0±0,26

Ме 10 10 8 10

Д% - - - +25

р - р<0,01

Полученные результаты показывают, что анти-А и анти-В антитела по-разному реагируют на воздействие пирувата. Степень агглютинации анти-А антител со стандартными эритроцитами не отличалась от степени агглютинации в контроле, а степень агглютинации анти-В антител увеличилась на 25%. Таким образом, анти-А антитела индифферентны к действию пирувата, а анти-В антитела отвечают на воздействие пирувата.

Выявлено повышение степени агглютинации анти-А и анти-В антител плазмы крови с эритроцитами под влиянием этанола (табл. 17).

Степень агглютинации анти-А иммуноглобулинов увеличилась на 20%, а анти-В иммуноглобулинов на 25%. Выявлено, что анти-А антитела отвечают только на воздействие этанола, а анти-В антитела подвержены влиянию обоих метаболитов.

Полученные результаты исследования показывают, что пируват и этанол прямо или опосредованно вызывают такую модификацию конформации молекул иммуноглобулинов, что сродство антиген-антитело увеличивается.

Таблица 17. Влияние этанола на степень агглютинации анти-А и анти-В антител плазмы крови с эритроцитами (р^

Статистический показатель (n=30) Контроль Анти-А антитела Анти-А антитела Контроль Анти-В антитела Анти-В антитела

M±SD 10±0,33 12,0±0,30 8,0±0,34 10±0,31

Me 10 12 8 10

Д% - +20 - +25

р р<0,01 р<0,01

Возможно, исследуемые низкомолекулярные метаболиты влияют непосредственно на антигенсвязывающие сайты паратопа антител, что приводит к более высокой специфичности взаимодействия, или оптимизируют условия связывания антител с антигенами, влияя на окружение данных молекул. Полученные нами данные позволяют дополнить представление о белок-лигандных взаимодействиях в определенных условиях, прямо или опосредованно влияющих на эти взаимодействия.

3.3. Влияние пирувата и этанола на моноклональные антитела

Получение искусственных человеческих антител стало возможным после клонирования генов иммуноглобулинов и разработки метода гибридом. Гибридомная технология, или методология получения моноклональных антител впервые была описана в 1975 году G. Kohler и C. Milstein. Они применили оригинальный подход, создав гибрид нормальной антителообразующей клетки и опухолевой - гибридому. Гибридома получала от нормальной клетки способность к производству антител, а от опухолевой клетки - способность к неограниченному количеству делений. Моноклональные антитела являются продуктами секреции одной антителообразующей клетки, представлены

идентичными молекулами иммуноглобулинов, как правило, иммуноглобулинами М или G, и могут быть выработаны против любого природного антигена, который будет специфически связывать антитело. Благодаря уникальным свойствам моноклональных антител - высокой специфичности и прочности взаимодействия с определенной антигенной детерминантой - их активно используют в научных исследованиях и медицинской диагностике (Альтшулер Е.П. и соавт., 2010). С их помощью изучают структуру и функции ранее открытых молекул, а также выявляют новые антигенные компоненты клеток и тканей (Barclay A.N. et al., 1993). Диагностические моноклональные антитела против антигенов эритроцитов широко применяют для определения групп крови, что сделало типирование крови более простым и надежным (Митерев Г.Ю. и соавт., 2008). Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы: специфическая фаза, в которой происходит комплементарное соединение паратопов антител и эпитопов антигена, и неспецифическая фаза, характеризующаяся внешними признаками образования иммунных комплексов или агглютинатов (рис. 21).

Схема взаимодействия антигена с антителами Специфическая фаза Неспецифическая фаза

% ^антиген; Y & -антитела

Рисунок 21. Схема взаимодействия антигена с антителами (Хаитов Р.М.,

В норме организм вырабатывает антитела против тех антигенов, которых нет на эритроцитах. Так как одноименные антитела и антигены вступают друг с другом в реакцию, что приводит к склеиванию эритроцитов, они не могут содержаться в крови одного человека. Поэтому плазма крови людей с группой крови А имеет анти-В антитела, плазма крови группы В содержит анти-А антитела, а в случае с кровью группы АВ плазма не содержит никаких антител. В следующей серии экспериментов нам было важно исследовать действие метаболитов на анти-А и анти-В моноклональные антитела. Мы использовали моноклональные антитела, продуцируемые мышиными гибридомами и принадлежашие к классу иммуноглобулинов М. Основные показатели -степень и время наступления агглютинации - остались прежними.

Проведенные исследования показывают, что степень агглютинации моноклональных анти-А и анти-В антител с эритроцитами А(П), В(Ш) и АВ(1У) групп крови под действием пирувата и этанола не изменялась и была равна 12 р^ как в контрольных образцах. Клеточный осадок образовывал один комок и был виден макроскопически.

В отличие от степени агглютинации эритроцитов, время начала агглютинации эритроцитов с моноклональными анти-А и анти-В антителами под влиянием исследуемых низкомолекулярных метаболитов подвергалось колебаниям. Характер изменения времени начала агглютинации антиген-антитело под действием пирувата представлен в табл. 18.

Под действием пирувата моноклональные анти-А антитела вступили во взаимодействие с эритроцитами быстрее на одну секунду, что проявлялось в уменьшении времени начала реакции антиген-антитело на 16,6%. Для анти-В антител также характерно ускорение агглютинации с эритроцитами по сравнению с контрольным временем. Противоположный эффект вызывает инкубация с пируватом моноклональных анти-А и анти-В антител, вступающих в реакцию агглютинации с эритроцитами АВ(1У) группы, время наступления агглютинации эритроцитов увеличилось на 16,6%.

Таблица 18. Влияние пирувата на время начала агглютинации моноклональных антител с эритроцитами А(П), В(Ш) и ЛВ(1У) групп крови (с)

Статистический показатель (п=30) Контроль анти-А антитела Анти-А антитела Контроль анти-В антитела Анти-В антитела

М±SD 6,0±0,02 5,0±0,04 6,0±0,05 5,0±0,04

Ме 6 5 6 5

Д% - -16,6 - -16,6

р р<0,01 р<0,01

Статистический показатель (п=30) Контроль анти-А антитела ЛВ(1У) Анти-А антитела ЛВ(1У) Контроль анти-В антитела ЛВ(1У) Анти-В антитела ЛВ(1У)

М±SD 6,0±0,02 7,0±0,04 6,0±0,03 7,0±0,05

Ме 6 7,1 6 6,5

Д% - +16,6 - +16,6

р р<0,01 р<0,01

Хотелось бы отметить, что пируват по-разному влияет на время начала агглютинации моноклональных антител с эритроцитами А(П), В(Ш) и ЛВ(1У) групп крови. Эритроциты, имеющие на своей мембране только один вид антигенов - А или В, быстрее образовывали агглютинаты с анти-А и анти-В моноклональными антителами, проинкубированными с пируватом, а эритроциты ЛВ(1У) группы крови, несущие оба антигена, медленнее образовывали комплексы антиген-моноклональное антитело.

Далее было изучено влияние этанола на время начала агглютинации моноклональных антител с эритроцитами трех групп крови (табл. 19).

Таблица 19. Влияние этанола на время начала агглютинации моноклональных антител с эритроцитами А(П), В(Ш) и АВ(1У) групп крови (с)

Статистич. показатель (п=30) Контроль анти-А антитела Анти-А антитела Контроль анти-В антитела Анти-В антитела

М±SD 6,0±0,03 5,0±0,04 6,0±0,03 5,0±0,04

Ме 6 5 6 5

Д% - -16,6 - -16,6

р р<0,01 р<0,01

Статистич. показатель (п=30) Контроль анти-А АВ(1У) Анти-А АВ(1У) Контроль Анти-В АВ(1У)

М±SD 6,0±0,03 7,0±0,05 6,0±0,04 6,0±0,04

Ме 6 7 6 6

Д% - +16,6 - -

р р<0,01 -

Предварительная инкубация с этанолом анти-А и анти-В моноклональных антител способствует более быстрой агглютинации с эритроцитами А(П) и В(Ш) групп крови, время наступления агглютинации уменьшилось на 16,6%. Агглютинация анти-А моноклональных антител с эритроцитами АВ(1У) группы крови под влиянием этанола наступала медленнее по сравнению с контрольным временем. Инкубация с этанолом моноклональных анти-В антител не оказывала влияния на антиген-антительное взаимодействие эритроцитов АВ(1У) группы крови.

Установлено, что моноклональные антитела служат объектом прямого или опосредованного действия обоих низкомолекулярных метаболитов. Нами выявлена отчетливая тенденция, а именно: время наступления агглютинации анти-А и анти-В моноклональных антител с эритроцитами А(П) и В(Ш) групп крови уменьшилось под влиянием пирувата и этанола (рис. 22).

□ Контроль

Пируват

□ Этанол

х

П!

Ч

X

S?

J П! X S I-2 с;

П!

с;

П! Т П! X

К

s

<11

ей

^<0,05

5 4 3 2 1 0

■

*

*

■_ . » I

■

♦ *

à

: -V Л

г Л" Л

: -V Л

4 "Л". . ■■ ■

■

№ m

6 I " "

щ m

Анти-А антитела

Анти-В антитела

Анти-А антитела АВ(Ш)

Анти-В антитела АБ(!У)

8

7

6

6

6

6

6

Рисунок 22. Влияние пирувата и этанола на время начала агглютинации моноклональных антител с эритроцитами разных групп крови

Противоположный эффект наблюдается при действии метаболитов на процесс агглютинации анти-А моноклональных антител с эритроцитами AB(IV) группы крови - время начала агглютинации эритроцитов увеличилось. Анти-В антитела остаются индифферентными к присутствию этанола в среде и время начала агглютинации с эритроцитами AB(IV) группы крови не изменилось.

В результате проведенной серии экспериментов нами установлено, что инкубация с пируватом и этанолом (раздельно) анти-А и анти-В моноклональных антител не изменяет степень агглютинации эритроцитов A(II), В(Ш) и АВ(^) групп крови. Вероятно, система крови, состоящая из большого числа высоко- и низкомолекулярных соединений, обладающих различными физико-химическими свойствами, сглаживает влияние пирувата и этанола, поэтому при оценке степени агглютинации изменений не выявлено. Воздействие метаболитов на анти-А и анти-В моноклональные антитела облегчает узнавание и связывание антител с эритроцитами А(П) и В(Ш) групп крови (время начала агглютинации уменьшается), и противоположная тенденция имеет место в отношении анти-А моноклональных антител, которые

вступают в реакцию агглютинации с эритроцитами AB(IV) группы крови медленнее. Сочетание двух антигенных детерминант в AB(IV) группе крови затрудняет узнавание и взаимодействие антиген-антитело. Доказано, что пируват и этанол могут регулировать взаимодействия моноклональных антител с группоспецифическими антигенами эритроцитов.

Актуальность изучения механизмов взаимодействия антиген-антитело обусловливает значимость исследования структуры, свойств и стереохимии иммунных комплексов. В исследованиях M. Oda показано, что иммобилизованная на матрицу сенсорного чипа концевая часть молекулы иммуноглобулина (Fc) может связывать только один антиген, тогда как в свободном состоянии антитело с высоким сродством связывает два антигена (Oda M. et al., 2009). Предполагается, что была изменена стереохимия антиген-антительного взаимодействия путем ограничения передвижения области Fc иммуноглобулина. Позднее, методом рентгеновской кристаллографии подтверждено, что стерические затруднения присоединения к антителу второй молекулы антигена вызваны связыванием первой молекулы антигена (Giménez-Romero M.A. et al., 2012). В другом исследовании установлено, что анти-M моноклональные антитела имеют специфичный пептидный паратоп, в котором метионин в 8-м положении и валин в 6-м положении играют ключевую роль в образовании иммунных комплексов. Гликозилирование ключевых аминокислотных остатков и аминокислотных остатков, примыкающих к наиболее специфической части паратопа анти-M антитела, модулирует структуру паратопа и изменяет свойства аминокислотных остатков, присутствующих в антигенсвязывающем сайте, и, как следствие, изменяется специфичность анти-M моноклональных антител (Jaskiewicz E. et al., 1994). В работах M. Duk показано, что распознавание антителами антигенов AB0 зависит от O- или N-гликозилирования сайтов связывания антигенов (Duk M. et al., 1997).

В настоящее время представление о том, что комплементарность структуры определенного участка антигена и активного центра антитела определяет специфичность их взаимодействия, является общепризнанным.

Возможно, конформационная перестройка молекул иммуноглобулинов может лежать в основе изменения времени узнавания и связывания моноклональных антител с эритроцитами A(II), B(III) и AB(IV) групп крови под действием пирувата и этанола.

Полученный блок данных в трех сериях модельных экспериментов показывает, что малые молекулы - пируват и этанол - за счет прямых и опосредованных эффектов изменяют специфические белок-лигандные взаимодействия, что доказывается колебаниями двух показателей реакции агглютинации - степени и времени начала агглютинации.

3.4. Характер влияния лактата на группоспецифические антигены эритроцитов, естественные и моноклональные антитела

Лактат (молочная кислота) входит в число наиболее важных аналитов, поскольку является универсальным продуктом обмена веществ практически у всех живых организмов, конечным продуктом тканевого обмена глюкозы при нехватке кислорода, основным межклеточным энергетическим веществом в тканях мозга (Dringen R. et al., 1993). Лактат образуется из пирувата под действием лактатдегидрогеназы в последней реакции анаэробного гликолиза. По данным научной литературы, нормальная концентрация лактата в крови варьируется в пределах 0,2-2,4 ммоль/л (Cooke N.T. et al., 1983; Литвинов A.B., 2000; Назаренко Г.И., Кишкун A.A., 2006).

Чтобы изучить влияние лактата на антиген-антительные взаимодействия, мы поставили ряд модельных экспериментов: с группоспецифическими антигенами эритроцитов, с естественными и моноклональными антителами. Предварительно нами была определена концентрация лактата в крови клинически здоровых лиц 0(I)-AB(IV) групп крови (табл. 20).

Таблица 20. Содержание лактата в крови клинически здоровых лиц 0(1)-АВ(1У) групп крови (ммоль/л)

Статист. показатель Группа крови Среднее значение

0(I) A(II) B(III) AB(IV)

М±т 2,2±0,15 2,0±0,12 2,2±0,14 2,0±0,18 2,1±0,14

Me 2,1 1,7 2,2 1,8 1,9

min 1,14 1,04 1,09 0,86 0,86

max 4,65 4,16 4,28 4,01 4,65

Полученные результаты исследования показывают, что содержание лактата в крови в среднем составляет 2,1±0,14 ммоль/л, оно незначительно варьируется в пределах нормальных значений в 0(1)-АВ(^) группах крови. В первой серии экспериментов мы изучили влияние лактата на антигены системы АВ0. Определяли степень и время начала агглютинации эритроцитов A(II), В(Ш) и АВ(^) групп крови с антителами.

Показано, что под действием лактата степень агглютинации антигенов А и В эритроцитов А(П), В(Ш) и АВ(^) групп крови не изменилась и составила 12 р^ как и в контрольных образцах.

В отличие от степени агглютинации, времени начала агглютинации эритроцитов А(П), В(Ш) и АВ(^) групп крови с антителами под действием лактата изменялось (табл. 21).

Установлено, что под действием лактата группоспецифические антигены эритроцитов медленнее вступали во взаимодействие с антителами.

Таблица 21. Влияние лактата на время начала агглютинации эритроцитов А(П), В(Ш) и АВ(1У) групп крови (с)

Статистич. показатель (n=30) Контроль антиген А А (II) Антиген А A(II) Контроль антиген В В(Ш) Антиген В B(III)

M±m 6,0±0,1 8,5±0,16 6±0,1 7,0±0,22

Me 5,9 8,0 6,0 7,0

Д% - +41,6 - +16,6

Р p<0,001 p<0,01

Статистич. показатель (n=30) Контроль антиген А АВ(1У) Антиген А AB(IV) Контроль антиген В АВ(1У) Антиген В ÄB(IV)

M±m 6±0,1 9,0±0,21 6±0,1 8,0±0,25

Me 6 9 6 8

Д% - +50 - +33,3

2р p<0,001 p<0,001

Наибольшее влияние лактат оказывает на антиген-антительное взаимодействие антигена А эритроцитов АВ(1У) группы крови, а наименьшее воздействие - на связывание антигена В эритроцитов В(Ш) группы крови с антителом. Присутствие антигена А на поверхности мембраны эритроцитов А(П) и АВ(1У) групп крови вызывает больший ответ на действие лактата, чем присутствие антигена В на поверхности мембраны эритроцитов В(Ш) и АВ(1У) групп крови.

Несколько другой эффект вызывает контакт лактата с естественными анти-А и анти-В антителами (табл. 22).

Таблица 22. Влияние лактата на степень агглютинации антител плазмы крови с эритроцитами A(II), B(III) и AB(IV) групп крови (pt)

Статистич. показатель (n=30) Контроль анти-А антитела Анти-А антитела Контроль анти-В антитела Анти-В антитела

M±m 10 5,0±0,34 8 3,0±0,43

Me 10 5,5 8 3

Д% - - 50 - - 62,5

р - p<0,001 p<0,001

Установлено, что лактат может вызывать модификацию иммуноглобулинов плазмы крови, происходит снижение степени агглютинации анти-А и анти-В антител плазмы с соответствующими антигенами эритроцитов. Наибольшее изменение степени агглютинации наблюдалось после действия лактата на анти-В антитела плазмы.

Анализ данных, полученных в серии экспериментов с моноклональными антителами, показывает, что антитела служат объектом прямого или опосредованного действия лактата (табл. 23).

Лактат вызывает снижение степени агглютинации как анти-А, так и анти-В моноклональных антител с эритроцитами А(П), В(Ш) и АВ(1У) групп крови на 75%. Степень агглютинации значительно уменьшалась, а именно - с 12 до 3 р!

Таблица 23. Влияние лактата на степень агглютинации анти-А и анти-В моноклональных антител с эритроцитами A(II), B(III) и AB(IV) групп крови (pt)

Статистический показатель (n=30) Контроль анти-А антитела Анти-А антитела Контроль анти-В антитела Анти-В антитела

M±m 12 3,0 ±0,38 12 3,0±0,41

Me 12 3 12 3

Д% - -75 - -75

р p<0,001 p<0,001

Статистический показатель (n=20) Контроль анти-А антитела АВ(^) Анти-А антитела ДВ(^) Контроль анти-В антитела ДВ(^) Анти-В антитела AB(IV)

M±m 12 3,0±0,39 12 3,0±0,43

Me 12 3 12 3

Д% - -75 - -75

р p<0,001 p<0,001

Характер влияния лактата на время начала агглютинации моноклональных антител с эритроцитами A(II), B(III) и AB(IV) групп крови представлен в табл. 24.

Время образования антиген-антительных комплексов анти-А и анти-В моноклональных антител с группоспецифическими антигенами существенно замедлялось: почти в 20 раз в реакции агглютинации анти-А антител с эритроцитами A(II) и АВ(^) групп крови и в 15 раз - в реакции агглютинации анти-В антител с эритроцитами В(Ш) и АВ(^) групп крови.

Таблица 24. Влияние лактата на время начала агглютинации моноклональных антител с эритроцитами А(П), В(Ш) и АВ(^) групп крови (с)

Статистический показатель (n=30) Контроль анти-А антитела Анти-А антитела Контроль анти-В антитела Анти-В антитела

M±SD 6,0±0,03 115,5 ±1,38 6,0±0,04 88,5±1,97

Me 6 109,3 6 90,7

Л% - +1825 - +1375

р p<0,001 p<0,001

Статистический показатель (n=30) Контроль анти-А антитела AB(IV) Анти-А антитела ЛВ(^) Контроль анти-В антитела A(IV) Анти-В антитела AB(IV)

M±SD 6,0±0,03 112,5±2,81 6,0±0,04 88,5±1,76

Me 6 115,9 6 91,4

Л% - +1775 - +1375

р p<0,001 p<0,001

В литературе встречаются данные о влиянии различных соединений на связывание иммуноглобулинов с антигенами эритроцитов. В исследованиях И.В. Шабунина установлено, что современные органические йодсодержащие рентгеноконтрастные средства имеют сродство к иммуноглобулинам и могут связываться с ними, вследствие этого ингибируется их способность взаимодействовать с антигенами (Шабунина И.В. и соавт., 2000). Алкилоксибензолы, имеющих в своем составе алкильный радикал, угнетают способность иммуноглобулинов к специфическому связыванию с антигенами. Основной вклад в модификацию антител вносят взаимодействия гидрофобных

алкильных радикалов алкилоксибензолов с гидрофобными аминокислотами в области активного центра антител. Гидроксильные радикалы исследуемых бензолов могут также влиять на степень гидратации белка. Совместно эти эффекты приводят к изменению конформации иммуноглобулина, которая необходима для комплексообразования антиген-антитело (Дерябин Д.Г. и соавт., 2009). В работе С.А. Бобровника показано, что определяющими для связывания иммуноглобулинов с антигенами являются такие факторы, как стерическая комплементарность, комплементарность зарядов эпитопа и паратопа и ван-дер-ваальсовы взаимодействия (Бобровник С.А., 2002). Показано, что эмбриональный альфа-фетопротеин может ингибировать реакцию агглютинации А и В антигенов эритроцитов со специфическими антисыворотками. Гемагглютинация не ингибируется другими белками амниотической жидкости. Ингибирующий эффект связан с количеством антител и концентрацией альфа-фетопротеина (Brenner T. et al., 1985).

Три серии модельных экспериментов по изучению влияния лактата на антигены А и В эритроцитов А(П), В(Ш) и АВ(^) групп крови, моноклональные и естественные антитела показали, что введение лактата в систему антиген-антитело вызывает структурно-функциональные изменения антигенов А и В и антител к ним благодаря высокой химической активности гидроксикислоты и наличию отрицательного заряда. Можно предположить модифицирующее действие лактата на белок, и, как следствие, изменение показателей реакции агглютинации - степени и времени начала агглютинации.

3.5. Влияние этанола на каталитическую активность дегидрогеназ

Белок-лигандные взаимодействия лежат в основе многих метаболических процессов, происходящих в клетке. В последние годы появляется много информации о регуляции белок-лигандных взаимодействий в принципиально новых, ранее не изученных аспектах. Нам было интересно, как этанол -соединение с низкой молекулярной массой и высокой химической активностью

- влияет на белок-лигандные взаимодействия - фермент-субстратные. В качестве объекта изучения мы выбрали группу ферментов из класса оксидоредуктаз - дегидрогеназы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, а именно перенос водорода от одного субстрата на другой.

Мы изучали эффекты этанола на активность глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФД), а-глицеролфосфат-

дегидрогеназы (а-ГФД) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). ГАФД, а-ГФД и ЛДГ относятся к семейству НАД-зависимых дегидрогеназ. Энзимологи эту группу ферментов выделяют как уникальный биологический объект для изучения происхождения и эволюции белковых катализаторов, имеющих сложные коферменты. Все три фермента играют ключевую роль в углеводно-липидном обмене, обеспечивающем образование энергии в живых организмах и восполнение субстратов для различных метаболических процессов.

Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа ф-глицеральдегид-3-фосфат: NAD оксидоредуктаза фосфорилирующая - КФ 1.2.1.12) катализирует превращение глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-бисфосфоглицерат в присутствии НАД.

Содержание ГАФД в клетке превышает содержание остальных ферментов и составляет 10-20% от общего количества растворимых белков, что, несомненно, способствует тому, что фермент широко используется как модельный объект (Арутюнов Д.Ю. и соавт., 2002). Самое высокое содержание ГАФД определено в цитоплазме, фермент может также присутствовать в митохондриях и в ядре (Butterfield D.A et al., 2010). При физиологических условиях (рН, ионная сила) молекула ГАФД положительно заряжена и может связываться с любыми отрицательно заряженными биомолекулами, так как обладает высокореакционноспособными сульфгидрильными группами активного центра (Плетень А.П., 2009). В настоящее время имеются многочисленные данные о том, что ГАФД осуществляет не только гликолитические функции, но и способна взаимодействовать с другими белками, нуклеиновыми кислотами, а также с внутриклеточными структурами,

выполняя неканонические функции. ГАФД может участвовать в мембранном транспорте, образовании цитоскелета, регуляции экспрессии генов, а также может взаимодействовать с рядом малых молекул, в том числе с фактором некроза опухоли, глутатионом и оксидом азота (Muronetz V.I. et al., 1994; Volker K.W. et al., 1995; Hara M.R. et al., 2006; Bryksin A.V. et al., 2008; Dai R.P. et al., 2008; Groblewska M. et al., 2008; Hwang N.R. et al., 2009). Одной из наиболее интересных функций ГАФД является участие в апоптозе клетки (Sen N. et al., 2008). Кроме того, было обнаружено, что фермент играет важную роль в патофизиологии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и Хантингтона (Mazzola J.L. et al., 2002; Shalova I.N. et al., 2007; Kadmiri N. et al., 2014; Avila C.L. et al., 2014). Нативная молекула ГАФД находится в форме олигомера, состоящего из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых имеет свой активный центр (рис.

Рисунок 23. Изображение гомотетрамера ГАФД с встроенным коферментом НАД из клеток млекопитающих. Четыре субъединицы окрашены в разные цвета (Rodacka А., 2013)

Рентгеноструктурный анализ молекулы ГАФД показал, что каждая субъединица содержит два домена - каталитический и НАД-связывающий. Акт катализа протекает на границе доменов, поэтому характер взаимодействия

23).

последних играет важнейшую роль в функционировании дегидрогеназы. Для многих изученных ГАФД из различных источников (мышцы человека, свиньи, кролика, курицы, омара и пекарские дрожжи) с помощью анализа аминокислотной последовательности определена первичная структура и установлена высокая степень гомологии аминокислотных остатков - 70-95% (Branlant C. et al., 1989).

Совокупность данных по химической модификации и рентгеноструктурному анализу ГАФД показывает наличие в составе активного центра ферментов Цис 149, Гис 176 и Тир 311. Основную роль играет Цис 149, аминокислотный остаток участвует в связывании кофермента и субстрата (Aguilera L. et al., 2009; Bedhomme M. et al., 2012). Определенную роль в катализе играют остатки Гис 38, Лиз 191 и Арг 231, функция которых заключается в создании определенной конформации молекулы фермента. В литературе встречаются сведения, что в активном центре ГАФД присутствуют как катионные локусы, так и анионные локусы. Показано, что катионные локусы формируют аминокислотные остатки Лиз 191 и Арг 231 (Rovensky Y.A. et al., 1999). Два анионных локуса образуют аминокислотные остатки Сер 148, Трп 150, Трп 208, Арг 231, Трп 179 и Асн 181, они необходимы для связывания неорганического фосфата и фосфатной группы субстрата. В формировании одного анионного локуса также принимает участие гидроксильная группа рибозы молекулы НАД (Saibil H., 2000). Вероятно, такая сложная система межсубъединичных и внутрисубъединичных взаимодействий необходима для проявлений различных функций ГАФД.

В функциональном отношении ГАФД связана с а-ГФД, катализирующей реакцию превращения глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат, катализируемого а-ГФД. Фермент а-ГФД (а-глицерол-3-фосфат-НАД-оксидоредуктаза - КФ 1.1.1.8) имеет структуру асимметричного димера, каждый мономер которого имеет N- и С-концевые домены. N-концевой домен фермента содержит классический Р-а-Р-а-Р-мотив, характерный для многих НАД-зависимых ферментов, в то время как С-концевой домен - в основном а-

спиральный. В состав апофермента входят более 10 сульфгидрильных групп, обеспечивающих оптимальное конформационное соответствие каталитического центра субстрату (Alarcon D.A. et al., 2009). С помощью метода компьютерного моделирования определены десять активных аминокислотных остатков каталитического центра. Показано, что остатки Лиз 125 и Лиз 210 имеют решающее значение в акте катализа, а в качестве ключевого остатка определен Лиз 210, который находится в аминокислотной последовательности а-спирали С-концевого домена (Choe J. et al., 2003).

Лактатдегидрогеназа (L-лактат-НАД-оксидоредуктаза - КФ 1.1.1.27) -фермент гликолиза, катализирует обратимое превращение пирувата в лактат. Специфической особенностью структуры фермента является строение его доменов. Структура одного, ответственного за связывание с коферментом, имеет сходство с другими доменами НАД-зависимых дегидрогеназ (алкогольдегидрогеназой, ГАФД), строение другого домена имеет особенности у дегидрогеназ разной специфичности (Зимин Ю.В. и соавт., 2001). На основе рентгеноструктурного анализа были построены полные атомные модели ЛДГ человека. Установлено, что часть каталитического участка представлено петлей из аминокислотных остатков в положениях 96-111, гибкость петли способствует связыванию субстрата. В неактивном состоянии фермента петля стабилизируется водородными связями и гидрофобными контактами, образованными остатками Арг 108, Ала 97, Арг 98, Глн 99 и Арг105; ключевым аминокислотным остатком, участвующим в акте катализа, является остаток Арг 108 (Nilov D.K. et al., 2015).

Нами было исследовано, как этанол - низкомолекулярное соединение с высокой реакционной способностью - влияет на фермент-субстратные взаимодействия ГАФД, а-ГФД и ЛДГ в гемолизате цельной крови и в изолированной среде (на гомогенные ферментные препараты) в опытах in vitro. На первом этапе эксперимента нами изучалось действие этанола на активность исследуемых дегидрогеназ в полиферментной полисубстратной среде -гемолизате цельной крови (табл. 25). Полученные результаты показывают, что

удельная активность ГАФД, а-ГФД и ЛДГ в контрольных пробах составляет в среднем 0,251 Е/мг, 0,192 Е/мг и 0,317 Е/мг, соответственно, что согласуется с данными литературы (Ва1^ S.K., 1987; Наквасина В.Г. и соавт., 2012; Гильмиярова Ф.Н. и соавт., 2013). Влияние этанола на активность исследуемых дегидрогеназ представлено в табл. 25.

Таблица 25. Влияние этанола на активность ГАФД, а-ГФД и ЛДГ гемолизате цельной крови (Е/мг)

ГАФД а-ГФД ЛДГ

Контроль 0,251±0,003 0,192±0,003 0,317±0,004

Инкубация без этанола

М±SD 0,250±0,004 0,195±0,007 0,314±0,007

Д% Д% -0,4 Д% +1,5 Д% -1,0

р р>0,05 р>0,05 р>0,05

Инкубация с этанолом

М±SD 0,440±0,005 0,244 ±0,011 0,517±0,006

Д% Д% +75 Д% +27 Д% +63

р р<0,001 р<0,01 р<0,001

Активность ГАФД, а-ГФД и ЛДГ после инкубации с этанолом возросла на 75%, 27% и 63% соответственно. Наиболее выраженные изменения активности наблюдаются у ГАФД и ЛДГ, повышение активности а-ГФД было менее значительным.

Как предполагается, этанол может прямо или опосредованно влиять на каталитические свойства исследуемых дегидрогеназ в гемолизате. Индуцированная ли это конформационная перестройка макромолекулы

фермента, непосредственное ли действие на аминокислотную последовательность активного центра или опосредованное влияние на макро- и микроокружение дегидрогеназ, можно будет уточнить в экспериментах с изолированными гомогенными ферментами. Во второй серии экспериментов изучили влияние этанола на гомогенные ферментативные препараты ГАФД, а-ГФД и ЛДГ. Был выявлен стимулирующий эффект этанола на исследуемые каталитические белки в изолированном состоянии (табл. 26).

Таблица 26. Влияние этанола на активность ГАФД, а-ГФД, ЛДГ в изолированной среде (Е/мг)

ГАФД а-ГФД ЛДГ

Контроль 23,19±0,87 2,94±0,02 493,4±17,1

Инкубация без этанола

М±SD 22,72±0,88 2,98±0,04 485,8±19,1

Д% Д% -2 Д% +1,3 Д% -1,6

Р-уровень р>0,05 р>0,05 р>0,05

Инкубация с этанолом

М±SD 30,17±0,77 3,26±0,04 625,1±16,5

Д% Д%+30 Д% +11 Д% +27

Р-уровень р<0,01 р<0,05 р<0,01

Установлено, что активность ГАФД после воздействия этанола выросла на 30% и составила 30,17 Е/мг, по сравнению со значением в контроле - 23,19 Е/мг.

Сравнение активности а-ГФД и ЛДГ до и после действия этанола свидетельствует о том, что этанол вызывает сдвиг активности ферментов в сторону увеличения на 11% и 27% соответственно. Выявлено сохранение

стимулирующего эффекта этанола на исследуемые ферменты в изолированной среде.

Сравнительная оценка влияния этанола на активность дегидрогеназ в полиферментной полисубстратной среде - гемолизате - и в изолированной среде показала, что сдвиг активности ГАФД, а-ГФД и ЛДГ происходит в сторону увеличения в обеих средах, но в количественном отношении активность ферментов в изолированной среде увеличивается значительно меньше, чем в многокомпонентной - гемолизате цельной крови (рис. 24).

Рисунок 24. Сравнительная оценка активности ферментов в гемолизате и в изолированной среде (100% значения активности ферментов в контрольных пробах)

Установлено системное влияние этанола на активность ГАФД, а-ГФД и ЛДГ. Выявленное нами усиление активности ферментов в гемолизате и в изолированной среде дает основание предположить, что метаболит, обладающий реакционноспособной гидроксильной группой в силу наличия

короткого двууглеродного радикала и незначительного индуктивного эффекта, может вступить в донорно-акцепторные отношения с функциональными группами апофермента, что ведет к повышению его реакционноспособности.

Отличительным свойством строения этанола является относительная подвижность водорода гидроксильной группы. Следует отметить, что влияние гидроксильной группы особенно велико на соединения с небольшой углеводородной цепочкой, такой как у аминокислот. В литературе есть данные о том, что этанол за счет неферментативного взаимодействия с функциональными группами белков модулирует их функцию. Этанол может изменять взаимодействие а1-глицинового рецептора с G-белком. Методом мутагенеза было показано, что замена остатка глутаминовой кислоты на остаток нейтральной аминокислоты снижает потенцирование данного рецептора. Основную роль в этанол-индуцированной модификации взаимодействий глицинового рецептора с G-белком играет аминокислотный остаток лизина в 385-м положении. Замена остатка лизина на лейцин или глутамин приводит к изменению электростатического потенциала близлежащего региона без изменений структуры рецептора и, как следствие, снижает модуляцию этанолом белок-лигандных взаимодействий (Castro P.A. et al., 2012). Возможно, этанол модифицирует структуру дегидрогеназ, оказывает стерический эффект на реагирующие атомы в активном центре и тем самым изменяет активность ферментов. В исследованиях Ю.Ю. Щуцкой установлено, что перекись водорода способна окислять SH-группы цистеина в каталитическом центре ГАФД (Щуцкая Ю.Ю. и соавт., 2008). Показано, что субадаптогенные дозы перекиси водорода приводят к сильной гиперактивации ГАФД в клетках человека, что может быть активным клеточным ответом на окислительный стресс (Cerella С. et al., 2009).

Результаты, полученные в ряде исследований, показывают модулирующее влияние различных соединений на активность а-ГФД. Так, этанол-индуцированное поражение печени приводит к повышению активности а-ГФД в гепатоцитах (Sato T. et al., 2014). Активность фермента стимулируют оксид азота и

супероксидные радикалы, способствующие связыванию а-ГФД с субстратом (Marin P. et al., 1995). Снижение активности а-ГФД наблюдалось под влиянием витаминов А и D, а повышение - после воздействия аскорбиновой кислоты (Smith S.B. et al., 2009).

В исследованиях Nussler A.K. установлено: в гепатоцитах человека при хроническом потреблении алкоголя снижается активность ферментов-антиоксидантов и повышается активность ЛДГ на 40% (Nussler A.K. et al., 2010). Изучая влияние этанола на пролиферацию гепатоцитов человека, установили значительное повышение активности внеклеточных ферментов -ЛДГ, АСТ, АЛТ и каспаз 3 и 9 (Tuoi T.H. et al., 2011).

Эффекты этилового спирта на различные белки в большой степени определяются их субъединичным составом (Горбунова О.Б., 2004). Увеличение активности ЛДГ в гемолизате соизмеримо с увеличением активности ГАФД и значительно выше, чем увеличение активности а-ГФД. По-видимому, действие этанола на молекулы ферментов, имеющих тетрамерную структуру, имеет схожие механизмы.

Функционирование любого фермента в клетке во многом определяется его способностью образовывать динамические надмолекулярные комплексы и ансамбли как друг с другом, так и с белками цитоскелета и другими молекулами (Чернов Н.Н., 1996). Методами ионообменной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле впервые было показано, что в ферментных препаратах, выделенных из дрожжей, существует комплекс функционально связанных ферментов - транскетолазы и ГАФД (Kochetov G.A. et al., 1970). В работе K.V. Fokina выявлена способность ГАФД образовывать комплексы с фосфоглицераткиназой и 3-дифосфоглицератмутазой -ферментами, которые используют 1,3-дифосфоглицерата в качестве субстрата (Fokina K.V. et al., 1997). Исследования H. Riveros-Rosas свидетельствуют о возможности образования комплекса между ГАФД и алкогольдегидрогеназой дрожжей (Riveros-Rosas H. et al., 1997). В работах A. Bai выявлено, что

фосфорилирование некоторых аминокислотных остатков в структуре молекулы ЛДГ изменяет общий заряд молекулы и электростатические взаимодействия с мембранами (Bai J.H. et al., 1997). Описано специфическое взаимодействие ГАФД и ЛДГ из сердца и мышц млекопитающих, которое может влиять на метаболизм НАД/НАДН(Н) и гликолиз в живых клетках (Svedruzic Z.M. et al., 2006). Возможно взаимодействие ЛДГ и с белками цитоскелета клетки - F-актином, тубулином, микротубулином (Walsh J.L. et al., 1992). В эритроцитах ГАФД может находиться в комплексе с такими ферментами, как альдолаза, фосфофруктокиназа и ЛДГ (Campanella M.E. et al., 2005). Предполагается, что обратимая адсорбция ферментов гликолиза на структурных компонентах клетки является одним из важнейших механизмов регуляции обмена веществ благодаря упорядоченности и локализации метаболических процессов в определенных компартментах клетки (Sheedy R.J. et al., 2001). Взаимодействие ЛДГ с белками и электролитами создает возможность образования комплексов, которые изменяют равновесие в системе «димер-тетрамер» и тем самым влияют на каталитическую активность фермента. Функциональная роль димерной формы ЛДГ заключается в восстановлении пирувата, а тетрамерной - в окислении лактата (Муронец В.И. и соавт., 1990). Таким образом, находясь на разветвлении гликолитического пути, ЛДГ участвует в регуляции анаэробного и аэробного гликолиза.

Для определения механизмов влияния микроокружения на активность ферментов было предложено исследовать функционирование каталитических белков в среде обращенных мицелл, имитируя ситуацию внутри клетки, заметно отличающуюся по свойствам от водных растворов. Интерес к подобным системам продиктован тем, что максимально естественно моделируется природное микроокружение ферментов. Исследование влияния мицеллярной среды на функционирование гетеродимерной у-глумилтрансферазы привело к открытию нового активного центра, расположенного на тяжелой субъединице фермента (Kabanov A.V. et al., 1991).

В системе обращенных мицелл изменяется эффективность каталитического действия трипсина за счет снижения скорости образования фермент-субстратного комплекса (Захарченко Н.Л. и соавт., 2008). Вышесказанное позволяет сделать вывод, что система обращенных мицелл оказывает многофакторное влияние на активность некоторых ферментов, как и гемолизат.

Согласно современным воззрениям, регуляция метаболизма в клетке выполняется всей совокупностью её ферментов. При этом относительное значение конкретного фермента в регуляции метаболического цикла не может быть точно спрогнозировано, так как оно во многом определяется его окружением.

Увеличение активности ферментов в гемолизате существенно выше, чем в изолированной среде. По-видимому, суммируются прямые и косвенные эффекты этанола, т.е. опосредованные взаимодействием этилового спирта с другими реакционноспособными соединениями и созданием оптимального микроокружения для реакции с коферментом и субстратом, а также их взаимодействия с окружающими макро- и микромолекулами. Главная цель такой чувствительности ферментов - ответить на изменение окружающей среды, акклиматизировать клетку к иным условиям и дать должный ответ на стимул.

Таким образом, в процессе метаболической адаптации к воздействию внешнего стимула повышается эффективность всех исследуемых дегидрогеназ, т.е. этанол может оказывать влияние на внутриклеточные молекулярные процессы. Выявленное действие этанола на активацию дегидрогеназ в лизате эритроцитов позволяет экстраполировать результаты к возможному действию этанола на функцию внутриклеточного метаболизма, а также предположить наличие множественных эффектов этанола за счет модификации конформации белков, вступающих в дальнейшем в белок-лигандные взаимодействия.

Таким образом, в процессе метаболической адаптации к воздействию внешнего стимула повышается эффективность всех исследуемых дегидрогеназ,

т.е. этанол может оказывать влияние на внутриклеточные молекулярные процессы. Выявленное действие этанола на активацию дегидрогеназ в лизате эритроцитов позволяет экстраполировать результаты к возможному действию этанола на функцию внутриклеточного метаболизма, а также предположить наличие множественных эффектов этанола за счет модификации конформации белков, вступающих в дальнейшем в белок-лигандные взаимодействия.

Таким образом, в процессе метаболической адаптации к воздействию внешнего стимула повышается эффективность всех исследуемых дегидрогеназ, т.е. этанол может оказывать влияние на внутриклеточные молекулярные процессы. Выявленное действие этанола на активацию дегидрогеназ в лизате эритроцитов позволяет экстраполировать результаты к возможному действию этанола на функцию внутриклеточного метаболизма, а также предположить наличие множественных эффектов этанола за счет модификации конформации белков, вступающих в дальнейшем в белок-лигандные взаимодействия.

Таким образом, в процессе метаболической адаптации к воздействию внешнего стимула повышается эффективность всех исследуемых дегидрогеназ, т.е. этанол может оказывать влияние на внутриклеточные молекулярные процессы. Выявленное действие этанола на активацию дегидрогеназ в гемолизате цельной крови позволяет экстраполировать результаты к возможному действию этанола на функцию внутриклеточного метаболизма, а также предположить наличие множественных эффектов этанола за счет модификации конформации белков, вступающих в дальнейшем в белок-лигандные взаимодействия. Необходимо дальнейшее исследование для того чтобы выявить возможные механизмы действия этанола на фермент-субстратные взаимодействия, но это не входило в задачу нашей работы.

ГЛАВА 4

ПРОГНОЗИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПИРУВАТА,

ЛАКТАТА, ЭТАНОЛА И АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАТ А И В

Молекулярное моделирование в последнее время стало важнейшей составляющей фактически любого исследования в биохимии. Изучение механизмов ферментативных реакций, определение биологической активности соединений, выяснение наличия или отсутствия взаимодействия между молекулами и конструирование молекул с заданными свойствами — эти области науки уже не могут обходиться без молекулярного моделирования (Хельтье Х.Д. и соавт., 2010). Молекулярное моделирование — это один из аспектов понятия т silico, который представляет собой набор вычислительных методов, позволяющих на уровне атомов изучать молекулярные системы разной сложности. Использование таких вычислительных методов обеспечивает основу для улучшения нашей способности предсказывать и понимать функционирование и взаимодействие различных соединений, что помогает проектировать дизайн метаболических и сигнальных путей в живых организмах (МагйпЬо N. е1 а1., 2014).

Эффективность применения молекулярного моделирования можно продемонстрировать на примере белок-лигандных взаимодействий, определяющих большинство метаболических процессов в клетке. Благодаря успехам проектов по получению полных последовательностей геномов различных организмов, изучение параметаболических взаимодействий особенно актуально. Знание первичной структуры белка относительно бесполезно без определения функций белка, для выявления которых необходимы трудоемкие экспериментальные исследования, в то время как секвенирование геномов — это хорошо отработанная технология (Pirooznia М. е1 а1., 2015). Объем получаемых сведений гораздо больше того, который можно проверить в эксперименте, вследствие этого возникает значительное отставание между установлением первичной структуры белков и определением их

функции. Решить проблему можно по-разному: медленно и надежно выяснять функции вновь открытых белков экспертами-биологами или быстро, с помощью автоматизированных программных систем. Анализ количества сведений по биологическим последовательностям в различных базах данных показывает, что аннотации для большинства последовательностей были получены с помощью компьютерных методов. По данным системы RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) от 01.05.2008 года, всего для 3,2% белков экспериментально были установлены функциональные аннотации. Похожие сведения дает и база данных SwissProt (http://www.expasy.org/sprot/) - только для 6,6% белков была проведена проверка их функциональных аннотаций в эксперименте. В связи с огромным ростом количества сведений о последовательностях белков биологам все больше приходится полагаться на предсказание функций различных молекул методами in silico. В сложившейся ситуации совершенствование методов молекулярного моделирования приобретает все большую значимость.

Как и в любом вычислительном эксперименте, при предсказании in silico важную роль играют методы проверки и верификации полученных прогнозов. Одним из подходов является сравнение с экспериментальными данными, но, к сожалению, в большинстве исследований используются лишь несколько модельных организмов, что затрудняет проверку предсказаний для других организмов. Например, база данных - Database of Interacting Proteins (DIP) содержит информацию о белок-белковых взаимодействиях для 110 организмов, но 96% всех взаимодействий подтверждено лишь на восьми организмах (Пятницкий М.А. и соавт., 2009). Другим подходом является сравнение результатов прогноза с ранее полученными сведениями в различных базах данных. В исследованиях Sun J. результаты предсказаний сравниваются с базой данных Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), которая содержит данные о метаболических путях (Sun J. et al., 2005).

Одним из методов молекулярного моделирования является метод Quantitative structure-activity relationship (QSAR). Помимо доступности, важной

причиной использования метода QSAR служит доказанная возможность правильно прогнозировать биологическую активность различных соединений (Brown R.D. et al., 1998). Количество исследований методом QSAR в последнее десятилетие увеличилось экспоненциально, их применяют в широком диапазоне дисциплин, в частности, в фармацевтической промышленности для разработки лекарств (Pabon A. et al., 2013; Melo-Filho C.C. et al., 2014). Аббревиатура QSAR часто используется для обозначения любых методов, прогнозирующих свойства соединения по структуре. При качественном описании соотношений между структурами химических соединений и их биологической активностью употребляют англоязычный термин Structure-Activity Relationship (SAR).

Компьютерная система Prediction of Activity Spectra for Substances (PASS) относится к методам молекулярного моделирования QSAR. Программа PASS -прогноз спектров биологической активности органических соединений -предсказывает большое число вероятных видов биологической активности вещества на основе его структурной формулы, используя единое описание химической структуры и универсальный математический алгоритм установления зависимостей «структура-активность» (Poroikov V.V. et al., 2000). Эта система отвечает всем современным требованиям моделирования, ее главными составляющими являются: представление биологической активности, описание структуры химических соединений, база данных о взаимосвязях «структура-активность» и алгоритм прогноза спектров биологической активности. SAR base включает в себя словарь названий видов биологической активности, словарь MNA-дескрипторов, описания структур и активностей из обучающей выборки, данные и знания о взаимосвязях «структура-биологическая активность». MNA-дескриптор 0-го уровня - это метка атома, соответствующая символу химического элемента, дескриптор любого следующего уровня - условное обозначение структурного фрагмента соединения. Таким образом, структура разных молекул может быть показана как неповторяющееся множество MNA-дескрипторов.

Прогноз спектра биологической активности соединения представляется в виде перечня названий активностей и вероятностей Ра «быть активным» (to be active) и Pi «быть неактивным» (to be inactive), в начале спрогнозированного списка располагаются более вероятные виды активности. Если при анализе прогнозируемого списка активностей для исследования выбираются те виды активности, для которых Pa>90%, то мы рискуем пропустить около 90% действительно активных соединений, но вероятность ложноположительных прогнозов при этом ничтожно мала. Для Pa>80% - пропустим уже только 80% активных соединений, но и вероятность ложноположительных прогнозов будет выше, и, наконец, для Pa>Pi вероятности ошибок первого и второго рода равны.

В нашем вычислительном исследовании вероятность Ра «быть активным» мы принимали больше 0,100.

В программе PASS версии 1.917 в перечень прогнозируемых по умолчанию видов активности включено 2800 названий, из них: 384 - это фармакологические эффекты, 2242 - молекулярные механизмы действия и 41 -различные побочные эффекты и виды специфической токсичности, 69 -метаболически опосредованных действий и 64 - регуляция экспрессии генов и транспорт-обусловленные эффекты. Система PASS в качестве основы для описания структуры органических соединений использует структурную формулу, характеризующую взаиморасположение в пространстве атомов свободной молекулы в вакууме, что является необходимой и достаточной характеристикой ее структуры (Филимонов Д.А. и соавт., С. 91).

Как известно, к соединениям, постоянно присутствующим в физиологических концентрациях в организме, которые называются эндогенные и естественные метаболиты, относятся карбомоилфосфат, ацетат, пируват, лактат, ацетил-КоA, этанол и многие другие органические соединения. Они являются важными и незаменимыми участниками обмена веществ в организме.

4.1. Прогнозирование спектра биологической активности пирувата

Пируват ежедневно образуется в организме естественным путем и является важнейшим промежуточным продуктом энергетического обмена, связывающим взаимопревращения углеводов, белков и липидов. Интермедиат является продуктом распада глюкозы в процессе гликолиза; дальнейшее превращение пирувата возможно двумя путями - аэробным и анаэробным. В условиях достаточного поступления кислорода пируват в митохондриях декарбоксилируется с образованием ацетил-кофермента А, который является основным субстратом цикла Кребса, синтеза жирных кислот и холестерина. Если кислорода недостаточно, пируват превращается в лактат. При определенных состояниях организма пируват может использоваться в глюконеогенезе. Подобные изменения в распределении интермедиата -проявление регуляции реакций метаболизма, направленных на поддержание гомеостаза в ответ на изменение условий (Cody, G.D. et al., 2000).

«Индивидуальность» любой биомолекулы определяется химией функциональными группами и их расположением в трехмерном пространстве. Пировиноградная кислота относится к карбоновым кислотам, которые содержат в составе молекулы две функциональные группы - карбоксильную группу и оксигруппу, таким образом, она является кетокислотой:

Пировиноградная кислота обладает выраженными кислотными свойствами, в биосредах организма (рН-7) обычно находится в виде аниона пирувата. В биохимии до настоящего времени практически не применяли компьютерное моделирование для выявления биологических эффектов естественных метаболитов. Мы использовали PASS версии 1.917 для

определения потенциально возможных биологических активностей пировиноградной кислоты в соответствии с ее структурной формулой, представленной в виде MNA-дескрипторов. Число MNA-дескрипторов в молекуле пировиноградной кислоты равно 18.

Анализ результатов компьютерного прогноза показывает, что у пирувата существует вероятность наличия 257 фармакологических эффектов из 384 возможных и 1578 механизмов их реализации из 2242. Определено 35 из 41 возможных побочных и токсических эффектов, 56 метаболически опосредованных действий (табл. 27).

Таблица 27. Анализ результатов вероятной биологической активности

пирувата (значение Ра - вероятность проявление действия)

Общее Количество видов Количество видов

количество видов биологической биологической

биологической активности в активности в

активности в PASS для PASS для

PASS пирувата Ра>0,1 пирувата Ра>0,5

Всего

биологических 2736 1926 642

активностей

Фармакологических эффектов 384 257 54

Молекулярных

механизмов 2242 1578 569

действия

Побочных и

токсических 41 35 11

эффектов

Метаболически

опосредованных 69 56 8

действий

Мы отобрали биологические активности с высокой степенью проявления, значение Ра больше 0,5. С высокой степенью вероятности предсказана способность пирувата проявлять антинеопластический, антиишемический,

фибринолитический, нейропротекторный и противовоспалительный фармакологические эффекты (табл. 28). Некоторые спрогнозированные нами биологические эффекты были подтверждены экспериментально.

Таблица 28. Фармакологические эффекты пирувата (значение Ра -вероятность проявление действия)

Фармакологический эффект Ра>0,5 Подтверждение в эксперименте

Антинеопластический эффект (рак печени) 0,901 Cipolleschi M.G. et al. Cell Cycle. 2014. 13(2). P. 268-78

Регулятор обмена липидов 0,812

Фибринолитический 0,778

Антиишемический 0,771 Kim H.N. et al., Brain Res. 2015 Jun 23.pii: S0006-8993(15)00493-X

Антитоксический 0,742

Стимулятор лейкопоэза 0,724

Цитопротекторный 0,721 Sharma A.B. et al., Resuscitation. 2008. V. 76. P. 108-119.

Антинейротоксический 0,704

Регулятор метаболизма липидов 0,688

Антивирусный 0,663

Стимулятор секреции инсулина 0,659

Антагонист апоптоза 0,655 Sharma Р. et al., Brain Res. 2003. 28; 992(1). P. 104-13.

Антигипоксический 0,650 Mongan P.D. et al., J Physiol Heart Physiol. 2001. V. 281(2). Р.854-64.

Антимутагенный 0,648

Нейропротекторный 0,648 Sharma P., Mongan P.D. Shock. 2010. V. 33(5). Р. 532-40.

Восстановитель 0,610

Антидот 0,575

Противовоспалительный 0,574 Van Harten A.E. et al., Anaesthesia. 2012. V. 67. P. 280-293.

Липотропный 0,565

Фармакологический эффект Ра>0,5 Подтверждение в эксперименте

Иммуномодулирующий 0,554

Гемопротекторный 0,524

Стимулятор эритропоэза 0,708 Lu H. et al., J Biol Chem. 2002. 28; 277(26). P. 23111-5.

Антиишемический эффект пирувата изучал Kim H.N. c группой ученых, ими было выявлено несколько механизмов действия. Они установили, что при моделируемой ишемии мозга пируват ингибирует активность каспазы-3 и стимулирует активность поли (АДФ-рибоза)-полимеразы, что способствует поддержанию морфологии клеток и подавлению апоптоза (Kim H.N. et al., 2015). В работах Sharma A.B. и Van Harten A.E., исследовавших нейропротекторные и противоспалительные свойства пирувата показано, что они связаны со способностью пирувата, усиливать процессы биологического окисления, а также ингибировать синтез цитокинов (Sharma A.B. et al., 2008; Van Harten A.E. et al., 2012). Выявлено вероятное влияние пирувата на процесс созревания эритроцитов: возможный молекулярный механизм действия -стимуляция синтеза эритропоэтина. В работах A.Q. Nguyen установлено, что пируват может регулировать экспрессию генов, в том числе и экспрессию гена эритропоэтина (Nguyen A.Q. et al., 2014). Предсказано, что пируват стимулирует лейкопоэз, проявляя гемопротекторное действие.

Анализируя данные компьютерного прогноза, выявили, что пируват способен регулировать обмен липидов, оказывая при этом гиперхолестеролемический и липотропный эффекты, быть цитопротектором, антагонистом апоптоза и стимулятором секреции инсулина. Предсказано, что он способен проявлять антитоксическое, противовирусное, антигипоксическое и антиканцерогенное действие. Свои фармакологические эффекты пируват реализует через конформационное изменение рецепторов, модуляцию синтеза биологически активных веществ и активность множества ферментов,

используемых для регуляции разнообразных метаболических путей. Как известно, метаболические пути согласованы между собой по времени, локализации и интенсивности протекания. Эта согласованность протекания всех процессов обеспечивается сложными механизмами регуляции.

Компьютерная оценка молекулярных механизмов показывает широкий спектр различных действий пирувата, регулирующих обменные процессы, которые можно разделить на ряд блоков: обмен аминокислот, белков, углеводов, липидов, синтез гема и цикл трикарбоновых кислот - общий путь катаболизма органических соединений.

Спрогнозирована способность пирувата регулировать обмен аминокислот. Вероятный молекулярный механизм действия - ингибирование активности ферментов, катализирующих реакции метаболизма аминокислот, таких как аланиндегидрогеназа (Ра 0,939), ^метилглициноксидаза (Ра 0,874), глутаминаза (Ра 0,849), пролиндегидрогеназа (Ра 0,787), сериндегидрогеназа (Ра 0,754), триптофантрансфераза (Ра 0,738), глутаматдегидрогеназа (Ра 0,725), треонинальдолаза (Ра 0,710), глициндегидратаза (Ра 0,693) и диамин N ацетилтрансферазы (Ра 0,555).

Нельзя не отметить влияние пирувата на обмен серосодержащих аминокислот: цистеина, метионина и сульфокислоты таурина. Установлено возможное угнетение активности цистеингидролазы (Ра 0,619), цистеинлиазы (Ра 0,719) и тауриндегидрогеназы (Ра 0,706). Непосредственное участие в синтезе метионина из гомоцистеина принимает 5-метил-тетрагидрофолат редуктаза (Ра 0,889), ингибитором фермента может являться пируват. Дегидрогеназы аминокислот - участники восстановительного аминирования кетокислот, ведущих к образованию аминокислот. Так, аланин образуется из пировиноградной кислоты под действием аланиндегидрогеназы, имеющей кофермент НАД. Угнетая активность аланин-дегидрогеназы пируват тем самым, регулирует свой собственный метаболизм. Согласно данным прогноза, метаболит оказывает воздействие как на катаболизм (реакции

дезаминирования), так и на синтез аминокислот, а также на образование биогенных аминов, выполняющих роль гормонов и нейромедиаторов.

Пируват может быть вероятным стимулятором секреции инсулина (Ра 0,659) и ингибитором целого ряда ферментов - глюкозооксидазы (Ра 0,794), транскетолазы (Ра 0,758), пируваткиназы (Ра 0,540). В исследованиях M.S. German обнаружено, что промежуточные метаболиты анаэробного гликолиза могут стимулировать инсулиновый промоутер, тем самым запускать синтез инсулина (German M.S., 1993). Известно, что инсулин может подавлять процесс глюконеогенеза, стимулировать гликолиз и пентозофосфатный путь окисления глюкозы (May M. et al., 2014; Tiwari V. et al., 2014).

Пируват с высокой степенью вероятностью может выступать регулятором активности ферментов обмена углеводов и цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). Предсказано угнетающее действие на активность изоцитратдегидрогеназы (Ра 0,837), малатдегидрогеназы (Ра 0,710), сукцинатдегидрогеназы (Ра 0,776), пируваткарбоксилазы (Ра 0,816), пируватдегидрогеназы (Ра 0,827). По данным Gray L.R. пируват может модулировать синтез АТФ и основные пути биосинтеза, пересекающиеся с ЦТК, регулируя активность пируватдегидрогеназы (Gray L.R. et al., 2014).

Предсказывается способность пирувата выступать регулятором обмена липидов, инактивируя активность ферментов, катализирующих реакции синтеза жирных кислот и эйкозаноидов, липолиза в адипоцитах и катаболизма липидов. Спрогнозировано угнетение активности ацилглицеролипазы (Ра 0,855), липопротеинлипазы (Ра 0,725), транс-2-еноил КоА-редуктазы (Ра 0,708), кротонил-АПБ-гидратазы (Ра 0,692). Обращает на себя внимание вероятная способность пирувата тормозить активность ферментов, катализирующих метаболизм эйкозаноидов - лейкотриен-В4-монооксигеназы (Ра 0,742), простагландин-Е2-редуктазы (Ра 0,678) и 15-

гидроксипростагландиндегидрогеназы (Ра 0,585), а также модулировать продукцию цитокинов (Ра 0,720). Согласно данным литературы, кетокислоты могут подавлять экспрессию мРНК таких воспалительных медиаторов, как

интерлейкины, и ингибировать активность циклооксигеназы и липоксигеназы, что вызывает снижение содержания простагландинов и лейкотриенов -гормонов местного действия (Terazawa S. et al., 2012; Aoki-Yoshida A. et al., 2013). Для многих цитокинов характерно наличие гидрофобной сигнальной последовательности для связывания с лигандами (Sporn M.B., 1997). Вероятно, пируват, имея в своем составе гидрофильную часть (карбонильную и гидроксильную группы), создает определенное микроокружение, которое способствует контакту с молекулами, вызывая изменение их активности.

Пируват может быть вероятным регулятором синтеза гема гемоглобина, быть антидотом, ингибитором активности ферментов-антиоксидантов и участвовать в метаболизме витаминов.

Согласно данным прогноза, пируват может ингибировать активность протопорфириногеноксидазы (Ра 0,734) и порфобилиногенсинтазы (Ра 0,837), выступать антидотом (Ра 0,588), что вероятно из-за способности ингибировать активность алкогольдегидрогеназы (Ра 0,755), предотвращая образование ацетальдегида и реализацию его неблагоприятных эффектов. Ему присуща роль вероятного ингибитора активности супероксиддисмутазы (Ра 0,805) и каталазы (Ра 0,781) - ферментов антиоксидантной защиты организма.

Предсказано, что пируват наделен антиканцерогенной биологической активностью, является ингибитором кислой фосфатазы (Ра 0,847).

Показано вероятное влияние метаболита на ферментативную антиоксидантную систему, а именно регуляцию активности ключевых ферментов метаболизма аскорбиновой кислоты - L-глюкуронат редуктазы и монодегидроаскорбат редуктазы. Выявлено вероятное участие пирувата в метаболизме витаминов: тиамина и пантотеновой кислоты, биотина и витамина А - ретинола.

По данным прогноза он выступает ингибитором метилентетрогидрофолатредуктазы (Ра 0,889), тиаминфосфатазы (Ра 0,553), каротин 15-монооксигеназы (Ра 0,565) и биотинидазы (Ра 0,722).

Спрогнозирована вероятная биологическая активность пирувата - быть агонистом/антагонистом, т.е. соединением, которое при взаимодействии с рецептором изменяет его состояние, что приводит к биологической активности (рис. 25).

Рисунок 25. Прогнозируемые биологические эффекты пирувата - быть агонистом/антагонистом (вероятность проявления действия от 0 до 0,8)

С достаточно высокой степенью вероятности пируват наделен способностью выступать антагонистом ГАМК-рецептора (Ра 0,627), рецептора фибриногена (Ра 0,522), нейротрансмиттеров (Ра 0,699) и интегрина (Ра 0,680). Возможно, взаимодействуя с рецептором, метаболит блокирует его и тем самым предотвращает развитие физиологического эффекта. Пируват может выступать вероятным агонистом инсулиноподобного фактора роста 1 (Ра 0,685), Р-рецептора ретиноевой кислоты, нейротрофического фактора (Ра 0,670). Нейротрофический фактор оказывает сильное влияние на основные процессы жизнедеятельности, стимулирует рост нервной ткани. Показано, что нейротрофический фактор головного мозга действует на метаболизм и

внутреннюю структуру холинергических нейронов, что может быть обусловлено наличием у пирувата нейропротекторного и антигипоксического эффектов (Сахарнова Т.А. и соавт., 2014).

Анализ возможных эффектов показывает наличие способности у метаболита оказывать токсические и побочные эффекты -гиперхолестеринемический (Ра 0,757), гепатотоксический (Ра 0,615), кардиотоксический (Ра 0, 546) и осуществлять опосредованные метаболические действия: быть субстратом цитохромов Р-450 4А11 (Ра 0,682), Р-450 4А2 (Ра 0,613) и Р-450 4В (Ра 0,588).

В литературе недостаточно освещены вопросы понимания роли пирувата как лиганда для многочисленных соединений. Наряду с этим возможности современных компьютерных методов молекулярного моделирования позволяют на основании структуры функциональных групп пирувата, пользуясь огромной аналоговой базой данных, предсказать широкий спектр биологических эффектов, включающих мембранотропный, антиишемический, цитопротекторный, фибринолитический, антигипоксический,

антиканцерогенный. Вероятно, уже спрогнозированные, но еще доказанные функции пирувата могут обеспечить динамичность и равновесие сигнальных путей в сложной метаболической сети взаимодействий высоко- и низкомолекулярных соединений, выполняющих многообразные функции. Как и в любом вычислительном эксперименте, при предсказании in silico значительную роль играют методы проверки полученных прогнозов. По сведениям базы данных Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), многие предсказанные биологические эффекты пирувата имеют некоторое сходство с данными функциональной аннотации для этой кетокислоты. Создатели программы PASS отмечают, что наличие какого-либо эффекта не обязательно говорит о том, что этот эффект присущ данному соединению, его присутствие необходимо подтверждать в эксперименте (Филимонов Д.А. и соавт., 2014). В настоящее время ряд биологических эффектов пирувата

подтвержден экспериментально (Hinoi E.A. et al., 2006; Corl C.M. et al., 2010; Zager R.A. et al., 2014; McCommis K.S. et al., 2015).

Проведенное нами тестирование пирувата с помощью программы Prediction of Activity Spectra for Substances позволило выявить многопрофильные фармакологические эффекты и молекулярные механизмы влияния на активность факторов, модулирующих внутри- и межклеточные взаимодействия. Можно предположить, что пируват выступает в качестве посредника, регулирующего функции макромолекул, реализующих различные физиологические эффекты. Являясь важнейшим метаболитом, пируват активно вмешивается в обменные процессы в клетке и выступает регулятором многих параметаболических взаимодействий, лигандом для рецепторов и транспортных молекул. Таким образом, пируват имеет значение «краеугольного камня» для многочисленных аспектов жизнедеятельности организма.

4.2. Прогнозирование спектра биологической активности лактата

Молочная кислота (2-гидроксипропионовая кислота) - естественный метаболит, постоянно присутствующий в организме в физиологических концентрациях:

н3с — сн — соон

При анаэробных условиях молочная кислота является конечным продуктом гликолиза у животных, растений и микроорганизмов. Молочная кислота относится к гидроксикарбоновым кислотам (гидроксикислотам), в биологических средах организма обычно находится в виде аниона лактата.

В химическом плане гидроксикислоты получают либо путем

гидроксилирования карбоновых кислот, либо из спиртов введением карбоксильной группы. Молочная кислота является химически активным соединением, т.к. наличие в ее составе двух видов функциональных групп -карбоксильной и гидроксильной - позволяет ей вступать в различные химические реакции и проявлять свойства кислот и спиртов. Гидроксикислоты могут образовывать соли, сложные эфиры, амиды, алкоголяты и простые эфиры. По сравнению с карбоновыми кислотами гидроксикислоты имеют более выраженные кислотные свойства.

Характеризуя биологическую активность лактата, следует сказать, что на протяжении большей части двадцатого века лактат расценивался как буферный метаболический тупик, нивелирующий колебания пирувата. Такая оценка взаимоотношений пируват/лактат была основана на том факте, что при изменяющихся метаболических ситуациях содержание пирувата изменяется в меньшей степени, чем уровень лактата, что отражает большую значимость в обмене веществ первого, чем второго соединения (Ostrovsky Y.M., 1986).

В настоящее время изменилось представление о лактате в связи с уточнением его роли в многочисленных метаболических процессах. Согласно «челночной гипотезе лактата» (lactate shuttle hypothesis), лактат - это активный системный метаболит, мигрирующий внутри клеток, между клетками и между органами, способный использоваться не только для синтеза глюкозы, но и вовлекаться в энергетический обмен клеток, в том числе непосредственно окисляясь в митохондриях (Мещерякова О.В. и соавт., 2010). Транспорт лактата между клетками и межклеточным пространством осуществляется с помощью специальных белков, которые называются монокарбоксилатными переносчиками (Brooks G.A., 2000). Современные исследования определили лактату новое место и роль в метаболизме, что определило задачу нашего исследования - изучение биологических активностей метаболита методом молекулярного моделирования.

Анализ результатов компьютерного прогноза биологической активности лактата, полученный с помощью программы PASS представлен в таблице 29.

Таблица 29. Анализ результатов биологической активности лактата с

помощью программы PASS (значение Ра - вероятность проявление действия)

Общее количество видов биологической активности в PASS Количество видов биологической активности в PASS для лактата Ра>0,1 Количество видов биологической активности в PASS для лактата Ра>0,5

Всего биологических активностей 2736 1792 604

Фармакологических эффектов 384 243 31

Молекулярных механизмов действия 2242 1434 545

Побочных и токсических эффектов 41 37 18

Метаболически опосредованных действий 69 61 10

Анализ данных прогноза показал спектр фармакологических эффектов лактата с высокой степенью проявления действия (табл. 30). Обращает на себя внимание вероятная способность лактата проявлять антацидное действие, влиять на процессы созревания клеток - стимулировать лейкопоэз и эритропоэз, оказывать противовоспалительное действие, а также противовирусное влияние в отношении арбовирусов, риновирусов, пикорнавирусов. Противовирусная активность лактата предположительно связана с рН-зависимыми перестройками в структуре вируса: при уменьшении рН-среды вирус теряет инфекционную активность, при этом связь рибонуклеопротеина с белковым матриксом возрастает, что препятствует процессу репликации (Жирнов О.П. и соавт., 2014).

Таблица 30. Прогнозируемые фармакологические эффекты лактата

(значение Ра - вероятность проявление действия)

Фармакологический эффект Pa>0,5 Подтверждение в эксперименте

Антацидный 0,932

Ингибитор тромбоцитопоэза 0,854

Иммуномодулятор 0,811

Стимулятор лейкопоэза 0,803

Гипергликемический 0,775

Антивирусный (арбовирус) 0,753 Жирнов О.П. и соавт. Вопросы вирусологии, 2014. - Т. 59. -№3. - С. 41-46.

Антигипоксический 0,743

Фибринолитический 0,716

Вазопротектор 0,681 Ярцев В.Н. Биомед. радиоэлектр., 2014. - №4. - С. 84-85.

Стимулятор эритропоэза 0,673

Диуретический 0,668

Нейропротекторное 0,646

Антинейротоксический 0,639 Jha M.K. et al., Neurosci Biobehav Rev. 2016. - V. 11(68). - P. 1-19.

Противовоспалительный 0,614

Стимулятор желудочной секреции 0,599 Chacin J. et al., Gastroenterology. 1991. - 100(5 Pt 1). - Р. 1288-95.

Противовирусный (пикорнавирус) 0,588

Усилитель антибактериальной активности 0,583

Цитопротектор 0,554

Мембранопротектор 0,544

Антивирусный (папиллома) 0,542

Важными представляются данные о вероятной способности лактата оказывать защитное действие на мембраны клеток организма и кровеносные сосуды. По-видимому, реализация данного эффекта возможна путем непосредственного влияния на нейрогенный тонус кровеносных сосудов (Ярцев В.Н., 2014).

Предсказана способность лактата проявлять фибринолитическое и антитоксическое действия. Возможность лактата оказывать такие биологические эффекты, предположительно, связана с имеющейся в составе гидроксильной группой, выполняющей роль заместителя и обуславливающей способность вступления соединения в реакции нуклеофильного замещения.

Принимая во внимание вышеописанные фармакологические эффекты лактата, следующей задачей стало изучение молекулярных механизмов их реализации. Перечень молекулярных механизмов действия лактата представлен в табл. 31.

Таблица 31. Возможные молекулярные механизмы действия лактата (значение Ра - вероятность проявление действия)

Молекулярный механизм действия Шифр фермента Ра>0,5

Ингибитор лактат-2-монооксигеназы ЕС 1.13.12.4 0,935

Ингибитор фосфоенолпируватфосфотрансферазы ЕС 2.7.3.9 0,922