Особенности иммунного ответа организма на Treponema Pallidum тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Вязьмина, Елена Сергеевна

• Вязьмина, Елена Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Вязьмина, Елена Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Морфология и биология Treponema pallidum, антигенное строение.

1.2. Патогенез сифилиса.

1.3. Лабораторная диагностика сифилиса.

1.4. Динамика антител.

1.5. Клеточный иммунитет при сифилисе.

1.6. Растворимые формы антигенов имму некомпетентных клеток.

1.6.1. Растворимая форма антигенов HLAI класса.

1.6.2. Растворимая форма CD50 антигена.

1.6.3. Растворимая форма CD95 антигена.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Иммуноферментный метод определения специфических антител класса IgG против антигенов Т. pallidum с использованием рекомбинантных белков.

2.2. Синтез пептидов.

2.3. Иммуноферментный метод определения специфических антител' класса IgG и IgM, против антигенов Treponema pallidum с использованием синтетических пептидов.

2.4. Иммуноферментный метод определения в сыворотке крови гетеродимера " j32- микроглобулин-HLA антигены I класса".

2.5. Иммуноферментный метод определения растворимых форм дифференцировочных антигенов CD50 и CD95 в сыворотке крови.

2.6. Перйодатный метод синтеза коньюгата.

2.7. Получение поликлональных антител против антигенов мононуклеарных клеток человека.

2.8. Электрофорез в полиакриламидном геле.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Определение уровня интерлейкина-4 и интерферона-гамма в сыворотке крови больных сифилисом.

3.2. Определение содержания растворимой формы антигенов HLAI класса в сыворотке крови больных сифилисом.

3.2.1. Разработка иммуноферментного метода определения гетеродимера "р2-микроглобулин-HLA антигены I класса".

3.2.2. Содержание растворимой формы гетеродимера "(Зг-микроглобулин-НЬА антигены I класса" у больных различными формами сифилиса.

3.3. Содержание растворимой формы дифференцировочного антигена CD95 (Apo-1/Fas) у больных различными формами сифилиса.

3.4. Содержание растворимой формы CD50 антигена у больных различными формами сифилиса.

3.5. Исследование антигенных свойств рекомбинантных белков и синтетических пептидов, воспроизводящих фрагменты протеинов

Т. pallidum.

3.5.1. Изучение антигенной активности синтетических пептидов, воспроизводящих фрагменты мембранных липопротеинов Тр41 и Тр17.

3.5.2. Частота встречаемости антител класса ^О и к иммунодоминантному эпитопу белка Тр41 при различных формах сифилиса.

3.5.3. Сравнительное исследование антигенных свойств рекомбинантных белков Тр17, Тр41, Тр47 и синтетического пептида 23-51.

3.6. Анализ уровня антителопродукции во взаимосвязи с другими иммунологическими показателями.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности иммунного ответа организма на Treponema Pallidum»

Актуальность проблемы

Известно, что инфицировние организма бледной трепонемой сопровождается множественными нарушениями функционального состояния иммунной системы. Иммунный ответ при сифилисе может характеризоваться как активацией, так и супрессией различных звеньев клеточного иммунитета. Причины длительной персистенции возбудителя в организме, стадийность и разнообразие клинических проявлений заболевания, возникновение серорезистентности после лечения, а также отсутствие протективного иммунитета при сифилисе в настоящее время до конца не выяснены. В таких условиях, актуальным является поиск, разработка и применение новых методов оценки особенностей иммунных реакций на инфицирование организма бледной трепонемой. Поскольку функциональное состояние Т-лимфоцитов может быть и причиной и следствием разнообразных форм иммунных нарушений, наблюдающихся при сифилитической инфекции, актуальным является изучение особенностей реакции клеточного звена иммунной системы в ответ на персистенцию в организме Treponema pallidum.

Изучение особенностей иммунного ответа у больных сифилисом требует детального исследования антигенной структуры возбудителя и его влияния на иммунную систему хозяина. Это актуально как в теоретическом плане для изучения основ иммуногенеза при инфицировании организма Treponema pallidum, так и в практическом аспекте для дифференциальной диагностики сифилиса. Разработка на этой основе иммуноферментных тест-систем четвертого поколения является важной практической задачей.

Цель исследования

Определить особенности клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа на Treponema pallidum с применением новых методических приемов.

Задачи

1. Оценить уровень интерлейкина-4 и интерферона-гамма в сыворотке крови больных различными формами сифилиса.

2. Разработать двух-сайтовый иммуноферментный метод определения уровня растворимой формы молекул HLA I класса. Провести сравнительную оценку сывороточных уровней растворимых форм молекул HLA I класса и растворимых CD50 и CD95 антигенов у больных сифилисом.

3. С использованием рекомбинантных белков и синтетичесих пептидов, воспроизводящих иммунозначимые эпитопы возбудителя сифилиса, изучить особенности антителопродукции против антигенов Treponema pallidum.

4. Разработать иммуноферментные тест-системы для определения специфических антител классов IgG и IgM в сыворотке крови человека.

5. Оценить значимость рекомбинантных белков и синтетических пептидов для дифференциальной диагностики различных форм сифилиса.

6. Провести сравнительное исследование содержания растворимых форм мембранных антигенов в сыворотке крови с уровнем специфических антител у больных сифилисом.

Положения, выносимые на защиту

1. В крови больных сифилисом на фоне повышенного содержания интерферона-гамма существует дисбаланс уровня растворимых форм молекул HLA I класса, CD50, CD95. При серорезистентности после лечения сифилиса наблюдается пониженный уровень растворимых молекул HLA I класса и CD50.

2. С применением рекомбинантных белков и синтетического пептида 23-51, воспроизводящего иммунодоминантный эпитоп белка Тр41, разработаны иммуноферментные тест-системы четвертого поколения для диагностики сифилиса. Пептид 23-51 применим для дифференциальной диагностики раннего скрытого сифилиса и ложноположительных реакций.

Научная новизна

Содержание интерлейкина-4 и интерферона-гамма показало, что у больных сифилисом в сыворотке крови наблюдается увеличение содержания интерферона-гамма, что свидетельствует о доминирующей активации Т11-1 клеток.

Показано, что у больных сифилисом наблюдается изменение уровня растворимых антигенов НЬА I класса. По мере развития сифилитической инфекции (вторичный сифилис, ранний скрытый сифилис, серорезистентность после лечения сифилиса) происходит снижение концентрации данного белка с увеличением количества больных с низким содержанием сывороточного вНЬД-Г

У больных различными формами сифилиса достоверное повышение уровня растворимого СБ95 антигена наблюдается только у больных манифестными формами.

Установлено, что в ответ на инфицирование бледной трепонемой обнаруживаются выраженные изменения уровня растворимого СБ50 антигена. Если при манифестных формах, вторичном и раннем скрытом сифилисе уровень зСБ50 достоверно повышен, то при серорезистентности после лечения содержание данного растворимого белка достоверно понижено.

Сравнение антигенных свойств исследованных в работе белков и пептидов показало, что наиболее значимыми для использования в иммунодиагностике сифилиса являются рекомбинантный протеин Тр17 и синтетический пептид 23-51.

Установлено, что с помощью пептида 23-51 и моноклональных антител, направленных против IgM человека, можно выявлять специфические антитела класса IgM в сыворотке крови больных сифилисом.

Выявлена корреляционная взаимосвязь между уровнем растворимых форм антигенов HLA I класса, CD50 антигена и содержанием антител, направленных против эпитопа белка Тр41, воспроизводимого с помощью синтетического пептида 23-51.

Показано, что определение специфических антител класса IgG к пептиду 23-51 позволяет достигнуть положительного эффекта, который выражается в повышении точности дифференциальной диагностики раннего скрытого сифилиса и ложноположительных реакций.

Практическая значимость работы

На основе синтетических пептидов и рекомбинантных белков, воспроизводящих фрагменты белков Treponema pallidum, а также конъюгатов моноклональных антител против человеческих иммуноглобулинов классов IgG и IgM, разработаны иммуноферментные тест-системы для диагностики сифилиса. Тест-система "ИФА-анти-СИФ" позволяет выявлять антитела класса IgG к возбудителю сифилиса и может быть использована при скрининговых исследованиях. Тест-система "ИФА-анти-СИФ-IgM" позволяет определять антитела класса IgM в сыворотке крови больных сифилисом. Совместно с Нижегородским НИКВИ разработан способ дифференциальной диагностики раннего скрытого сифилиса и ложноположительных реакций на сифилис, основанный на определении антител класса IgG в сыворотке крови к синтетическому пептиду 23-51 белка Тр41 возбудителя сифилиса. На данный способ в настоящее время получен патент № 2157536.

С использованием моноклональных антител разработан иммуноферментный метод определения антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса в биологических жидкостях, применимый для изучения роли этих белков в молекулярных механизмах иммунных реакций, а также для изучения прогностической роли уровня растворимых молекул HLA I класса при различных заболеваниях.

Внедрение полученных результатов

Полученные результаты легли в основу технологии производства тест-систем для диагностики сифилиса: "ИФА-анти-СИФ" и "ИФА-анти-СИФ-IgM". Тест-система "ИФА-анти-СИФ" прошла Государственные испытания в ГИСК им. JT.A. Тарасевича и утверждена в МЗ РФ в качестве медицинского диагностического препарата и внедрена в производство научно-производственной компанией "Препарат", Н. Новгород (ФСП 42-0101-0899-01, утверждена 07.03.2001) Уровень внедрения - Российский. Тест-система "ИФА-анти-СИФ" используется в лабораториях инфекционных стационаров, центров крови, центров СПИД и т.д. Тест-система "ИФА-анти-СИФ-IgM" успешно прошла апробацию на базе лабораторий практического здравоохранения и выпускается в виде экспериментально-производственных серий научно-производственной компанией "Препарат", Н. Новгород.

Апробация работы

Результаты работы представлены на VII и VIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2001), на конференции «Естественные факторы защиты в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний», посвященной 70-летию ННИИЭМ (Н. Новгород, 2000), на Международной конференции, посвященной памати академика РАМН и РАМНТ И.Н. Блохиной (Москва, 2000), на 6-й Нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2001), на 8-й и 9-й Международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2000,

11

2001), на 6-й Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (С.-Петербург, 2001), XII юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001), на научно-практической конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии" (Казань, 2000), VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001), на заседании Нижегородского научного общества иммунологов (Н.Новгород, 2002).

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ. Апробация диссертации состоялась на расширенной межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н.Блохиной 19 марта 2002 года.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Вязьмина, Елена Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Повышенное сывороточное содержание интерферона-гамма, у больных вторичным, ранним скрытым сифилисом и при серорезистентности свидетельствует о смещении Т-клеточного ответа в ходе сифилитической инфекции в сторону Th-1 - го типа.

2. Разработан иммуноферментный метод определения уровня растворимых антигенов HLA I класса в сыворотке крови с использованием моноклональных антител. Установлено пониженное содержание sHLA-I у больных ранним скрытым сифилисом и при серорезистентности после лечения сифилиса.

3. Показано, что повышение уровня растворимого CD95 антигена наблюдается только при манифестных формах сифилиса. Обнаружено повышенное содержание растворимого CD50 антигена у больных манифестными формами, вторичным сифилисом и снижение сывороточного содержания sCD50 при серорезистентности после лечения сифилиса.

4. Наиболее оптимальным вариантом выявления специфических антител к Treponema pallidum является смесь синтетического пептида 23-51, воспроизводящего N-концевой фрагмент белка Тр41 и рекомбинантного белка Тр17. Установлено, что данный пептид позволяет выявлять антитела класса IgM в сыворотке крови больных сифилисом

5. Разработаны две иммуноферментные тест-системы, предназначенные для выявления суммарных антител (классов IgG и IgM) в сыворотке крови и определения антител класса IgM, основанные на использовании рекомбинантных белков и синтетического пептида.

6. Определение специфических антител класса IgG к пептиду 23-51 белка Тр41 повышает точность дифференциальной диагностики раннего скрытого сифилиса и ложноположительных реакций (патент №2157536). Установлено, что у больных сифилисом и при серорезистентности концентрация специфических антител к пептиду 23-51 коррелирует с сывороточным уровнем sHLA-I и sCD50 молекул.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Эпидемиологическая ситуация с заболеваемостью сифилисом остается крайне напряженной. С начала 90-х годов она возросла почти в 40 раз и в 1999 г. достигла 186,7 случаев на 100 тыс. населения (приказ №87, 210). Сифилис относится к классическим заболеваниям, передающимся половым путем [71]. Начавшееся в 90-х годах ХХ-го столетия резкое повышение заболеваемости сифилисом сопровождается рядом характерных особенностей и, прежде всего, большим разнообразием клинических проявлений [25]. Сифилис может заявить о себе в любом возрасте, так как его возбудитель передается от матери плоду и годами сохраняется в латентном состоянии. Он не культивируется на искусственных питательных средах, и почти ничего неизвестно о факторах, которые определяют его патогенность и способность "ускользать" от иммунологического надзора.

В настоящее время наряду с манифестными формами сифилиса значительно возросло число его малосимптомных и скрытых форм [7, 60]. Участились случаи раннего врожденного сифилиса с активными проявлениями и летальным исходом, отмечены случаи нейросифилиса, участились случаи бытового заражения, чаще стала выявляться серорезистентность [6, 21, 22, 28, 30, 33, 42, 59. 68].

Сифилис принадлежит к инфекциям, хроническое течение которых вступает в несоответствие с иммунным 'ответом на антигены возбудителя. Исследование Т- и В- клеточного звена иммунной системы дает порой разноречивые результаты. Изучение механизмов иммунного ответа на Т. pallidum остается важной актуальной задачей, решение которой требует детального исследования антигенной структуры возбудителя, а также изучение особенностей реакции разных звеньев иммунной системы на возбудителя. Это актуально как в теоретическом плане для изучения основ иммуногенеза при сифилитической инфекции, так и в практическом аспекте для дифференциальной диагностики сифилиса. Принципиально важным шагом в решении этих проблем является использование новых методических подходов, в том числе применение рекрмбинантных белков и синтетических пептидов как аналогов антигенных детерминант возбудителя сифилиса. Разработка на этой основе иммуноферментных тест-систем четвертого поколения является важной практической задачей.

В реализации гуморальных и клеточных механизмов иммунного ответа важную роль играют цитокины. В связи с этим в исследовании клеточно-опосредованного иммунного ответа при сифилисе представляет интерес изучение уровня цитокинов, определяющих тип иммунного ответа. Ранее было установлено, что развитие Т-клеточного ответа на рекомбинантные белки Тр15, Тр17, ТрЗО, ТрЗЗ, Тр35, Тр47, Тр37 возбудителя сифилиса в течение экспериментальной сифилитической инфекции демонстрирует ответ ИМ-го типа [75].

В тоже время при раннем скрытом сифилисе и серорезистентности после лечения сифилиса, информации о количественном содержании цитокинов, определяющих тип иммунного ответа, нами не встречено. Поэтому в настоящей работе было проведено количественное исследование уровня интерлейкина-4 и интерферона-гамма у больных различными формами сифилиса. Показано, что концентрация интерлейкина-4 в сыворотке крови больных вторичным, ранним скрытым сифилисом и при серорезистентности после лечения сифилиса достоверно не отличалась от нормы. В тоже время, уровень интерферона-гамма был достоверно повышен во всех исследованных группах больных сифилисом.

Повышение уровня ШЫ-у показывает, что развитие Т-клеточного ответа в ходе сифилитической инфекции происходит путем смещения равновесия популяций ТЬ-1 и ТЬ-2 в сторону ТЬ-1-го типа. Наибольший уровень ШЫ-у у больных вторичным сифилисом по сравнению с группами больных ранним скрытым сифилисом и при серорезистентности после лечения сифилиса можно объяснить наличием персистирующей инфекции у этой группы больных, так как этот период характеризуется активным размножением возбудителя.

Одним из наиболее сложных вопросов в практической сифилидологии остается вопрос о серологической резистентности после лечения сифилиса, когда после полноценного специфического лечения не происходит негативации серологических реакций [49, 53, 70].

Повышенное содержание IFN-y у больных с серорезистентностью может свидетельствовать о присутствии персистирующей в организме бледной трепонемы и наличии, вследствие этого, антигенной стимуляции, вызывающей выработку специфических антител класса IgG у этих больных. При серорезистентности после лечения сифилиса уровень IFN-y соответствует его содержанию у больных ранним скрытым сифилисом, что также может свидетельствовать в пользу наличия персистенции Т. pallidum в организме и, косвенно, об изменении антигенпрезентирующей функции макрофагов.

Таким образом, проведенные исследования уровня цитокинов у больных сифилисом продемонстрировали, что развитие клеточного иммунного ответа при сифилисе происходит путем доминирующей активации Th-1 -клеток, о чем свидетельствует повышенная концентрация IFN-y во всех исследованных группах больных.

Показано, что IFN-y влияет на экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса. В экспериментах iv vitro установлено, что IFN-y способен индуцировать высвобождение растворимых молекул HLAI класса [101, 107, 123].

Уровень растворимых молекул HLA I класса в сыворотке крови может отражать состояние клеточного иммунитета и процессы активации иммунной системы. Сход этих молекул с мембран может приводить к блокаде иммунного ответа [149]. Поэтому следующим этапом настоящей работы была оценка уровня sHLA-I у больных различными формами сифилиса.

Для количественного определения уровня sHLA-I в сыворотке крови был разработан двух-сайтовый иммуноферментный метод с использованием МКА ИКО-53 - против a-цепи молекулы HLA-I, и МКА ИКО-216 - против

Р2-микроглобулина. Разработанный метод был использован для оценки уровня гетеродимера у больных различными формами сифилиса.

Оценка среднего уровня sHLA-I у больных манифестными формами, вторичным сифилисом, РСС и СР, показала, что уровень гетеродимера в сыворотке крови достоверно снижается, по сравнению с группой здоровых доноров при РСС и СР. Кроме того, индивидуальный анализ данных показал, что по мере течения сифилитической инфекции увеличивается относительное количество больных с пониженным содержанием сывороточного sHLA-I. Поскольку HLA I класса экспрессируется на поверхности всех ядросодержащих клеток, повышение уровня растворимого гетеродимера в сыворотке крови может происходить вследствие схода этих молекул в местах некротических повреждений тканей. Повышенный уровень sHLA-I у больных манифестными формами и вторичным сифилисом по сравнению с группами РСС и СР может объясняться наличием ярких клинических проявлений, когда возбудитель вызывает выраженные повреждения кожи, слизистых оболочек и т.д. При РСС и СР, когда в сравнении с манифестными формами воспалительный потенциал болезни снижен, уровень sHLA-I также снижался.

Одной из известных функций sHLA-I является блокада Т-клеточного рецептора и индукция апоптоза [149]. Пониженное содержание гетеродимера в сыворотке больных сифилисом свидетельствуют о разбалансированности иммунных реакций и снижении Т-клеточной активации.

Следующим этапом настоящей работы было определение растворимой формы молекул CD95 в сыворотке крови больных сифилисом. Оценка уровня растворимого CD95 антигена, ингибирующего апоптоз и способного снижать проапоптотический потенциал sHLA-I, проводилась с использованием иммуноферментного метода для полуколичественного определения sCD95 с использованием моноклональных антител ИКО-160. Достоверное повышение уровня sCD95 зарегистрировано только в группе больных манифестными формами сифилиса, что отражает наличие у этих больных молекулярных механизмов, выраженно ингибирующих апоптотические процессы.

Известно, что в процессах инициации иммунного ответа кроме молекул HLA I класса принимают участие молекулы адгезии, в частности ICAM-3. ICAM-3 - главный лиганд для LFA-1 и CD209 при инициации иммунного ответа [100, 82]. В литературе отсутствуют данные о содержании, функционально-диагностическом значении растворимого CD50 в ответ на инфицирование Treponema pallidum. Мы провели оценку уровня sCD50 у больных различными формами сифилиса с помощью иммуноферментного метода с использованием МКА ИКО-бО. Обнаружено, что во всех исследованных группах больных сифилисом происходит достоверное изменение уровня sCD50 антигена. У больных сифилисом уровень sCD50 был повышен при манифестных формах, при вторичном сифилисе и при РСС. При серорезистентнтности после лечения сифилиса - достоверно понижен. Представляет интерес проведенный индивидуальный анализ данных. По мере течения сифилитической инфекции, относительное количество сывороток с повышенным содержанием sCD50 уменьшается. Относительное количество сывороток с пониженным содержанием, напротив, увеличивается.

Ранее продемонстрировано усиление спонтанной хемилюминисценции нейтрофилов у больных первичным и вторичным сифилисом, что трактуется как возбужденное состояние клеток, то есть их активация [45]. Показано, что при активации нейтрофилов происходит шеддинг экспрессирующегося на их поверхности CD50 антигена [147]. Следствием этого явления, по нашему мнению, может являться повышение содержания его растворимой формы в сыворотке крови больных манифестными формами и при вторичном сифилисе. В то же время у больных CP обнаружен дефицит нейтрофилов [2, 8], который, вероятно, вносит свой вклад в снижение уровня растворимого ICAM-3.

С другой стороны, изменение концентрации сывороточного sCD50 антигена может являться индикатором дисбаланса иммунных реакций, наиболее выраженном, как показано рядом авторов [2, 14, 53, 54] у больных серорезистентными формами сифилиса.

Увеличение концентрации sCD50 в биологических жидкостях может приводить к блокаде взаимодействия молекул DC-SIGN (CD209) и LFA-1 с мембранной формой ICAM-3, блокируя, тем самым, адгезию наивных Т-лимфоцитов на антиген-презентирующих дендритных клетках. Следствием этого является изменение уровня активации Т-хелперных клеток и, в конечном итоге, изменение уровня антителопродукции в ответ на инфицирование организма Т. pallidum. Проведенные исследования позволяют рассматривать уровень sCD50 антигена как биомаркер выраженности иммунного ответа при сифилисе.

Чтобы проверить возможность существования связи между уровнем растворимых форм мембранных антигенов (и в первую очередь - sCD50) с уровнем антителопродукции мы разработали собственные методические подходы оценки антителопродукции против антигенов Т. pallidum. Полученные при этом результаты привели к созданию двух новых иммуноферментных тест-систем для определения антител класса IgG и IgM против антигенов возбудителя сифилиса.

В работе были использованы синтетические пептиды и рекомбинантные белки, являющиеся аналогами нативных белков Т. pallidum и их фрагментов.

Проведено исследование особенностей антителообразования к рекомбинантным белкам - аналогам белков возбудителя сифилиса - и синтетическим пептидам, воспроизводящим иммунозначимые антигенные детерминанты этих белков. С одной стороны, изучались особенности гуморального иммунного ответа у больных сифилисом, с другой стороны, определяли антигенные свойства данных белков и синтетических пептидов.

Изучение антигенной активности синтетических пептидов, воспроизводящих фрагменты мембранных липопротеинов Тр41 и Тр17, показало, что в молекуле белка Тр41 существует минимум три независимых антигенных сайта. Один из них локализован в 1Ч-конце белка приблизительно между 23-51 аминокислотными остатками. Два других находятся в С-концевой части приблизительно между 255-275 и 317-345 аминокислотными остатками. Наиболее иммуногенным является Ы-концевой эпитоп белка Тр41. Пептиды, воспроизводящие этот фрагмент обладали наиболее выраженными антигенными свойствами. Наши исследования подтверждают данные зарубежной и отечественной литературы о расположении наиболее иммунозначимых участков в белке Тр41 на 14-конце [20, 74, 114]. Исследование антигенных свойств пептидов, воспроизводящих фрагменты последовательности Тр17, показало, что наибольшей антигенной активнстью по отношению к образцам сыворотки крови больных сифилисом обладают пептиды 34-93 и 138-156, что соответствует данным литературы [9, 23] и свидетельствует о том, в природном антигене 17 кДа существуют как минимум два иммунодоминантных региона, имеющих, по-видимому, линейное строение.

Исследование частоты встречаемости антител классов и 1§М к пептиду 23-51 у больных различными формами сифилиса показало 100 %-ную выявляемость антител класса ^О при вторичном свежем и вторичном рецидивном сифилисе и высокую встречаемость антител этого класса у больных первичным и ранним скрытым сифилисом. Использование пептида 23-51 позволяет также выявлять антитела класса ^М. Таким образом, данный пептид может быть использован в диагностике как ранних, гак и поздних форм заболевания.

Известно, что комплекс стандартных серологических реакций на сифилис нередко может показывать ложноположительные результаты [61, 62]. Сложной в этих условиях представляется дифференциация РСС с ложноположительными результатами серологических тестов. С помощью иммуноферментного метода для определения антител класса IgG к синтетическому пептиду 23-51 были протестированы сыворотки крови от больных РСС и лиц с ЛПР. Определение антител к синтетическому пептиду 23-51 подтвердило специфичность стандартных серологических реакций у 100 % больных РСС. При использовании иммуноферментной тест-системы Вектор-Бест (г. Новосибирск) подтверждение результатов стандартных серологических реакций было получено только у 96,3 % больных РСС. У лиц с установленным ЛПР использование пептида 23-51 давало повышение точности диагностики на 35,3 %. Основываясь на полученных результатах, совместно с сотрудниками Нижегородского НИКВИ был разработан способ дифференциальной диагностики раннего скрытого сифилиса и ложноположительных реакций на сифилис. Способ основан на определении специфических антител класса IgG к синтетическому пептиду 23-51 и позволяет достигнуть повышения точности дифференциальной диагностики РСС и ЛПР (патент № 2157536).

Следующим этапом настоящей работы было сравнительное исследование спектра специфических антител у больных различными формами сифилиса и антигенных свойств рекомбинантных белков Т. pallidum и пептида 23-51. Было проведено исследование частоты встречаемости антител класса IgG к рекомбинантным белкам Тр17, Тр41, Тр47 и антител классов IgG и IgM к синтетическому пептиду 23-51 у больных первичным серопозитивным, вторичным свежим, вторичным рецидивным, ранним скрытым сифилисом. В качестве контрольной группы исследовались сыворотки крови от больных с кожной патологией и здоровых доноров с отрицательными значениями КСР.

Результаты свидетельствуют о том, что наиболее перспективными для использования в иммуноферментной диагностике сифилиса являются рекомбинантный белок Тр17 и синтетический пептид 23-51, поскольку при совместном использовании они позволяют выявлять 99,9 % образцов сыворотки больных различными формами сифилиса. Однако, в связи с длительной персистенцией Т. pallidum в организме могут возникать изменения антигенной структуры Т. pallidum [46]. Поэтому, для наиболее полного представления антигенной структуры возбудителя сифилиса мы сочли целесообразным использовать в качестве антигенной основы смесь рекомбинантных белков и синтетического пептида.

На основании проведенного исследования антигенных свойств рекомбинантных белков и синтетических пептидов нами были сконструированы две иммуноферментные тест-системы для диагностики сифилитической инфекции «ИФА-анти-СИФ» и «ИФА-анти-СИФ-IgM». В качестве антигенной основы для тест-системы «ИФА-анти-СИФ» послужили рекомбинантные белки Тр17, Тр41, Тр47 и синтетический пептид 23-51. Иммуносорбентом для тест-системы «ИФА-анти-СИФ-IgM» явился синтетический пептид 23-51, воспроизводящий иммуно доминантный фрагмент белка Тр41. Тест-система «ИФА-анти-СИФ» предназначена для выявления антител классов IgG и IgM к Treponema pallidum, тест-система "ИФА-анти-СИФ-IgM" позволяет выявлять только антитела класса IgM к возбудителю сифилиса. Результаты клинико-лабораторных испытаний разработанных диагностикумов позволяют заключить, что тест-системы «ИФА-анти-СИФ» и «ИФА-анти-СИФ-IgM» обладают высокой чувствительностью и специфической активностью, не уступающей активности имеющихся аналогов. Это позволяет использовать их в серодиагностике сифилиса.

На заключительном этапе работы мы определили концентрацию специфических антител к пептиду 23-51 у больных различными формами сифилиса и провели оценку корреляционных взаимоотношений данного показателя с уровнем растворимых антигенов HLA I класса, CD50, CD95 и цитокинов IFN-y и IL-4. Наибольшие титры специфических антител регистрировались в группе больных вторичным сифилисом, наименьшие - в сыворотках крови больных с серорезистентностью после лечения сифилиса. Сывороточное содержание антител к пептиду 23-51 отражает динамику

145 антителообразования при сифилисе: наибольшие титры антител регистрируюся при манифестации инфекционного процесса, снижение титра антител - при скрытом сифилисе и серорезистентности.

При оценке корреляционных взаимоотношений между исследованными показателями оказалось, что содержание sCD95 коррелирует с уровнем sCD50 у здоровых доноров, больных манифестными формами вторичным и ранним скрытым сифилисом. При серорезистентности корреляций между этими показателями обнаружено не было. В то же время при исследовании группы больных сифилисом в целом, обнаружены корреляции между титром специфических антител класса IgG к пептиду 2351 и уровнем растворимых антигенов HLA I класса и CD50.

Полученные результаты позволяют рассматривать растворимые формы мембранных антигенов HLA I класса и CD50 антигена в качестве показателей активности иммунных процессов. Корреляционные отношения между концентрацией sHLA-I и sCD50 антигенов и уровнем антителопродукции свидетельствуют о вероятной связи между этими показателями и интенсивностью специфического антителообразования на Treponema pallidum.

146

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Вязьмина, Елена Сергеевна, 2002 год

1. Аббасова С. Г., Кушлинский Н. Е., Степанов Ю. М. и др. Ингибитор апоптоза растворимый Fas-антиген в сыворотке крови больных хроническим гастритом и раком желудка. // Журн. АМН Украины. -1999. - Т. 5.- №2.-С. 347-351.

2. Бахметьева Т. М. Роль иммунных нарушений в развитии серорезистентности при сифилисе и эффективность спленина в комплексной терапии больных. // Дисс. Канд. мед. наук. М. - 1988. - 150 с.

3. Барышников А. Ю. Моноклональные антитела серии ИКО к дифференцировочным антигенам лимфоцитов человека. // Гематология и трансфузиология. -1990. №8. - С. 4-7.

4. Барышников А. Ю., Кадагидзе З.Г., Короткова О. В. и др. Моноклональные антитела ИКО-53 против мономорфных HLA-антигенов I класса. // Вестник ВОНЦ АМН СССР. 1991. - №1. - С. 9-11.

5. Борисенко К. К., Лезвинская Е. М., Воронин Ю. В., Патаридзе И. Ф. И др. Роль некоторых факторов гуморального и клеточного иммунитета в патогенезе сифилиса. // Вестник дерматологии и венерологии. 1984. - №6. -С. 30-34.

6. Борисенко А. А., Лосева О. К., Гришко Т. Н. и др. Случай позднего врожденного сифисиса. // Инфекции, передаваемые половым путем. 1999,- №5-С. 42-45.

7. Борисенко А. А., Лосева О. К., Доля О. В. Ранний врожденный сифилис: клиника, патоморфология, диагностика, лечение, профилактика. // Русский медицинский журнал. 1998. - Т. 6. - № 15. - С. 985-993.

8. Васильев Т. В., Орлина Э. А., Максудов Ф. М. К вопросу о патогенезе серорезистеного сифилиса. // Патогенез и терапия кожных и венерических заболеваний. 1983. - Минск. - Вып. 26. - С. 149-152.

9. Вербов В. Н., Колобов А. А., Иванов А. М. и др. Эпитопное клонирование антигена 17 кДа Т. pallidum с помощью синтетическихпептидов. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. С.Петербург. - 2001. - Т. 5. - №1. - С. 43-44.

10. Галактионов В. Г. Иммунология. М. - 2000. - 486 с.

11. Гланс С. Медико-биологическая статистика. М. - 1999. - 459 с.

12. Гражданцева А. А., Сиволюбова Г. Ф., Урманов И. X. и др. Клонирование и экспрессия в E.coli основных антигенов Treponema Pallidum и исследование их иммунохимических свойств. // Иммунология. 1998. - № 4. - С. 17-20.

13. Гражданцева А. А., Кочнева Г. В., Сиволюбова Г.Ф. и др. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантных антигенов. И Иммунология. -1998. №4.-С. 20-23.

14. Данилов С. И. Критерии диагностики, иммунокоррекция и реабилитация больных с серорезистентностью после лечения сифилиса. Дисс. докт. мед. наук. С.-Петербург. - 1996. - 300 с.

15. Данилов С. И. Назаров П. Г. Новая концепция формирования серорезистентности после лечения сифилиса. // Инфекции передаваемые половым путем. 2000. - №2. - С. 16-19.

16. Дмитриев Г. А., Брагина Е. Е. Современные методы диагностики сифилиса. // Вестник дерматологии и венерологии. 1996. - №2. - С. 29-33.

17. Дмитриев Г. А., Брагина Е. Е. Современные методы диагностики сифилиса. // Вестник дерматологии и венерологии. -1996. №3. - С. 33-39.

18. Дмитриев Г. А. Методические материалы по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) и заболеваний кожи. Протокол ведения больных. - 2001. - М. - 40 с.

19. Захаров В. К. Сочетание неспецифических средств защиты и иммунологической реактивности у больных скрытым мифилисом в процессе лечения. Автореф. канд. дисс. Киев. - 1986. -25 с.

20. Иванов А. М., Колобов А. А., Вербов В. Н. и др. Характеристика синтетических аналогов возбудителя сифилиса в иммуноферментноманализе. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. С.Петербург. - 1999. - Т. 3. - №1. - С.108-109.

21. Иванова М. А., Морозова Т. А., Федорова И. В. и др. Случай раннего врожденного сифилиса: патоморфологические изменения органов плода, плаценты и оболочек. // Вестник дерматологии и венерологии. 2001. - №3. -С. 50-51.

22. Иванова М. А., Лосева О. К., Коробейникова Э. А. и др. Сифилис и беременность. // Вестник дерматологии и венерологии. № 6. - 2001. - С. 6366.

23. Кампе-Немм С. А., Гаче М. В., Шпень В. М. и др. Изучение антигенной структуры мембранного белка Тр17 из Treponema pallidum. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. С.-Петербург. -1999. - Т. 3. - №1. - С. 109-109.

24. Капкаев Р. А., Ким Э. Г., Любан Б. Г. Фагоцитарная активность лейкоцитов при сифилисе. // Вестник дерматологии и венерлогии. 1988. -№2.-С. 69-73.

25. Карачева В. Ю., Аковбян В. А., Прохоренков В. И. О механизмах клинического полиморфизма сифилитической инфекции. // Вестник дерматологии и венерологии. 2001. - № 3. - С. 39-44.

26. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., Воробьев А. А. Эндогенные иммуномодуляторы. С-Петербург. - 1992. - 256 с.

27. Ким Э. Г. Особенности иммуногенетики и иммуногенеза при сифилисе. Автореф. докт. дисс. - М. - 1992. - 31 С.

28. Кутаева Л. И. Семейный случай заболевания сифилисом. // Вестник дерматологии и венерологии. -2001. № 1. - С. 78-80.

29. Лосева О. К. Сифилис и беременность. // Современные методы диагностики, терапии и профилактики ИППП. Материалы рабочего совещания дерматовенерологов и акушеров-гинекологов. - 1999. - М. - С.5-10.

30. Майнулова Л. А., Федотов В. П., Логунов В. П. Т-звено иммунитета у больных сифилисом. // Вестник дерматологии и венерологии. 1983. - №3.-С. 23-27.

31. Маянский А. Н. Микробиология для врачей (очерки патогенетической микробиолории). Н. Новгород. - 1999.-238 с.

32. Миракян М. Е., Саркисян Р. Н. Сифилитический панувеит. // Вестник дерматологии и венерологии. -2001. №1. - С. 79-80.

33. Новиков В. В. Диагностическая значимость при вирусных инфекциях мембранных и растворимых форм дифференцировочных антигенов клеток иммунной системы. // Гематология и трансфузиология. 1996. - № 6. - С. 4043.

34. Новиков В. В. Характеристика и биотехнология моноклональных антител против лимфоцитарных антигенов. Дисс. док. биол. наук. Н. Новгород. - 1994. - 300 с.

35. Овчинников Н. М., Беднова В. Н., Делекторский В. В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. М. - 1987. - 302 с.

36. Овчинников Н. М., Делекторский М. М. Ультраструктура венерических заболеваний и их клинической течение. М: Медицина. - 1973. - 305 с.

37. Орлина Э. А. Усовершенствование методики постановки реакции иммунофлюоресценции для серодиагностики сифилиса. Автореф канд. дисс. -М.- 1985. -25 с.

38. Пожарская В. О. Функциональные свойства клеточных структур культуральных Treponema pallidum. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. - № 3. - С. 11-14.

39. Приказ № 87 Минздрава РФ от 26.03.2001 г. О совершенствовании серологической диагностики сифилиса. М. - 2001.

40. Приказ № 291 Минздрава РФ от 30.07.2001 г. О мерах предупреждения распространения инфекций передаваемых половым путем. -М.-2001.

41. Потекаев С. Н., Потекаев Н. С., Покровский В. В. и др. Спинная сухотка как проявление раннего сифилиса на фоне иммунодефицитного состояния. И Вестник дерматологии и венерологии. 2000.- №1. - С. 43-45.

42. Птицына Ю. С., Матвеева Е. М., Вязьмина Е. С. и др. Растворимая форма Fas/APO-1 (CD95) антигена в сыворотке крови ВИЧ-инфицированных лиц //Тезисы VII-ого Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство".- 2000.- Москва.- С.57-57.

43. Резайкина А. В., Аковбян В. А., Куршакова Т. С. и др. Федорова JL Д., Аковбян Г. В., Ветрова Т. Н. Реактивность нейтрофилов у больных сифилисом. // Вестник дерматологии и венерологии. 1997. - № 2. - С. 39-41.

44. Родин Ю. А., Родин А. Ю. Персистенция бледных трепонем и иммунитет при сифилисе. // Вестник дерматологии и венерологии. 2000-№6.- С.23-14.

45. Родионов А. Н. Сифилис: руководство для врачей. С-Петербург. -1997.-288 с.

46. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология.- М.: Мир.- 2000.- 581с.

47. Романенко Г. Ф., Вербенко Е. Ф., Петрова И. Л. К вопросу о серорезистентном сифилисе. // Вестник дерматологии и венерологии. 1983. - №6,-С. 25-29.

48. Серегин С. В., Белавин П. Б., Бабкина И. Н. и др. Получение рекомбинантных антигенов Treponema pallidum и их применение в иммуноферментной диагностике сифилиса. // Вестник дерматологии и венерологии. 2000. - №2.- С. 5-8.

49. Скрипкин Ю. К., Резайкина А. В., Бухова В. П. и др. Уровень иммунокомпетентных клеток у социально дезадаптированных больных сифилисом. // Вестник дерматологии и венерологии. 1999.- №3. - С. 3-7.

50. Смирнова В. С., Фрейдлин И. С. Иммунодефицитные состояния. -С.-Петербург. 2000. -566 с.

51. Соколовский Е. В. Серологическая резистентность после лечения сифилиса (причины и факторы развития, профилактика и лечение). Дисс. докт. мед. наук. С.-Петербург. - 1995. -300 с.

52. Соколовский Е. В., Фрейдлин И. Н., Соколов Г. Н., и др. Оценка состояния иммунитета больных сифилисом на различных этапах развития инфекции. // Журнал дерматовенерологии и косметологии. 1996. - №1. - С. 39-55.

53. Таумин М.Р. Иммунный статус больных вторичным рецидивным сифилисом и его изменения в процессе лечения. // Вестник дерматологии и венерологии. 1986. - №5. - С. 74-75.

54. Тимченко Г. Ф. Реакция пассивной гемагглютинации в серодиагностике сифилиса. Автореф. докт. дисс. - Москва. - 1991. - 195 с.

55. Ткачев В. К. ИФА-диагностика сифилиса. Информационно-методическое пособие. -Кольцово. - 1998. - 35 с.

56. Туманова Е. Л., Васечкина Л. И., Друзюк Е. 3., Миронова О. С. Клинико-морфологическая характеристика современного врожденного сифилиса. // Вестник дерматологии и венерологии. 1999. - № 6. - С. 9-10.

57. Тургиев Б.С. Клинико-эпидемиологическая и социально-личностная характеристика больных сифилисом в Северной Осетии. // Вестник дерматологии и венерологии. 1995. - №6. - С. 14-16.

58. Фриго Н. В. Современные критерии дифференциальной диагностики раннего скрытого сифилиса и ложноположительных результатов стандартных серологических реакций на сифилис. Автореф. докт. дисс. -М.-2001.-34 с.

59. Фриго Н. В., Главинская Т. А., Пименов В. К. и др. Рекомбинантные белки и синтетические пептиды в дифференциации истинных и ложноположительных реакций на сифилис. // Российский журнал кожных и венерических болезней. 1999. - № 4. - С. 18-22.

60. Хаитов Р. М., Алексеев Л. П. Физиологическая роль главного комплекса гистосовместимости человека. // Иммунология. №3. - 2001. - С. 4-11.

61. Цераиди Н. Ф. Некоторые механизмы иммунодепрессии при сифилисе. // Вестник дерматологии и венерологии. 1986. - №4. - С. 29-34.

62. Цераиди Н. Ф. Т-клеточные субпопуляции у больных сифилисом. // Вестник дерматологии и венерологии. 1986. - №5.- С. 24-27.

63. Цераиди Н. Ф. Актуальные проблемы иммунитета при сифилисе. // Вестник дерматологии и венерологии. 1987. - №2. - С. 13-17.

64. Шапошников О. К. Венерические болезни. М: Медицина. - 1991.325 с.

65. Чеботарев В. В., Павлик Н. В., Халайчева Е. Е. и др. Бытовое заражение сифилисом детей. // Российский журнал кожных и венерических болезней. -2000. № 6. - С. 48-51.

66. Черкасский Б. Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека. -М,- 1994.-520 с.

67. Юцковский А. Д., Тихомирова Я. А., Стефанович Е. В. и др. К проблеме серологической резистентности при сифилитической инфекции. // Инфекции передаваемые половым путем. 2000. - №1. -С. 23-28.

68. Яцуха М. В. Противоэпидемическая работа и заболеваемость венерическими заболеваниями. // Вестник дерматологии и венерологии. -1990. №3,- С. 33-36.

69. Ярилин А. А., Добротина Н. А. Введение в современную иммунологию. Н. Новгород. - 1997. - 238 с.

70. Acevedo A., Pozo М.А., Arroyo A. G. et al. Distribution of ICAM-3-bearing cells in normal human tissues. Expression of a novel counter-receptor for LFA-1 in epidermal Langerhans cells. // Am. J. Pathol. 1993. - Vol. 143. - P. 774-783.

71. Antoni G., dal Maso G., Berti В. et al. Detection of antigenic determinants in the Treponema pallidum membrane protein TmpA using overlapping synthetic peptides. // J. Immunol. Methods. 1996-Vol. 189. - P. 137-140.

72. Arroll T. W., Centurion-Lara A., Lukehart S. A. et al. T-cells responses to treponema palludum subsp. pallidum antigens during the course of experimental syphilis infection. // Infection and Immunity. 1999. - Vol. 67. - № 9. - P. 47574763.

73. Baker-Zander S., Sell S. A histopathologic and immunologic study of the course of syphilis in the experimentally infected rabbit. Demonstration of long-lasting cellular immunity. // Am. J. Pathol. 1980. - Vol. 101 (2). - P. 387-413.

74. Bresciani A., Pirozzi G., Spera M. et al. Increased level of soluble serum HLA class I antigens in patiens with systemic lupus erythematosus. Correlation with disiase activiti. // Tissue Antigens. 1998. - Vol. 52 (1). - P. 44-50.

75. Treponema pallidum membrane protein 1 (Tromp 1) expressed in Escherichia coli has porin activity and surface antigenic exposure. // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178 (23).-P. 6685-6692.

76. Blanco D. R., Miller J. N., Lovlett V. A. Surface antigens of the syphilis spirochete and their potential as virulence determinants. // Emerging Infectious Desease. 1997. - Vol.3. - № 1. - P. 3458-3462.

77. Bleijs D. A., Geijtenbeek B. H., Figdor C. G. DC-Sign and LFA-1: a battle for ligand. // TRENDS in immunology. 2001. - Vol. 22. - № 8. - P. 457463.

78. Camejo E. N., Rosengren B., Camejo G. et al. Interferon gamma binds to exstrasellular matrix chondroitin-sulfate proteoglycans, thus enhancing its cellular response. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1995. - Vol. 15 (9). - P. 14561465.

79. Casiano I., Fuicci G., Papoff G. et al. Three function soluble forms of the humans apoptosis indusing FAS molecule are prodused by alternative splising. // J. Immunol. 1995. - Vol. 154 (6). - P. 2706-2713.

80. Chamberlain N. R., Brandt M. E., Erwin A. L. et al. Major integral membrane protein immunogens of Treponema pallidum are proteolipids. // Infect. Immun. 1989. - Vol. 57. - P. 287-298.

81. Champion C. Cloning, sequensing, expression of two class B endoflagellar genes of Treponema pallidum subsp. Pallidum encoding the 34,5 -and 31- kilodalton protein. // Infect. Immunol. 1990. - Vol. 58. - №6. - P. 16971709.

82. Cheng J., Zhou T., Liu C. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule. // Science. 1994. - Vol. 263. - P. 1759-1762.

83. Cordell J. L., Pulford K., Turley H. Cellular distribution of the human leukocyte adhesion molecule ICAM-3. // J. Clin. Pathol. 1994. -Vol. 47. - P. 143-147.

84. Cunningham T. M., Walker E. M., Miller J. N. et al. Selective release of the Treponema pallidum outer membrane and assosiated polipeptides with triton XI14. // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170. - P. 5789-5796.

85. Comuzio S., Puppo F., Ruzzeneti R. et al. Simple ELISA method For the evalution of solubleHLA class I antigens in human serum. // Clin. Lab. Anal. -1991.-Vol. 5 (4).-P. 278-283.

86. Demaria S., Schwab R., Gottesman S. R. et al. Soluble beta 2-microglobulin-free class I heavy chains are released from the surface of activated and leukemia cells by a metalloprotease. II J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269 (9). -P. 6689-6694.

87. Dobbe L. M., Stam N. J., Neefjes J. J. Biochemical complexity of serum HLA class I molecules. // Immunogenetics. 1988. - Vol. 27. - P. 203-210.

88. Dunlop L. C., Skinner M. R., Bendall L. J. Characterization of GMP-140 (P-selectin) as a circulating plasma protein. // J. Exp. Med. 1992. - Vol. 175. - P. 1147-1150.

89. Fawcett J., Holness C. L., Needman L. A. Molecular cloning of ICAM-3, a third ligand for LFA-1, conctitutively expressed on resting leucocytes. // Nature. 1992. - Vol. 360. - P. 481-484.

90. Fereira A., Garcia Rodrigez M. C., Omenaca F. et al. Soluble class I histocompatibility antigens (s-HLA) and beta 2-microglobulin at delivery. // Clin. Exp. Immunol. 1991. - Vol. 84 (1). - P. 167-169.

91. Ferreira A., Villar M. L., Alvazer Germeno J. C. et al. Quantification of soluble serum HLA class I antigens in healthy voluntrees and AIDS patients. // Clin. Chim. Acta. 1998. - Vol. 174 (2). - P. 207-211.

92. Fraser C. M., Norris S. J., Weinstock G. M. et al. Complete genome sequense of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. // Science. 1998. - Vol. 281.-P. 375-388.

93. Filaci G., Contini P., Brenci S. et al. Soluble HLA class I and class II molecule levels in serum and cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients. // Human Immunology. 1997. - Vol. 54 (1). - P. 54-62.

94. Fougerolles A. R., Springer T. A. Intercellular adhesion molecular 3, a third adhesion counter-receptor for lymphocyte function-associated molecule 1 on resting lymphocytes. // J. Exp. Med. 1992. - Vol. 175. - P. 185-190.

95. Gastl G., Ebert T., Finstad C. L. et al. Major histocompatibility complex class I and II expression in renal cell carcinoma and modulation by interferon gamma. // J. Urol. 1996. - Vol. 155 (1). - P. 361-367.

96. Gerber A., Krell S., Morenz J. Recombinant Treponema pallidum antigens in syphilis serology. // Imminobiology. 1996. - Vol. 196 (56). - P. 535549.

97. Gelder F. B., McDonald J. C., Landreneau M. D. et al. Identification charactrization, and guantitation of soluble HLA antigens in the circulation and peritoneal dialysate of renal patients. // Ann. Surg. 1991. - Vol. 213 (6). - P. 591-597.

98. Ghio M., Contini P., Mazzei C. et al. Soluble HLA class I, HLA class II, and Fas ligand in blood conponents: a possible key to explain the immunomodulatory effects of allogeneic blood transfusions. // Blood. 1999. -Vol. 93. -№5.-P. 1770-1777.

99. Goldberger A., Middleton K. A., Oliver J. A. Biosynthesis and processing of the cell adhesion molecule PEC AM-1 includes production of a soluble form. // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 17183-17191.

100. Hagihara M., Shimura T., Yamamoto K., et al. Clinical significance of serum soluble HLA class I antigens in systemic lupus erythematosus. // Tokai. J. Exp. Clin. Med. 1993. - Vol. 18. - P. 61-64.

101. He X., Le J. Alternative splicing of HLA class I transcripts induced by IFN-gamma and TNF in fibroblasts: release of soluble HLA class I heavy chain and an associate protein. // Cell. Immunol. 1995. - Vol. 162 (1). - P. 159-168.

102. Hiromatusu Y., Bednarczuk T., Soyejima E. Increased serum soluble Fas in patients with Graves disease. // Thyroid. 1999. - Vol. 9 (4). - P. 341-345.

103. Hsu P. Seguence analisis of the 47 kilodalton major integral membrane immunogen of Treponema pallidum. // Infect. Immun. - 1989. - Vol. 57. - №1. - P. 196-203.

104. Hori Y., Wada H., Mori Y. Plasma sFas and sFas ligand levels in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura and in those with disseminated intravascular coagulation. // Am. J. Hematol. 1999. — Vol. 61. - P. 21-25.

105. Hosaka N., Oyaizu N., Kaplan M. N. Membrane and soluble forms of Fas (CD95) and Fas ligand in peripherial blood mononuclear cell and in plasma from human immunodeficiency virus-infected persons. // J. Infect. Dis. 1998. -Vol. 178.-P. 1030-1039.

106. Hubbard C. Molecular cloning and characterization of a 35,5 -kilodalton lipoproteins of Treponema pallidum. // Infect. Immunol. 1991. - Vol. 59. - P. 1521-1528.

107. Hughes D. P., Crispe I. N. A naturally occuring soluble isoform of murine FAS generated by alternative splising. // J. Exp. Med. 1995. - Vol. 825. -P. 1395-1401.

108. Inostroza J., Ferrada J., Navarrete C. Soluble histocompatibility class I antigens and beta 2-microglobulin in pregnant females and cord blood samples. // Human Immunology. 1997. - Vol. 54 (1). - P. 63-68.

109. Jodo S., Kobayashi P., Nakajima Y. Elevated serum levels of soluble Fas/APO-1 (CD95) in patients with hepatocellular carcinoma. // Clin. Exp. Immunol. 1998.-Vol. 112.-№2.-P. 166-171.

110. Jodo S., Kobayashi S., Kayagaki N. Serum levels of soluble Fas/Apo-1 (CD95) and its molecular structure in patients with Systemic lupus erythematosus (SLE) and other autoimmune disease. // Clin. Exp. Immunol. 1997. - Vol. 107 (l).-P. 89-95.

111. Jones J. D., Bourell K. W., Norgard M. V. Membrane topology if Borelia burgdoferi and Treponema pallidum lipoproteins. // Infect. Immunol. 1995. -Vol. 63. - P. 2424-2434.

112. Knipping E., Debatin K., Striker K. Identification of soluble Apo-1 in supernatants of human Band T-cells lines and increased serum levels in B- and T-cell leukemias. //Blood. 1995. - Vol. 85. - P. 1562-1569.

113. Krangel M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. // J. Exp. Med. 1986. - Vol. 163. - P. 1173.

114. Krangel M. S. Two forms of HLA Class I molecules in human plasma. // Hum. Immunol. 1987. - Vol. 20.-P.155.

115. Kimura M., Tomita Y., Imai T. et al. Significance of serum-soluble CD95 (Fas/APO-1) on progno in renal cell cancer patients. // Br. J. Cancer. 1999. -Vol. 80.-P. 1648-1651.

116. Le J., Hua J. C. Production of soluble HLA-class-I molecules by IFN-gamma-induced colon-adenocarcinoma cells. // Int. J. Cancer. 1995. - Vol. 60 (4).-P. 576-571.

117. Martin S., Rieckmann P., Melchers I. Circulating forms of ICAM-3 (cICAM-3). Elevated levels in autoimmune diseases and lack of association with cICAM-1. // J. Immunol.- 1995.-Vol. 154.-P. 1951-1955.

118. McDonald J. C., Gelder F. B., Aultman D. F. et al. HLA in human serum-quantitation of class I by enzyme immunoassay. // Transplantation. 1992. -Vol. 53 (2).-P. 445-449.

119. Moore C., Ehlayel M., Inostroza J. et al. Elevated levels of soluble HLA class I (sHLA-I) in children with atopic dermatitis. // Ann. Allergy Asthma Immunol. 1997.-Vol. 79 (2).-P. 113-138.

120. Mizutani Y., Yoshida O., Bonavida B. Prognostic significanse of soluble Fas in the serum of patiens with bladder canser. // J. Urol. 1998. - Vol. 160 (2). -P. 571-576.

121. Munker R., Younes A., Cabanillas F. Soluble CD95 in the serum with low and intermediate grade malignant lymphomas: absence of prognostic correlations. // Leuk. Lymphoma. 1997. - Vol. 27 (5). - P. 517-521.

122. Nacanishi K., Kobayashi T., Komatsu Y. et al. Synchronous decline of serum-soluble HLA class I antigens and beta-cell function in insulin-dependent diabetes mellitus. // Clin. Immunol. Immunopathol. 1997. - Vol. 85 (3). - P. 4450.

123. Natali P. J., Bigotti A., Nicotra M. R. et al. Distribution of human Class I (HLA A, B, C) histocompatibility antigens in nornal and maligant tissues of nonlymfoid irigin. // Canser Res. 1984. - Vol. 44. - P. 46-79.

124. Newman W., Beall L. D., Carson C. W. Soluble E-selectin is found in supernatants of activated endothelial cells and is elevated in the serum of patients with septic shock. // J. Immunol. 1993. - Vol. 150. - P. 644-654.

125. Niitsu N., Sasaki K., Umeda M. A high serum soluble Fas/APO-1 level is assosieted with a poor outcome of aggressive non- Hodgkin,s lymphoma. // Leukemia. 1999. - Vol. 13 (9). - P. 1434-1440.

126. Park C. W., Yun S. N., Yang C. W. et al Serum and urine soluble HLA class I antigen consentrations are increased in patiens with hemmorragic fever with renal syndrome. // Korean J. Intern. Med. 1997. - Vol. 12 (1). - P. 52-57.

127. Parker K. C., Di Brino M., Hull L. The beta 2-microglobulin dissociation rate is an accurat measure of the stability of MHC class I heterotrimers and depends on which peptide is bound. // Immunology. 1992 . -Vol. 149 (6).-P. 1896-1904.

128. Parham P., Clayberger C., Zorn S. L. et al. Inhibition of alloreactive cytotoxic T lymphocytes by peptides from the domain of HLA-A2. // Nature. -1987. Vol. 325. - P. 625-640.

129. Papo T., Parizot C., Otrova M. Apoptosis and expression of soluble Fas mRNA in sistemic lupus erythematisus. // Lupus. 1998. - Vol. 7 (7). - P. 455461.

130. Pauletty P., Ferrone S., Amesland F. et al. Summary report from the first international workshop on soluble HLA antigens. // Tissue Antigens. 1993. - Vol. 42(1).-P. 45-54.

131. Pickl W. F., Majdic O., Fae I. et al. The soluble pool of beta 2-microglobulin free HKA class I alfa-chains. Qualitative and quantitative characterization. //Immunology. 1993. - Vol. 151 (2). - P. 2613-2622.

132. Piazzola G., Tortorella C., Fiore G. et al. Immunoresponsiveness in chronic hepatitis C patients: correlation between tissue and serum findings. // Immunopharmacol Immunotoxicol. 1998. - Vol. 20 (3). - P. 337-354.

133. Pino-Otin M. R., Vinas O., Fuente M. A. et al. Existence of a soluble form of CD50 (intercellular adhesion molecule-3) produced upon human lymphocyte activation. // Jornal of Immunology. 1995. - Vol. 154. - №6. - P. 3015-3024.

134. Podwinska J., Lusiak M., Zaba R. The pattern and level if cytokines secreted by Th 1 and Th 2 lymphocytes of syphilitic patients correlate to the progression of the disease. // Immunol. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 28 (1). - P. 1-14

135. Podwinska J., Zaba R., Chomik M. The ability of peripherial blood mononuclear cells of rabbits infected with Treponema pallidum to produce IL-2. // Immunol. Med. Microbiol. 1993. - Vol. 7. - № 3. - P. 257-264.

136. Podwinska J., Szczepanik A., Farbiszewska A. Effect of serum lymphocytotoxic activity on T and B cells in rabbits infected with Treponema pallidum. // Arch. Immunol. Ther. Exp. 1986. - Vol. 34. - № 1. - P. 59-64.

137. Pozo M. A., Pulido R, Munoz C. et al. Campanero M. R, Sanchez-Madrid F. Regulation of ICAM-3 (CD50) membrane expression on human neutrophils through shedding mechanism. // Eur. J. Immunol. 1994. - Vol. 24 (11).-P. 2586-2594.

138. Puppo F., Brenci S., Montinaro E. et al. Inhibition of alloreactive cytotoxic T cell activity by HIV-positive sera: potential role of circulating soluble HLA Class I molecules. // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1994. - Vol. 10. - P. 10611069.

139. Puppo F., Contini P., Ghio M. et al. Soluble human MHC class I molecules induce soluble Fas ligand secretion and trigger apoptosis in activated CD8+ Fas (CD95)+ T lymphocytes. // International Immunology. 1999. - Vol. 12. - №2. - P. 195-203.

140. Pozo M. A., Pulido R., Munoz C. Regulation of ICAM-3 (CD50) membrane expression on human neutrophils thruough a shedding mechanism. // Eur. J. Immunol. 1995. - Vol. 24. - P. 2586-2594.

141. Radolf J. D., Norgard M. V., Shulz W.W. Outer membrane ultrastructure explaines the limited antigenicity of virulent Treponema pallidum. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 2051-2055.

142. Rhynes V. K., McDonald J. C., Gelder F. B. et al. Soluble HLA class I in the serum of transplantant recipients. // Ann. Surg. 1993. - Vol. 217 (5). - P. 485499.

143. Rothelin R., Mainolfi E. A., Czajkowski M. et al. A form of circulating ICAM-1 in human serum. // J. Immunol. 1991. - Vol. 147. - P. 3788-3793.

144. Van Rood J. J., van Leeuwen A., van Santer M. Anti HL-A2 inhibitor in normal human serum. // Nature. 1970. - Vol. 266. - P. 366.

145. Sano H., Asano K., Minatoguchi S. Plasma soluble Fas ligand in chronic glomerulonephritis. //Nephron. 1998. - Vol. 80 (2). - P. 153-161.

146. Sakaguchi K., Koide N., Takenami T. et al. Soluble HLA class I antigens in sera of patients with chronic hepatitis. // Gastroenterology. 1992. -Vol. 27 (2).-P. 206-211.

147. Saririan K., Wali A., Almedia R. P. Increased serum HLA class I molecule levels in elderly human responders to influenza vaccination. // Tissue Antigens. 1993. - Vol. 42 (1). - P. 9-13.

148. Scheleiffebaum B. O., Spertini O., Tedder T. F. Soluble L-selectin is present in human plasma at high levels and retains functional activity. // J. Cell. Biol. 1992. - Vol. 119. -P. 229-238.

149. Schneck J., Lee Maloy W., Coligan J. E. et al. Inhibition of an allospecific T cell hybridoma by soluble class I proteins: estimation of the affinity of a T cell receptor for MHC. // Cell. 1989. - Vol. 56. - P. 47.

150. Schouls L. M. Wrigt D. Molecular and cell biology of sexually transmitted diseases. London. - 1992. - P. 85-129.

151. Schouls M. Characterization of the 35 kilodalton Treponema pallidum subsp. Pallidum recombinant lipoprotein TmpC and antibody response to lipidated and nonlipidated T. pallidum antigens. // Infect. Immunol. - 1991. - Vol. - 59. -№10. - P. 3536-3546.

152. Schoulds L. Characterization of lipid-modified immunogenic proteins of Treponema pallidum expressed in Escherichia coli. // Microb. Patog. 1989. -Vol.7. -№3. - P. 3708-3714.

153. Seth R., Raymond F. D., Makgoba M. W. Circulating ICAM-1 isoforms: diagnostic prospects or inflammatory and immune disoders. // Lancet. 1991. -Vol. 33.-P. 83-84.

154. Shimaoka Y., Hidaka Y., Okumura M. Serum concentrations of soluble Fas in patients with autoimmune thyroid disease. // Thyroid. 1998. - Vol. 8 (1). -P. 43-47.

155. Stamm L. V., Dallas W. S., Ray P. H. Identification, cloning, and purification of protein antigens of Treponema pallidum. // Infectious diseases. -1988.-Vol. 65.-P. 403-407.

156. Tabor D. R., Bagasra O., Jacobs R. F. Treponemal infection specifically enhances node T-cells regulation of macrophage activity. // Infect. Immunol. -1986,- Vol. 54.-№1.- P. 21-27.

157. Tedder T. F., Penta A. C., Levine H. B. et al. Expression of the human leukocyte adhesion molecule, LAM1. Identity with the TQ1 and Leu-8 differentiation antigens. // J. Immunol. 1990. - Vol. 144. - P. 532-540.

158. Tortorella C., Sacco R., Orlando P. et al. SICAM-1, sCD95 and sCD95L levels in chronic liver disease of different etiology. // Immunopharmacol Immunotoxicol. 2000. - Vol. 22. - №1. - P. 19-33.

159. Tomai M. A., Elmquist B. J., Warmka S. M. et al. Macrophage-mediated suppression of con A-induced IL-2 production in spleen cells from syphilitic rabbits.//I. Immunol. 1989. - Vol. 143.-№ 1. - P. 309-314.

160. Vazeux R., Hoffman P. A., Tomita J. K. Cloning and characterisation of a new intercellular adhesion molecule ICAM-R. //Nature . 1992. - Vol. 360. - P. 485-488.

161. Van Vooris W. C., Barrett L. K., Koell D. M. et al. Primari and secondary syphilis lesions contain mRNA forTh 1 cytokines. // J. Infect. Dis. -1996. Vol. 173. - №2. - P. 491-495.

162. Wellicom S. M., Kapahi P., Mason J. C. et al. Detection of a circulating form of vascular cell adhesion molecule: paired levels in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. // Clin. Exp. Immunol. 1993. - Vol. 92. - P. 412418.

163. Walker E. M., Zamphigi G. A., Blanco D. R. et al. Demonstration of rare protein in the outer membrane of Treponema pallidum by freeze-fracture analisis. // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 71.-P. 500-511.

164. Wicher V., Wicher K. Lymphocyte transformation in inbred guinea pigs infected with Treponema pallidum nichols. // Int. Arch. Allergy. Appl. Immunol. -1985. Vol. 76 (3). - P. 266-269.

165. Wicher V., Zhano J., Dilwith R. et al. Immune abnormatilis in guinea pigs with asymptomatic conginetal syphilis. // Pediatr. Res. 1997. - Vol. 42. - № 6. - P. 794-798.

166. Zavazava N., Kronke M. Soluble HLA class I molecules induce apoptosis in alloreactive cytotoxic T lymphocytes. // Nature Med. 1996. - Vol. 2. -P. 1005.

167. Zipp F., Otzelberg K., Dichgans J. et al. Serum CD95 of relapsing remmiting multiple sclerosis patients protects from CD95-mediated apoptosis. // J. Neuroimmunol. 1998. - Vol. 86 (2). - P. 151-154.