Особенности размножения хантавирусов в культурах клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Малкин, Геннадий Андреевич

• Малкин, Геннадий Андреевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Малкин, Геннадий Андреевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Хаитавирусы

1.1 Общие сведения

1.2 Морфология и молекулярная биология хантавирусов

1.3 Антигенные и генетические взаимоотношения

1.4 Специфическая лабораторная диагностика

1.5 Применение клеточных культур в хантавирусологии

ЧАСТЬ II СОБСТВЕННЫЕИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1 Клеточные культуры

2.2 Вирусы

2.3 Иммунные сыворотки и моноклональные антитела

2.4 Непрямой метод иммунофлюоресценции (МФА)

2.5 Методы иммуноферментного анализа (ИФА)

2.6 Метод индикации фокусобразующихединиц (МФОЕ)

2.7 Реакция нейтрализации в культуре клеток (РН)

2.8 Изоляция хантавирусных штаммов

2.9 Индикация микоплазм в культуре клеток методом ПЦР

2.10 Санация клеточных культур ПТ-1 и 4647 от микоплазменной контаминации

2.11 ОТ-ПЦР

2.12 Методы электронной микроскопии

2.13 Статистические методы

ГЛАВА 3. Репликация патогенных хантавирусов в клеточных линиях различного происхождения

3.1 Сравнительная оценка эффективности методов индикации размножения

3.2 Адаптация хантавирусов к размножению в клеточных культурах различного происхождения

3.3 Динамика размножения хантавирусов в клетках наиболее пермиссивных клеточных культур

3.3.1 Определение оптимальной множественности заражения

3.3.2 Влияние различных условий на динамику накопления вируса Пуумала в КЖ

3.3.3 Анализ динамики размножения вируса Пуумала в течение длительного периода времени в культуре клеток VERO

3.3.4 Характеристика ФОЕ патогенных хантавирусов в культурах VERO и Vero Е6

ГЛАВА 4. Изоляция и идентификация штаммов хантавирусов

4.1 Изолирование хантавирусов в культуре клеток

4.2 Иммунологическая дифференциация штаммов хантавирусов (МФА, РН)

ГЛАВА 5. Морфологическая характеристика хантавирусов

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ

АГ — антиген

AT - антитела

БОЕ - бляшкообразующие единицы

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом

ГЛПС-ДОБ - ГЛПС, вызванная вирусом Добрава/Белград

ГЛПС-ПУУ - ГЛПС, вызванная вирусом Пуумала

ДОБ - вирус Добрава/Белград

ДОБ/Куркино - генотип вируса ДОБ, хозяин - полевая мышь

ДОБ/Сочи - генотип вируса ДОБ, хозяин - кавказская лесная мышь

ИФА - иммуноферментный анализ

КЖ - культуральная жидкость

КЛ - клетки

лизат клеток - клетки, разрушенные замораживанием/оттаиванием

мАТ - моноклональные антитела

МЗ - множественность заражения

МФА - метод флюоресцирующих антител

МФОЕ - метод индикации фокусобразующих единиц

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПУУ - вирус Пуумала

РН - реакция нейтрализации

СЕУ - вирус Сеул

ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин

ФИТЦ - флюоресцеин-5-изотиоцианат

ФОЕ - фокусобразующие единицы

ХПС - хантавирусный пульмональный синдром

ХТН - вирус Хантаан

ЭС - Энросепт

DMP-30 - 2,4,6 - три диметиламинометил фенол

PBS - фосфатный буферный раствор

VERO - культура Vero; в отличие от Vero Е6 выделено

прописными буквами для облегченного восприятия в

тексте

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности размножения хантавирусов в культурах клеток»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) занимает ведущее место среди природно-очаговых инфекций в России. Возбудители этой инфекции в составе рода Hantavirus входят в семейство Bunyaviridae.К настоящему времени доказана этиологическая роль четырех хантавирусов в структуре заболеваемости ГЛПС: в европейской части России и странах Европы - вирусы Пуумала (ПУУ) и 3 генотипа вируса Добрава/Белград (ДОБ); в российских регионах Дальнего Востока и странах Азии - вирус Хантаан (ХТН) и его подтип Амур и вирус Сеул (СЕУ). Таким образом, под одним названием «ГЛПС» регистрируются, по крайней мере, четыре этиологически самостоятельных хантавирусных инфекций. Естественными хозяевами хантавирусов являются грызуны и насекомоядные, в организме которых вирус длительное время коэволюцинировал. Хантавирусы с трудом адаптируются к размножению в организме лабораторных животных, а также в клеточных культурах, что вероятно объясняет более чем тридцатилетний период безуспешных попыток изолировать возбудитель ГЛПС, вирусная природа которого уже была доказана [90]. Возможность использования клеточных культур для культивирования хантавирусов стала активно изучаться после успешной адаптации вируса Хантаан, изолированного на лабораторных мышах, к культуре клеток карциномы легких человека, А549 [31].

Ввиду отсутствия лабораторных животных, чувствительных к размножению подавляющего большинства хантавирусов, клеточные культуры приобретают особо важное значение для выделения и культивирования хантавирусов, изучения их патогенеза in vitro, генетических, антигенных и других таксономических характеристик, а также для конструирования диагностических и вакцинных препаратов. В то же время, хантавирусы, как и большинство представителей семейства Bimyaviridae, плохо адаптируются к размножению в клеточных культурах, характеризуются длительным циклом репликации, отсутствием цитопатического эффекта, имеют прочную внутриклеточную ассоциацию, низкий уровень накопления вируса в культуральной жидкости. Спектр изученных клеточных культур, используемых для размножения хантавирусов, весьма ограничен. Несмотря на многочисленные исследования, подбор клеточной культуры пригодной в качестве субстрата для производства вакцин против ГЛПС, остается одной из актуальных проблем. В особенности это касается вакцины на основе вируса Пуумала вследствие низкого уровня репродукции его в культуре клеток. Вместе с тем, получение высокоурожайного вирусного субстрата является принципиально важной основой для создания убитых цельновирионных вакцин против ГЛПС. К настоящему времени инактивированные хантавирусные вакцины производятся в Китае, КНДР и Южной Корее на основе вирусов Хантаан и Сеул, но они не обладают защитным действием

против вируса Пуумала - основного возбудителя ГЛПС у жителей европейской части России, на которую приходится более 98% всей заболеваемости, регистрируемой в России [104]. Степень разработанности темы исследования

К началу нашей работы не проводились систематические исследования, касающиеся оптимизации условий получения вирусного субстрата для инактивированных вакцин против ГЛПС. Отсутствовала информация о сравнительной эффективности известных лабораторных методов выявления инфекционной активности хантавирусов в клеточных культурах, как основы для разработки методов контроля безопасности вакцины. Несмотря на то, что морфологические характеристики вируса Пуумала, очищенного из суспензии легких спонтанно инфицированных рыжих полевок, были определены еще в 1982 г. [3], данных, характеризующих морфологию вируса Пуумала адаптированного к размножению в клеточных культурах, в доступной литературе не имелось. По-прежнему ограниченным остается спектр клеточных культур, разрешающих эффективную репликацию патогенных хантавирусов. Все вышесказанное определяет актуальность и значимость настоящего исследования. Цель и задачи исследования

Цель данной работы - уточнение спектра перевиваемых линий клеток,

способных поддерживать размножение хантавирусов, вызывающих ГЛПС

6

(ПУУ, ХАН, СБУ, ДОБ), выявление наиболее пермиссивной клеточной культуры и условий эффективной репликации в них хантавирусов, включая изоляцию штаммов от природных носителей. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку эффективности лабораторных методов для выявления инфекционной активности хантавирусов при культивировании в клеточных культурах (МФА, ИФА, МФОЕ, ОТ-ПЦР).

2. Провести адаптацию вирусов Пуумала и Добрава/Белград к размножению в клеточных культурах различного происхождения.

3. Определить динамику размножения и оптимальные сроки накопления вирусов ПУУ, ХТН, СБУ, ДОБ в культуральной жидкости и в клетках наиболее пермиссивных клеточных культур.

4. Оптимизировать условия получения вирусного субстрата (ПУУ, ХАН, СБУ, ДОБ), пригодного для использования при изготовлении цельновирионной инактивированной вакцины против ГЛПС.

5. Изолировать хантавирусные штаммы в культуре клеток и провести их идентификацию.

6. Исследовать морфологические характеристики вируса Пуумала, а также культуры клеток при репликации в ней вируса, по результатам электронной микроскопии.

Научная новизна

Получены приоритетные данные в изучении биологии возбудителей хантавирусных лихорадок у нас в стране и за рубежом. Впервые показана возможность адаптации патогенных хантавирусов Пуумала и Добрава/Белград к размножению в не свойственной им биологической системе - перевиваемых клетках, полученных из почки овцы и почки теленка, что открывает возможности дальнейшего изучения вопросов, связанных с преодолением видового барьера, вирусной трансмиссии и экологии хантавирусов. Впервые установлено, что вирионы вируса Пуумала по форме и размерам значительно отличаются от аналогичных характеристик других патогенных хантавирусов, но имеют сходство с морфологией близкородственного непатогенного вируса Тула. Установлено, что штаммы, представляющие вирусы Пуумала, Хантаан, Сеул, а также генотипы Добрава/Сочи и Добрава/Куркино отличаются по размеру и форме фокусов, образуемых в культурах Vero и Vero Е6, что позволяет рассматривать эти различия как отличительный фенотипический признак. Теоретическая и практическая значимость работы

Установлены закономерности размножения вирусов, возбудителей ГЛПС, в пермиссивных клеточных культурах, определены оптимальные условия сбора вирусного урожая. Штаммы вирусов-возбудителей ГЛПС адаптированы к размножению в клеточных культурах, разрешенных для производства вакцин вводимых людям. Предложены методы контроля остаточной инфекционной

активности инактивированной вакцины на основании сравнительной оценки эффективности методов индикации хантавирусов в культуре клеток. Уточнена морфология вирионов хантавируса Пуумала, адаптированного к размножению в клеточных культурах, что имеет практическую значимость для усовершенствования методов концентрирования и очистки вируссодержащих препаратов.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований использованы при создании лабораторных серий вакцины против ГЛПС, а также при составлении научно-технической документации на вакцину.

В Государственной коллекции вирусов депонированы 2 штамма, представляющие генотипы Добрава/Сочи и Добрава/Куркино, выделенные в культуре Vero Е6 от кавказской лесной мыши и от полевой мыши, соответственно.

Личное участие автора в получении результатов

Автором самостоятельно проведен обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой теме, обобщены результаты исследований и подготовлены материалы к публикациям. Самостоятельно выполнены все эксперименты по изучению хантавирусов в клеточных культурах, выделению и идентификации вирусных штаммов и их типированию. Совместно с сотрудниками лаборатории патоморфологии вирусных заболеваний выполнены электронно-микроскопические исследования.

Методология и методы исследования. Методологической основой исследования послужила совокупность вирусологических, серологических, молекулярно-биологических и электронно-микроскопических методов. Основные положения, выносимые на защиту

1. Определена эффективность различных методов индикации размножения патогенных хантавирусов в клеточных культурах (выявление вирусного антигена, инфекционного вируса и вирусной РНК).

2. Впервые показана возможность репликации вирусов Пуумала и Добрава/Белград в перевиваемых клетках почки овцы и почки теленка.

3. Установлено, что после 3-5 последовательных пассажей штаммов хантавирусов Пуумала, Добрава/Белград, Хантаан и Сеул в культуре VERO уровень накопления этих вирусов в культуральной жидкости соответствуют таковому в культуре клеток Vero Е6.

4. Определена динамика накопления вирусов Пуумала, Добрава/Белград, Хантаан и Сеул в пермиссивных клеточных культурах в зависимости от множественности заражения (МЗ), времени контакта, присутствия белковых компонентов в среде поддержки.

5. В культуре Vero Е6 изолированы штаммы 2-х генотипов вируса Добрава/Белград, проведено их иммунотипирование.

6. Выявлено, что ФОЕ, образуемые штаммами вирусов Пуумала, Хантаан и Сеул, а также штаммами генотипов Добрава/Сочи и Добрава/Куркино в культурах VERO или Vero Е6 имеют различия по размеру и очертаниям,

что позволяет рассматривать их как отличительные фенотипические признаки.

7. Впервые показано, что вирионы вируса Пуумала морфологически отличаются от других патогенных вирусов при исследовании ультратонких срезов зараженной культуры Vero Е6. Апробация и публикация материалов исследования

Материалы исследования доложены и обсуждены на: конференциях молодых ученых ИПВЭ им. М.П. Чумакова 2011, 2012, 2013, 2014 гг; X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 12-13 апреля 2012 г; IX Международной конференции по проблемам ГЛПС, ХПС и хантавирусам. Пекин, Китай, 2013.

По теме диссертации опубликованы 7 научных работ, из них 1 - в зарубежном журнале, индексируемом в международных библиографических базах, 5 публикаций в российских журналах, входящих в Перечень рецензируемых журналов, рекомендованных ВАК, а также 1 монография.

ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Хантавирусы

1.1 Общие сведения

Хантавирусы в составе рода Hantavirus входят в семейство Bunyaviridae - одно из наиболее крупных семейств, включающих более 300 известных вирусов животных и растений, объединенных в 5 родов: Bunyavirus, Phlebovirus, Uukuvirus, Nairovirus и Hantavirus. Представители первых 4 родов являются типичными арбовирусами. Для хантавирусов какой-либо переносчик достоверно не установлен.

К настоящему времени Международным комитетом по таксономии вирусов (ICTV-2012) зарегистрировано в составе рода Hantavirus 23 вируса, однако количество серологически и генетически различающихся друг от друга хантавирусов значительно превышает это число. К ним относятся не только патогенные для человека хантавирусы, но и вирусы с неустановленной к настоящему времени эпидемиологической значимостью. По распространению они подразделяются на вирусы Старого Света (Хантаан, Пуумала, Сеул, Добрава/Белград, Тула, Хабаровск, Топографов, Таиланд, Тоттапалиам) и Нового Света (Андес, Байо, Блэк Крик Кэнал, Кано Делгадито, Ель Моро Каньон, Исла Виста, Лагуна Негра, Мулешу, Нью Йорк, Проспект Хил, Рио Маморе, Рио Секундо, Син Нобре).

Хантавирусные инфекции человека на евроазиатском континенте

I

объединены под единым названием геморрагическая лихорадка с почечным

12

синдромом (ГЛПС). В структуре заболеваемости ГЛПС доказана этиологическая роль четырех хантавирусов: вирус Пуумала и три подтипа вируса Добрава/Белград в европейской части России и странах Европы; вирусы Хантаан и его подтип Амур и вирус Сеул - в российских регионах Дальнего Востока и странах Азии. На американском континенте хантавирусные инфекции объединены под названием хантавирусный пульмональный синдром (ХПС) и вызываются, в основном, вирусами Син Номбре и Андес в Северной и Южной Америке соответственно [1]. 1.2 Морфология и молекулярная биология хантавирусов Вирионы хантавирусов имеют округлую форму с размером в диаметре от 90 до 130 нм. Липидосодержащая оболочка имеет выступы, сформированные вирионными гликопротеинами, вирусные частицы морфологически однородны [2,3,4,5].

Плавучие плотности вирусных частиц в растворах сахарозы и хлорида цезия составляют 1,16-1,17 г/мл и 1,20-1,21 г/мл, соответственно. Хантавирусы стабильны лишь в нейтральной среде при значениях рН не ниже 5 и не выше 8, инактивируются растворителями липидов и термообработкой при температуре 50 °С [6].

Геном вирусов представляет собой сегментированную одноцепочечную негативную РНК. Три сегмента генома - большой (Ь), средний (М) и малый (Б) - кодируют вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу КсШ.р,

поверхностные гликопротеины вп и вс и нуклеокапсидный белок >1,

соответственно [7,8,9]. Каждый из геномных сегментов имеет единственную функционирующую открытую рамку считывания.

Вирусные белки -КсШр, вп, Ос и N — имеют молекулярные массы 200, 72, 56 и 45 КД соответственно. Все три сегмента хантавирусной РНК имеют на 3'-концах одну и ту же характерную короткую последовательность 3'-АиСАиСАиСиО-...-5', отличающую их от других буньявирусов.

Вирион проникает в клетку, прикрепляясь к ее поверхности участками

одного или обоих наружных белков: вп, вс, с последующим эндоцитозом.

Для проникновения в клетку патогенные и непатогенные хантавирусы

используют различные рецепторы, ЬЗ и Ы интегрины соответственно

[10,11,12]. После интернализации вирусы оказываются в составе первичной

эндосомы. Далее происходит ее слияние с первичной лизосомой с

образованием вторичной эндосомы, что приводит к резкому закислению рН

среды, окружающей вирусную частицу [13]. Предполагается, что для

проникновения вируса в клетку необходимым условием является закисление

эндосом, что приводит к изменению конформации Оп:Ос гетеродимеров и

способствует слиянию клеточной и вирусной мембран [14]. Инициация

транскрипции у хантавирусов, предположительно, происходит также, как

у вируса гриппа [15], а именно: эндонуклеаза, входящая в состав

полимеразного комплекса вириона, расщепляет мРНК зараженной клетки с

образованием кэпированных фрагментов, действующих впоследствии в

качестве праймеров - затравок. Полученные праймеры гетерогенны по

14

нуклеотидным последовательностям и имеют длину 10-18 нуклеотидов. Эти неспецифические последовательности были обнаружены на 5'-концах РНК разных буньявирусов, включая хантавирусы [16].

Геномные РНК-сегменты образуют комплексы с 1ч|-белком, формируя Ь-, М- и 8-нуклеокапсиды. Предшественник поверхностных гликопротеинов, кодирующийся РНК М-сегмента, расщепляется в процессе синтеза белка (котрансляционно) на гликопротеины Оп и Ос, путем воздействия клеточной сигнальной пептидазы на консервативный аминокислотный мотив ^МУААЗАП?]. Было показано [18] и позже подтверждено [19], что ни Оп, ни Ос не могут покинуть эндоплазматический ретикулум при условии, что они транслированы независимо друг от друга. Есть и другие данные [20], свидетельствующие, что поверхностные гликопротеины, экспрессированные поодиночке, транспортируются в различные клеточные компартменты: Оы - в комплекс Гольджи, а Ос - в эндоплазматический ретикулум. Оба исследования, однако, сходятся в том, что формирование функционального гликопротеинового комплекса возможно только в комплексе Гольджи, куда Ок и Ос транспортируются только в случае их последовательной трансляции с одного мРНК предшественника. После гликозилирования вирусные частицы созревают — почкуясь через мембрану комплекса Гольджи и образуя везикулы, которые транспортируются к плазматической мембране с последующим выходом вирионов путем слияния клеточной и везикулярных мембран [21].

Репликация хантавирусов, как и других РНК-содержащих вирусов, сопровождается высокой частотой мутаций, вызываемых ошибками копирования РНК. Характеристики этих ошибок — скорость и частота мутаций. Скорость мутаций (среднее число нуклеотидных замен на один цикл репликации) была определена для двух вирусов: ХТН и СЕУ - 1,7x10"4 и 3,3х10"4нт/сайт/год соответственно [22]. Что касается частоты мутаций (фракция РНК потомства, в которой наблюдается данная замена), то она была определена только для вируса Пуумала [23].

Явление генетической реассортации как in vitro, так и in vivo было описано для вирусов семейства Bunyaviridae уже давно. Начиная с 1995 года стали появляться публикации об обнаружении подобного явления и у хантавирусов, в том числе возбудителей ГЛПС: Пуумала [24], Добрава/Белград [25]. Изучение реассортантов вируса Хантаан: вирулентного для новорожденных мышей штамма, вызывающего фатальную инфекцию при подкожном заражении, и его аттенуированного варианта, не вызывающего смертность у мышей, показало, что генетические отличия между штаммами затрагивали M сегмент, а именно замену 515 аминокислоты в гликопротеине Gn [26]. Возможность межвидовой геномной реассортации в эксперименте была показана при одновременном заражении клеток вирусом Пуумала и непатогенным представителем хантавирусов Нового света — вирусом Проспект Хилл. В результате был получен только один реассортантный клон с диплоидным M сегментом П.' Хилл и S, L

сегментами Пуумала. При последующем клонировании были получены клоны вируса П. Хилл, исходный клон и клон, содержащий Б, Ь сегменты Пуумала и М сегмент вируса П.Хилл. Последний обладал способностью вырабатывать у иммунизированных мышей нейтрализующие антитела к вирусу Пуумала [27].

Предполагается, что эволюция хантавирусов, подобно другим РНК-содержащим вирусам, происходит благодаря двум известным механизмам -генетическому "дрейфу" (накоплению мутаций, а также делеций/вставок) и генетическому "шифту" (реассортации сегментов генома). Хантавирусы обнаруживаются у индивидуальных представителей природных носителей в виде относительно гомогенных (1% нуклеотидных различий) популяций ~ "квазивидов" [28]. Такой спектр близкородственных генотипов накапливается благодаря отсутствию механизмов генетической репарации. По-видимому, данный факт является основой эволюции хантавирусов как представителей РНК-содержащих вирусов. Частота их достаточно велика, судя по исследованиям, выполненным на примере вируса Пуумала. Так при анализе неполных сиквенсов Б, М, Ь сегментов вирусной РНК от 360 полевок, которые были отловлены в течение 5 лет на одной территории, было показано, что абсолютное большинство нуклеотидных замен располагалось в нетранслируемой области или синонимические, таким образом, изменения на аминокислотном уровне консервативны. Реассортации сегментов РНК вируса Пуумала происходят регулярно и включают различные варианты ассоциаций

геномных сегментов: S-L/M (48,5%), M-L/S (47%), S-M/L (4,4%), однако, реассортанты не стабильны. Лишь незначительная часть реассортантных вариантов продолжает циркулировать наряду с родительскими штаммами. Таким образом, эволюционные процессы у хантавирусов имеют больше нейтральный характер [29, 30].

Фенотипические изменения хантавирусов могут происходить при смене хозяина. Например, вирус Пуумала, адаптированный к клеткам Vero Е6, становился менее патогенным для основного хозяина — рыжей полевки. При этом изменения на геномном уровне коснулись только некодирующих последовательностей S сегмента (замены в п 1577, 1580), не затронув аминокислотные последовательности вирусных белков [31].

1.3 Антигенные и генетические взаимоотношения

Антигенные свойства хантавирусов обусловлены наличием антигенов нуклеокапсидного белка и антигенов поверхностных гликопротеинов. При исследовании различных моноклональных антител к вирусу Пуумала было выявлено, что нуклеокапсидный белок вызывает образование антител, не способных нейтрализовать инфекционную активность, тогда как поверхностные гликопротеины стимулируют образование нейтрализующих антител [32,34].

Использование моноклональных антител в лабораторной диагностике

сделало возможным детально определить антигенные связи между

различными хантавирусами [35,36,37,38]. Тем не менее, результаты

иммунологического анализа различных хантавирусных штаммов с помощью данного метода могут быть весьма разноречивы и безусловное предпочтение при выяснении антигенных взаимоотношений остаётся за реакцией нейтрализации.

В настоящее время для определения родственных взаимоотношений хантавирусов используется анализ генетического и эволюционного родства, проводимый с помощью математической обработки данных (филогенетический анализ) нуклеотидных или аминокислотных последовательностей вирусного генома. При сравнении полученных таким образом данных с данными иммунологических реакции (нейтрализация по редукции числа бляшек, МФА с использованием моноклональных антител) было показано, что они согласуются между собой. Критерии оценки молекулярно-генетических данных в отношении принадлежности хантавирусов к определенному виду до сих пор в окончательном виде не представлены. Международным комитетом по таксономии вирусов были предложены альтернативные критерии, такие как прямое доказательство ассоциации с определенным видом (или подвидом) грызуна-резервуара и носителя; значительная (не менее 7%) степень различий в аминокислотных последовательностях нуклеокапсидного белка; не менее 4-х кратной двухсторонней разницы в опытах перекрёстной нейтрализации вирусов; отсутствие естественной реассортации с другими видами, которые в комплексе определяют видовую дифференциацию хантавирусов [39].

1.4 Специфическая лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика хантавирусной инфекции начала активно развиваться с 80-х годов прошлого столетия. Применительно к хантавирусам были разработаны иммунологические, молекулярно-генетические и вирусологические методы исследования, позволяющие в крови больных и органах грызунов выявить вирусоспецифические антитела, антиген и вирусную РНК.

Впервые хантвирусный антиген был обнаружен непрямым методом

флюоресцирующих антител при исследовании криостатных срезов органов

полевых мышей [40]. После выделения в культуре клеток Vero Е6 вируса

Пуумала (штамм CG-1820) от рыжей полевки, отловленной в окрестности

г.Уфы [41], а также вируса «Уссури» от восточно-азиатской мыши [42],

отловленной в природном очаге ГЛПС в Приморском крае, была разработана

технология изготовления культуральных антигенных препаратов. Внедрение

МФА в широкую практику с начала 80-х годов позволило выявлять

атипичные формы ГЛПС, а также подтверждать диагноз в сомнительных

случаях. Выявляемые МФА антитела представляют собой суммарно

иммуноглобулины классов IgM и IgG. Для подтверждения серологического

диагноза проводят исследование МФА парных сывороток крови для

выявления 4-х кратного и более нарастания титра антител (суммарно IgM и

IgG), поскольку в эндемичных районах у 5-10 % здорового населения

имеются специфические антитела класса IgG. Как метод индикации анти-

хантавирусных ^М МФА не применяется, т.к. ^М антитела плохо выявляются этим методом из-за конкурентного связывания антигенных детерминант антителами класса [43], которые также могут определяться в крови с первых дней заболевания. Преимущество этого метода заключается в том, что в составе инфицированных клеток присутствуют все вирусные антигены в естественно конформационной форме, в отличие от рекомбинантных антигенов. До внедрения методов молекулярно-генетического исследования, для серологической дифференциации хантавирусов активно применялся МФА с помощью моноклональных антител и реакция нейтрализации.

Различные модификации иммуноферментных методов нашли применение для выявления специфических антител классов 1§М, [41,42,43,44,45]. Антитела к хантавирусам регистрируются с первых дней заболевания, однако в некоторых случаях появляются несколько позднее и для достоверности необходимо исследование второй сыворотки в период до 6 дня болезни [46]. Было показано, что вирусспецифические 1§М антитела у некоторых больных длительно (более 1 года) могут выявляться в крови после заболевания, что предполагает необходимость определять нарастание титра ^М антител в парных сыворотках при диагностике ГЛПС [52]. Также было показано, что титры антител классов 1§М и не коррелируют с тяжестью заболевания [48,49,50,53].

Иммуноферментные методы успешно применяются для выявления хантавирусных антигенов в суспензии органов мелких млекопитающих, а также органов больных, погибших от ГЛПС, в культуральной жидкости и лизате инфицированных хантавирусами клеток [54,55,56].

Различные модификации иммуноферментных методов нашли применение для выявления специфических антител классов IgM, IgG, IgE. На основе иммунохроматографии разработан экспресс метод определения IgM антител, диагностическая эффективность которого оценивается авторами 98-99% по отношению к иммуноферментной тест-системе IgM ELISA, выпускаемой фирмой Progen [57,58].

Метод выявления нейтрализующих антител основан на выявлении «выжившего» вируса после его контакта с антителами. Поскольку хантавирусы не вызывают видимых цитопатических изменений клеток, их индикацию в культуре клеток проводят различными методами: МФА, по образованию бляшек, по выявлению инфекционных фокусов. Как правило, применяется аранжировка опыта с использованием постоянной дозы вируса, которая нейтрализуется антителами в разведениях исследуемой сыворотки. Нейтрализующую активность сыворотки, ее титр, определяют как обратную величину конечного разведения сыворотки, подавляющей не менее 50-80 % опытной дозы вируса. А. Svedmiretal. в 1980 году предложили метод МФА для оценки титра хантавируса в реакции нейтрализации (РН) по конечному разведению дозы вируса, но в связи с малой чувствительностью, трудностью

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Малкин, Геннадий Андреевич, 2015 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ткаченко Е.А. Актуальные проблемы современного этапа изучения геморрагической лихорадки с почечным синдромом в России / Е.А. Ткаченко, А.Д. Бернштейн, Т.К. Дзагурова, В.Г. Морозов, Р.А. Слонова, Л.И. Иванов, Д.В. Транквилевский, Д. Крюгер // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2013. — №1. -С. 51-58.

2. White J.D. Hantaan virus, aetiological agent of Korean haemorrhagic fever, has Bunyaviridae-like morphology / J.D. White, F.G. Shirey, G.R. French, J.W. Huggins, O.M. Brand, H.W. Lee //The Lancet. - 1982. - P. 768-771.

3. Donets M.A. Taxonomic features of causative agent of haemorrhagic fever with renal syndrome / M.A. Donets, G.V. Rezapkin, M.B. Korolev, EA.Tkachenko //The Lancet. -1982. - P. 794-795.

4. McCormick J.B. Morphological identification of the agent of Korean haemorrhagic fever (Hantaan virus) as a member of the Bunyaviridae / J.B. McCormick, D.R. Sasso, E.L. Palmer, M.P. Kiley // The Lancet. -1982.- Vol. 1. -P. 765-768;

5. Королев М.Б. Морфология и морфогенез вируса ГЛПС в клеточной культуре / М.Б. Королев Е.А. Ткаченко, Т.К. Дзагурова // Актуальные проблемы медицинской вирусологии. - 1985. - С. 143-144.

6. Schmaljohn С. Characterization of Hantaan virions, the prototype virus of hemorrhagic fever with renal syndrome. / C. Schmaljohn S. Hasty, S. A. Harrison, J.M. Dalrymple // The Journal of infectious diseases. - 1983. - Vol.148. -P. 1005-1012.

7. Schmaljohn C. Coding strategy of the Sgenome segment of Hantaan virus / C. Schmaljohn, G. Jennings, J. Hay, J.M. Dalrymple // Virology. - 1986. - Vol. 155. -P. 633-643.

8. Schmaljohn C. Hantaan virus mRNA: coding strategy, nucleotide sequence, and gene order / C. Schmaljohn, A. Schmaljohn, J. Dalrymple // Virology. - 1987. -Vol. 157.-P. 31-39.

9. Schmaljohn C. Nucleotide sequence of the L genome segment of Hantaan virus /

C. Schmaljohn // Nucleic Acids Research. - 1990. - Vol. 18. - P. 6728.

10. Gavrilovskaya I.N. beta3 Integrins mediate the cellular entry of hantaviruses that cause respiratory failure / I.N. Gavrilovskaya, M. Shepley, R. Shaw, M.H. Ginsberg, and E.R. Mackow // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.- 1998. No. 95(12). - P. 7074-7079.

11. Gavrilovskaya I.N. Cellular entry of hantaviruses which cause hemorrhagic fever with renal syndrome is mediated by beta3 integrins / I.N. Gavrilovskaya, E.J. Brown, M.H. Ginsberg, and E.R. Mackow // Journal of Virology. - 1999. No.73(5). -P. 3951-3959.

12. Goldsmith C.S. Ultrastructural characteristics of Sin Nombre virus, causative agent of hantavirus pulmonary syndrome / C.S. Goldsmith , L.H. Elliott , C.J. Peters , S.R. Zaki // Archives of Virology. - 1995. - No. 140(12). - P. 2107-2122;

13. Jin M. Hantaan virus enters cells by clathrin-dependent receptor-mediated endocytosis / M. Jin, J. Park, S. Lee, B. Park, J. Shin, K.J. Song, T.I. Ahn, S.Y. Hwang, B.Y. Ahn, K. Ahn // Virology. - 2002. - Vol. 294. - P. 60-69.

14. Mackow E.R. Cellular receptors and hantavirus pathogenesis. / E.R. Mackow and I.N. Gavrilovskaya // Current topics in microbiology and immunology . - 2001. No. 256.-P. 91-115.

15. Kolakofsky D. Bunyavirus RNA syntesis: genome transcription and replication /

D. Kolakofsky D. Hacker // Current topics in microbiology and immunology. — 1991.-Vol. 169.-P. 143-159.

16. Garcin D. The 5'-ends of Hantaan virus (Buniaviridae) RNAs suggest a prime-and-realign mechanism for the initiation of RNA synthesis / D. Garcin, M. Lezzi,

M. Dobbs, R.M. Elliot, C. Schmaljiohn, C.Y. Kang, D. Kolakofsky // Journal of Virology. - 1995. - Vol. 69. - P. 5754-5762

17. Lober C. The Hantaan virus glycoprotein precursor is cleaved at the conserved pentapeptide WAASA / C. Lober, B. Anheier, S. Lindow, H.D. Klenk, H. Feldmann // Virology. - 2001. - Vol. 289. - P. 224-229.

18. Ruusala A. Coexpression of the membrane glycoproteins G1 and G2 of Hantaan virus is required for targeting to the Golgi complex / A. Ruusala, R. Persson, C. Schmaljohn, R.Pettersson // Virology. - 1992. - Vol. 186. - P. 53-64.

19. Spiropoulou C. Sin Nombre virus glycoprotein trafficking / C. Spiropoulou, C. Goldsmith, T. Shoemaker // Virology. - 2003. - Vol. 308. - P. 48-63

20. Pensiero M. The Hantaan virus M-segment glycoproteins G1 and G2 can be expressed independently / M. Pensiero, J. Hay // Journal of Virology. - 1992. -Vol. 66.-P. 1907-1914.

21. Pettersson R. Protein localization and virus assembly at intracellular membranes / R. Pettersson // Current topics in microbiology and immunology . - 1991. -Vol. 170.-P. 67-106.

22. Song K. Molecular phylogeny of Hantaan virus, the prototype virus of HFRS / K. Song, S. Kim, Y. Choi etal. // 3rd Internftional Conference on HFRS and Hantaviruses. - Helsinki. - 1995. - P. 48.

23. Plyusnin A. Sequences of wild Puumala virus genes show a correlation of genetic variation with geographic origin of the strains / A. Plyusnin, O. Vapalahti, K. Ulfves // Journal of General Virolgy. - 1994. Vol. 75. - P. 405-409.

24. Khaiboulina S. Genetic variability and natural reassortment of the Puumala hantavirus in Bashkiria, Russia / S. Khaiboulina, S. Jeor, S. Morzunov // 10th Internftional Conference on negative strand viruses. - Dublin. - 1997. - P. 155.

25. Klempa B. Genetic interaction between distinct Dobrava hantavirus subtypes in Apodemus agrarius and A. flavicollis in nature / B. Klempa, H. Schmidt, R. Ulrich // Journal of Virology. - 2003. - Vol. 77. - P. 804-809.

26. Ebihara H. Pathogenicity of Hantaan virus in newborn mice: genetic reassortant study demonstrating that a single amino acid change in glycoprotein G1 is related to virulence / H. Ebihara, K. Yoshumatsu, M. Oginoeta // Journal Virology. - 2000. - Vol. 74. - P. 9245.

27. Handke W. Generation and characterization of genetic reassortants between Puumala and Prospect Hill hantavirus in vitro / W. Handke, R. Oelschlegel, R. Franke, L. Wiedemann, D.H. Kriiger, A. Rang // Journal of General Virolgy. -2010.-Vol. 9.-P. 2351-2359.

28. Plyusnin A.Quasispecies in wild-type tula hantavirus populations / A. Plyusnin, Y. Cheng, H. Lehvaslaiho, A. Vaheri // Journal Virology. - 1996. - Vol. 70. - P. 9060-9063.

29. Razzauti M. Microevolution of Puumala hantavirus during a complete population cycle of its host, the bank vole (Myodes glareolus) / M. Razzauti, A. Plyusnina, H. Henttonen, A. Plyusnin // Public Library of Science. - 2013. No. 8(5).

30. Razzauti M. Accumulation of point mutations and reassortment of genomic RNA segments are involved in the microevolution of Puumala hantavirus in a bank vole (Myodes glareolus) population / M. Razzauti, A. Plyusnina, H. Henttonen, A. Plyusnin // Journal of General Virology. -2008. - Vol. 89. - P. 1649-1660.

31. Lundkvist Â. Cell culture adaptation of Puumala hantavirus changes the infectivity for its natural reservoir, Clethrionomys glareolus, and leads to accumulation of mutants with altered genomic RNA S segment / Â. Lundkvist, Y. Cheng, K.B. Sjôlander, B. Niklasson, A. Vaheri, and A. Plyusnin // Journal of Virology. - 1997. - Vol. 71(12). - P. 9515-9523.

32. Arikawa J. Protective role of antigenic sites on the envelope protein of Hantaan virus defined by monoclonal antibodies / J. Arikawa, J.S. Yao, K. Yoshimatsu, I. Takashima, and N. Hashimoto // Archives of Virology. - 1992. - Vol. 126(1-4). - P. 271-281.

33. Koch J. Human recombinant neutralizing antibodies against hantaan virus G2 protein / J. Koch, M. Liang, I. Queitsch, A.A. Kraus, and E.K. Bautz // Virology. -2003.-Vol. 308(1).-P. 64-73

34. Liang M. Generation of an HFRS patient-derived neutralizing recombinant antibody to Hantaan virus G1 protein and definition of the neutralizing domain / M. Liang, M. Mahler, J. Koch, Y. Ji, D. Li, C. Schmaljohn, and E.K. Bautz // Journal of medical virology. - 2003. - Vol. 69(1). - P. 99-107.

35. Van der Groen G. Characterization of Hantaviruses using monoclonal antibodies / G. Van der Groen, K. Yamanishi, J. McConnick, G. Lloyd, EA. Tkachenko // Acta Virologica. - 1987. - Vol. 31(6). - P. 499-503.

36. Sugiyama K. Four serotypes of haemorrhagic fever with renal syndrome viruses identified by polyclonal and monoclonal antibodies / K. Sugiyama, S. Morikawa, Y. Matsuura, E.A. Tkachenko, C. Morita, T. Komatsu, Y. Akao, T. Kitamura // Journal of General Virolgy. - 1987. - Vol. 68. - P. 979-987.

37. Lundkvist A. Antigenic variation of European haemorrhagic fever with renal syndrome virus strains characterized using bank vole monoclonal antibodies / A. Lundkvist, A. Fatouros, B. Niklasson // Journal of General Virolgy. - 1991. - Vol. 72.-P. 2097-2103.

38. Dzagurova T. Antigenic relationships of Hantavirus strains analysed by monoclonal antibodies / T. Dzagurova, E. Tkachenko, R. Slonova // Archives of Virology. - 1995. - Vol. 140 - P. 1763-1773.

39. Elliot R. 7th report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Bunyaviridae / R. Elliot, M. Bouloy, C. Calisher // Academic Press. - 2000. - P. 599-621.

40. Lee H.W. Isolation of the etiologic agent of Korean Hemorrhagic fever / H.W. Lee, P.W. Lee // Journal of Infectious Diseases. - 1978. - Vol. 137. - P. 298-308.

41. Tkachenko E.A. Isolation in Vero E6 cells of Hantavirus from CI. glareolus captured in the Bashkiria area of the USSR / E.A. Tkachenko, V.N. Bashkirtsev, G. VanderGroen // Ann. Soc. Beige Med. trop. - 1984. - Vol. 64. - P. 425-426.

42. Слонова P.A. Выделение штаммов вируса ГЛПС на культуре клеток от больных людей и грызунов / Р.А. Слонова, Т.И. Астахова, Е.А. Ткаченко, Т.К. Дзагурова // Вопросы вирусологии. - 1986. - Н. 2. - Р. 180-183.

43. Дзагурова Т.К. Эффективность применения культуральных антигенов для серодиагностики ГЛПС с помощью метода иммунофлюоресценции / Т.К. Дзагурова, Е.А. Ткаченко, В.А. Петров // Вопросы вирусологии. - 1988. - Н. 1. -С. 71-75

44. Ivanov А.Р. Enzyme immuno assay for the detection of virus specific Ig G and Ig M antibody in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome / A.P. Ivanov, E.A. Tkachenko, V.A. Petrov, A.J. Pashkov, Т.К. Dzagurova, T.P. Vladimirova, G.M. Voronkova, and G. VanderGroen. Archives of Virology. -1988.-Vol. 100.- P. 1-7.

45. Zoller L.G. A novel L-capture enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant proteins for sensitive and specific diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome / L.G. Zoller , S. Yang, P. Got, E. K. F. Bautz, G. Darai // Journal of Clinical Microbiology. - 1993. - Vol. 31. - No. 5. - P. 1194-1199.

46. Sjolander К. B. Diagnostic potential of Puumala virus nucleocapsid protein expressed in Drosophila melanogaster cells / K.B. Sjolander, I. Golovljova, A.

Plyusnin, A. Lundkvist // Journal of Clinical Microbiology. - 2000. - Vol. 38. -No. 6. - P. 2324-2329.

47. Araki K. Truncated hantavirus nucleocapsid proteins for serotyping Hantaan, Seoul, and Dobrava Hantavirus infections / K. Araki, K. Yoshimatsu, M. Ogino, H. Ebihara, A. Lundkvist, H.Kariwa, I.Takashima, J.Arikawa.. Journal of Clinical Microbiology. - 2001. - Vol. 39. - No. 7. - P. 2397-2404.

48. Meisel H. Development of novel immunoglobulin G (IgG), IgA, and IgM enzyme immunoassays based on recombinant Puumala and Dobrava hantavirus nucleocapsid proteins / H. Meisel, A. Wolbert, A. Razanskiene, A. Marg, A. Kazaks, K. Sasnauskas, G. Pauli, R. Ulrich, D. H. Kruger // Clinical And Vaccine Immunology. - 2006. - Vol. 13. - No. 12. - P. 1349-1357.

49. Kallio-Kokko H. Evaluation of Puumala virus IgG and IgM enzyme immunoassays based on recombinant baculovirus-expressed nucleocapsid protein for early nephropathiaepidemica diagnosis / H. Kallio-Kokko, O. Vapalahti, A. Lundkvist, and A. Vaheri,. Clin. Diagn // Virology - 1998. - Vol. 10(1). - P. 83-90.

50. Tkachenko E.A. Immunosorbent assay for diagnosis of HFRS / E.A. Tkachenko, A.P. Ivanov, Т.К. Dzagurova, M.A. Donets, G.V. Rezapkin, E.V. Leshchinskaya, I.M. Zagidullin, A.A. Ivanova, N.M. Mustafin, T.I. Savinova // The Lancet. -1981. - Vol. 2.-P. 257-258.

51.Klempa B. Hemorrhagic fever with renal syndrome caused by two distinct lineages of Dobrava hantavirus emerging in Russia / B. Klempa, E. Tkachenko, T. Dzagurova, Yu. Yunicheva, V. Morozov, N. Okulova, G. Slyusareva, A. Smirnov, D. Kruger // Emerging Infectious Diseases Journal. - 2008. - Vol.14. - No.4. - P. 617-625.

52. Иванов Л.И. Клинико-иммунологическая характеристика заболеваемости ГЛПС в Хабаровском крае / Л.И. Иванов, Е.А. Ткаченко, Н.И. Здановская, Т.К. Дзагурова, А. Г. Ковальский, В. И. Резник // Вопросы вирусологии. -1990.-Вып. 1.-С. 74-76.

53. Морозов В.Г. Концентрация специфических иммуноглобулинов класса M в сыворотке крови больных ГЛПС в зависимости от сроков и характера течения болезни / В.Г. Морозов, А.П. Иванов, А.Е. Деконенко, Т.К. Дзагурова, В.И. Рощупкин, Е.А. Ткаченко // Дальневосточный медицинский журнал. - 2003. - Н. 3. - С. 107.

54. Иванов А.П. Поликлональная иммуноферментная система для определения антигенов хантавирусов: оценка специфичности с помощью моноклональных антител и полимеразной цепной реакции / А.П. Иванов, А.Е. Деконенко, Т.М. Шуткова, Т.К. Дзагурова, Е.А. Ткаченко // Вопросы вирусологии. - 1996. - Н. 3. - С. 110-112.

55. Иванов А.П. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональных антител для типирования антигенов хантавирусов / А.П. Иванов, Т.К. Дзагурова, А.Е. Деконенко, П.М. Барановский, В.И. Шервали, Е.А. Ткаченко // Вопросы вирусологии. - 1996. -Н. 6.-С. 263-265.

56. Araki К. Truncated hantavirus nucleocapsid proteins for serotyping Hantaan, Seoul, and Dobrava hantavirus infections / K. Araki, K. Yoshimatsu, M. Ogino, H. Ebihara, A. Lundkvist, H. Kariwa, I. Takashima, J. Arikawa // Journal of Clinical Microbiology. - 2001. - Vol. 39 No. 7. - P. 397-404.

57. Hujakka H. Comparison of a new immunochromatographic rapid test with a commercial EIA for the detection of Puumala virus specific IgM antibodies / H. Hujakka, V. Koistinen, P. Eerikainen, I. Kuronen, A. Laatikainen, J. Kauppinen, A. Vaheri, O. Vapalahti, A. Narvanen // Journal of Clinical Virology. - Vol. 23. -P. 79-85.

58. Hujakka H. Diagnostic rapid tests for acute hantavirus infections: specific tests for Hantaan, Dobrava and Puumala viruses versus a hantavirus combination test / H. Hujakka, V. Koistinen, I. Kuronen, P. Eerikainen, M. Parviainen, A. Lundkvist, A.

Vaheri, O. Vapalahti, A. Narvanen // Journal of Virological Methods. - Vol. 108. -P. 117-122.

59. Tanishita O. Evaluation of focus reduction neutralization test withper oxidase-antiperoxidase staining technique for hemorrhagic fever with renal syndrome virus O. Tanishita, Y. Takahashi, Y. Okuno, K. Yamanishi, and M. Takahashi // Journal of Clinical Microbiology. - 1984. - Vol. 20(6). - P. 1213-1215.

60. Lee P.W. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests / P.W.Lee, C.J. Gibbs, C. Gajdusek, R. Yanagihara // Journal of Clinical Microbiology. - 1985. - Vol. 22. -No. 6. - P. 940-944.

61.Niklasson B. Comparison of European isolates of viruses causing hemorrhagic fever with renal syndrome by a neutralization test / B. Niklasson, M. Jonsson, A. Lundkvist, J. Horling, and E. Tkachenko // The Journal of tropical medicine and hygiene. - 1991. - Vol.45(6). - P. 660-665.

62. Heider H. A chemiluminescence detection method of hantaviral antigens in neutralisation assays and inhibitor studies / H. Heider, B. Ziaja, C. Priemer, A. Lundkvist, J. Neyts, D.H. Kriiger, and R. Ulrich // Journal of Virological Methods. -2001.-Vol. 96(1).-P. 17-23.

63. Tsai T.F. Hemagglutination-inhibiting antibody in hemorrhagic fever with renal syndrome / T.F. Tsai, Y.W. Tang, S.L. Hu, K.L. Ye, G.L. Chen, and Z.Y. Xu // Journal of Infectious Diseases - 1984. - Vol. 150(6). - P. 895-898.

64.Tang Y.W. Distribution of hantavirus serotypes Hantaan and Seoul causing hemorrhagic fever with renal syndrome and identification by hemagglutination inhibition assay / Y.W. Tang, Y.L. Li, K.L. Ye, Z.Y. Xu, S.L. Ruo, S.P. FisherHoch, and J.B. McCormick // Journal of Clinical Microbiology. - 1991. - Vol. 29(9)-P. 1924-1927.

65. Гайдамович С.Я. Реакция непрямой гемагглютинации для индикации вируса ГЛПС и лабораторной диагностики заболеваний / С.Я. Гайдамович, Г.А. Клисенко, Т.К. Дзагурова // Ж. Вопросы вирусологии. - 1984.

66. Sugiyama К. An immune adherence assay for discrimination between etiologic agents of hemorrhagic fever with renal syndrome / K. Sugiyama, Y. Matsuura, C. Morita, S. Shiga, Y. Akao, T. Komatsu, and T. Kitamura // Journal of Infectious Diseases . - 1984. - Vol. 149(1). - P. 67-73.

67. Gresikova M. A simple method of preparing a complement-fixing antigen from the virus of haemorrhagic fever with renal syndrome (Western type) / M. Gresikova, and M. Sekeyova // Acta Virologica. - 1988. - Vol. 32(3). - P. 272-274.

68. Horling J. Detection and subsequent sequencing of Puumala virus from human specimens by PCR / J. Horling A. Lundkvist, K. Persson, M. Mullart, T. Dzagurova, A. Dekonenko, E. Tkachenko, B. Niklasson // Journal of Clinical Microbiology. - 1995. - Vol. 33. - No. 2. - P. 277-282.

69. Морозов В.Г. Генетическая идентификация хантавирусов в крови больных ГЛПС // В.Г. Морозов, С.П. Морзунов, С.Ф. Хайбулина, В.И. Рощупкин, Т.К. Дзагурова, А.П. Иванов, Е.А. Ткаченко // Эпидемиология и иинфекционные болезни - 2004. № 2. - С. 43-47.

70. Dzagurova Т.К. Molecular diagnostics of hemorrhagic fever with renal syndrome during a Dobrava virus outbreak in the European part of Russia / Т.К. Dzagurova, B. Klempa, E.A. Tkachenko, G.P. Slusareva, V.G. Morozov, B. Auste, D.H. Kruger // Journal of Clinical Microbiology. -2009. - Vol. 47. - No. 12. - P. 40294036.

71. French G.R. Korean hemorrhagic fever: propagation of the etiologic agent in a cell line of human origin / G.R. French, R.S.Foulke, O.A. Brand, G.A. Eddy, H.W. Lee, and P.W. Lee //Science. - 1981. - Vol. 211(4486). - P. 1046-108.

72. Niklasson В. Isolation of the nephropathiaepidemica agent in Sweden / B. Niklasson and J. Le Due//Lancet. - 1984.-P. 1012-1013.

73. Yanagihara R. Propagation of nephropathiaepidemica virus in cell culture / R. Yanagihara, D. Goldgaber, P.W. Lee, H.L. Amyx, D.C. Gajdusek, C.J. Gibbs, Jr., and A. Svedmyr//Lancet. - 1984. - P. 101.

74. Temonen M. Susceptibility of human cells to Puumala virus infection / M. Temonen, O. Vapalahti, H. Holthofer, M. Brummer-Korvenkontio, A.Vaheri and H. Lankinen // Journal of General Virology. - 1993. - Vol. 74. - P. 515-518.

75. Pensiero M.N. Hantaan Virus Infection of Human Endothelial Cells / M.N. Pensiero, J. B. Sharefkin, C.W. Dieffenbach, J. Hay // Journal of Virology. - 1992. - Vol. 66. - No. 10. - P. 5929-5936.

76. Song G. Preliminary human trial of inactivated golden hamster kidney cell vaccine against HFRS / G. Song, Y.C. Huang, C.S. Hang // Vaccine. - 1992. - Vol. 10.-P. 214-216.

77. McCaughey C. Low pH-induced cytopathic effect - a survey of seven hantavirus strains / C. McCaughey, X. Shi, R.M. Elliot, D.E. Wyatt, H.J. O'Neill, P.V. Coyle // Journal of Virological Methods. - 1999. - Vol. 81. - P. 193-197.

78. Nemirov K. Adaptation of Puumala hantavirus to cell culture is associated with point mutations in the coding region of the L segment and in the noncoding regions of the S segment / K. Nemirov, A. Lundkvist, A. Vaheri,. A. Plyusnin // Journal of Virology. - 2003. - Vol. 77. - No. 16. - P. 8793-8800.

79. Desmyter J. Defectiveness of Interferon Production and of Rubella Virus Interference in a Line of African Green Monkey Kidney Cells (Vero) / J. Desmyter, J.L. Melnick, W.E. Rawls //Journal of Virology. - 1968. - Vol. 2.-No. 10. - P. 955-61.

80. Миронова JI.JI. Способ культивирования вирсов / JI.JI. Миронова, В.П. Грачев, Н.В. Кузнецова, В.Д. Попова // Патент РФ 770195. - 1993.

81. Миронова JI.JT. Линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455, используемой для культивирования вирусов / Л.Л. Миронова, Ю.Х. Хапчаев, В.Д. Попова // Патент РФ № 984214. - 1993.

82. Конюшко О.И. Штамм культивируемых клеток почки эмбриона овцы для размножения вирусов / О.И. Конюшко, Л.Л. Миронова, В.Д. Попова // Патент № 1559700.- 1993.

83. Миронова Л.Л. Штамм гетероплоидных клеток почки теленка Таурус-1, используемый для культивирования вирусов / Л.Л. Миронова, Н.К. Преображенская, Г.С. Шитикова // Патент РФ № 1347448. - 1993.

84. Миронова Л.Л. Опыт создания банка авторских линий перевиваемых клеток и их применение в вирусологической практике / Л.Л.Миронова, В.Д.Попова, О.И. Конюшко, Ю.Х. Хапчаев, А.С.Акопян // Биотехнология. - 2000. - Н. 6. -С. 41-47.

85. Дзагурова Т.К. Разработка иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом / Т.К.Дзагурова, О.Н. Солопова, П.Г. Свешников, H.A. Коротина, М.В. Баловнева, O.A. Леонович, Н.Е. Варламов, Г.А. Малкин, С.Е. Соцкова, Е.А.Ткаченко // Вопросы вирусологии. - 2013. Н. 1. - С. 40-44.

86. Дзагурова Т.К. Выделение и идентификация штаммов хантавирусов-возбудителей ГЛПС в европейской части России / Т.К. Дзагурова, Е.А. Ткаченко, В.Н. Башкирцев // Медицинская вирусология. -2008. Том XXV. -С. 142-150.

87. Гублер Е.В. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях / Гублер Е.В., Генкин A.A. // -Медицина. - 1973.

88. Geimonen E. Pathogenic and nonpathogenic hantaviruses differentially regulate endothelial cell responses / E. Geimonen, S.Neff, T. Raymond, S.S. Kocer, I. N. Gavrilovskaya, E.R. Mackow // Proceedings of the National Academy of Sciences USA.- 2002. - Vol. 99(21). - P. 13837-13842.

89. Бернштейн А.Д. Особенности природной очаговости хантавирусных зоонозов / А.Д.Бернштейн, И.Н.Гавриловская, Н.С.Апекина, Т.К.Дзагурова, Е.А.Ткаченко // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2010. -№2. - С. 513.

90. Смородинцев А.А. Этиология и клиника геморрагического нефрозо-нефрита / А.А.Смородинцев, И.С. Альтшуллер, М;И. Дунаевский, Л.И. Казбинцев// ВИЭМ.- 1944.

91. Hooper J. A lethal disease model for hantavirus pulmonary syndrome / J. Hooper, T. Larsen, D. Custer, C. Schmaljohn // Virology. - 2001. - Vol. 289. - P. 6-14.

92. Yanagihara R. Experimental infection of human vascular endothelial cells by pathogenic and nonpathogenic hantaviruses / R. Yanagihara, D.J. Silverman // Archives of Virology. - 1990. - Vol. 111. - P. 281 -286.

93. Nagai T. Isolation of haemorrhagic fever with renal syndrome virus from leukocytes of rats and virus replication in cultures of rat and human macrophages / T. Nagai, O. Tanishita, Y. Takahashi // Journal of General Virology. - 1985. - Vol. 66.-P. 1271 -1278.

94. Иванов Л.И. Адаптационная способность хантавирусов при изоляции на культуре клеток VERO-E6 в зависимости от вида экологического хозяина / Л.И. Иванов, Н.И. Здановская, Т.К. Дзагурова, Е.А. Ткаченко // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2000. - № 4. - С. 22-25.

95. Миронова Л.Л. Разные аспекты применения культур клеток в вакцинологии / Л.Л. Миронова // Фундаментальные исследования. - 2009. № 9. - С. 60-62.

96. Klempa В. Novel hantavirus identified in Major's pine voles (Microtus majori) in southern European Russia / B. Klempa, P.T. Witkowski, L. Radosa, E. A. Tkachenko, Т. K. Dzagurova, N. M. Okulova, Y. V. Yunicheva, V.G. Morozov, G. A. Malkin, D.H. Kriiger // Abstract book. IX Internternayional Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses.- 2013. - P. 65.

97. Sanada T. Isolation of Hokkaido virus, genus Hantavirus, using a newly established cell line derived from the kidney of the grey red-backed vole (Myodes rufocanus bedfordiae) / T. Sanada, T. Seto, Y. Ozaki, N. Saasa, K. Yoshimatsu, J. Arikawa, K. Yoshii, H. Kariwa // Journal of General Virology. - 2012. Vol. 93. - P. 2237-2246.

98. Окулова H.M. Пространственная структура природных очагов хантавирусов на территории Северо-Западного Кавказа / Н.М. Окулова, JI.A. Хляп, А.А. Варшавский, Т.К. Дзагурова, Ю.В. Юничева, Т.Е.Рябова, М.И. Баскевич, JI.E. Василенко, Е.А. Ткаченко // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. - 2013. № 5. - С. 47 — 53.

99. Апекина Н.С. Варианты иммунореактивности и течения инфекции у рыжей полёвки (Myodesglareolus) при экспериментальном заражении хантавирусам Puumala (PUUV) / Н.С. Апекина, А.Д. Бернштейн, В.Т. Дёмина, И.Н. Гавриловская // Вопросы вирусологии. - 2014. Том 59. № 4. - С. 42-46.

100. Мутных Е. С. Эпидемические, эпизоотологические и этиологические особенности вспышки геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Тамбовской области в 2006-2007 гг / Е. С. Мутных, Т. К. Дзагурова, А. Д. Бернштейн, Е. В. Калинкина, Н. А. Коротина, Н. С. Апекина, С. Е. Соцкова, Г. А. Толстова, А. П. Суворин, Е. А.Ткаченко // Вопросы вирусологии. -2011. №6.-С. 41-47.

101. A. J. Battisti. Structural Studies of Hantaan Virus /А. J. Battisti,.Y-K. Chu, P. R. Chipman, B.Kaufmann, C.B. Jonsson, M.G. Rossmann // Journal of Virology.-2011. - Vol. 85. - No. 2. - P. 835-841.

102. Huiskonen J.T. Electron Cryotomography of Tula Hantavirus Suggests a Unique Assembly Paradigm for Enveloped Viruses/ J.T. Huiskonen, J.Hepojoki, P.Laurinmaki, A. Vaheri, H.Lankinen, S. J. Butcher, K.Grunewald // Journal of Virology.-2010.- Vol.24. - No. 10.- P. 4889-4897.

103. Ravkov E.V.Polarized entry and release in epithelial cells of Black Creek Canal virus, a New World Hantavirus / E.V.Ravkov, S.T.Nichol, RW.Compans// Journal of Virology.-1997.-Vol. 71.-No. 2.- P. 1147-1154.

104. Tkachenko E.A. Current Status of Hantavirus Vaccines Development / E.A.Tkachenko, T.K.Dzagurova, P.E. Tkachenko// in book Novel Technologies for Vaccine Development, edited by I.S.Lukashevich and H.Shirwan, Springer.-2014.- Ch. 5.- P. 113-151.