Особенности субпопуляционного спектра клеток крови у больных с различными вариантами течения глиобластом: патогенетические и клинические аспекты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.28, кандидат медицинских наук Чумаков, Владимир Александрович

• Чумаков, Владимир Александрович
• кандидат медицинских наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Чумаков, Владимир Александрович

I. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы

Несмотря на значительный прогресс в современной диагностике н терапии опухолей« прогноз дли больных с глиобластомой (ГБ), наиболее частой по-качественной опухолью головного мозга (ЗОГМ>, остается нерешительным. Большинством исследователей в качестве объективных критериев оценки проведенного лечения используется как средняя продолжительность жизни (СПЖ) группы больных, леченных но одной, предварительно выбранной методике {продолжител ьность жизни отсчитываете я от момента гистологической верификации опухоли на зтапе операции до момента смерти больного от основного заболевания), так к длительность без,рецидивного периода (о настоящее время зтот срок приближается к 8 месяцам), отсчитываемого от момента гистологической веркфнкаини опухоли до первого рецидива заболевания |6). СПЖ у пациентов с ГБ не превышает 50-60 недель, а пятилетняя выживаемость вообще менее К)% [3].

Очевидно, "(то, несмотря на определенную общность клиники, биологии и морфологии. ГБ являются гетерогенной группой новообразований, имеющей отличительные особенности течения заболевания и его прогноза (3. 11J.

Для увеличения послеоперационной выживаемости в качестве инструментов воздействия на опухолевый процесс широко используются различные тех* нологнн консервативное лечения, конечной целью которых является достижение максимального уровня некроза опухолевой ткани и подавление се способности к пролиферации К таким технологиям, которые внесли заметный вклад н решение проблемы послеоперационной выживаемости, можно отнести методы химиотерапии и лучевое лечение.

Таблица I. Традиционные ехсчЫ течения глнобметом « послеоперационном периоде

Вид лечения Гнстотии ГБ <кч классификации Л И 1 ».lunniu 1999)*

Иючорфо-кяеточим (ИМК ГБ) ГИалиморфо* KKWDiïl (ПМК гы f см«м: гони гаркая (ГЦГВ) ученом тирания BCCI .13 всегда ut« да

Химютервпия После тотального удаления опухоли •cetдл пенс юск/^ани»

Галанов А.В. ГлиобЯйСТомыбольших полушарий головного чоэга: результаты коч-SHinrpoiiaiiom .течения и фй*гГО(ЧЛ. влияющие на шотп И Аггорсф. лис. . д-ря чел наук,- М 1999.

В то же время, каждый из этих методов имеет весьма значительные недостатки и ограничения, сдерживающие дальнейшую модификацию и усовершенствование существующих схем противоопухолевой терапии н реабилитации. Иными словами, несмотря на значительный прогресе в нейрохирургичсс кой оперативной технике и развитие новых версий химиолучевой терапии, революционного скачка в улучшении исходов ЭОГМ не отмечается 1173).

Сложившаяся ситуация диктует необходимость поиска и создания новых принципиально иных технологий ранней диагностики, мониторинга и лечения пациентов, перенесших операции по повод)' ЗОГМ, Одним из направлений исследований в этой области является изучение адаптационных возможностей иммунной системы пациентов с ГБ в прел- и послеоперационном периоде н перспективы иммунологического мониторинга н лечения тахнх больных с использованием современных мегодо» противоопухолевой иммунофармакотера-пии (ИФТ), цель которой заключается как в мобилизации собственных ресурсов иммунном системы в рамках адаптационных реакций, гак и в усилении противоопухолевого иммунного о«вета с помощью иммунофармакокоррскто-ров с терапевтической направленностью (О], Очевидно, что наибольший клинический эффект может быть достигнут при комбинированном подходе - комплексном применении гралмционных программ хнмио- и радиотерапии с включением н них современных протоколов замещающей (с использованием ЬДК- или ИК-клеток), стимулирующей (противоопухолевые вакцины) или корригирующей ИФ'Г. При этом нельзя забывать о том, что в целом ряде случаев при апробации противоопухолевых иммунофармакокорректоров экспериментаторам н клиницистам пришлось столкнуться как с проблемой молекулярной устойчивости клеток глиомы к цитотоксическаму действию иммунотроппых средств, так и с феноменом ассоциированной с глиомой имыуносу прессни, обусловленной усиленным алоптоэом лимфоцитов периферической крови [33, 68.227].

Для внедрения в практику столь сложных программ противоопухолевой ИФТ важна постановка точного диагноза, раскрывающего состояние противп-олухыевого иммунитета (ПОИ) н объем соответствующего ресурса дня включения а схему лечения современных препаратов из разряда нммунотроггных или иимуногенокоррскторов.

Таким образом, разработка и внедрение в клиническую практику средств и методов патогенетически обоснованной противоопухолевой ИФТ, направленных на преодоление барьера устойчивости ткани глномы к цнтотокеиче-скому действию нммунотронных препаратов, а также повышение эффективности противоопухолевой терапии в предоперационном и раннем послеоперационном периодах, является актуальной проблемой в нейроон ко логин.

Известно, что развитие и л регрессирование ГБ в значительной степени связано с состоянием целого ряда звеньев ПОИ и, соответствен но. с формой иммунопатологии, определяющей клиническую картину заболевания, степень ннвазивности. а также вероятность прогрессирования опухоли в целом, При этом, помимо апоптоза для роста глиальиых опухолей, огромную значимость во взаимосвязи с другими параметрами клеточного иммунитета и продукцией ряда цнтокннов приобретает картина субнонуляциокного состава клеток пери фермческой крови патента (ССКПК). отдельные компоненты которого могу* играть определяющую роль в контроле опухолевого рос-га н в патогенезе ГБ в целом, и в первую очередь, на уровне механизмов контроля интотокснчности [95].

В .»той связи при разработке перспективных стратегий будущего в диагностике н лечении ЗОГМ возникает необходимость фундаментального исследования состояния ПОИ и отдельных его звеньев у больных с различными вариантами течения ГБ [32, 183], Тем более, что в последние годы изучение иммунолога ческой реактивности в самом широком понимании приобрело особое значение не только в мониторинге* но и в прогнозировании течения и исходов ней-рооикопатологин [6], 176].

В будущем результаты таких исследований внесут весомый вклад в патогенетическое обоснование и разработку новейших методов клинической имму-ногенодиагностики и мониторинга ГБ, что поможет преодолеть существующие препятствия в послеоперационном лечении ЗОГМ [173, 2 И |г

L2 Цель исследовании.

Целью работы явилось сравнительное исследование субпопу л я и ионного состава клеток периферической кроан (ССКПК) нрн различных вариантах течения глнобластом и выявление пагогенетически и клинически значимых им-мунофенотииическнх маркеров, определяющих степень тяжести и прогноз у больных с глиобластомой.

1.3 исследования.

1. Изучить особенности субпопуляинойной клеточной арх тектоники периферической крови у больных с различными вариантами течения ГБ;

2. Иеслеловать характер ассоциативности и возможные корреляции межлу содержанием отдельных клеточных еубпопуляцнй периферической крови или субпопуляцнонных кластеров с одной стороны и клннико-морфологическими особенностями ГБ, с другой;

3. Оценить патогенетическую н клинико-диагностическую значимость выявленных корреляций у больных с различными вариантами течения ГБ;

4, Разработать и внедрить в практику онколога и нейрохирурга протокол оценки ССШК как дополнительный клннико-нммунологичсскнй критерий диагностики, прогноза и лечения ГБ.

1.4 Теоретическая и практическим шачимость раоопш.

Впервые проведено комплексное исследование ССКПК у больных с различными вариантами течения ГБ, по итогам которого »несены уточнении в некоторые звенья иммунопатогенеза злокачественных глиом головного мозга. Выявлено существование различных иммунологических фенотипов, отличающихся по степени выраженности иммунодефицита и наличием аутоиммунного синдрома. Показано, что прогрессированис глнобластомы зависит ог формы иммунопатологии, а том числе, ог субполуляцнонной архитектоники периферической крови, определяющей, в значительной степени, особенности патогенеза и клиническую картину заболевания, Предложенные дополнения к существующей концепции нммунолатогеием ЗОГМ позволят выявить предикторы неблагоприятных исходов ГБ для установления прогноза заболевания и дальнейшей тактики лечения. Результаты проведенных исследований могут найти Применение как и нейрохирургической, так н в клнннко-иммунологи ческой практике в качестве современных методов диагностики и лечения злокачественных новообразований ЦНГ.

1.5 Публикации внедрение в практику.

По теме диссертации опубликовано J4 печатных работ. Основные результаты диссертации представлены в материалах публикаций и докладах t-ro Всероссийского конгресса "Профессия и здоровье". Москва 2002; 5 конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофар-макологни», Москва 2002; II конференции иммунологов Урала, Пермь 2002; Па XXII конгрессе EAACI, Франция 2003; На VI, VII и VUJ Всероссийском научном форуме с международным участием " Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", С - Петербург 2002, 2004 гг. соответственно; III съезд нейрохирургов России, С.-П-. 2002; I Международный конгресс "Здоровье и лекарство* Тбилиси. Грузия; 2004г., Вестника РАМН. 2005, 13th World Congress of Neurological Surgery (Marrakech. Morocco. 2005), Московское общество нейрохирургов (Заседание № 98 27 апреля 2006 года); на страницах журнала «Адлер-гология и иммунология» (2006, 7.1, С. 10-14).

Предложен для использования в клинической практике алгоритм мониторинга больных с ГБ. направленный на выбор адекватного комбинированного противоопухолевого лечения. Дня оценки эффективности проводимой противоопухолевой ИФТ у больных с ЭОГМ предложен дополнительный иммунологический критерий - сочетанное определение содержания цнтотоксических клеток и маркеров экспрессии Fas- и TNF- опосредованного алоптоза.

1.5.1 Форма внедрений.

• Акт о внедрении в практику' протокола мониторинга больных с г л ноблас гомон

1.5.2 Уровень внедрения.

• Нейрохирургическое отделение МОНИКИ

• Нейрохирургическое отделение ОКЕ г.ТверИ

II ОБЗОР

ГЛИАЛЬНЫЕ ОПУХОЛИ ГОЛОВНОГО МО ЗГА СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ КЛАССИФИКАЦИИ. ИММУИОПАТОГЕНЕЗА И ИМ-МУНОГЕНОДИАГНОСТИКИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности субпопуляционного спектра клеток крови у больных с различными вариантами течения глиобластом: патогенетические и клинические аспекты»

В структуре смертности населения России онкологические заболевайия продолжают занимать второе место, а злокачественные астроцитарные глиомы составляют до 50 % »сеч первичных опухолей головного мозга, причем половину из них составляют ГЬ| 16].

Прогноз для больных с ГБ остается неутешительным. СПЖ у данных пациентов на сегодняшний день не превышает 50-60 недель (по скоротечности 2-е место после острого лейкоза), а пятилетняя выживаемость менее 10 % [51. 55. 131,142, 157],Лечение и прогноз глиом о значительной степени базируются на адекватной современной классификационной оценке этих опухолей. Явным упущением является недооценка новых методов иммунодиагностики и иммунотерапии чгнх больных.

Данный обзор является отражением современного состояния знании, касающихся особенностей классификации, иммунонатогенеза, течения и прогно¡12 Классификаций и прогноз глиом.

Существующие классификации глиом не всегда удовлетворяют требованиям специалистов, многие из них. включая, последнюю классификацию ВОЗ 2ООО-го года, имеют ряд неточностей. Недостаток воспроизводимости гистологической диагностики может приводить к появлению противоречивой информации по эффективности лечения больных. Проблема создания унифицированной классификации опухолей глналыюго ряда остается актузльнойТсрмнн "глиомы", имеет корни в устойчивом словосочетании ¿чинимые клетки. относящихся к производным нейроналыюй трубки, обычно используется по отношению ко всем опухолям этого ряда, Среди них выделяют производные астроннюв - астропнтомы (А), к которым относят: а) фибриллярные, протоплазма тнчеекис. пилоцитарные. 6} анапластнческнс ястроцнтомы (АЛ) и, наиболее злокачественные, в) мультнформные глнобластомы. Оли годен дрог-лномы являются производными олигодендроцигов, в эпенднмомы — эпендимой ктон.

Домннируюшнс тины А позволяют классифицировать их по клеточному типу следующим образом [7й|. "Обычные" А: фибриллярные, чемкетоинтиче-ские. протоплазматическне и "Особые" Д: пилоцитарные и мозжечковые мик-рокнетозные.

Долгие годы было принято деление А по степени злокачественности по Кернохану [¡04]. Глиомы делились на 4 степени гзокачественноегн (табл.2),Деление основывалось на таких признаках, как наличие анаплазнн, ядерною плеоморфизма, количество мктоэов.

Таблица 2. Соответствие К"Г и МРТ признаковникатссгнсмноси« миом чги'рсч пемснын ш-ка честен ноет по КсрнотпГ|(ПСНЬ ),10к1'К01№-НОСТИ по Ксриомну КТ иршнаки МРТ иршиакнI 11 и жим и л си нос? ь, о го 1 сг-НИС МИСС |ффг к" 1 а ПтмгачккМ сигнал, пгг)тапие чисс "ффентз11 Низкая плотность + масс эффект Патологический сигал + мисс кффскМIII Наличие «онг рае 1 ною усилении IV Некро* (наличие щлыкобрмиго иицчкптщ уенлення) Глиомы высокой степени покачественностн. ГБ отличаются от менее злокачественных опухолей - ананласгнческнх астроцитом, последние ведут себя по иному, чем ГБ. Это касается возраста больных, длительности анамнеза заболевания. продолжительности жизни. Имеется дополнительный критерий морфологической характеристики ГБ невозможность определить клетки, из которых произошла опухоль [б]. В зарубежной литературе часто употребляются термины - глиомы III-IV степени злокачественности, злокачественные глиомы, что соответствует А А н ГБ по классификации ВОЗ.

Морфологический диагноз глнальных опухолей следует формулировать с не пол изо вам нем классификации ВОЗ 2000 г., выдержка из которой представлена в таблице 3.

Несмотря на попытки ряда авторов (10, 41, 42, 138] выделять многообразные гистологические типы глиальных опухолей * четко прослеживается тенденция к рассмотрению ГБ как единой нозологической формы. Основанием для этого является резко выраженный полиморфизм цитологической композиции ГБ, что делает крайне затруднительным выделение среди них отдельных разновидностей. По классификации ВОЗ (1993) выделено два варианта ГБ; гиганток-леточная н глиосаркома. В гистологической классификаций ВОЗ (2000) выделено две отдельных формы ГБ: мультиформная и глиосаркома [8]. В Институте нейрохирургии им. Н.Н Бурдснко<1998) разработана цитологическая классификация ГБ, включающая три основных разновидности опухоли: изоморфокле-точная, полнморфоклеточная и гемнетоцитарная ГБ [3]. Эти цитологачсскнс разновидности различаются клинически, патоморфологичсски и прогностически (табл.4)[9]. Наименьшая СПЖ зафиксирована у больных с изоморфоклеточнон формой ГБ -9,3 месяца, наибольшая при гемнсгоцктарной ГБ -19,5 месяца, а при поли морфоклеточ ной ГБ СП Ж занимает промежуточное положение и составляет в среднем 14,7 месяца [3].

ТдГчина 4. Цнт«ло1нч«кис раиноВИ.1НОС1И И мрм МОТ 1ЛИвй1ШСЧГистотип ГБ {по классификации А, в Гопанова 1999}' Изоморфо-клеточная {ИМК ГБ) Полимофо-клеточная (ПМК ГБ) Геммстоци-тарная (ГЦ ГБ)Средняя выживаемость (в месяце*) 9,3 14.7 19,5Толам» А В Глнобластомы Ослышх полушарий голоного мозга ре9ущ>т»ть1 коы«имнрс«аного лечения и факторы, влияющие на »полтот И Автореф дк д-ра меа нэук - М 1999 Достаточно четкое разделение на четыре степени -злокачественности используется в клинической работе североамериканских медиков (табл.5).

Тя&шна 5- Классификация глиом (Ассо-ниаиня не»! (кинру ртов США - А Л N,4,2001)I н III IV•Пиащтроп «проекте •< ъб кшиимальмаа пшпок-.»■очная ас< (ммт I »чя рипмгаИа •Ктпмаюипа агтроишоча *< > Гнисш нмоха гга чип как, про* 011.1 а пч-1 ичс кан) астрошл ст> • (пГНаНЧОНа » Олшо.имдрюмиоча ■¿тропотом* > 4nalLiacm.iici.-au а Лнаплагтичсская гмс<ианман 1.1Иоча • М),1ыафф)тап ГБ* 1.явнма нгрпип Частота встречаемости глиом различной степени злокачественности: ГЬ, анапластичсская астроинтома, глиома низкой степени злокачественности - 5:3:2 [76]. В целом СПЖ при глиомах различной степени злокачественности выглядит следующим образом: I степень - 8-10 лет; П степень - 7-8 лег; III степень -2 года; IV степень < 1года.

С прогностической точки зрения целесообразно рассмотреть два крайних варианта роста глиом, вероятно связанные с их биологическими особенностями (7, 8,98,99, 100].

Первый характеризуется наличием в полости черепа глиомы, вызывающей выраженную дислокацию срединных структур с наличием синдрома внутричерепной гипертензин. В случае глиом высокой степени злокачественности значительную роль, определяющую клиническую картину, может иметь перифокальный отек. Характерно и то, что при проведении коргнкостсроднон терапии в этом случае часто могут регрессировать не только гипертензнонный синдром, но и локальные симптомы; полностью или частично. Уменьшение с давления мозгового всшсства с определенным регрессом симптомов может быть прогностически значимым для течения послеоперационного периода.

Основным прогностическим критерием у больных с глиомами является гистологический диагноз, в соответствии с классификацией опухолей ЦНС ВОЗ 2000 г. (Стандарт), Поэтому тактика лечения прежде всего определяется гистологическим диагнозом. Другими важными прогностическими критериями являются молскулярно-гснетнческис особенности опухоли, возраст пациента, общий статус (обычно — коэффициент Карновского), выраженность внутричерепной гипертензии, сопутствующие заболевания. Эти факторы также в определенной степени влияют на выбор тактики лечения.

Другие опухоли, формально по морфологической классификации ВОЗ относящиеся к нейроэпителнальным, или глиальным, как то эпеидимомы, опухоли сосудистого сплетения, иейрональные опухоли, иейробластнческие опухоли, пинеальные паренхиматозные опухоли, эмбриональные опухоли, — все это отдельные виды опухолей, существенно различающиеся по биологическим и клиническим особенностям от астроиитзрных и олигодендроглиальных опухолей, итребующие иных подходов к лечению, иных стандартов. Обычно в рамках глиом эти опухоли в настоящее время не обсуждаются.

11.3 Наследственные синдромы, ассоциированные с глиомами.

Рак - заболевание генетического аппарата клетки- ГБ крайняя стадия генетической нестабильности клетки. В основе патогенеза ЗОГМ лежат генетические нарушения. Так мутации генома ведут к потере контроля клеточной пролиферации. Эпнгеиитнческие изменения ведут к неправильной экспрессии собственных генов клетки.

В развитии и прогрессировавши иммунных нарушений прн ГБ, весомую роль играют не только эффекторные, но и нммунорегулягорные сдвиги, способные влиять на динамику противоопухолевой цитотоксичности и эволюцию заболевания в целом. Такне сдвиги, по мнению ряда авторов, формируются еше в доклинических стадиях заболевания одновременно с характерными для опухоли геномными перестройками.

Генетический портрет каждой опухоли индивидуален. Идентификация специфических генных нарушений, имеющих непосредственное отношен не к патогенезу ГБ, создает предпосылки для адекватного лечения ЗОГМ.

С глиомами ассоциируются следующие наследственные неврологические опухолевые синдромы: канцерозный синдром Ы - Ргаитеп! (врожденная мутация р53), нейрофнброматоз первого н второго типа, туберозный склероз, синдром Turcot. Для каждого синдрома были идентифицированы: клиническая манифестация, локализация гена и функции, кодируемых им белков [119].

Большинство генов, отвечающих за врожденные опухолевые синдромы, это гены - опухолевые сунреесоры, T7F.7 гены, которые в норме подавляют клеточную пролиферацию и рост опухоли. Потеря или инактивация этих генов может привести к образованию опухолей и их мрогресснрованню. При глиомах корреляции врожденных генетических аномалий с онкогенезом белков была продемонстрирована в следующих случаях: мутация гена р53 (синдром Li-Ftaumem) и развитие асгроцитом; мутация гена 11Ф 1 и развитие иидоцитарных астроцитом; мутация геиа ИФ 2 и образование энендимом [115).

К приобритенным повреждениям генетического аппарата клегкн значимым в патогенезе ГБ можно отнсстиамплнфнкаиию онкогена EGFR, делению I-н, 10-й хромосомы,Для прогноза продо.чжнпшъности жизни больных с ГБ наибольшее значение имеют пролиферативный потенциал опухоли, определяемый в виде индекса меченного антигена ядер нролнфернрукнцих клеток (ИМАЯПК), экспрессия внутриклеточного домена рецептора эпидермзльного фактора роста (EGFR). экспрессия онкобелка p2lras, интенсивность процесса анонтоза в опухоли (11). а также состояние клеточного иммунитета макроорганизма. Наличие экспрессии EGFR значительно сокращает сроки выживания, тогда как экспрессия р21 и интенсивность процесса алолтоза более 0,5% существенно увеличивают СПЖбольных. Из молекулярно - биологических факторов, определяющих эффект использования химиотерапии при ГБ. экспрессия онкобелка р53 имеет положительное влияние на се результатах, а экспрессия bcl-2 и p2lras- негативное влияние!«, t37. 162).

11.4 Роль апоптом.

С одной стороны ингибироваьие апоптоза в малигнизированных клеткахприводит к росту опухоли. Клсгочиая смерть регулируется активностью антн-апоптотичсскнх и проапоптотичееких факторов. Вс1-2 н сю 1'омологнчные протеины - ингибиторы митохондрзльной фазы апоптом. В нормальной ткани здорового мозга Bct-2 выявляется с помощью моноклональных антител в цитоплазме глнальных клеток. Иншбирующее влияние на аноптоз оказывает также survivin, который присутствует в клетках глни. Предполагается, что Bet-2 и survivin - лва апоггтотическнх ингибитора, действующие через разные антиапоп* тотичсские механизмы [Í2J. А нарушение регуляции в системе енгналнровання через survivin может влиять на развитие опухолей, н том числе, ГБ и других, Проапоитотнческнм, способствующим агюптозу действием обладает Лаг-онкоген, который выявляют в низких количествах в клетках головного мозга, В норме в клетках глин экспресснруются и AuA-протенны, располагающиеся пере-иуклеарно. Хорошо изучена роль, мутирующего при глиобластоме, супрессора малигинзапнн. проапоггтотического онкогена Р53. [102,205, 206|.

С другой стороны апоптотическне процессы и нммунокомпстентных клетках во взаимосвязи с нарушением продукции» ряда цнтокниов играют весьма существенную роль в патогенезе злокачественных новообразований, в первую очередь, на уровне механизмов контроля цнтотокснчности (74). Для ГЬ> характерным является иммунодефицит с преимущественным поражением клеточного звена. При лом отмечено снижение уровня функциональной активности Т-лимфоинтов и естественной интотоксичносш (активности естественных клеток-киллеров, или Т^К-клеток). а также уменьшение циркулирующих в периферической крови количества зрелых Т-кдегок в случаях агрессивных форм ннзколнфференцированных ГБ. Все приводит к тому, что иммунные реакции при онкологических заболеваниях подавлены.

11.5 Иммунобиология глиом.

Взаимодействие иммунной и нервной системы осуществляется посредством секреции нммунокомпстентных субстанции [36, 160. 165], включая ин-токины и Другие агенты [43,86. 103].

Все опухоли и глиомы, в частности, обладают свойствами антигенности и иммуногениости, но чаще зто собственные антигены, характерные для ранней эмбриональной стадии развития или результат неконтролируемой гнперпродук-цнн некоего фактора или опухолевош маркера, Поэтому в основной своей массе опухоли слабо иммуногенны [П4]. Причиной низкой нммуногенности большинства опухолей может бьпъ не отсутствие опухолевоспе пифических антнгенов, а недостаточность функции антиген-презентируюпшл клеток (ЛИК), приводящей к нарушению процесса презентации опухолевых актагенов клеткам иммунной системы (107,221 j.

Если клетки опухоли не экепресснруют антигены III Л класса II. инициация иммунного ответа на уровне клеток-хелперов зависит от процесс ил га опухолевых антигенов специализированны ми АГ1К, Роль антигенпречеитующих клеток в ЦНС. по мнению многих авторов, отводится микроглни [66, 73, 128. 192].

ПроцессированиыЙ опухолевый антиген в комплексе с антигенами HLA 1-го класса может распознаваться шпотоксичсскнми CD8+ клетками, которые в результате тгого могут активироваться и уничтожать опухолевые клетки, что характерно, в первую очередь, для сильно иммуногенных опухолей [13].

Несмотря на определенную изолированность головного мозга, клетки иммунной системы вступают в тесное взаимодействие с онуходыо [65]. Относительно глиом доказано, что зкспресснрованные на поверхности члокачесгнен-ных клеток антигены представляются иммунокомлетентным клеткам (Т-киллерам и Т'Хелпсрам). как постредством главного комплекса гистосавместч-мости (ГКГС) I класса [116. 117J, так и ГКГС 2-класса с помощью профессиональных антиген-презентнрующих клеток [124, 139, 155,168, 172].

В индукции анергии Т-клеток как одного нэ механизмов иммунологической толерантности опухолевых клеток ключевое значение имеет неполнотаиндуцирующего сигнала, а точнее, отсутствие кости мулянни Т-клеток через мембранную молекулу С 028. Обычно это имеет значен не в случаях, когда анти-генпрезентнрующие клетки не экслресснруют костнмулнрующис молекулы В7. Главному комплексу гистосовмсстнмости для эффективного иммунного ответа необходимы полноценные кости мул яторные сигналы осуществляемые молекулами В 7.1 (СГОО) В7.2(С1>86)124, 178]рис1,Анергию Т-лнмфоцнтов можно легко индуцировать ш уКго. стимулируя их через Г-клеточный рсцегпор(ТСк X си гнал 1) в отсутствие костнмуляиин (сигнал 2). При этом анергия, возникающая из-за отсутствия кости мул нруюше-го сигнала, обратима, ибо ее легко устранить, стимулируя Т-клсткн посредством ИЛ-2Рис I. Характер и>ам%н1,м.-нстпии Г-,1нмф<нпп"н с АПК с участием июнч).»горных сш ни«в.(а) Т-сеН-АРС 1шегас(юп(Ь) Со5(1ти1а{1оп Ыоскас1еНедавно идентифицированный гомолог В 7.1/2 протеинов В7-Н1 демонстрировал в экспериментах способность угнетать С04+ и С1>8+ клеточную активацию- При этом выявлена высокая степень экспрессии данного протеина на поверхности клеток глиомы при ничком уровне в здоровой глиальной ткани, что может косвенно объяснять уход клеток глиомы от иммунного распознания и деструкции 1218|.

Таким образом, несмотря на изначальную нммуногенность глиом, развитие выраженного иммунного ответа или воспалительных реакций внутри ЦНС. как правило, не происходит, поскольку существует ряд механизмов (слабая экспрессия молекул ГКГС на клетках мозга, низкие концентрации во внутри мозговом микроокруженнн компонентов комгтлемента в сочетай и и с повышенным содержанием медиаторов е нммулосупрессорнымн свойствами, таких как трансформирующий ростовой фактор-)}, простагландин Е2. протеин В7-Н1. нн-терлейкнн-10). которые снижают активность иммунных процессов в головном мозге [54.65,69.147,218.227].

Опухолевые клетки также могут быть лишены и других молекул, например лейкоцитарного функционального антигена (ЬРА>-1 и (ЬРА>3 или молекулы межклеточной адгезии (1САМ)-1, необходимых для адгезии лимфондных клеток, либо же они могут экспрсссировать антиадгезивные молекулы. В результате снижаете* эффективность межклеточной кооперации, усиливается продукция факторов е нммуносупрессорными свойствами и происходит формнрованне Т-Клеточных дисфункций через механизмы связанные с усилением апоптоза лимфоцитов.

Эффективным механизмом цитотокенчиоетн опосредуемым Т-клетками может быть апотот через Fas/Fas-ли гаидн ый путь |37. 186. 212], Злокачественные глиомы экснресснруют высокий уровень Fas-R, тогда как в окружающих ннтактиых нейринах и астроинтах выявлен очень низкий уровень рецепторов Fas (211 J. Разные гнетоформы глиом могут иметь различные варианты экспрессии F as/Fas-L [75,173, 194], что могло бы служить для оценки восприимчивости этих клеток к апоптоэу и. соответственно, помочь при коррекции схем противоопухолевого лечения [74. 182],11.6 Клеточный иммунитет при глиомах.

В предшествующих исследованиях были отмечены изменении Ткл «очной активности у больных с ЗОГМ в зависимости от гистологического типа опухоли J40,172].

Примерно в 45% случаев вокруг опухолевого очага наблюдается инфильтрация лимфоцитами, относящимися к субпопуляиии Т-клеток-хелнсров, различной степени выраженности, что ряд авторов расценивает как защитную противоопухолевую реакцию при ГБ.

Более 50% Т-хелперной популяции жспресснруст CD45RO фенотип -маркер активности или памяти Т-клеток. СП>45КО-клеточный инфильтрат развивается как ответ на специфическую антигенную стимуляцию и вызываетувеличение количества адгезивных молекул — 1.РА-3. С02. а также продукции большого количества цитокннов. Неактивные Т-клеткн, представляющие С1>45КА фенотип, составляют лишь 8-35% клеток околоопухолевого инфильтрата. При инкубаинн Т-лнмфоцнтов с ннтерлейкнном-2 (И-2) 1п у||го процент С 1)45КО позитивных активных лимфоцитов увеличивается. Предполагают, что С038 позитивные клетки опухолевоспсцнфнчны. ибо они влияют на опухолевый рост мере! секрецию факторов роста.

В современной литературе в качестве одного из механизмов разлития иммунных нарушений у больных с ЗОГМ обсуждается повышенная готовность лнмфонлных клеток к индукции апоптоза Выявляемое в некоторых работах снижение количества С04+ н С08+ Т-лимфоцитов у больных злокачественными глиомами может косвенно свидетельствовать о возможности усиления программированной гибели лимфоцитов (101}, Известно, что реализация программы апоптоза периферических Т-клегок во многом зависит от уровня экспрессии на их поверхности Ра5-реиентора(С1>95)(129, 136).

Работами Р.$зв5 и соавт. [175] было показано, »по клетки астроинтомы высоко экспресснруют функциональный Няа-лиганд (РааЬ), при связывании с которым происходит деления Ра*+ Т-лнмфоии гов, ннфнльтрнруюших онколь,В то же время, в некоторых работах |15] показано, что среди больных со ЗОГМ не было зарегистрировано снижения абсолютного количества лимфоцитов, а также содержания основных Т-КЯеточных субпопуляций (СОЗ+, С04+,26CD8+ Т-лнмфоиитов). Белее того, сравнительна* оценка уровня ano птоза лимфоцитов не выявила достоверных различий ы относительном содержании апоп-тотичсскнх клеток среди свежевыдслснных мононуклеарных клеток, а также в 24-часовых культурах иитактных и КонА-стнмулнрованных мононуклеарных клетках в группах больных злокач ест венными глиомами н здоровых доноров. Вместе с тем» у больных с ЗОГМ (в отличие от здоровых доноров) было обнаружено двукратное снижение количества CD95+ лимфоцитов и уровня экспрессии Fas-peuemopa, что расценено как защитная, адаптационная реакция организма, направленная на предупреждение гибели лимфоцитов.

Такая мозалчность мнений по поводу Т-клеточного иммунодефицита может быть связана с различными i нстоформами опухолей и соответственно с различной экспрессией Fasl„ и других факторов с нммуносупрессоркыми свойствами.

11,7 Лабораторные методы в ранней диагностике ГБНесмотря на несомненную нммуногенность глиапьиых опухолей тем, неменее не существует объективных лабораторных тестон, позволяющих достоверно верифицировав диагноз астроцитарной глиомы в доклинической и ранней клинической стадии. Описаны лишь отдельные случаи повышения концентрации в крови карцннозмбрнонального антигена и альфа-фетонротенна у больных с ГБ. Имеются работы, указывающие на достоверное повышение в крови пациентов с ГБ уровня нсйроспецифнчсскнх белков (НС Б) - NSE. а I-BG.ti2-BG, S-100. танасцнн, gpJOO, gp24ö, MAGBI, MAGE2 н др.|2, 47. 48. 113. 215], 'по пока не открыло широких перспектив дня диагностики опухолей головного мозга. В литературе превалируют сведения о клиническом применении в диагностических целях глиофибриллярного кислого протеина GFA, баска S-100. специфического альфа-2 гликолротенда (a2-GP), нейроспсцифн ческой енолаэы - 14-3-2 К некоторых других. Большинство работ посвящены анализу НС Б в культурах гканей "ЮГМ и выявлению их в спинномозговой жидкости [17|. Уровень ИСБ у больных со злокачественными глиомами не коррелирует со степенью дислокации срединных структур. Вместе с тем, для больных с ЗОГМ отмечено характерная особенность - наличие обширных очагов некроза значительно снижает уровень определяемых НС Б в сыворотке крови. Уровни НСБ в сыворотке в первую очередь определяются гнстоструктуроЯ новообразования и уровнем злокачественное™. Высокие концентрации могут присутствовать и при малых размерах опухоли. Особенностью опухолевого процесса является антигенное "упрощение" малнгннзнрованной ткани, а также активация синтеза некоторых белковых компонентов специфических для той или иной ткани [21Интересным и псреспективным является анализ экспрессии значимых в онкопатологии генов (метод экспрессной и ых микрочинов). позволяющий выделить «паттерн генов» определяющих тактику лечения и прогноз ГБ.

Н.8 Особенности картины иммунопатологии при глиомах.

Выраженность иммунологических сдвигов у пациентов с ГБ может заметно различаться по глубине и спектру- Комплексные исследования в этом направлении, в том числе, наши собственные[19], покатали, «гто для больных с ГБ характерным является существование, по меньшей мере, двух иммунологических фенотипов - фенотипов I с картиной выраженного иммунодефицита и II- без явного иммунодефицита,У больных с фенотипом I содержание в крови СДО5 -лимфоцитов в среднем в 2-3 раза превышает норму. тогда как для фенотипа II превышение таких показателей не более 30-60%. При этом индексы апопгоза СЕ)957СОЗ' и С095 /С04" у больных с фенотипом I выше нормы в 3-5 и 1,5-2 раза, а в группе с фенотипом И - менее, чем на 40-50% соответственно от нормальных цифр. Такое различие связано с высоким уровнем апоптотнческой активности Г-клеток у больных с фенотипом V. Не исключено, что у них механизмы Ра$-опосредоаанного апоптоза могут играть существенную роль в патогенезе опухоли, а вследствие апоптотн ческой гибели основных субпоиуляцнА Т-лимфоцитов, способных противостоять прогрсссированию ГБ.

В группе I выявлено значительное увеличение в крови ГИР-у, что позволяет предположить о его влиянии на апоптоз в лимфоцитах при ГБ. Выявлена достоверная отрицательная коррелнщм между концентрацией №-т в сыворотке и количеством проаноитотнческнх СГУ?5-клеток.

У больных с фенотипом tí показатели TNF-a (ФНО-Ct) н INF-y практически не отличались от таковых, установленных для здоровых доноров.

Таким образом, для ГБ характерно наличие, по крайней мере» двух иммунологических фенотипов, что вероятнее всего обусловлено различными гисто-тнпами 30 ГМ, и должно учитываться при разработке современных программ re но- и иммунодиагностики, а также клннико-нммунологнчсских критериев лечения ГБ. Полученные нами [20] данные позволяют предположить, что алоп-тоз Т-лнмфоиитов, регулируемый через продукцию INF-y или ФИО-«, играет важную роль в патогенезе ГБ и может служить одним из объектов исследования при создании современных технологий иммунодиагностики ГБ.

При быстром прогрессировать опухоли может происходить обеднение основного пула зрелых Т-лнмфоцнтоа и истощающие ресурсы собственного ПОИ. что наблюдается прежде всего у больных с фенотипом I. Ослабление ПОИ подтверждается резким снижеиием уровня естественной //итотаксично-ста (ЕЦТ). Такие больных составляют группу особого риска и при их лечении оправданы средства обеспечивающие торможение агюптотнческой активности зрелых нммунокочпетентных клеток.

У больных с фенотипом It. имеющих минимальные отклонения в показателях апоптоза, уровень ЕЦТ и сывороточной продукции ФНО-а и INF-y сохраняется а пределах физиологических значений.

Вместе с тем, появление у отдельных пациентов с ГБ сывороточных ау-тоАТ к ней роспецифи чески м белкам, опухолево-ассоцннрованным протеинам натолкнуло исследователей на мысль о развитии у таких пациентов особой формы опухолевой иммунопатологии, объединяющей иммуноднфецит и обсуждаемый в литературе опухолево-ассоциированный аутоиммунный синдром {227).

Не исключено, что при дальнейших исследованиях будут установлены основные иммунофснотипнчсскне особенности и клнннко-нммунологнческне критерии ГБ. что будет положено в основу клиннко-иммунологической классификации нейроглиальных опухолей.

Большое значение в днфференцнровке и пролиферации клеток ГБ играют факторы роста и цнтокнны (69.207). Роли ниток и и он в регуляции злогггоза при опухолях глнального ряда в последние пять лет, вообще уделяется особое внимание Многообразие биологических эффектов нитерлейкинов и их ключевая роль я поддержании иммунологического гомеостаза делает понятным, почему нарушение баланса а системе цитокинов - важный механизм развития многих патологических процессов 114,27. 92, 106,151,163, 224],Известно, что оикопроцесс представляет собой параллельное су mecí вола ни с двух развивающихся и противоборствующих систем. При этом способностью непосредственно взаимодействовать с питокинами обладают не толькоклетки, обеспечивающие поддержание t омеостаза, но и, как выяснилось, клет31км опухоли, Следует отмстить, представлении о сугубо антагонистических взаимоотношениях опухоли и иммунной системы организма хозяина являются упрощенными. Факты свидетельствуют о том, что иммунная система часто не только отторгает растущую опухоль, но и активно помогает опухолевой прогрессии. В тоже время опухолевые клетки приобретают в процессе своего развития свойства характерные для н мму но компетентных клеток: способность к избирательной миграции в ткани, адпезнвность и инвазнвность. На трансформированных клетках можно обнаружить рецепторы присущие клеткам иммунной системы, что говорит об их генетическом родстве (4].

Из сказанного следует, что в условиях роста опухоли существуют две системы взаимодействия с интерлейкинамн: имиунокомпстентные клетки -интерлейкшш и опухолевые метки - ш/терлейкшы, Именно в этом состоит уникальность реализации биологических эффектов нитерлейкннов при злокачественном росте, н именно этот аспект исследований вызывает наибольшее число вопросов, на которые в настоящее время, к сожалению, нет ответов.

Как известно, прн ГВ элиминация опухолевых клеток нз организма пациента происходит без активационных (костнмуляторных) сигналов, имеющих нсспсцифнческую природу, в связи, с чем сегественный ПОИ оказывается относительно слабым н может быть преодолен прн участии нммуносупресснвных механизмов [ 114],Механизмы же специфического иммунитета с участием В-лимфоцктов, противоопухолевых антител и антителозависнмых Т-клеточных реакций начинают проявляться при заметном накоплении массы опухоли, Они вносят существенный вклад (до 90% клеток начальной опухоли уничтожается и лишь 10% способны пролиферироватъ). но предотвратить рост опухоли, по-видимому, уже не могут, поскольку, основной механизм защиты от опухолевого роста не гуморальный, а клеточный.

И.9 Имуногенодиагностина ГБ.

Естественно, что изучение столь гонких молекулярных инструментов какцнтокнны, обеспечивающих кооперативное взаимодействие между гуморальным и клеточным звеньями иммунитета. становится одним из стратегических направлений при создании современных средств нммуногенолиагиостики и нммуногеиотерапии злокачественных новообразований и ГБ, в частности.

Поскольку набор антигенов клеточной поверхности лимфоцитов зависит не только от типа и стадии дифференцирован клеток, но и от их функционального состояния, с помощью моноклоналиальиых антител можно не только рахличнть разные лимфоциты, но и отличить покоящиеся клетки от активированных. Антигены клеточной поверхности, выявляемые е помощью моноклональных антител, принято называть кластерами днфференцнровкн. Кластер моноклональных антител, реагируя со специфическими пол и пептидами на поверхности В- и Т-лнмфоцитов, макрофагов, нейтрофнлов и NK, выявляют их поверхностные маркеры, называемые CD (Claslcr Determinant). Наиболее существенные маркеры Т-лнмфоцитов - это CD2 ( TIJ К CD3 { ТЗ ), CD4 { Т4 ). CD5 ( Т1 ) и CDS { Т8 ). Сегодня выявлено более 200 маркеров. Аитшены CD имеют белковую природу и играют важную роль в иммунном ответе. Дифферсннироаочным пит тепам по номенклатуре Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) дастся название CD плюс порядковый номер. АббревмтатураСО, раешнфровывываемая как кластер днфферелцнровкн, обозначает группу антител, распознающих одну и ту же или близкие антигенные детерминанты, но может использоваться и для обозначения самого антигена - молекулы, распознаваемой соответствующей группой антител.

Необходимо отметить, что ряд поверхностных молекул лимфоцитов, которые, по сути, являются дифферент!ровочнычи антигенами, не включают в список CD-антигенов. Это в первую очередь антиген распознающие рецепторы как Т-лнмфонитоа (TcR), так и В-лнмфоцитоа (мембранные иммуноглобулины -mlg), а так же антигены ГКГС (МНС).

В последние голы изучение субпonуляционного состава клеток периферической крови (ССКПК) у больных с ГБ позволило обнаружить характерные диспропорции в составе клеточных кластеров, Прежде всего, это обеднение периферической крови субнонуляциями ДК (124, 184]. Данный факт нарушений в составе нммунорегуляторных субнону.ткций черезаычайно важен, ибо снижение уровня субиопудяннй ДК влечет за собой резкое истощение ресурсов ПОИуже на самых ранних (а первые 2-4 месяца после установления диагноза) стадиях развития ГБ, т.е., в период, когда механизмы наследственного иммунитета заметно ослаблены. ДК участвуют (вместе с косгнмуляторными молекулами} в презентации опухолсвозссоиннрованных антигенов (ОАА) Т-лимфоцитам, обеспечивая активацию последних и формирование у активированных Т-лнмфоцнтон цитотокснческнх свойств, рсстрнктнрованных по фенотипу С01 (СЭ1 -ЫКТ-клетки). Вполне допустимо, что недостаточность функции ДК (клеток мнкроглин у больных с ГБ) и входящих в их состав АПК, обуславливает нарушение процессов презентации ОАА клеткам иммунной системы, а, в конечном итоге, формирование низкой нмуногенности большинства форм ГБ [54.

Две важнейших субпопуляции ДК, экслресснрующих маркеры СР80/С086 с костимуляторными и иммунороуляторными функциями, заметно уменьшены в крови больных с агрессивными формами ГБ, снижая возможности для активации Т-нммуинтета, однако, указанные маркеры активно экс-пресснруются на клетках самой опухоли, определяя взаимодействие клеток ГБ с Т-лимфошггами и формируя, тем самым, новый механизм ускользания ГБ от иммунного надзора [178, 218]. При канцерогенезе отмечено снижение содержания большинства ДК (с фенотипом С01+/Ш1с1+, С021+, С027+, С071+ и др.), что отражает формирование у таких больных феномена опухолевой резистентности [202]. При ГБ значимым является тот факт, что в формированиисубпопуляцион ного дисбаланса, помимо традиционной пары FasR-FasL, активное участие принимает недавно описанный J.Wischhusen с соавт. [219] тандем CD7Q/CD27 (рецептор ФНО-а на иммуноцтах), дающий две альтернативные возможности - для клеток ГБ ускользать от иммунного надзора, а для иммуно-цитов, наоборот, провоцировать усиление аполтоза [212], Однако, именно Рая-опосредованный апоптоз основных субпопуляцнй Т-лимфоцитов, играет у больных с ГБ определяющую рол ь в и регрессировании опухоли [148].

Таким образом, в развитии и прогрессировавши ГБ. представляющих собой достаточно гетерогенную клннико-морфологнческую группу, весомую роль шрают не только эффекторные, но и иммунорегуляторные сдвиги в составе субпопуляцнй, способные влиять на динамику противоопухолевой цито-токсичностн и эволюцию заболевания в целом. Такие сдвиги формируются еще в доклинических стадиях заболевания одновременно с характерными для опухоли геномными перестройками, о чем свидетельствуют факты сокращения субпопуляцнй. экспрессирующнми маркеры ранней активации - CD25, CD38 (рецептор, участвующий в осуществлении адгезионных и сигналнрутощих функций) и С069 [34,6\ V Содержание в периферическом кровотоке отдельных субпопуляцнй и их комбинации в составе определенных клеточных кластеров обнаруживают коррелятивную зависимость с патоморфологнческнм типом ГБ и. соответственно, степенью злокачественности, причем высокое нлн низкое содержание субпопуляцнй отнюдь не означает ассоциативности с размерамисамой опухоли. Иммунотерапсвтнчсскне подходы могли бы предоставить желанные возможности в лечении злокачественных глиом. Но очевидно, что применяемые в настоящее время средства иммуннотсрапни не оправдывают ожиданий. Тем не менее, исследование нммунобнологнн глиом, внедрение современных методов иммуногеноднагноетики позволяет приблизиться к пониманию нммунопатогенеэа ГБ и разработать эффективную стимуляцию антиглн-омного иммунитета.Ill МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯIII. 1 Материалы, характеристика больных и клинически здоровых доноров.

111.1.1 Группы больных.

Пациентам проводились кпнннко-неврологическое, офтальмоскопическое, ото неврологическое обследование, компьютерная и {или) малмпно-резонансная томография головного мозга111.1.2 Клин ико-морфологич о с кая характеристика больных.

Для иммунологического исследования использована псрефернческаякровь больных с ГБ головного мозга, полученная от иаинснтов[п=411 находящихся на лечении в нейрохирургическом отделении МОНИКИ и НИК нейрохирургии РАМН им.И.Н.Бурденко в период с 2001 по 2003 гг. Контрольную группу составили сыворотки крови 28 клинически здоровых доноров (п=28) получение из МОНИКИ, ММА им. И.М. Сеченова и РГМУ.

Диагноз ставился на основании клнннко-морфологнческих критериев, изложенных в классификации опухолей головного мозга [ 108а также в соответствии с цитологи чес кой классификацией ГБ, включающей три основные гнетотнпа: изоморфоклеточная (ИМК ГБ), полнморфоклеточная (ПМК ГБ) и гемистоннтарная (ГЦ ГБ) [3], Доля случаев для ИМК ГБ, ПМК ГБ и ГЦ ГБ составило 61%. 15% и 24%. соответственно (табл.6).

Тайтци 6(классификация А, В. Гол а нови 1999г. ) Изоморфорклсточиая глиобластома (ИМК ГБ) 61%Полнморфоклеточная глнобласгома (Г1МК ГБ) 15%Гсмнстоцнтарнал глиобластома (ГЦ ГБ) 24%•Галанов А.В. Глиоб.чэстоии больших полушарий головного чона результаты комбмниро-ШИ1111 лечеим* н факторы, влияющие на мвшв// ЛвIиреч|| лис д-ря мел наук.- М 1ЧЧЧВсем обследуемым больным после забора крови ис позднее 9-х суток (в среднем на 4-е) проводилось хирургическое лечение, включающее в себя кост-но-нластнчеекую трепанацию, удаление опухоли.

Средний возраст больных составил 44,8года (от ]8 до 70 лет). Длительность заболевания 1-6 мсс, Средняя длительность заболевания - 2 месяца.

Оценку состояния больных осуществлял и с использованием щкалы КагпоГаку и оценивали в баллах,Задачей работы не являлась оценка катамнеза больных.

Иммунофенотипированне клеток кронн, осуществляемое методомпроточной интометрнн, позволяет оно и киль экспрессию нескольких маркеров одновременно, что использовано нами а данной работе. Показана возможность оценки гетсрогенносл! экспрессии маркеров на клетках одной популяции при анализе двумерных гистограмм - по прямому (/5С) и боковому (55С) светорассеянию, а также по флюоресценции клеток, связавших меченные различными флуорохромамн моноклональные антитела.

Позитивность окрашивания клеток анализируемых популяций мы оценивали путем наложения квадрантов на гистограмму, полученную для клеток, окрашенных негативным нзотнпичсским контролем, В дальнейшем данные квадранты -экстраполировались на гистограммы, содержащие позитивные клетки. На гистограммах, полученных по прямому и боковому светорассеянию, легко локализовались клетки как лимфоцнтарного, так и моноцитариого рядов дифференцнровкн, причем зоны их практически не перекрывались. Это позволило использовать данный подход для введения логических ограничений (л'йдаов) по морфологическим признакам - размерам </\Ю и гранулярности (£$£).

При использовании одноцветного анализа результаты отображались на однопараметрнческой гистограмме с логарифмической шкалой, Прииспользовании многоцветного анализа данные ею каналам флюоресценции отражены на бипараметрнческих гистограммах. Для анализа популяций с низкой плотностью клеток использовали смешанные линейно-логарифмированные гистограммы типа SSC/FL.

При анализе данных мы определяли положения кластера клеток в многомерном пространстве. Использование более двух флуорохромов, и выявление на двумерной гистограмме дубль-позитивного кластера позволяло полумать четыре варианта экспрессии третьего маркера. При одновременном использован ни трех антител, меченных разными флуорохромами, нашими зарубежными коллегами получено более восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций, расположение которых в пространстве трехмерных гистограмм (FI1/FI2, FI2/F13. FI3/F11) было строго фиксированным.

Далеко не всегда популяции, позитивные по экспрессии одного маркера, экенрессировалн агорой маркер также однородно, Для оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции (например, CD3, CD4 или CPS) мы использовали различные схемы отображения возможных вариантов ко-жспрессии маркеров на двумерной гистограмме, Количественная идентичность в относительных пропорциях популяций с одинаковым итоговым фенотипом, выявленная на таких гистограммах, использовалась в качестве внутреннего контроля качества ттробол од готовки.

Данная работа была выполнена на проточных питометрах, соответствующих современным требованиям лабораторной диагностики: модель FACS Cal i bur производства фирмы Beetan Dickenson (США), модель Cyan фирмы DAKO Cylomalion (Бельгия), и модель FACS Scan (Becion Dickinson, США).I) своей работе мы использовали как траднцнониую двухцветную метку, так и комби нации монокл опальных антител, меченных пятью различными флуорох ромами. Определение иммунологического фенотипа клеток периферической крови проводилось с использованием широкой панели моноклинальных антител, включающей:• мнелоидиые (CD] I Ь, CDI4. CD] 5 и др.);• не рестриктнрованные по линиям дифференцнровки (HLA-DR. CD34,CD38, и др.);• Т-клсточные (CD2, CD3, СЕМ, CDS и др.);• В-кл сточные (CD 19, CD20, CD2I, CD22. CD23 и др.);• другие антигены.

Опенка результатов проводилась на трех разных, вышеуказанных типах питометров, в разных клеточных гейтах, идентифицируемых на основании характеристик светорассеяния. Положительными считались случаи с экспрессией маркеров, превышающих 20% анализируемой популяции.

В этом варианте использовали и иной путь: 20 мкл каждого из антител добавляли к 100 мл крови, после чего смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мнн. Далее к пробирке добавляли 2 мл FACS-ли тирующего раствора фирмы Becion Dickinson (CUJA), перемешивали, н инкубировали в течение 10 мнн, в темноте. После второй инкубационной стадии лейкоциты отделяли центрифугированием при 1200 об/мин в течение 8 мин,, дважды промывали в Na-фосфатном буфере, pH 7,4. н в итоге рссуспенднровалн в 0,5 мл 0,5% раствора параформальдегнда. Во все образцы взятой крови добавляли ЭДТА.

Вариант 2. Во втором варианте выделенные из периферического кровотока мононуклеары rio методу Boy um [38. 39] окрашивали для последующего анализа. используя меченые моноклональные антитела. В качеегве монокдоиаль-ных антител нами и нашими коллегами были использованы моноклональные антитела фирм "Протеиновый контур". Coulter Clone (антн-CDH Му-4), DAKO Cytomation (CD3. CDI9, CD20, CDS, CD25, CD22, CDtlc, CD23, CD38. CD2I (CR2) и др.) и Beclon-Dickinson {anti-Leu-4 (CD3), anti-Lcu-3a (CD4), anti-Leu-2a (CD8)jmli'Leu-l lb (CD 16), anti-Leu-12 (CD 19). ami-TCRgd н др.), а также антитела, полученные от проф. Барышникова (ЮНЦ РАМН) и доктора Филатова (Институт иммунологии), зарегистрированные на международном рынке, и аятитела, специально приготовленные в зарубежных лаборатория* нашими партнерами (напр., CD86I9", CD86 I4', CD158a. CDlSSb' и CD2'CD|50, CD27*. CD28\ CD36*, CD37", CD40\ CD44\ CD60'. CD62L\ CD63*, CD68\ CD69\ CD8l\ CD82\ CDW\ CD95"). Чаетъ из обратное крови была помечена сложными комбинациями антител с 3-цветной меткой: ■ CD 14 (My-4)/CD16 (Leu-llc)/CD4(Lcu-3a); * CDI4/CD4/anti-HLA-DR; * CD14/CD4/CD13 (Leu-M7), • CDI4/CD4/CDI lb (Leu-15) и др. Anti-CD4 и антн-CD«, используемые в отдела пых исследованиях, были связаны с перидии хлорофилл протеином (РегСР). CD 14. CP45RCJ и CD45RA - с ФИТЦ, остальные - с Ф">,В целом ряде случаен, в том числе, при анализе субпситуляинонного состава NK-клеток поверхностные фенотипы анализировали с использованием многоцветной нммунофлюордеценцин и следующих моноклональных антител: ФИТЦ-антн-Va24(C 15) и ФЭ-анти-Уа24(С15); ФИТЦ-антн-УЫ 1(С21) и ФЭ-анти-Vbl 1(С21); ФИТЦ-анти-СОЗ(иСНТ]) н CyChrme-airrK-CD3(UCHTI); ФИТ11-anti-CI>4( RPA-T4) и CyChrome-anti-CP4(RPA-T4); ФИТЦ- ami-CD8(HlT8a); CyChromc-anti-CD16(IDXt2); Cy-Chrome-anti-CD56(Bl59}. Ангн-Va24 (клон CI 5) и антн-Vhl] (клон C2I) моноклональные антитела для идентн-фнкаинн и подсчета NK клеток получены от д-ра С. Порселли, д-ра ДМстелнтцы и д-ра Т.Элбейка (UCSF, СА, USA и Keck University. CA, USA). Используемые антитела отличались низким уровнем неспецнфического окрашивания и высокой разрешимостью (при достаточной плотности аначизируемой популяции клеток определялось менее 0.01% детектируемых по двойной метке клеток).

Для контроля уровня неснецнфнческого связывания антител использовали соответствующие изотонические контроли иммуноглобулинов (Becton-Dicktnson. CUJA К меченные ФИТЦ, ФЭ и др. Из каждой пробы анализировали от 3500 до 5500 жизнеспособных клеток попадающих в соответствующий гейт, дискриминируемых по интенсивности свечения.

Содержание дендритных клеток (ДК). NK-клсток и ряда других субпопу-ляцнй было определено с учетом рекомендаций, изложенных в работах К.Willmann [2I7J, L.Metelilsa [Hl], T.Kanda с соавт. (97J, T.Takamoío с соавт. [189], Барышникова А.Ю, [ 11 и К.Toba с соавт. [193].III.2.2 Определение субпопуляций клеток крови.

Исследование ССКПК проводили в соответствии с разработанным ранеепротоколом путем нммунофеиотнпировання субпопуляиий CD1', CD Id'. CD2. CD3", CD3*HLA-PR\ CD4 CD2S CD4 CD7 CD4 HLA-DR CDS*, CD7'. CDS'. CD8CD25". CD8"HLA-DR\ CD9 CDItb\ CDMc\ CD14CD163'. CDI5\ CDI6\ CDÍ8 CD19', CD20*. CD2f. CD22\ CD23\ CD25\ CD27". CD28'. CD30'. CD3l\ CD34', CD36", CD37", CD38 CD40 CD44", CD45\ CD45RA', CD53\ CDS4\ CD56\ CD57*, CD57 CD8', CD58*, CD60\ CD62L', CD63', CD68 CD69', CD8f, CD82\ CD86 I9'. CD86 I4'. CD04\ CD9S\ CDISSa", CD 158b" и CD2TD150' на проточных цитомеграх моделей FACSСаНЬигТМ н РС500 фирм Вескюп-Окктмп н Вссктап-Соиксг (США), а также Суап фирмы ГЗако Сутотаиол (Бельгия),111.2.3 Определение 1дС. 1дМ, 1дА.

Концентрации н 1цА в сыворотках крови определял и по методуМакчинн [132].

111.2.4 Определение ЦИК.

Количество циркулирующих иммунных комплексов в крови определялиметодом преципитации в полттилаЦ'лнколе (ПЭГ) с молекулярным весом 6000 (ФРГ). Метод предложен н модифицирован Ю.А. Грнневич и А.Н. Алферовым[51.

111.2.5 Определение онкомаркероаСывороточные онкомаркеры (РЭА, АФП и ШЕ), а также сывороточныеанти-МНР, аигпи-ККЮ н анти-МАС аутоАТ определяли методом ИФА.

111.3 Статистическая оценка результатов исследований.

Статистическая обработка результатов проводилось с использованием соответствующих компьютерных программ на основе методов вариационной статистики, Оценка однородности сравниваемых групп проводилось по критерию Колмогорова-Смирнова. Для оценки достоверности различий между средними цели чинами был использован ^-критерий Стьюдента н модуль нелараметриче-ской статистки,IV РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Дня прогрессировання ГБ головною мозга, отличающихся клнннко-морфологнческнм разнообразием, характерным являются многостадийность целого ряда патофизиологических механизмов, и формирование весьма определенной картины иммунопатологии [49, 61], Онкологу приходится сталкиваться с феноменом ассоциированного с опухолью вторичного иммунодефицита (ВИД), получившего название синдрома опухолевоассоциироярнчосо ВИД (СО-АВИД), причем выраженноегь иммунологических сдвигов у таких пациентов может заметно различаться по глубине и спектру. Исследования в этом направлении, в том числе наши собственные показали« что для больных с ГБ характерным является существование, по меньшей мере, днух иммунологических вариантов такого синдрома, отличающихся масштабом супрессии иммунной функции 119» 176J. В формировании того или иного варианта СОАВИД весомую роль играют клеточные еубпопулянин, обладающие как зффекторнымн, так и регуляторнымн в отношении ПОИ функциями. А спектр циркулирующих в периферическом кровотоке таких субпопуляиий и их количественное соотношение у больных с различными формами ГБ может иметь не только патогенетическую значимость, но н определенную клиническую ценность при планировании лечебно-реабилитационных мероприятий в послеоперационном периоде [18, 2271.

Ранее выявлены две группы больных с ГБ - с выраженным и слабовыра-женным ВИД или его отсутствием [ 19. 49]. Ми в одной из вышеуказанных групп не обнаружено признаков аутоиммунных нарушений: в крови отсутствовали противоопухолевые и антнтканевые<'антнорганные аутоантитела (аутоАТ). а содержание В-лимфоиитов не превышало нормы.

Вместе с тси, появление в крови отдельных пациентов сывороточных аутоАТ к нейроспеинфнческим белкам, опухолсво-ассонинрованным и протеинам натолкнуло на мысль о развитии у таких больных особой формы опухолевой иммунопатологии, объединяющей ВИД н обсуждаемый в литературе опухоле-во-ассонннрованный аутоиммунный синдром [227]. Итоги предварительных исследований в этом направлении, выделившие пациентов с признаками аутоиммунного синдрома (табл. 8). позволили распределить всех обследованных бальных с диагнозом ГБ на 3 основные группы: в первые две {N=37) вошли больные с СОАВИД (фенотипы I и И), во вторую (N=4) - пациенты с отхокяо-ассоцинр^кшннычI аутоиммунным синдромам я сочетании с вторичным нодефицктом (ВИДОАС). Результаты дальнейших исследований субпопуляни-ониой архитектоники у больных всех трех групп отражены в таблицах 8. 9,10. а также диаграммах 1Д, 3,4.

Таблица вЛ¡t&ipa I o|f ш Je lipHMlMl *у t <И1ММ>ИНС1«0 cmjpwu у больны* с г.шобластомой lllllkHIlU ç: Крщцшмин лараштры l.mpcliuf соланд КНДОАСаукшнцуииаю гнилрочв (M) (**> n=25 n -12 n-41. Наличие в крова BIIMOtMfWtpMi: JíSt — J — +A¥f CEA — i — A

Заключение диссертации по теме «Нейрохирургия», Чумаков, Владимир Александрович

VI ВЫВОДЫ.—®2

VII ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 83

VIII ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ—Я?

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Чумаков, Владимир Александрович, 2007 год

1. Д. Галанов А,В, Глиоблмлпчы больших полушарий головного мот га: результаты иинбиш-рованого лечения и факторы, влияющие на ало птоз II Авгореф, дне д-ра чел наук.- М. 1999.

2. Галовюнн МН Вмешательство раковых клеток в процессы еофевамия н селекции Т-лимфошпов как фактор опухолевой профессии Н Иммунология - 200. -№б - С.4-Ю,

3. Гринеанч Ю А., Алферов Л. и. Определение иммунных комплексов в крови онкологических больных// Лабдсло,-1981,- №8 - С.493-496.

4. Качко» И.А■ Комбинирован»*** герани* больных со тлока>кствс иными су пратенторналь-нычн глиомами И Дне. докгора мед. наук - М., I938,125с

5. Качков И. А. Бикшчиров Р,Г., Денисова Л.Б, Биологические аспекты роста мной II Вестник практической неврологии -Можайек-Тсрра" - 1997. № 36 - С. 115-116

6. Качков НА. Бихти чиров Р Г.Денисова Л Б. Прогностические факторы при 1чо*ачсе1-венных глиомах больших полушарий головною мозга Н Материны Второго Съезда Нейрохирургов РФ. Санкт-Петербург. - 1998. - С. 106.

7. Коршунов А,Г, Сычева Р,8. Анализ юанчосигкй чежду пролифератнвиой активностью доброкачественных н анапдаетичсскнх аетроцнтом больших полушарий головного мозга и особенностей нк гисгоегруктури,',' Журн. Вопр нейрокир,- 1997. - Нч I - С.30-34.

8. Озеров С.С. Лилиями И Э. Апотот: мехлиюч, регуляция и значение и мейроонкологии // Вопросы нейрохирургии.- 2000 - №4 - С.28-30

9. Ройт А. Бростоф Дж. МеИя Д Иммунология И11ср с вигж- М Мир. 2000. - 592с.

10. Свадовскнй Л И. Бутаков Л Л. Персссдов В В. Динамика параметров иммунного статуи больных с глномдмн головного мозга разной степени злокачественности // Иммунология ■ 1996,- №4-С56-58

11. Черсмисин И М., Гайдар Б.В. Асатурин МЛ. Результаты комбинированного лечении больных с глиадьнычи опухолями больших полушарий головного мозга //

12. Вести ренттеиологин и радиологин.-1995,-4.-с. 13-15.

13. Чехонин В.П. Специфические белки нервной ткани человека и животных (идентификация. выделение, физико-химическая характеристика и клнннко-лабораторные неследовэ* пня). Диес, Д04(т, мед наук -М -1989 379с

14. Чунлкри В.А-. Качко* И.Л,, Захаров А.В., Гребне« Ю П. Пронина ОЛ., Сучков С В. Им-мунолефнцитиые состояния при гл вольных опухолях головного чоыа И АЛЛСрГОЛЩИЯ и им чу МОЛ си И» fft-№2-C 278.

15. Aeuto О. Michel F. CD28-mcdiated co-stimulation: д quantitative support lor ICR vignaling // Nat Rev Immunol 2003,-Vol.3- P 939-5

16. Adam C., Geniteau M. Gougerot-Pocidalo M- VerToust P. Lchras J., (libcn С. Morel-Maroger L. Cry oglobulin», circulating immune complexes. and complement activation in cerebral malajro Ц Infect Immun-1^81 -Vol.3l.-S30-S.

17. Alaverdi N. Shih CC, C027 Othernames: Tp5S Hi Biol Regul Homeost Agents.- 2<MM>. Vd. 14,4*237-240

18. Allison J.P. CD2B - B7 interactions in T-cell activationCutr.Opian. Immunol-1994 -Vol.6 ■ P.4N-4t9.

19. Bencdetti S., Bra/zone M.G Polio В Eradication of rat malignant gliomas by retroviral-mediated. in vivo delivery of the iwerleukm J gene II Can«r Rev, 1999 - Vol.59.-Vol.645-652.

20. Bhondeley M К. Mehra R.D. Mehra N.K. MohafHtm Л.К. Tandon P N. Roy S„ Bijlam V Imbalances in T cell«bpopuhtfom in human gliomas/IJ Nctmisurg.- l9ftt.-Vol.68.-P.589-93.

21. Blair P.J, Riley J.I. larroll R.G St Louis D C I.evine B.L. Saha В, 1.« K-P. Pcrrirt PI, Harlan D.M., JuneC.M, CD28 co-receptor signal transduction in T-cell activation I/ Biochem Soc Trans.- 1997 -VolJf-P.6SI-7

22. Bodcy B„ Bodey B, Jr, Sicgel S,E„ Katscr HI- Cpregu lotion ol'endoglin {CD 105 > expression during childhood brain tumor-rclaied angiogetwstt. AiMi-angio®enic thmtpy II Anticancer Res -1W8-Vol.18.-P. 14*5-500.

23. Bollll M4 Borthwwk N J. CD38 in health and disease //Chem 1ттшн»1 2000.-Vol,75,-P,218-34.

24. Boy urn A. I.ovhaug ЕУ, Ties land E. Nordlie Г M. Separation оПйкжуЖ improved cell purity bv line adjustmentsof gradiem medium density and osmolality H Stand J Immunol,-1991 -VolJ4.-P697-7l2,

25. Braum D P, Pcnn R D. Flannery Л.М ami Marri J. Immunotegulatory cell function in peripheral blood leukocytes of patients with intracranial gliomas H Neurosurgery.- 1982 -Vol 10,-P-203.

26. Bredel M. Pollack M!, freund J M,. Hamilton A.D. Sctoti S.M. Inhibition of Ras related Cipro« eins as a therapeutic strategy for blocking malignant glioma growth H Neurosurgery - 1998.-Vol.43.-P. 124-131

27. Bru tier У Neuropathology of malignant gliomas. /.' Scmin.Oneol 1944.-Vol.21.-P. 126-138.

28. Bruno G.,Tcga F., Corclli U4 Molfetla R and Baiucco M The roleofsubslanee P in cerebral ¡»henil// lot J. Immuntipaihol Pharmacol.-2003.-Vol. I6.-P.67

29. Cabanas С, Sane he/-Madrid F CDI8 (leukocyte inlegrin bcta2 suhumt) // J Biol Regul Mo-mcost Agents -19».-Vol. 13 -P. 137-9,

30. Chambers W.U. Bo/ik M F. Brissette-Storkus S.C-. Basse P., Redgate E„ WntkimS. Boggs S.S. NKR-P1 + cells localize selectively in lim 9L gliosarcomas bul have rcduccd cytolytic function Cancer Rev- 1996-Vol.l.- P.3516-25.

31. Chen L. Co-inhibitory molccules of the B7-CD2S family in the control ofT-edl immunity //Nal Rev Immunol -2<KH.-VoM.P.336-47.

32. Conrad C.A., Milisavljevic V,P. Yung W.K. Advances in chemotherapy for adult primary brain tumors//Neuro. Clin 1995-Vol. I3.-P. 795-812.

33. Cooper M.A. Fehniger T. A., Turner S.C, Chen K S. Ghaheri B.A., Ghayur T, Carson W.E., Caligiuri MA, Human natural killer cells: a unique innate immunoregttlMOcy role for the CD56< bright) subset tl Blood.- 2001.-Vol.97 -P.3146-51

34. Croft M. Coslimulation of T cell* by 0X40.4-ШВ. and CD271) Cytokine Grcmih Factor Rev -2003.-Vol.l4.-P 265-73

35. CsetT II F Knopf P. M Cervical lymphatics, the blood-brain barrier and immunoreactivity of the brain — a new view If Immunol Today.—1992 —Vol. 13 —P.- 507-512.

36. Daumas-EJuport С. Scheithauer В.O'Fallon J. Kelly P I/ Grading of astrocytoma: A simple and reproducible method // Cancer l98S.-Vol.62.-P.2152-2165

37. Deaglio S., Mehta K. Malívasi F Human CD38; a (r)evnlutKinury story ofen/ymes and receptors/,' l.euk Res - 2001.-Vol.25.-P 1-12.

38. Dean J, McCarthy D., Lewler M. Doherty D.G., Olarrclly С., Golden-Mason !. Chinitieien/л-tion ofNKR^r T-cel| subsets tn human bone marrow: implications for immunosurveiMance of neoplasia it Clio Immunol - 2005,-Vol.l E4-P.42-511.l-S I a «ÄiÄ J

39. SO. Guevara-Palino J. A. Turk M J. Wolchok J.D., Houston A.N. Immunity to cancer through immune recognition of altered self: studies with melanoma H Adv Cancer Res - 2003.-Vol.90-P. 157-77.

40. Mayen W., Goebcler M., Kumar S. R lessen R. Nehb V. Hyaluronan stimulate tumor cell migration by modulating the fibrin fiber architecture //1 Cell Sei.-1999.-Vol. I I2.-P.224I-5L

41. He S.C. Qiao N mid Shcng W N cu ro behavioral. autonomic nervous function and lymphocyte subsets among aluminum electrolytic workers -2003 InL. J. mmunopalhol. Pharmacol - Vol. 16 -P.I39.

42. Herreman G-, God can P„ C'abane J., Acar J.F., Digeon M„ Bach J.F. Circulating immuns complexes and infections endocarditis. 64 eases /I Ann Med Interne (Paris).- 1978.-Vol. I29.-P.387-97.

43. Hongeng 5. Pctvises S. Worapangpniboon S. Rcifcamnuaychnkc В. Pakaluisama S, Joolar S. Generation ofC'l>3+ CD56- cytokine-ïiidueed killer cells aiKl their in vitro cytotoxicity against pediatric слпеег cells H lnt J llematol - 2003.-VoJ.77 -P.175-9.

44. Mori T T, Katafuchi S., Гаке N^ Shimi/u and A-NRJiim The autonomic nervous system as a communication channel between the brain and (he immune system // Neuroimmuiwmótíiilalion.-1995,-Vol 2.-P.203.

45. Hunter C.A. Licbcrman L A. Mason N. Pepper M. Sague S.I., Talo С. Zediak V. Costimula-tmn in resistance to infection and development of immune pathology: lessons from toxoplasma H Immunol Res - 2003.-Vol.27.-P.331-40.

46. Inagaki N. Asaoka U. Мол K.L. Sohda N. Miunt I. Misva II, Sato N Oshimi К FjMcfopa-thy-type T-eell lymphoma expressing NK-eell intraepithelial lymphocyte (NK-IEL) pbcnctype H Leuk Lymphoma -2004 -Vol.45 -P 1471-4.

47. Jean W.Ç, Spellman S R^Wallenfrtcdmaii М.Л. lmertcukin-12-bascd immunotherapy againsl rat9L glioma // Neurosurgery -1998 -Vol,42 -P.850-856.

48. Jothy S. CD44 and its partners in metastasis//Clin Exp Metastasis,- 2003,-Vol,20,- P. 195-20.

49. Kahion K,S. IJrown С. Cooper LJ. Raubitschek A. lorman SJ Jensen M.C- Spceitk recog-niiioo and killing of glioblastoma multiforme by intetkukin 13-ielakinc redirected cytolytic Г eel I» // Cancer Res - 2tH>4 -Vol 64 -P 9160-6

50. Kaiser HE, Bodey В Jr. Siegel SE, Grogcr AM, ßodey It, Spontaneous neoplastic regression the significance of apophysis // In Vivo,- 2000 • Vol. I4.-P 773-88.

51. Kandn T. Yokoyama T-. Ohshim» S. Yua« K Waianabe T.-Su/riki I M imita K I -lymphocvtc subsets as nonlnvasive maritereof cardiomvopatliy ¡l Clin Cardiol.- IWO.-VoUJ,-P,ó 17-22

52. Katchkov I.A., Vatislivily G.D., Timofcyeva TV. Non mrgicnl Trealmcnl ofLow Grade Matig-naney Gtiomas H 1n; 9-lh liurop Congr of Neurosurgery,- 199) - Moscow - Abstr.- P I88.

53. Kleihues P.Caven« W.K «Is. Patl»log> &. geiKlk»oflumore oflhc nervous syaem II WorUI Health Orijanisatlion classillcaitoii of tunwun. I von, Fran«. IARC Prv«. 2(K)0,

54. Kohno M. Hascgasvn M. Miyake M. Yamamoto T. Fuji ta S. CD151 etihanccs cell molility aitd meususis of cáncer cclls ¡n the presente o f focal adhesión kina.se // tnt J Cáncer - 2002 -Vol.97.-P.336-43,

55. Komat.su F-, Kajiwam M. CD18/CD54{+CDI02), CD2COÍ» pwh^y.indepcndcnl killing of Ijmpíiokinc-activaled killerlLAKlcellsagainst glioblastoma ccll Unes T98G afld H373MG a Oncol Rt». 2000.-Vol. l2.-P 17-24.

56. Koros AM. Goodwin D.G., Sidcrils R.H, Malavasi F. 'Natural klller" (NK) «II antuwnv CD56. CD57 and Oíher» № expressed on brcasi und Iwig tumor «lis as well as sea urehin coclomocjtcs // . Biol Rcgul llomcosl Agcnls - 2002.-Vol.t6.-P. 173-5.

57. Kuppncr M.C-. Itanníu Si.F. de Tribotd N. Aaiv¡«íon and adhesión molccule csprcssíon on lymphoid infiltrailcs in human glioMaslomas // / Ncuraimmunol.- 1990 -Vol 29.-P.229-3S,

58. Kutpad S.N. /hao X-G. Wiksírand C ). Balru S K Mcl.eadon R.F., Bigner D D. Tumor anttjfcfts ¡n astrocyiíc g liornas// Glta.- 1995.-VoJ-t5-P244-2$6

59. Kuaielcov V,p, Nonlincar eíf«Ls in chuiges of systcm loal «II anlitumour immuniiy // In-lemaíional journal on immunofchabiflati<ifl.-2000.-Vol.2.-P-37-47

60. Kyritsis I»., X« R-. Bondy M I., LcVin V, A Braner J M Correlatron of p53 immsmorcac-lívity scqucncing in paticnts wilh glioma //' Mol.Carcinog.-1996.-Vol. 15 -P,M

61. Ijmpson L A., Hicke> W l: Monoclonal antibody analysis of MI IC cxpression in human bratn biops»«; Tissue ranging from "histologically normal" tothat shovuny ditTen.111 tevcls of glial tumor insolventem //J Immunol-1986-Vol. 136 -P 4054-4062

62. Lampson L A Intetpttling MlIC" ctas 1 cxpresstun aiul cla»s l/clas» II rcciprocity in tbc CNS: Reeonciling divergent Undings ff Microsc Res Tech.- l995.-Vol.32.-P 267-285

63. Leung S,Y,. Wong M-P„ Chung LP„ Chan A.S.Y-. Yucn S.T : Monocyte ehcmoattractani proiein-l expression and macrophage Infiltration in gliomas1'.1 Acta Neuropathol (Herl).- 1997-Vol.93.-P 51 »-527.

64. Li H„ L.iu J- Hofmann M. CD44 expression pattems in primary and secondarv brain tumors U Zhonghua Yi Xue Za Zhi,-1995 - Vol.75.-P.525-«. 57.V Chinese

65. Im A.Y, Roudier M I1. True L.D. Heterogencity in primary and metaslatic prostate eanecr as defined by ccll surfuce CD profik // Am) Pmhol ■ 2004 -Vol, 165 -P I 543-56

66. Liu YJ., kan/ler II. Soumelis V., Gillict M. Dendritic eell lineare, plasticity aml erost-rcgulation /.' Nat Immunol - 2001.-Vol,2.-P,585-9.

67. Liu V J, Dendritic cell suhsets aml lineagcs, and their funetions in innote and adaptive immunity ff Cell.- 2001.-Vol. 106 -P,259-62,

68. Locw Papasero L. Symptomaiologv and natural Natural H iswtogy of Gliomas oi the Cerebral Hemisphcrcs Wroclaw H 19*7-VoL27.-p.| 1-37,

69. Lowe J. MacLennan K.A. Powe D.O., Pound J.D. Palmer JB. M icrogtial cel ls in human brain have phenotypte characteristks related to possible Tunction as dendritic am igen presenting «Iis// J Palhol.- l989.-Vol.1S9 -P. 143-9

70. Lynch D.H. Ramsdell F. Alderson M.R. Fas and Fasl. in ihe bomeostaiic regulmion of immune response» ■'/ Immunol Today -1995,-Vol, 16.-P 569-574

71. Machulla H.K- Steinbom F., Sehaaf A Hei decke V, Rainov N.G. Brain gliomu und humw fcukocyte antigens (HLA)-is ihere an association //1 Neorooiwof - 2001 -Vol 52.-P.253-(iI

72. Mohaky MS. Jr. Mettlin C^ Natarajan N„ j»s ER. Jr. Peace ft.ft. National wrvey of pattems ofeare for brain-lumor patienlsH J Neuro »urg,-1989 »Vol, 71 -P.826-836

73. Makrigiannis AP. Anderson S.K. Regulation of natural killer cell funetbn ff Cancer Biol Thcr-2003-V0L2-P.6. 0-6

74. Mancini G Corbnnara A.O. Ileremona J.F Immunochetmtal quantita of antigene by cinvlc radial imjnunodiffuswn i'/lrnmunochemistry ■ !%5,-vol.2.-P.235-254.

75. Mainin K Akinwunmi J Rooprai ILK Kennedy A J„ 1 jnktf A. Ognjenovic N. Pilkington GJ. Noncxpression of CD IS by neopläslic glitt: a barrier to metastasis? H Anticaneer Res-I995.-VoII5.-P 1159-66.

76. ManioR, Mauel J., Bete-Cormdin S CD69 and regulation oflhc immune function li Jin-munopharmacol Immunoto.vkol-1999.-Vol.2l -P,565-82

77. Maltha В., Marian i S.M К rammer Ml. The C'D95 system and the death of a lymphocyte // Semin Immunol.-1947 - Vol 9.-P. 5^-68.

78. McDermoit M.W. Snccd P K. Gulin P.H. Inlerstilial brachytherapy Tor malignant brain tumors /V Semin.Surg Oncol - I WS -Vol. 14 -P 79-87,

79. McKeovsn M. J. Ramsay I). A. Classification of astrocytomas malignant astrocytomas by principal components anat>*is a neural net. // J.Neuropalhol.Exp,Neurol.- 1996.-Vol. 551. P, 1238-12-15.

80. Meli man I. and Steinman R M Dendritic cclEs: specialized and regulated antigen processing machnws H Cell--2001 Voll06-P.255 2SS

81. Menage P. Thibault G. Lebranchu V,. Jan M. Bardos P. Deficiency of CD4+CD45RA-lymphocytes in patients with glioblastoma multiforme И Eui J Med - 1492.-Vol. I -P.362-4

82. MetdiLsa L S. Flow cytometry for natural killer T cells: mu If ¡-parameter methods for multifunctional cells II Clin Immunol - 2004,-Vol ||(l -P.267-76

83. Mitcbd S-, Charles В. Wilson M. H Ifcrger M (cd) The Gliomas. Saunders W.B„ New York, 1999, p 7%

84. Montclh T.C., Peraeoli M.T., С.аЬогта R С. Scares A.M., Kurokawa CS Familial canccr depressed NK-cell cytotoxicity in healthy and cancer affcctcd members II Arq Neuropsiquiatr-2001- Vol, 59 -P, 6-10

85. Moody D.B.r Poreclli S.A. Intracellular pathvsays of CD I antigen presentation // Nat Rev Immunol - 2003.- Vol 3 - P.I 1-22.

86. Moretta A., BottinoC-. Viialc М-» Pcnde Can ton i C„ Mingari M, С. Blassen« R. Мог-etta L. Activating receptors and coreeeptors involved in human natural killer cell-mediated cy-lolysis II Ann«, Rev Immunol -2001.- Vol. 14 -P, 197-206,

87. Moretta IFerlazzo G Mingari M,C„ Melloli G.r Moretta A. Human natural killer cellfunction and their interaction* with dendritic «Iis U Vaccine.- 2003.-Vol.21 -I',38-42.

88. Morford L.A., Ellinll I H„ Carlson S,L. T cell receptor-mediated signaling is defective in T ccil-s ohuuved from patients with primary intracranial tumors II J Immunol ■ 1997.■ Vol.159,-P.4415-4425.

89. Morford I. A., Dix A-R-. Brooks W.U., Ros/mnn T l Apcptotkelimination of peripheral 1 lymphocytes in patients with primary intraerania! tumors. H J Ncurosurg- 1999.-VoT9l.-P.93S-46,

90. Morkc W.G., Kuilin P.J. I.cibson PJ., TeiTeri A. Hanson C A. Demonstration ofaberrant T-cell and natural killer-cell antigen expression in all cases of granular lymphocytic leukaemia II Br J Haematol.- 2003 -Vol. I20.-P. 1026-36,

91. Nagai M. Arai T. Clinical effect of interferon in malignant brain tumours/.' Neurosurg Rev.' 1984 -Vol 7.-P.5S-64

92. Naor D„ NedveUki S. Golan I. Melnik L Faitelson Y. CD44 in cancer /,' Crit Rev Clin 1лЬ Sei,- 2002-Vot.39.P.527-79

93. Naot Ii,. Sionov R,V Ish-Shalom D, CD44: structure, function, and association vsith the malignant process II Adv Cancer Res -1997.^ Vol? 1 -P 241 -319,

94. Nguyen Q.H. Moy R.L. Roth M.l>-, Yamamoto R., Tornow Duhinett S.M- Expression of CD45 isoforms in fresh ami IL.-2-cultured tunwr-infillraling lymphocytes from basal cell carcinoma//Cell Immunol.-1993.-Vol. I46.-P.421 -30.

95. Ni K-. O'Ncill HjC. The role of dendrita cells in Tcríl ■Clh«lKHi /.' Immunol Cell Biol.-l997.-Vol.?5.-P-223-230.

96. Nicholson I.C. CD62L (L-sdeclin) IIJ Biol Regut Homeost Agents.-2002.-Vol.l6.-P. 144-6.

97. Nn-derC Grosu A l. Molls M. A. comparison of trealmeni rcsults fot IKWM malignan! glwmas II Cáncer Trcat Rcv. 20Q0.-Vol,26.-P.397-M»9.

98. Pennisi E. Tracing molecules tíuit makc ihe hrain body ennneenon tt Science -1997.-Vol.275 -P.930.

99. Pientlim M. Ifcmamíni MI" Supratcntorial glioblasloma: neuroradiologieal ündingv survival afler surgen radwlherapy tt NcuroradioJogy -1996,-Vol 38.-P.S26-S30

100. Piguct V. Cairel S„ de Tribota N. Modulatirm of III.A-DR expresión and growih inh ibi-tion on glioma cells: heterogenous responses to IFN-gamma. Walker M.D., Tilomas D.Ct.T-. eds. Btology of Brain Tumors. Boston. Mass; NijholT; 1986

101. Ponto H-, Sherman I Herrlieh P.A. CD44: from adhesión molecules tosignalling regúlalos

102. Nal Rcv Mol Cell Biol - 2003.-Vol,4.-P 33-45.

103. Rckhlm S, Nraroendoe/rne-imniuflc interactums II New Fngl. i. Mcd.■ 1993. Vol 21 P. 1246.

104. Roggendorf W. StruppS. Paulus W, Dtslnbulion and characterízation of rntero-glia^mocropliagcs in human brain tumor»// Acta Neuropathol (Berl> -1996 -Vo| 92.-P.288-293,

105. Romagnani S. Biology of human THl and TH2 cells// J Clin Immunol - l995.-Vol.l5-P 121-9.

106. Rósm M.I., Hughesi.T-. Esiri M.M., Coakham H.8., Urovvnell D B Immunohistologieal study ofmononuclcarccll mfilirate in malignanl gllomas.'/ Acta Ncwopothol (Bcrl).-I987 -Vo|,74.-P.269-277.

107. Rossi M.L. SánchezC.F., Hughes J.T. Esiri M.M and Coakham H.B. Immunobistochcmi-cal sludy of numonuelearcell infíltrate in malignam gfioma*// J. Clin. Pathol,- |998,-Vol.4l,-P.3I4.

108. Roth W. Fontana A, Trepel M.r Reed J.C-. Dkhgans J^ Weller M Immunoehcmolltcrapy of malignan! glioma: syncrgistic activity ofCD95 liguml and chemolherapeulics II Cáncer Immunol ImmuiHMhcr. -1997.-Vol.44.p.55-63.

109. Russcl 1>,S, Ruhmsiein LJ Pathology of Tumors of thc Ñervo«* SysJem /,' cd I dv ard Ar-iJnUt 1977.- P. 152-244.

110. Saas P. Wilker P.P., Hfllme M, Fas.|¡pnd expression by asi roe yt orna in vivo: maimatning immune privilege in thc brain? ii L Clin Invesl.— IW7.-Vol.99.-P 1173-1178.

111. Sablotzfci A., Efcd H. Muhhng J. Dehnc M.G. Nopens II. Giessetmann H,. IIcmpelmann G. Djvcgulation of immunc rcsponsc folloning neurosurgieal operad ioíi> U Acta A«aesthe*iol Scand- 2000,-Vol.44 -P.82-7.

112. Schreiner B. Wischhusen JMitsdocíflcr M. Schneider D. Bomemann A. Melms A. Tolo» C-. Weller M, W tendí II Expression of thc B7-njla*ed rnokcutc ICOSL by human glioma cells in vino and in vKo H Glia.-2003.-Vot.44 -P.296-301.

113. ScmpotAski G.D, l ee D.SI. Kaufman K 1 Flaynes B.F- Siructurc and fiinction ofthe Cl>7 moleculett Crit Rcv ImrWttk- l9W.-Vol.l9.-P331-48

114. O. Scnncr V,, Sjuíw A-, Baur L Sdtiril U.H., I?«leí 1. Pauto* tt. CD24 pnvnoles invasión oí glion» cells in vivo // J Nctiropalfool E\p NcuroJ - l999.-Vol.58.-P.795-802

115. Snivifi MJ. Godrrey DI. Trapani JA. A fresh look at tumor ímmunosurveil lance and im-munolherapy // Nal ImmunoE- 2001 -Vol.2,-P.293-9.

116. Strik II.M, Stoll M. Meyermann R,. Slrik H.M. SlolJ M, Mcycrmann R. mmuneccll infiltration ofintrinsie and metflsialic ¡ntracrantnl tumours// Antkanccr Res • 2004,-Vol 24.-P.37-42.

117. Soda T,, Nagata S. Purifieatum and characteriratioo of ihe I os-ligand thal induces apoptosis til Exp Med -1994,-VoEI79-P,873-879.

118. Tada M Kanta M. Yaoai H, Okita K. Application and limitation ofendoscopic polypcc-tomy in tfnmach polyps.■Nippon Naika (ükkai Zdssbi.- |992.-Vo|,8l.p,666-72,

119. Toda K-. Shiraishi T Nakagawa S. Kihaía S J« Y„ labuebi K. ReiatíOTJllip heiueen Pas antigen expression and apoptosis in glial tumors in Japanese. H Neuro immunol Res.-1995.-Vol.7 -P >25-128

120. TsurashimaH- Liu S.Q., Tsuboi K. Voshii Y Nosc T-, Ohno T Induction of human autologous cytotoxie T lymphocyies again« mmeed lissues of glwblasloma multiforme H J Neu-rosurg.- l996.-Vol.84.-P 258-63

121. Vaquero J„ Zurita M. Aguayo C. Coca S. Apoptosis is not corrclaied with üw prtsence of CD57+ NK-cells in bfiiti mwastasej// Acta Neuroch ir (Wien).- 2003.Voll45-P773-6

122. Vitolo I)., Paradiso P, Lkcini S., Ruco I.P, Baroni f.D. Expression of adhesión molecules and extraceltular matnx proicins in glioblastomas: relation to angiogenesis and spread ;; Histo-pmthology - 1996-Vol.28 -P 521-8

123. Von Deimling A. Etbi R. II. Ohgaki IL P53 mutaLionsare associated with 17p allelie ioss in grade II grade Iii astrocytoraa. II Cancer Res 1992 Vot, 5, - P. 2987-2990

124. Von Deimling A., Louis D. N. Menon A. G. Astrocytie gliomas. charaeien/ation on a keular genetie hasis.//Acia neuropathol -1993,-Vol, 86 -P 81-85

125. Waldmann T,A. The IL-2/1L-, receplor svstem. A target for rational immune Intervention // Immunol Today - I99J - 14 Ahsiract 168 P,264-270,

126. Ware C.F. APRIL and BAFF Connect Autoimmunitv and Cancer II J.Exp.Med.- 2000.-Vol. 192.-P.35-37

127. Welter M. Frei k-, Groscurlh P. Krammcr P11 - Yonekawa Y. Fontana A. Awi-Fm/APO-1 antibody-mediated apoptosi» of cultured human glioma «Ils. Induction and modulation of sensitivity by cytokines,',' J Clin Invest -1994.^01.91 -P.954-964.

128. Weiler M. klfthues P. Didigans J. Ohgaki H. CD95 ligand: lethal «capon against malig-mint glioma" •''' Brum Pathol - 199« -Vol 8.-P.285-93

129. Wesley J., Вгойау L. NK T ttll-NK cell cross-talk: reciprocal interaction and activation11 U Arch Immunol Пкг Рдр (Wars/)- 2(103-Vol.5 l.-p.i21-6

130. Witkins A.L,. Yang W,. Yang JJ. Structural btology of the cell adhesion protem CD2: from molecular recognition to protein folding and design II Curr Protein Pcpt Sei,- 2003,-VoL4.-P.367-73.

131. Willmann кDunne J,F- А По* cytometric immune function assay lor human peripheral blood dendritic cells Í/J l.eukoc Biol- 2000.-Vol.67.-P 536-44

132. Wintterlc S Schreiner Ii. Mitsdocrffer M. Schneider D. Chen L, Me)ermann R., Weiler M. Wiendl H. Expression of the B7-rdated molecule H7-HI by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis Л Cancer Res.- 2003.-Vol.63.-P.7462-7.

133. Yang T. Witham T.F., Villa L. Glioma-associated hyaluronaninducesapoptosis in dendritie ecllsvia inducible mtroc onide synthase implications forlhe useofdcndrilic cells for therapy of gliomas И Cancer Rcs.-2002.-Vol 62.-P.2583-2591.

134. Yasudo M„ Naluno К. Yasumoto K,. lanaka Y CD44; functional retevance to inflammation and malignancy H H istol Histopathol.- 2002.-Vol. 17.-P.94 5-50,

135. Yfagan L,ft„ Quinn B. CD44 expression m astrocytic tumors // Mod Pathol - 1997 -Vol. 10 -P 1239-16

136. Yu J-S-, Wei MX., Chiocca Ë.A. Treatment of glioma by engineered interleukin 4-secreting cdls II Cancer Rts-(993,Vol 53.-P,3125-3128.

137. Yu SJÍ. Zhang J.Q., Lu ü.H. An immunohistochcmical study of Ki-67 expression of bruin lumor cells and mononuclear cell subsets infiltraiing lhcsc tumors1,1 /honghun Bing Li Xuc/a ZJll- 1994.-Vol. 23-P267-9.

138. Zheng M. Luán X Prognostic significance йГС057+ cell level and pTNM staying system in patients svith laryngeal cancer //Un Chuang Er Bi Yan Hou kc Za /hi- 200L-Vol.l5.-P 73-6,