Организация регуляторных систем слитого домена α/β-глобиновых генов Danio rerio тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Ковина Анастасия Павловна

• Ковина Анастасия Павловна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Ковина Анастасия Павловна

2.1 Актуальность работы

2.2 Степень разработанности темы

2.3 Цели и задачи

2.4 Новизна и научная значимость

2.5 Личный вклад автора

2.6 Методология и методы исследования

2.8 Степень достоверности и апробация результатов

3) ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1 Определение понятия «энхансер»

3.2 Эпигенетические маркеры энхансеров

3.3 Процесс активации транскрипции с помощью энхансеров

3.4 Механизмы действия энхансеров

3.5 Эволюция регуляторных систем

3.6 Механизм «выпетливания» и его основные участники

3.7 ТАДы

3.8 Глобиновые гены

3.9 Эволюция глобиновых генов

3.10 Регуляция транскрипции домена а-глобиновых генов

3.11 МИБ

3.12 Переключение экспрессии глобиновых генов

3.13 Структурно-функциональная организация объединенного кластера а- и Р-глобиновых генов на 3 хромосоме Danio гегю

3.14 Заключение

4) МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1 Биологические материалы

4.2 Методы

4.2.1 Создание генетических конструкций и оценка люциферазной активности

4.2.1.1 Выделение высокомолекулярной ДНК из культуры клеток

4.2.1.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

4.2.1.3 Рестрикция ДНК

4.2.1.4 Выделение фрагментов ДНК из геля

4.2.1.5 Лигирование

4.2.1.6 Приготовление компетентных клеток Е.еоН

4.2.1.7 Трансформация компетентных клеток

4.2.1.8 Скрининг колоний методом ПЦР-амплификации

4.2.1.9 Выделение плазмидной ДНК

4.2.1.10 Культивирование клеток

4.2.1.11 Трансфекция

4.2.1.12 Измерение люциферазной активности

4.2.2 Манипуляции с РНК

4.2.2.1 Выделение тотальной РНК

4.2.2.2 Обратная транскрипция

4.2.3 ЗС-анализ

4.2.3.1 Фиксация клеток и изоляция ядер

4.2.3.2 Рестрикция и лигирование ДНК

4.2.3.3 Очистка продуктов лигирования

4.2.3.4 Приготовление эквимолярной смеси продуктов лигирования

4.2.4 ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами

4.2.5 Приготовление 5С-библиотек

4.2.5.1 Отжиг 5С-праймеров

4.2.5.2 Лигирование 5С-праймеров

4.2.5.3 Обработка данных секвенирования и построение 5С-карт

4.2.6 Иммунопреципитация нативного хроматина (native chromatin immunoprecipitation - N-ChlP)

4.2.7 Иммунопреципитация фиксированного хроматина (X-ChIP)

4.2.8 Выделение бакмидной ДНК

5) РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

5.1 Анализ энхансерной активности MRE по отношению к промоторам глобиновых генов главного локуса Danio rerio

5.2 Анализ пространственных взаимодействий MRE в эритроидных клетках на различных стадиях индивидуального развития Danio rerio

5.2.1 Анализ уровня транскрипции глобиновых генов главного локуса на разных стадиях индивидуального развития

5.2.2 Анализ пространственных взаимодействий MRE с регуляторными элементами главного локуса глобиновых генов

5.3 Детекция участков связывания CTCF в главном локусе

5.4 Анализ энхансер-блокирующего действия CBS4

5.5 Анализ пространственных взаимодействий между CTCF-связывающими сайтами

5.6 Анализ топологии главного локуса глобиновых генов Danio rerio

5.7 Анализ эпигенетических модификаций гистонов главного локуса

6) ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

7) ВЫВОДЫ

3

1) СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

dH2O дистиллированная вода

DHS участок гиперчувствительности к ДНКазе I (DNaseI hypersensitive site)

DMEM Модифицированная Дульбекко среда Игла (Dulbecco modified Eagle medium)

dNTP дезоксинуклеозидтрифосфат (desoxynucleosidtriphosphate)

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота (ethylenediaminetetraacetic acid)

EtBr бромистый этидий (ethidium bromide)

GTFs общие факторы транскрипции (general transcription factors)

HS то же, что и DHS

Kb то же, что и т.п.н. (kilobase pairs)

LCR область контроля локуса (locus control region)

MCS консервативные некодирующие последовательности (multispecies conserved sequences)

MRE главный регуляторный элемент (major regulatory element)

PBS фосфатно-солевой буфер (phosphate-buffered saline)

SDS додецилсульфат натрия (sodium dodecylsulfate)

SV40 обезьяний вирус 40 (simian virus 40)

ДМСО диметилсульфоксид

п.о. пары оснований (ДНК)

п.н. пары нуклеотидов (ДНК), то же, что и п.о.

ПЦР полимеразная цепная реакция

тыс. п.о. тысячи пар оснований (ДНК)

ТАЕ трис-ацетатный-ЭДТА (tris-acetate-EDTA)

3С фиксация конформации хромосомы (chromosome conformation capture)

BAC искусственная бактериальная хромосома (bacterial artificial chromosome)

Ct пороговый цикл (threshold cycle)

RT-PCR ПЦР в реальном времени (real-time polymerase chain reaction)

2) ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Организация регуляторных систем слитого домена α/β-глобиновых генов Danio rerio»

2.1 Актуальность работы

Гены, кодирующие а- и в- субъединицы гемоглобина, являются традиционной моделью для изучения регуляции транскрипции. У теплокровных животных а- и в-глобиновые гены расположены на разных хромосомах, организованы в хроматиновые домены разного типа, и их экспрессия регулируется с привлечением разных механизмов. Экспрессия а-глобиновых генов теплокровных животных находится под контролем главного регуляторного элемента (major regulatory element, MRE). Как в геноме человека, так и в геномах остальных позвоночных, главный регуляторный элемент домена располагается на значительном расстоянии от глобиновых генов в интроне гена домашнего хозяйства NPRL3. MRE является сильным эритроид-специфичным энхансером. Нуклеотидные последовательности MRE разных организмов не гомологичны друг другу, однако, взаимное расположение сайтов связывания транскрипционных факторов коровой части MRE имеет много общего. В геномах холоднокровных животных, напротив, а- и в-глобиновые гены образуют слитые кластеры. Такое устройство а- и в-глобиновых генов, вероятнее всего, было характерно и для последнего общего предка всех позвоночных, так как именно такая организация глобиновых генов позволяет обеспечить их эквимолярную экспрессию. Изучение организации и регуляции кластеров глобиновых генов холоднокровных животных позволит проследить возможные причины последующей сегрегации а- и в-глобиновых генов, и, таким образом, лучше понять особенности работы регуляторных систем доменов глобиновых генов теплокровных животных и человека. Это определяет актуальность настоящей работы.

Хотя данная работа имеет четко выраженный фундаментальный характер, полученные результаты могут иметь и определенное практическое приложение. Исследование пространственной организации главного локуса глобиновых генов тропической рыбы Danio rerio и идентификация регуляторных элементов генома, задействованных в переключении экспрессии глобиновых генов, позволили нам впервые построить модель эволюции трехмерной организации глобиновых генов у позвоночных животных. Предложенная модель показывает, что глобулярная структура сохранилась в ходе эволюции, так как она позволяет регулировать несколько промоторов в рамках одного активаторного хроматинового блока; в то же время линейная структура была утрачена.

2.2 Степень разработанности темы

Пространственная организация кластеров глобиновых генов теплокровных животных, в том числе курицы, мыши и человека, была подробно изучена с использованием разных методических подходов. Было показано, что транскрибирующиеся глобиновые гены привлекаются в активаторный хроматиновый блок (de Laat & Grosveld, 2003), и это позволяет энхансерам стимулировать активность промоторов сразу нескольких генов на тех стадиях индивидуального развития, для которых характерна экспрессия привлекаемых генов. Хроматиновые блоки представляют собой ДНК-белковые комплексы, образованные при участии как тканеспецифичных, так и конститутивных факторов транскрипции. Они являются основой для привлечения инициаторного комплекса и успешной активации транскрипции (Core et al, 2012).

Что касается холоднокровных животных, в геномах которых глобиновые гены а- и Р-типов не сегрегированы, то пространственная конфигурация слитых доменов глобиновых генов в эритроидных клетках этих животных на разных стадиях онтогенеза не изучалась. Регуляторные элементы главного локуса глобиновых генов Danio rerio были охарактеризованы лишь частично.

2.3 Цели и задачи

Целью нашей работы было изучение организации главного локуса глобиновых генов Danio rerio и систем регуляции транскрипции глобиновых генов, в том числе на этапе переключения экспрессии с эмбрионально-личиночного на взрослый тип. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Уточнить позицию консервативного эритроид-специфичного энхансера в интроне гена NPRL3 Danio rerio и выяснить, участвует ли этот энхансер в регуляции транскрипции взрослых и эмбрионально-личиночных глобиновых генов, в том числе в ходе переключения экспрессии глобиновых генов с эмбрионально-личиночного на взрослый тип;

2) Охарактеризовать пространственную организацию главного локуса глобиновых генов Danio rerio на разных стадиях индивидуального развития;

3) Идентифицировать не охарактеризованные ранее геномные элементы, которые участвуют в регуляции экспрессии глобиновых генов главного локуса Danio rerio;

4) Исследовать распределение активируюших и репрессирующих модифицированных форм гистонов в границах главного локуса глобиновых генов в эритроидных клетках Вато тетго на разных стадиях индивидуального развития.

2.4 Новизна и научная значимость

В диссертационной работе впервые продемонстрировано, что суб-локусы главного локуса глобиновых генов на 3 хромосоме Вато тетю, по-разному организованы в пространстве: взрослый суб-локус образует глобулу, в то время как эмбриональный суб-локус остается линейным. Показано, что суб-локусы главного локуса глобиновых генов Вато тетго разделены CTCF-связывающим геномным элементом, который обладает энхансер-блокирующей активностью. Продемонстрировано, что содержащий глобиновые гены взрослого типа суб-локус главного локуса глобиновых генов Вато тетго активируется главным регуляторным элементом домена, расположенным в составе гена ЫРКЬЗ, в то время как экспрессия глобиновых генов эмбрионально-личиночного типа не контролируется этим регуляторным элементом. На основании полученных данных сформулирована модель эволюции пространственной организации кластеров глобиновых генов у различных позвоночных животных. В совокупности, полученные результаты вносят важный вклад в раскрытие механизмов, контролирующих переключение экспрессии глобиновых генов по ходу индивидуального развития.

2.5 Личный вклад автора

Диссертационная работа основана на собственных данных, полученных автором в период с 2014 по 2018 гг. В ходе работы автором проведены эксперименты, в результате которых были выявлены регуляторные геномные элементы главного локуса глобиновых генов Вато тетго, охарактеризованы пространственная организация локуса и профили ацетилирования гистонов в границах локуса на разных стадиях развития, а также были сделаны выводы о возможном механизме стадиеспецифичной репрессии.

2.6 Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной и клеточной биологии, в том числе методов молекулярного клонирования, анализа уровня транскрипции репортерного гена, трансфецированного в культивируемые клетки в составе различных генетических конструкций, фиксации конформации хромосом и его производных, иммунопреципитации хроматина, ПЦР в реальном времени и др.

2.7 Положения, выносимые на защиту

1) В пятом интроне гена NPRL3 Danio rerio присутствует энхансер, который участвует в регуляции экспрессии глобиновых генов главного локуса Danio rerio взрослого, но не эмбрионально-личиночного типа.

2) Суб-локусы главного локуса глобиновых генов Danio rerio, содержащие эмбрионально-личиночные глобиновые гены и глобиновые гены взрослого типа, различаются по способу упаковки в хроматине и пространственной конфигурации.

3) На границе эмбрионально-личиночного и взрослого сублокусов главного локуса глобиновых генов Danio rerio расположен CTCF-связывающий энхансер-блокирующий элемент, который участвует в установлении функционально-значимой конфигурации домена.

4) Стадиеспецифичная репрессия эмбрионально-личиночных глобиновых генов и глобиновых генов взрослого типа корелирует с триметилированием гистона H3 по 27ому лизину в соответствующих сегментах генома, что косвенно свидетельствует о привлечении к этим сегментам генома репрессорных комплексов PRC1.

2.8 Степень достоверности и апробация результатов

Соискатель имеет 7 опубликованных работ, в том числе по теме диссертации 4 работы, из них 4 статьи, опубликованных, в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных для защиты в диссертационном совете МГУ по специальности 03.01.03 - молекулярная биология.

ПУБЛИКАЦИИ:

1. Kovina A., Petrova N., Gushchanskaya E., Dolgushin K., Gerasimov E., Galitsyna A., Penin A., Flyamer I., Ioudinkova E., Gavrilov A., Vassetzky Y., Ulianov S., Iarovaia O., Razin S. Evolution of the Genome 3D Organization: Comparison of Fused and Segregated Globin Gene Clusters. // Molecular Biology and Evolution. 2017. V.34, №6, p.1492-1504

2. Ковина А., Петрова Н., Разин С., Яровая О. Главный регуляторный элемент (MRE) домена a/ß-глобиновых генов Danio rerio проявляет энхансерную активность по отношению к промоторам глобиновых генов эмбрионально-личиночного и взрослого субдоменов. // Молекулярная биология (Москва). 2016. Т.50, №6, с.1020-1029

3. Яровая О., Юдинкова Е., Петрова Н., Долгушин К., Ковина А., Нефедочкина А.,

Васецкий Е., Разин С. Эволюция а- и ß- глобиновых генов и их регуляторных систем в

8

свете гипотезы доменной организации генома. // Биохимия (Москва). 2014. Т.79, №11, с. 1405-1416

4. Яровая О., Ковина А., Петрова Н., Юдинкова Е., Васецкий Е., Разин С. Генетические и эпигенетические механизмы переключения экспрессии бета-глобиновых генов. // Биохимия (Москва). 2018. Т.83, №4, с.381-392.

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИЙ:

1. Ковина А., Петрова Н. Функциональный анализ главного регуляторного элемента домена а/в-глобиновых генов Danio rerio. Научная конференция «Ломоносов», Москва, 2014.

2. Ковина А., Петрова Н., Разин С., Яровая О. Идентификация регуляторных геномных элементов а/в-глобинового домена Danio rerio и анализ их функциональной активности. V Съезд Российского биохимического сообщества, Дагомыс, Сочи, 2016.

3. Kovina A., Petrova N., Guschanskaya E., Galitsina A., Flyamer I., Gerasimov E., Vasetzky E., Ulianov S., Iarovaia O., Razin S. Organization and evolution of vertebrate alpha-globine gene domains. 25th Wilhelm Bernhard Workshop on the Cell Nucleus, Nizhny Novgorod, 2017.

4. Kovina A., Petrova N., Gerasimov E., Galitsina A., Ulianov S., Iarovaia O., Razin S. Adult and larval subloci of the zebrafish major alpha/beta-globin gene cluster possess different epigenetic state and spatial chromatin structure. 42nd Febs Congress, Jerusalim, 2017.

3) ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Организмы позвоночных животных состоят из клеток различных типов, для каждого из которых характерна определенная морфология и специфические функции. При этом каждая клетка многоклеточного организма содержит одинаковый набор генов. Клеточное разнообразие определяется различными профилями экспрессии тканеспецифичных генов. Известно, что уровень сложности организма не коррелирует с количеством генов. Например, геномы как млекопитающих, так и круглых червей содержат несколько десятков тысяч генов (Hodgkin, 2001). Однако по ходу эволюции прослеживается тенденция к усложнению регуляторных систем, которые контролируют экспрессию генов. Так, отличительной особенностью геномов позвоночных является наличие большого количества энхансеров, в том числе располагающихся на значительных расстояниях от подконтрольных им генов (Montavon & Duboule, 2012). Если у дрозофилы чаще всего на одна ген приходится два энхансера (Arnold et al., 2013), то у человека по разным оценкам около 3-6 и более энхансеров (Encode Project Consortium, 2012). Чтобы правильно оценить регуляторный потенциал такой сложной системы следует учесть также то обстоятельство, что несколько энхансеров могут одновременно влиять на уровень экспрессии гена, причем разные их комбинации могут стимулировать работу гена по-разному. Именно сложность регуляторных систем, контролирующих экспрессию генов, является одним из основных источников клеточного разнообразия.

3.1 Определение понятия «энхансер»

Энхансеры - геномные элементы, которые активируют транскрипцию генов, но при этом могут располагаться на некотором расстоянии от старта транскрипции. Первый энхансер был обнаружен в 1981 году в геноме вируса SV40 (Banerji et al, 1981). Этот цис-регуляторный элемент состоит из повторов длиной 72 нуклеотида, расположенных на расстоянии 200 пар оснований (п.о.) к 5'-концу от белок-кодирующей последовательности Т-антигена. Данный энхансер необходим для репликации генома вируса, а также для транскрипции поздних вирусных генов в инфицированных клетках. Было показано, что энхансер вируса SV40 может стимулировать транскрипцию ß-глобинового репортерного гена при трансфекции в культивируемые клетки почек обезьяны. Дальнейшие исследования привели к обнаружению транскрипционных факторов, которые связываются с энхансером SV40, таких как AP1 и NF-kB (Lee et al, 1987; Phares & Herr, 1991). Первые энхансеры животных клеток были обнаружены в B-лимфоцитах млекопитающих: они

контролируют экспрессию гена тяжелой цепи иммуноглобулинов (Banerji et al, 1983;

10

Gillies et al, 1983; Mercola et al, 1983). Позднее были обнаружены транскрипционные факторы, которые связываются с этими энхансерами (Baeuerle & Baltimore, 1988; Murre et al., 1989). В дальнейшем энхансеры были обнаружены в геномах многих других организмов (Banerji et al., 1983; Gillies et al., 1983), и стало ясно, что обычно они представляют собой участки генома длиной несколько сотен п.о., состоящие из кластеров сайтов связывания транскрипционных факторов (Spitz & Furlong, 2012).

Сайты связывания транскрипционных факторов играют определяющую роль в организации энхансера: если изменить расстояния между ними или их расположение относительно друг друга, то способность энхансера активировать транскрипцию может сильно снижаться. Это происходит потому, что любое изменение расстояния между сайтами связывания транскрипционных факторов изменяет их положение в пространстве. Исключение составляют вставки 10 п.о., которые представляют собой полный оборот спирали ДНК: в таком случае сохраняется положение сайта связывания в пространстве, а значит и ориентация комплексов транскрипционных факторов, связывающихся с этими сайтами (Agalioti et al., 2000; Merika & Thanos, 2001; Thanos & Maniatis, 1995).

Поскольку энхансеры представляют собой участки связывания транскрипционных факторов, нуклеосомы на них чаще всего отсутствуют или располагаются редко, вследствие чего эти последовательности могут быть детектированы как сайты гиперчувствительности к ДНКазе I (Wu et al, 1979; Xi et al., 2007). Дестабилизация нуклеосом на энхансерах, часто обеспечивается включением в нуклеосомное ядро вариантных форм гистонов, таких как H3.3 и H2A.Z (Barski et al., 2007; Jin et al., 2009; Wang et al., 2008), которые формируют менее стабильные контакты с ДНК (Jin & Felsenfeld, 2007).

Чаще всего энхансеры располагаются в консервативных некодирующих последовательностях (Bulger & Groudine, 2011; Visel et al., 2008). Это связано с тем, что некодирующие последовательности, которые не задействованы в регуляции, будут накапливать мутации, ведь они не влияют на ход эволюции, в отличие от важных регуляторных элементов, которые будут консервативны у многих организмов (Bulger & Groudine, 2011). Так, экспрессия ß-глобиновых генов в эритроидных клетках возможна только при наличии области контроля локуса, состоящей из нескольких участков, для каждого из которых характерна значительная консервативность последовательности среди всех организмов, геном которых секвенирован на сегодняшний день (Bender et al., 2000; Moon & Ley, 1990; Slightom et al., 1997). Были проведены исследования, которые показали, что на основании эволюционной консервативности регуляторных

последовательностей ДНК можно детектировать новые геномные элементы, обладающие энхансерной активностью (Hughes et al., 2005; Visel et al., 2009).

3.2 Эпигенетические маркеры энхансеров

Активность различных генов и геномных элементов часто регулируется ковалентными модификациями гистонов и ДНК (Jenuwein, 2001; Spector, 2003; Strahl & Allis, 2000). Исследование чувствительности хроматина к ДНКазе I позволило разделить хроматин на транскрипционно-активный и транскрипционно-неактивный и выявить характерные особенности каждого из них (Weintraub & Groudine, 1976). Транскрипционно-активный хроматин обычно характеризуется высоким уровнем ацетилирования гистонов в составе нуклеосом, а также большим количеством гистонацетилтрансфераз, частичным разворачиванием нуклеосомной частицы и присутствие белков группы HMG (Madisen et al., 1998; Razin et al., 2007; Walters et al., 1999). Транскрипционно-неактивный хроматин, напротив, сильно обеднён ацетилированными формами гистонов, в то же время для него характерен повышенный уровень метилирования гистона Н3 по лизину в позициях 9 и 27, присутствие белка НР1, участвующего в конденсации хроматиновой нити, и белков, участвующих в репрессии генов (группа Polycomb и целый ряд других факторов) (Beisel & Paro, 2011; Spencer & Davie, 1999).

Существуют специфические эпигенетические маркеры, характерные для

энхансеров. Полногеномный анализ позволил выявить, что таким эпигенетическим

маркером, например, является монометилирование гистона H3 по лизину 4 (H3K4me1)

при отсутствии триметилирования по этому же сайту (H3K4me3) (Heintzman et al., 2007;

Koch et al., 2007). Обратная ситуация - высокий уровень H3K4me3 и низкий уровень

H3K4me1 обычно маркирует промоторы потенциально активных генов. Однако стоит

отметить, что в некоторых других работах такое отличие не было настолько очевидным

(Barski et al., 2007; Wang et al., 2008). Причина несоответствия непонятна, хотя во всех

упомянутых работах использовались различные источники хроматина и протоколы его

выделения. Поиск энхансеров в геноме становится более точным, когда наряду с

метилированием гистона H3 по лизину 4, проводится также анализ на другие маркеры

энхансерной активности, специфичной для конкретного клеточного типа. Чаще всего,

таким маркером является гистонацетилтрансфераза p300 (Blow et al., 2010; Ghisletti et al.,

2010; Visel et al., 2009). Ацетилирование гистона H3 по лизину 27 в комбинации с

H3K4me1 обычно указывает на активные в данном клеточном типе энхансеры, в то время

как H3K4me1 без ацетилирования H3K27 обычно маркирует неактивные энхансеры

12

(Creyghton et al., 2010; Rada-Iglesias et al., 2011). Примечательно, что именно p300 может ацетилировать H3K27. Было проведено исследование, в котором многие неактивные энхансеры в эмбриональных стволовых клетках были маркированы H3K27me3. При дифференцировке этих клеток в нейроны эпигенетические метки нейрон-специфичных энхансеров менялись с H3K27me3 на H3K27Ac (Rada-Iglesias et al., 2011). Все имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют сделать вывод, что чаще всего для энхансерных последовательностей характерно монометилирование по H3K4, в то время как дополнительные модификации помогают отличать активные энхансеры от потенциальных (молчащих).

3.3 Процесс активации транскрипции с помощью энхансеров

На первом этапе процесса активации транскрипции с энхансером связываются так

называемые «пионерские» транскрипционные факторы (Zaret & Carroll, 2011), которые

контролируют смещение нуклеосом и делают хроматин более доступным, облегчая

связывание специфических транскрипционных факторов (Calo & Wysocka, 2013). Обычно

связывание «пионерских» факторов происходит параллельно с деметилированием ДНК

(Xu et al., 2007) и появлением активаторных модификаций гистонов, например

ацетилирования (Ghisletti et al., 2010; Heinz et al., 2010). Однако, связывание только

«пионерских» факторов недостаточно для начала транскрипции (Ghisletti et al., 2010;

Hoogenkamp et al., 2009; Xu et al., 2009). После этого целый ряд специфичных

транскрипционных факторов, которые активны только в определенный период времени в

определенном клеточном типе, связывается с последовательностью энхансера. Несколько

различных транскрипционных факторов могут конкурировать за связывание с одними и

теми же участками (Erokhin et al, 2015). Связывание этих транскрипционных факторов

вызывает привлечение коактиваторов, не обладающих ДНК-связывающей активностью,

что в конечном итоге приводит к формированию энхансосомы (активного энхансерного

комплекса). Коактиваторы могут быть посредниками при формировании контактов между

энхансерами и промоторами или функционировать как комплексы ремоделирования

хроматина (Erokhin et al., 2015). Чаще всего на энхансерах происходит сборка большого

коактиваторного комплекса медиатор, который состоит из ряда субъединиц (Yin & Wang,

2014). Составляющие медиатор белки очень консервативны от дрожжей до человека.

Нокдаун медиатора обычно сильно понижает транскрипцию генов, которые активируются

энхансерами (Kagey et al., 2010; Lai et al., 2013; Sung et al., 2005; Whyte et al., 2013).

Медиатор взаимодействует с транскрипционными факторами, включая общие факторы

транскрипции, которые связываются с промоторами, а также с РНК-полимеразой II и

13

факторами элонгации (Ansari & Morse, 2013; Malik & Roeder, 2010). Медиатор способствует переносу активирующего сигнала от энхансера к промотору, стимулирует сборку преинициаторного комплекса, регулирует элонгацию транскрипции, а также стимулирует РНК-полимеразу II при прохождениях пауз (Poss et al, 2013; Szutorisz et al, 2005). Таким образом, связывание транскрипционных факторов с энхансером ведет к активации транскрипции путем привлечения коактиваторов, которые облегчают работу РНК-полимеразы II. Энхансеры обладают высокой специфичностью, и активность каждого из них ограничена определенным временем, местом и позицией в рамках генома, так как определенный набор ДНК-связывающих транскрипционных факторов контролирует специфичность их действия (Butler & Kadonaga, 2001; van Arensbergen et al, 2014; Zabidi et al., 2015).

РНК-полимераза II связывается со многими энхансерами (Heintzman et al., 2007; Kim et al., 2010; Koch et al, 2008). На сегодняшний день до конца неясно, для чего это необходимо. Можно предположить, что это приводит к повышению вероятности колоколизации энхансеров и промоторов в транскрипционных фабриках (Bulger & Groudine, 2011). Более того, было показано, что энхансеры могут транскрибироваться с образованием коротких, двунаправленных и неполиаденилированных РНК (Kim et al, 2007). В нейронах мыши было обнаружено 12000 участков, связывающих один из белков-коактиваторов CBP (cap-binding protein), а также обогащенных H3K4me1 и расположенных на некотором расстоянии от сайтов начала транскрипции (Kim et al., 2010). Среди этих участков 25% связываются с РНК-полимеразой II, и 16,7% транскрибируются с образованием молекул РНК длиной около 2 тыс. п.о. Энхансерные РНК также были выявлены в других экспериментах путем поиска участков связывания РНК-полимеразы II (de Santa et al., 2010; Koch et al., 2011), либо активаторов транскрипции - рецепторов эстрогенов (Hah et al., 2011; Hah et al,2013), p53 (Melo et al., 2013) и MYOD1 (Mousavi et al., 2013). В некоторых работах была показана регуляторная роль молекул энхансерной РНК. Например, такая транскрипция в некоторых случаях коррелирует с экспрессией рядом расположенных генов (de Santa et al., 2010; Kim et al., 2010; Onoguchi et al, 2012; Ponjavic et al, 2009) и деградация энхансерной РНК приводила к снижению их экспрессии (Lam et al., 2013; Li et al., 2013; Melo et al., 2013; Mousavi et al., 2013; Onoguchi et al., 2012). В некоторых случаях активация генов коррелирует с продукцией энхансерной РНК (Li et al., 2013; Wang et al., 2011). Роль энхансерной РНК в промотор-энхансерных взаимодействиях недостаточно изучена на сегодняшний день, но для энхансеров, которые могут взаимодействовать с промоторами, характерен высокий уровень образования энхансерной РНК (Li et al., 2013; Lin et al., 2012; Sanyal et al, 2012).

Каким образом в эволюции возникли энхансеры? Существует теория, согласно которой они возникли путем смены функции некоторых ретротранспозонов, которые сформировали кластеры белок-связывающих мотивов (Santangelo et al., 2007; Sasaki et al.,

2008) или сформировались из промоторов архаичных генов, кодирующие последовательности которых были утрачены (Williamson et al, 2011).

Какими могут быть эволюционные последствия мутаций или делеций энхансеров? Существует две разных точки зрения о том, что именно влияет на эволюцию экспрессии генов у животных. Одни исследователи считают, что главные изменения происходят в белок-кодирующих последовательностях, тогда как другие утверждают, что главный источник - эволюция регуляторных элементов (Levine, 2010; Rebeiz et al, 2009; Visel et al.,

2009). В целом ясно, что действуют оба этих механизма. При этом изменения кодирующих последовательностей могут напрямую влиять на функцию белка. В то же время изменения в энхансерных последовательностях могут приводить к тонким аккуратным изменениям уровней экспрессии генов - это именно то, что необходимо для эволюции количественных признаков и регуляторного ответа на изменения окружающей среды, например, при экологических стрессах. Кроме того, фенотипические эффекты мутаций в энхансерах могут распространяться только на конкретные ткани или стадии развития, что в свою очередь позволяет этим геномным элементам активировать подконтрольные им промоторы для выполнения ранее не характерных для них функций (Rebeiz et al., 2009). Таким образом, именно мутации энхансеров - наиболее удобный источник материала для дивергентной эволюции (Levine, 2010; Noonan & McCallion,

2010).

3.4 Механизмы действия энхансеров

Существует четыре, не всегда взаимоисключающих модели, которые описывают механизм передачи активационного сигнала от энхансера к промотору (Bulger & Groudine, 1999) (рисунок 1).

Модель «трэкинга» («tracking») предполагает, что факторы, активирующие транскрипцию, связываются с энхансером и мигрируют вдоль цепи ДНК к промотору (рисунок 1). В результате на последнем формируется инициаторный транскрипционный комплекс. «Трэкинг» обычно происходит по хроматиновой нити, которая обогащена ацетилированными гистонами. Например, в некоторых экспериментах после того, как клетка получает активационный сигнал, на участке ДНК между регуляторным элементом и промотором обнаруживаются белки, взаимодействующие с энхансером. Например, в

индуцируемом локусе HNF-4a человека такие энхансерные белки как CBP и PCAF детектируются на участке между энхансером и промотором еще до старта транскрипции (Hatzis & Talianidis, 2002). В другом случае в гормон-индуцируемом локусе 11beta-HSD2 (этот ген кодирует 11-бета-гидроксистероид дегидрогеназу, тип 2) после добавления к клеткам стероидов происходит привлечение к энхансеру активатора STAT5A и ядерного стероидного рецептора, что приводит к синтезу длинного некодирующего транскрипта, аналогичного полнодоменным транскриптам в локусах глобиновых генов (Subtil-Rodriguez et al., 2008). Однако, модель «трэкинга» может объяснять только действие энхансера, находящегося на достаточно близком расстоянии от подконтрольного элемента. Другим доказательством модели «трэкинга» является наличие полнодоменной транскрипции в некоторых доменах. Согласно гипотезе Траверса (Travers, 1999) низкоуровневая полнодоменная транскрипция необходима для активации всего локуса, так как элонгирующий комплекс РНК-полимеразы II выполняет роль «транспортного средства», которое обеспечивает перемещение гистонацетилтрансфераз и факторов ремоделирования хроматина, которые взаимодействуют с С-концевым доменом полимеразы (Bell & Felsenfeld, 1999a; Geyer, 1997). Таким образом, эти белковые комплексы поддерживают открытую конформацию хроматина на протяжении всего домена. Эта гипотеза подтверждается в нескольких экспериментальных работах. Например, в незрелых эритробластах кур до начала активной транскрипции глобиновых генов была детектирована транскрипция участка генома, который включает в себя домен а-глобиновых генов и некоторые регуляторные элементы с 5'-конца. В неэритроидных клетках такой полнодоменный транскрипт не был обнаружен (Borunova et al, 2005).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ковина Анастасия Павловна, 2018 год

4.1 Биологические материалы

1. Плазмиды: pGL3-Basic, pGL3-Control, pRL-CMV (Promega)

2. Штамм E. coli DH5 а

3. Культивируемые клеточные линии: HD3 (клетки эритробластоза кур).

4. Рестриктазы: SalI, HpaI, HindIII, Ple19I, MfeI, PsiI, SphI (New England Biolabs), BamHI, XhoI, (Promega).

5. Праймеры для создания генетических конструктов: см.Таблица 1.

Таблица 1. Олигонуклеотиды для ПЦР-амплификации.

Фрагмент Пары олигонуклеотидов Длина фрагмента, п.о.

Промотор а2 5' taataagcttcaagcgaatgctgagcaa 3' 5' attaaagcttccacgtcgtggtatcacaa 3' 1680

Промоторы а1 5' taatctcgaggatgtccttaggtgcttgc 3' 5' taatctcgagtttctcaagtgaggtttcttcag 3' 919/957

Промотор bel 5' tatactcgagttgttgctgtgaatgttttg 3' 5' tatactcgagaagctgaagagtgctgtgaaga 3' 2008

Промотор е1 5' tatactcgaggatgactttacagcaaacttct 3' 5' tatactcgagaagctgaagagtgctgtgaaga 3' 1638

MRE 5' taatggatcctatatgtctctgcagcaaattcaa 3' 5' taatggatcctttgagtcgatgcgttgt 3' 1854

Плазмидные праймеры для скрининга колоний pgl3_2 5' gcaataaacaagttaacaacaacaat 3' pgl3_2 геу: 5' tgtcctacgagttgcatgataaa 3' Длина вставки + 200

Инсулятор 5' taatggatccgggtgtttgtgtgtagaatgaa 3' 5' taatggatccataagtaatatttaagaataaagagctagac 3' 277

Б2 5' taatacgcgtaaggttgaagaaaagaagcagg 3' 5' taatacgcgtctatgattctgtcattctaaatctctct 3' 242

6. Праймеры для анализа кДНК: см. Таблица 2. Таблица 2. Олигонуклеотиды для анализа кДНК методом ПЦР в реальном времени

Фрагмент Пары олигонуклеотидов Длина фрагмента, п.о.

Ра2 5' ^адМ^с^аа^е^; 3' 5' е1ес1еейе1йа1ссс1е 3' 5' (fam)ccaaaa(t-bhq1)acctctgagtccagggataaa ро4 3' 176

аа2 5' tcattggcctgaccactctc 3' 5' gaagtttccagggtctacgc 3' 5' (fam)aattgtga(t-bhq1)gggtgctatcaccgatg ро4 3' 166

аа1 5' taccctcaaaccaagacctact 3' 5' cacgcagcttgaaggcat 3' 5' (fam)agaagcacggaaagac(t-bhq1)atcatgggtg ро4 3' 175

Ре1 5' tggactcagcggtacttcg 3' 5' agcacacttaaatcagcataggt 3' 5' (fam)agcacagt(t-bhq1)ttaccgtgggcagc ро4 3' 164

ае1 5' catggagctcactgaggttc 3' 5' agaccaagacctacttctctcact 3' 5' (fam)tccggca(t-bhq1)taaggtcatcgattttg ро4 3' 153

5' gcagcatgaaggcgtgta 3'

ае3 5' §асШ§йс§Шассс1;са§ 3' 185

5' (fam)tccgtt(t-bhq1)atcaccgtggttccgtg ро4 3'

БАМ - флуоресцентный краситель, BHQ-1 - гаситель флуоресценции.

7. Праймеры для анализа 3С данных: см.Таблица 3. Таблица 3. Олигонуклеотиды для анализа данных 3С методом ПЦР в реальном времени

Фрагмент Пары олигонуклеотидов

«1», Taq-Man 5' fam-atcacagac(t-bhq1)aacagctccaccttctgtt-po4 3'

«7», Taq-Man 5' fam ctgtttggc(t-bhq1)cgctataattgttcagttt ро4 3'

«8», Taq-Man 5' fam tacaatgg(t-bhq1)gagtttcttgggtgtgtcg ро4 3'

«13», Taq-Man 5' fam ttgggtg(t-bhq1)atcttcctgtgagcagtataa ро4 3'

«2», Taq-Man 5' fam caagtg(t-bhq1)gaattagatacgccataataacc ро4 3'

«5», Taq-Man 5' fam atgcgtca(t-bhq1)ctcagcaagattatccaa ро4 3'

«0» 5' ctgcacacatcaactgaatttaac 3'

«1» 5' catggtctcctaacacactttctaa 3'

«2» 5' tatggcgtatctaattcacacttg 3'

«3» 5' tttctcttgtgataccacgacg 3'

«4» 5' aatttctttgagaagatgacgca 3'

«5» 5' taactgaacatattttgtttggca3'

«6» 5' gataatcttgctgagatgacgc 3'

«7» 5' atcagtccgaaccacacctct 3'

«8» 5' tgaacaattatagcgagccaaa 3'

«9» 5' cccaagaaactcaccattgtaaa 3'

«10» 5' attttgcactctatttacactacaca 3'

«11» 5' ccaaggctaacctcattaaaca 3'

«12» 5' tagaaacatgtgtcctgcataaaa3'

«13» 5' ctcacaggaagatacacccaag 3'

«14» 5' agcaaccatgagtctttccg 3'

БАМ - флуоресцентный краситель, BHQ-1 - гаситель флуоресценции.

8. Праймеры для анализа Х-СЫр данных: см.Таблица 4. Таблица 4. Олигонуклеотиды для анализа данных Х-СЫр методом ПЦР в реальном времени

Фрагмент Пары олигонуклеотидов

СББ1 5' §1ссаас§ас1§с1§§1с1е 3' 5' с§аа1§с1§а1§с§1с1§1 3' 5' fam agtaatgg(t-bhq1)ggtgacctcgtcctgc ро4 3'

СББ2 5' tgagttatatttatatgaagaaaggtg 3' 5' ctgctggaaaatgagaaggtt 3' 5' fam tgcaagc(t-bhq1)gctgcaggttcttgac ро4 3'

СББ3 5' agggtataagtttagatttttctgtc 3' 5' gatattccaaacgatcaccaa 3' 5' fam atagg(t-bhq1)aaaacgaatgctgtagggctcaa ро4 3'

СББ4 5' cttgaaatggacattgacagcag 3' 5' agctagacacgtttttttcatggta 3' 5' fam- aaatgttgggcc(t-bhq1)atattgttctatgcgac ро4 3'

аа1 5' taccctcaaaccaagacctact 3' 5' cacgcagcttgaaggcat 3' 5' (fam)agaagcacggaaagac(t-bhq1)atcatgggtgpo4 3'

Рс1 5' tggactcagcggtacttcg 3' 5' agcacacttaaatcagcataggt 3' 5' (fam)ccttga(t-bhq1)gttgtccatgttcttcactgc ро4 3'

ае1 5' catggagctcactgaggttc 3' 5' agaccaagacctacttctctcact 3' 5' (fam)tccggca(t-bhq1)taaggtcatcgattttg ро4 3'

БАМ - флуоресцентный краситель, BHQ-1 - гаситель флуоресценции.

Во всех биохимических экспериментах использовали деионизованную воду, полученную с помощью системы очистки воды MILLIPORE Simplicity.

Дизайн праймеров для клонирования, обратной транскрипции и анализа 3С-данных методом полимеразной цепной реакции «в реальном времени» осуществляли с использованием компьютерной программы Primer Premier. С последовательностями ДНК работали в программе Vector NTI. Последовательности ДНК были взяты из интернет-ресурса NCBI (National Center for Biotechnology Information) в разделе GeneBank. Праймеры проверялись на повторы на интернет-ресурсе UCSC Genome Bioinformatics в разделе Blat и на гомологии на интернет ресурсе BLAST (Basic Local Allignment Search Tool) в разделе nucleotide blast.

4.2 Методы

4.2.1 Создание генетических конструкций и оценка люциферазной активности

Для оценки функциональной активности MRE было создано 2 типа генетических конструкций. В конструкциях первого типа участки между глобиновыми генами главного локуса Danio rerio были амплифицированы и встроены перед геном люциферазы светлячка в плазмиду pGL3-Basic по сайту XhoI.

Далее в полученные конструкции был встроен участок, соответствующий изучаемому энхансеру. Этот участок был амплифицирован с геномной ДНК и клонирован по сайту BamHI.

Для оценки энхансер-блокирующей активности CBS4 (рисунок 19) исследуемый участок был амплифицирован и встроен по сайту BamHI, в то время как MRE был встроен по сайту SalI. Инсуляторы FII были амплифицированы и встроены по сайтам NheI и MluI.

4.2.1.1 Выделение высокомолекулярной ДНК из культуры клеток

Геномную ДНК из фрагмента ткани Danio rerio выделяли с использованием набора «GeneElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit» (Sigma), согласно протоколу производителя. Полученный осадок ДНК растворяли в воде; препарат хранили в холодильнике при -20оС. Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 8000 или на флуориметре Qubit с использованием набора реактивов Quant-iT dsDNA Assay Kit (Invitrogen).

3G-35 циклов -<

4.2.1.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Олигонуклеотидные праймеры были подобраны на основании соответствующих последовательностей, депонированных в базе данных GeneBank (NW_001878837.3). Дизайн праймеров осуществляли с использованием компьютерной программы Primer Premier. Последовательности всех олигонуклеотидов, использованных в данной работе приведены в таблицах.

В качестве матрицы для ПЦР использовали геномную ДНК Danio rerio. На одну реакцию брали от 0,5 до 1 мкг матрицы, по 7,5 пкмоль каждого праймера, по 7,5 нмоль каждого дезоксирибонуклеотид-5'-фосфата и 1 единицу высокоточной полимеразы с горячим стартом (KAPA Biosystems) в соответствующем буфере. Реакцию амплификации проводили на автоматическом ПЦР-амплификаторе Perkin Elmer Gene Amp PCR system 27GG (Applied Biosystems) в следующем режиме:

1. 95°С - 5 мин - денатурация;

2. 98°С - 2G сек - денатурация;

3. Температура отжига праймеров - 1S сек - отжиг праймеров;

4. 72°С - 1-2 минуты, элонгация.

Температура отжига праймеров подбиралась экспериментально, исходя из теоретически рассчитанных с помощью программы Primer Premier значений.

Время элонгации при 72оС подбиралось исходя из размера амплифицируемого фрагмента индивидуально. Так, согласно инструкции производителя HiFi-полимеразы (KAPA) данный фермент синтезирует около 1000 нт/мин.

4.2.1.3 Рестрикция ДНК

Смесь, содержащую необходимое количество ДНК, эндонуклеазу рестрикции (не более 1/10 объема), 1/10 часть соответствующего 10-кратного буфера и, при необходимости, 1/10 часть 10-кратного BSA, инкубировали при 370С в течение 1-3 часов. Для аналитических рестрикций объём смеси составлял 15 мкл, а для препаративных рестрикций - 30 мкл.

4.2.1.4 Выделение фрагментов ДНК из геля

Электрофорез в агарозном геле проводили при напряжённости электрического поля В-10 В/см. Освещая гель на источнике дальнего УФ, скальпелем вырезали полосы необходимых фрагментов ДНК. Элюция фрагментов ДНК с сопутствующей их очисткой осуществлялась с использованием набора колонок и реагентов "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen) согласно инструкциям производителя.

4.2.1.5 Лигирование

Смесь общим объёмом 15 мкл, содержащую около 50 фмоль вектора, около 1 пкмоль вставки и 5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в соответствующем буфере (буфер Т4 ДНК лигазы 10х, New England Biolabs), инкубировали в течение ночи при +22°С.

4.2.1.6 Приготовление компетентных клеток E.coli

Компетентные клетки готовились согласно методике (Inoue et al., 1990) с некоторыми модификациями.

Среда SOB: 2% бактотриптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, 2,5 mM KCl, 10мМ MgCl2, 10мМ MgSO4. Среда SOC: 2% бактотриптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, 2,5 mM KCl, 10мМ MgCh, 10мМ MgSO4, 20мМ глюкоза. Буфер ТВ (на milliQ H2O): 10 мМ PIPES pH 6,7 (KOH), 15 мМ CaCh, 250 мМ KCl, 55 мМ MnCl2.

Замороженную культуру клеток E.coli (штамм DH5a) размораживали во льду, высевали на SOB-агар и инкубировали ночь при 37оС. Затем клетки с колоний сеяли петлей в 5 мл жидкой среды SOB и инкубировали при 18-21оС около суток при перемешивании. Далее 200 мкл этой суспензии помещали в 250 мл жидкой среды SOB и растили с перемешиванием при 18-21оС до оптической плотности суспензии 0,6 (при Х=600 нм и оптической длине пути 1 см). Полученную культуру инкубировали 10 мин во льду. Затем клетки центрифугировали 10 мин при 2500 об/мин (1200g) и 4оС. Осадок клеток ресуспендировали в 80 мл охлажденного во льду буфера ТБ и переносили в две пластиковые пробирки на 50 мл. Суспензию инкубировали 10 мин во льду, после чего центрифугировали 10 мин при 2500 об/мин (770g). Осадок клеток ресуспендировали в 20 мл охлажденного буфера ТБ и добавляли ДМСО до 7% и инкубировали 10 мин во льду. Суспензию клеток разделили на аликвоты, заморозили в жидком азоте и хранили при -70°С.

4.2.1.7 Трансформация компетентных клеток

Жидкая питательная среда Luria-Bertani (LB): 1% бакто-триптон, 0.5% бакто-дрожжевой экстракт, 1% NaCl. Твердая питательная среда LB-агар: жидкая питательная среда LB, 1,5 % бакто-агар

К 200 мкл размороженных на льду компетентных клеток добавляли лигазную смесь и инкубировали на льду 30 мин. Затем клетки подвергались тепловому шоку при 42°С в течение 60 сек., быстро охлаждались (выдерживались во льду 5 мин), и в пробирку добавлялся 1 мл жидкой среды LB. Смесь осторожно перемешивалась и инкубировалась при 37°С 45 мин. После этого необходимая часть смеси (10-100%) высевалась на чашки Петри с питательной средой (LB-агар) и селективным антибиотиком ампициллином

(100мкг/мл). Чашки инкубировались 16-18 часов при 37°С до появления видимых колоний.

Отбор нужного клона осуществлялся путем ПЦР с плазмидными праймерами и специфическими праймерами для вставки (см. таблица 1).

4.2.1.8 Скрининг колоний методом ПЦР-амплификации

Вместо матрицы в реакционную смесь для проведения ПЦР добавляли соскоб с бактериальной колонии. На одну реакцию брали по 4 пкмоль каждого праймера, по 7,5 нмоль каждого дезоксирибонуклеотид-5'-фосфата и 1 единицу Taq-полимеразы (Fermentas) в соответствующем буфере. Реакцию амплификации проводили на автоматическом PCR-амплификаторе Perkin Elmer Gene Amp PCR system 2700 в следующем режиме:

5. 95°С - 5 мин - денатурация; '"б. 95°С - 30 сек - денатурация;

30 циклов < 7. Температура отжига праймеров - 30 сек - отжиг праймеров;

8. 72°С - 1-2 минуты, элонгация.

4.2.1.9 Выделение плазмидной ДНК

Бактерии культивировали 16 часов в 5мл среды LB при 37оС на качалке (180 об./мин). Плазмидная ДНК выделялась с помощью набора колонок и реактивов Genelute Plasmid Mini-Prep Kit (Sigma) в соответствии с инструкциями производителя.

4.2.1.10 Культивирование клеток

Линию клеток эритробластоза кур HD3 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, Dulbecco's modified Eagles medium) с добавлением 8% фетальной сыворотки теленка, 2% куриной сыворотки и 200 мкг/мл канамицина. Культивирование проводили при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. При достижении плотности 2,5 -3 млн клеток в мл среду, суспензию разводили свежей средой в 10 - 20 раз.

4.2.1.11 Трансфекция

За день до трансфекции клетки, суспендированные в полной среде подсчитывали в камере Горяева и рассевали до плотности 0,7 млн/мл, чтобы их плотность во время трансфекции составляла 1,5млн/мл. В день трансфекции клетки рассевали на 9 см2 лунки б-луночного культурального планшета в 2 мл полной среды клетки. На одну трансфекцию было использовано 100-200нг ДНК pRL-CMV, которая добавлялась к 190 мкл среды без сыворотки. К полученному раствору добавляли 2мкг плазмидной ДНК соответствующей конструкции (соотношение pGL3:pRL=20:1-10:1), а затем 4мкл реагента Turbofect. После

54

перемешивания, полученную смесь инкубировали 15 минут для образования комплекса ДНК с поликатионом. После этого смесь ДНК-Turbofect по каплям добавляли к клеткам. Инкубировали клетки 24 часа при 37°С в СО2-инкубаторе. Соотношение pGL3:pRL=20:1-10:1.

4.2.1.12 Измерение люциферазной активности

Клетки промывали PBS и лизировали в 300 мкл Passive Lysis Buffer (Promega) 15 минут на качалке при комнатной температуре. Полученные лизаты хранили при -70°С и использовали для измерения люциферазной активности. К 20 мкл лизата добавляли 100 мкл раствора LAR II для измерения активности люциферазы светлячка. Показания снимали при помощи люминометра Fluoroscan Ascent FL, время интеграции сигнала 10 сек. Далее к лизату добавляли 100 мкл раствора Stop&Glo для гашения люминисценции люциферазы светлячка и измерения активности люциферазы Renilla renoformis.

4.2.2 Манипуляции с РНК

4.2.2.1 Выделение тотальной РНК

Для работы с РНК вода (mQ) была обработана раствором диэтилпирокарбоната (DEPC), взятом в отношении 1:1000 объёма используемой воды и затем автоклавирована.

РНК выделяли из 10 млн. эритроцитов 20-дневных и взрослых Danio rerio, а также из 10 млн. фибробластов Danio rerio. Эритроциты собирали на льду в 10 мл буфера для сбора (0,14 М NaCl, 10 mM EDTA, 10% FBS, 100 ед/мл гепарина) и осаждали центрифугированием 5 минут при 4000 rpm. Фибробласты Danio rerio скребком снимали с чашек. Суспензию центрифугировали 5 минут при 4000 rpm. Клеточный осадок в обоих случаях использовали для выделения РНК.

Далее процедура выделения РНК аналогична для всех используемых видов клеток. 10 млн. клеток ресуспендировали в 1 мл реактива Trizol (Invitrogen) при комнатной температуре до полного лизиса и гомогенизации образца. Затем к раствору добавляли 200 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали и выдерживали 3 мин. при комнатной температуре. После чего центрифугировали 15 мин. при 13400 rpm и 4оС. Водную фазу отбирали и осаждали из неё РНК. Для этого к раствору добавляли равный объём изопропанола, интенсивно встряхивали и инкубировали 10 мин. при комнатной температуре, после чего раствор центрифугировали 15 мин. при 13400 rpm и 4оС. Супернатант удаляли, осадок РНК промывали 1 мл 70% этанола, приготовленного на DEPC-H2O, и центрифугировали 10 мин. при тех же условиях. Снова удаляли супернатант, осадок РНК подсушивали на воздухе 5 мин, выдерживая пробирку на льду, и затем растворяли в 50 мкл DEPC-H2O. Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре

55

NanoDrop 8000 или на флуориметре Qubit с использованием набора реактивов Quant-iT RNA Assay Kit (Invitrogen).

4.2.2.2 Обратная транскрипция

Реакцию проводили в объёме 20 мкл. В состав каждой реакционной смеси входили: 1 мкг РНК, 1х реакционный буфер для ревертазы M-MuLV (50 мМ Трис-HCl (рН 8.3), 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 10 мМ DTT), каждый dNTP (Силекс) в концентрации 1мМ, 20 ед. ингибитора РНКаз, 200 ед. ревертазы M-MuLV (Fermentas), а также 0.2 мкг гексануклеотидных праймеров (Силекс) или специфический праймер в концентрации 1 мкМ. В каждую реакционную смесь была добавлена вода (mQ), приготовленная на DEPC, до объёма 20 мкл. В качестве отрицательного контроля вместо ревертазы добавляли равный эквивалентный объём DEPC-H2O.

4.2.3 3С-анализ

ЗС-анализ выполняли согласно ранее опубликованным протоколам (Drissen et al., 2004; Gavrilov & Razin, 2008).

4.2.3.1 Фиксация клеток и изоляция ядер

Danio rerio на соответствующей стадии развития наркотизировали в растворе Tricain (этил-3-аминобензойная метансульфоновая кислота), который используется для анестезии рыб, с концентрацией 150мг/мл. Далее с помощью лезвия рыбе отрезали хвост, после чего собирали клетки крови в 10 мл раствора для сбора эритроцитов (0,14 М NaCl, 10 мМ EDTA, 10% FBS, 100 ед/мл гепарина). Процедура проводилась на льду, собранная кровь пропускалась через клеточный фильтр с размером пор 100 мкм. После этого клетки подсчитывались с помощью камеры Горяева. 1 х 107 клеток фиксировали в растворе для сбора эритроцитов при добавлении 2% формальдегида в течение 10 мин при комнатной температуре и покачивании. Реакцию останавливали добавлением 2 М глицина до концентрации 0.125 М, после чего суспензию клеток охлаждали во льду и центрифугировали в течение 8 мин при 3000rpm и 4°С. Осадок клеток промывали 4 мл раствора для сбора эритроцитов без добавления гепарина (0,14M NaCl, 10mM EDTA, 10% FBS) и повторяли центрифугирование. Для изоляции ядер осадок суспендировали в 4 мл буфера для лизиса клеток (10 мМ Tris (pH 8.0), 10 мМ NaCl, 0,2% NP-40, коктейль ингибиторов протеаз R1321 (Fermentas)) и инкубировали 10 мин во льду. Ядра собирали центрифугированием в течение 5 мин при 4000rpm и 4°С.

4.2.3.2 Рестрикция и лигирование ДНК

1 х 107 ядер суспендировали в 0,5 мл 1.2-кратного буфера для рестрикции (NEB buffer 3), добавляли 20% SDS до концентрации 0,3% и инкубировали 1 ч при 37°С и

интенсивном перемешивании 1000 об/мин. Далее добавляли 20% тритон Х-100 до концентрации 1.8% (для «нейтрализации» SDS) и инкубировали 1 ч при 37°С и интенсивном перемешивании 1000 об/мин. После инкубации, добавляли 800 единиц MboI (высококонцентрированная эндонуклеаза рестрикции, «New England BioLabs») и переваривали ДНК в течение 16 ч при 37°С и интенсивном перемешивании 1400 об/мин. Реакцию останавливали добавлением 20% SDS до концентрации 1,3% и нагреванием в течение 20 мин при 65°С. Раствор после рестрикции смешивали в 50-мл пластиковой пробирке для центрифугирования с 7 мл буфера для лигирования (50 мМ Tris (pH 7.5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ), добавляли 20% тритон Х-100 до концентрации 1% и инкубировали 1 ч при 37°С и перемешивании 200 об/мин. Далее добавляли 100 ед. ДНК лигазы фага Т4 («Fermentas») и инкубировали с покачиванием 5-6 ч при 16°С и после, в течение 30 мин при комнатной температуре.

4.2.3.3 Очистка продуктов лигирования

После лигирования раствор инкубировали в течение 16 ч при 65°С в присутствии 1400 мкг протеиназы К (Sigma) 0,5% SDS, 10 мМ EDTA, а затем добавляли 500 мкг РНКазы А (Fermentas) и переваривали РНК в течение 45 мин при 37°С. Раствор последовательно экстрагировали равным объемом смеси фенол:хлороформ (1:1) и хлороформом, после чего разводили в два раза водой mQ, добавляли 400 мкг гликогена, 3М ацетат натрия (pH 5.2) до концентрации 0.3 М, три объема холодного 96% этанола и выдерживали сутки при -80°С. ДНК собирали центрифугированием в течение 1 ч при 4000rpm и 4°С, промывали осадок ДНК холодным 70% этанолом и центрифугировали в тех же условиях 20 мин. Осадок ДНК растворяли в 100 мкл 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5), разделяли на аликвоты и хранили при -70°С.

4.2.3.4 Приготовление эквимолярной смеси продуктов лигирования

Для приготовления эквимолярной смеси продуктов лигирования рестриктных фрагментов исследуемой области генома 10 мкг ДНК искусственной бактериальной хромосомы (BAC, клон CH211-5K11), переваривали рестриктазой Sau3A, очищали ДНК экстракцией фенол-хлороформом и хлороформом, после чего преципитацией этанолом, а далее религировали при концентрации ДНК около 200 нг/мкл и вновь очищали ДНК.

Затем готовили 4 десятикратных разведения продуктов религирования бакмиды, добавляли к ним полногеномную ДНК Danio rerio в количестве, соответствующем таковому в ПЦР с 3С-образцами и использовали полученную смесь в качестве матрицы в RT-PCR при построении калибровочных кривых. Как и 3С-образцы, разведения бакмидного стандарта были разделены на аликвоты и заморожены.

4.2.4 ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами

Реакцию амплификации проводили в объеме 20 мкл. Каждая реакция содержала 1х буфер для Taq-полимеразы (Sibenzyme), MgCh в концентрации 1,5 мМ, каждого dNTP в концентрации 0,2 мМ, TaqMan-пробу в концентрации 0.25 мкМ, 0.5 мкМ каждого праймера, 0.75 ед. Hot Start Taq-полимеразы (Sibenzyme) и по 1мкл матрицы. В качестве матрицы использовалась ДНК, полученная в результате метода фиксации конформации хромосом или эквимолярная смесь продуктов лигирования. Реакция проводилась по следующей схеме:

9. 94°С - 5 мин - денатурация;

"10. 94°С - 15 сек - денатурация 59 циклов < 11. 60°С - 60 сек - отжиг праймеров, элонгация;

12. детекция флуоресценции.

Размер ПЦР-продуктов составлял 50-150 п.н. Последовательности праймеров и TaqMan пробы представлены в подразделе «Биологические материалы».

ПЦР выполняли на приборе BioRad CFX96 Real-Time System. Результаты ПЦР обрабатывались в программе Bio Rad CFX Manager.

4.2.5 Приготовление 5С-библиотек

4.2.5.1 Отжиг 5С-праймеров

Отжиг 5С-праймеров на ЗС-библиотеки и бакмидный стандарт проводили в объёме 10 мкл, содержащем 1 мкл 10Х буфера NEB4, 600 нг соответствующей ЗС-библиотеки или 10 нг бакмидного стандарта, 1000 нг ДНК лосося, фрагментированной ультразвуком до размера 100 - 1000 п.н., и 1.7 фмоль каждого 5С-праймера. Отжиг проводили 16 часов в ПЦР-амплификаторе при температуре 54оС.

4.2.5.2 Лигирование 5С-праймеров

К образцам добавляли 20 мкл лигазной семи, содержащей 1Х буфер для Taq-лигазы (NEB) и 10 ед. Taq-лигазы. Реакционную смесь инкубировали 1 час при 54оС, после чего пробирки охлаждали в кельвинаторе и хранили при -20оС.

Для амплификации 5С библиотек проводили ПЦР с праймерами, специфичными к ТЗ и Т7 адаптерным последовательностям 5С-праймеров.

5C библиотеки были подготовлены к секвенированию в лаборатории эволюционной геномики (факультет Биоинженерии и Биоинформатики) и секвенированы на платформе Illumina HiSeq парными ридами длиной 101 н. (7 - 10 млн парных ридов на образец).

4.2.5.3 Обработка данных секвенирования и построение 5С-карт

Эта часть работы выполнялась сотрудниками учебно-научного центра «Биоинформатика» ИППИ РАН.

Картирование ридов 5С было проведено с использованием Bowtie 2 (половинок ридов с опцией -local против фрагмента генома, на котором расположены праймеры из библиотеки), после чего производили подсчет продуктов лигирования каждого прямого праймера с каждым обратным и строили первичную матрицу контактов.

Для подбора 5С-праймеров использовали сервер my5C (http://my5c.umassmed.edu/welcome/welcome.php).

4.2.6 Иммунопреципитация нативного хроматина (native chromatin immunoprecipitation - N-ChIP)

Буфер для сбора эритроцитов: 0,14 М NaCl, 10 мМ, 10% FBS, 100 u/ml гепарин, 5 мМ бутират натрия. Буфер для лизиса: 0,32 М сахароза, 0,5% тритон Х100, 10 мМ Tris-HCl рН 8,0, 100 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 0,5 мМ CuSO4, 0,5 мМ PMSF, 1х коктейль ингибиторов протеиназ, 5 мМ бутират натрия. CuSO4, PMSF, бутират натрия и коктейль ингибиторов протеиназ добавляется перед использованием. Буфер для переваривания: 50 мМ Tris-HCl рН 8,0, 3 мМ MgCh, 1 мМ CaCh, 0,3 М сахароза, 100 мМ NaCl, 0,5 мМ PMSF, 1х коктейль ингибиторов протеиназ, 5 мМ бутират натрия. PMSF, бутират натрия и коктейль ингибиторов протеиназ добавляется перед использованием. Буфер для элюции: 1 мМ Tris-HCl рН 8,0, 0,2 мМ ЭДТА, 0,2 мМ PMSF, 20 мМ бутират натрия, 1х коктейль ингибиторов протеиназ. Буфер для инкубации: 50 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl рН 8,0, 20 мМ бутират натрия, 5 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF, 1х коктейль ингибиторов протеиназ.

Хроматин получали из эритроцитов взрослых и 18-дневных Danio rerio. Кровь

собирали из хвостовой вены рыбы, обездвиженной трикаином, взятым в концентрации

150 мг/л. Кровь собирали в раствор для сбора эритроцитов. После этого клетки осаждали

центрифугированием при 2000 об/мин в течение 8 минут на 4°С. Суспендировали осадок в

охлажденном буфере для лизиса из расчета 1 мл буфера на 20 млн клеток. Далее

суспензию инкубировали 15 мин на льду, после чего центрифугировали 8 минут при 3000

об/мин и 4°С. Осадок клеток ресуспендировали в охлажденном буфере для лизиса без

CuSO4 из расчета 1 мл буфера на 20 млн клеток, затем снова центрифугировали 8 минут

при 3000 об/мин и 4°С. Дважды промывали осадок ядер охлажденным буфером для

переваривания из расчета 1 мл буфера на 20 млн клеток. Затем суспендировали осадок в

буфере для переваривания из расчета 1 мл буфера на 100 млн клеток. Суспензию ядер

инкубировали в течение 10 минут при 28°С с добавлением микрококковой нуклеазы

59

(TermoScientific) до нужной концентрации. После переваривания смесь быстро помещали в лед и добавляли ЭДТА до концентрации 10 мМ. Проводили электрофорез для установления эффективности перевара. Для проведения иммунопреципитации с антителами были выбраны фракции, содержащие моно-, ди- и тринуклеосомы. Для дальнейшей работы хроматин концентрировали на колонках Amicon 100 kDa. Сконцентрированный хроматин снимали с колонок буфером для элюции. На этом этапе отбирали аликвоты Input. Остальные фракции хроматина доводили буфером для инкубации до объема 1 мл. Добавляли антитела из расчета 5 мкг антител на хроматин, выделенный из 10 млн клеток. Инкубировали ночь на 4°С при постоянном перемешивании 30 об/мин.

На следующий день добавляли магнитные шарики Dynobeads Protein G (Life Technologies) и инкубировали 3 часа на 4°С при постоянном перемешивании 30 об/мин. Затем отмывали как рекомендовано (Life Technologies) и извлекали, инкубируя в 150 мкл смеси для снятия с шариков с инкубацией в течение ночи на водяной бане при 55°С. ДНК очищали, используя QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Выделенную ДНК хранили на -20°С, и затем использовали для анализа ПЦР «в реальном времени».

4.2.7 Иммунопреципитация фиксированного хроматина (X-ChIP)

Хроматин получали из эритроцитов взрослых и 18-дневных рыб. Кровь собирали

из хвостовой вены рыбы, обездвиженной трикаином, взятым в концентрации 150 мг/л.

Кровь собирали в раствор для сбора эритроцитов, фиксировали 1% формальдегидом в

среде DMEM/F-12 (1:1) (Invitrogen) при комнатной температуре 8 минут. Фиксированные

клетки осаждали центрифугированием (700g, 4°C) в течение 4 минут, промывали PBS,

содержащим ингибитор протеаз AEBSF (1мМ) и коктейль ингибиторов протеаз (2мкл/мл)

(Sigma), снова центрифугировали и ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера (50

мМ Tris-HCl pH 8,0, 1% SDS, 10 мМ EDTA). Затем образец инкубировали 10 минут на

льду и обрабатывали ультразвуком (Cole-Parmer CP750, амплитуда 30%, 40 циклов по 3

секунды с интервалом 10 секунд). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (10

минут, 13000 rpm, 4°С), супернатант разводили в 10 раз буфером (16,7 мМ Tris-HCl, pH

8,0, 16,7 мМ NaCl, 1,2 мМ EDTA, 1% Triton X-100, 0,01% SDS, 1 мМ AEBSF, и 1 мкл/мл

коктейля ингибиторов протеаз (Sigma)). На этом этапе отбирали аликвоты Input.

Клеточные лизаты очищали с помощью инкубирования на магнитных шариках Dynabeads

Protein G (Life Technologies) и затем инкубировали с 30 мкг антител против CTCF при 4°С

с покачиванием. Крысиные антитела были приготовлены против N-концевого региона

куриного CTCF, содержащего аминокислоты 86-233. После инкубации с антителами,

60

ДНК-белковые комплексы преципитировали связыванием с магнитными шариками Dynabeads Protein G (Life Technologies) и отмывали как рекомендовано (Life Technologies), затем извлекали, инкубируя по 15 минут в буфере (1% SDS, 0,1 M NaHCO3) при комнатной температуре. ДНК очищали, используя QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Выделенную ДНК хранили на -20°С, и затем использовали для анализа ПЦР «в реальном времени».

4.2.8 Выделение бакмидной ДНК

Клетки E. coli, несущие необходимые бакмиды, растили в среде LB с добавлением 12.5 мкг/мл хлорамфеникола в течение 20 часов, а затем осаждали центрифугированием 10 минут при 3200g при комнатной температуре. Осадок ресуспендировали в 300 мкл буфера GTE (50 мМ глюкоза, 25 мМ Трис-НО (рН 8.0), 10 мМ EDTA), добавляли 600 мкл 7.5 М ацетата аммония и инкубировали на льду 10 мин. Далее раствор центрифугировали 20 минут при 16000g при комнатной температуре; супернатант отбирали и повторно центрифугировали 10 минут при 16000g. Затем к супернатанту добавляли 700 мкл изопропанола и центрифугировали 20 минут при 16000g при комнатной температуре, после чего осадок ДНК промывали 500 мкл 70% этанола и повторно центрифугировали 5 минут при тех же условиях. Осадок ДНК растворяли в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис (pH 8.0), 1 мМ EDTA) и добавляли 10 мкг РНКазы А (Sigma); инкубировали 60 минут при 37оС. После инкубации к раствору добавляли 10 мкл 3М ацетата натрия, 330 мкл 96% этанола и выдерживали 20 мин. при -20оС. Затем центрифугировали 15 мин. при 16000g и комнатной температуре, осадок промывали 500 мкл 70% этанола и повторно центрифугировали 5 мин. Полученный осадок ДНК растворяли в 50 мкл 10мМ Трис-HCl (рН 7.5); препарат хранили в холодильнике при -70оС. Концентрацию ДНК измеряли на флуориметре Qubit с использованием набора реактивов Quant-iT dsDNA Assay Kit (Invitrogen).

5) РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

5.1 Анализ энхансерной активности МКЕ по отношению к промоторам глобиновых генов главного локуса Danio ^гю

Как уже было сказано ранее, на 3-й хромосоме Danio ^гю расположен главный локус, содержащий 13 глобиновых генов. Он состоит из эмбрионально-личиночного и взрослого суб-локусов, содержащих как а-, так и Р-глобиновые гены. Кластеризованные а-и Р-глобиновые гены соседствует с геном В пределах пятого интрона у

Danio rerio находится геномный элемент, для которого характерно консервативное расположение сайтов связывания эритроид-специфичных транскрипционных факторов, типичное для главного регуляторного элемента (МКБ) локуса а-глобиновых генов теплокровных животных. Кроме того, для этой области была продемонстрирована энхансерная активность в экспериментах с трансгенными животными, а также присутствие эритроид-специфичных сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I (ОашБ й а1., 2012).

Наша первая задача состояла в том, чтобы оценить энхансерную активность участка пятого интрона по отношению к промоторам глобиновых генов главного

локуса Danio ^гю. Анализ энхансерной активности исследуемого геномного элемента был проведен с помощью оценки экспрессии репортерного гена люциферазы в составе генетических конструкций. Было исследовано, повышается ли экспрессия репортерного гена люциферазы, поставленного под контроль промоторов глобиновых генов главного локуса, при наличии предполагаемого энхансера в составе генетических конструкций. В качестве предполагаемого регуляторного элемента был выбран фрагмент, охватывающий по 900 пар оснований в направлении 5'-конца и 3'-конца от фрагмента, характеризующегося консервативным расположением сайтов связывания эритроид-специфичных транскрипционных факторов. В дальнейшем описании экспериментальной работы данный фрагмент будет обозначаться как МЯБ.

Для оценки энхансерной активности МЯБ была использована фирменная система

(Ргоше§а), которая позволяет детектировать и количественно оценить независимо друг от

друга одновременную экспрессию двух различных ферментов в пределах одного образца

(рисунок 7). Экспрессия репортерного гена люциферазы светлячка ^^Ыпш pyralis)

зависит от различных комбинаций регуляторных последовательностей, под контролем

которых он находится. Активность котрансфецированного гена люциферазы морской

губки (RemПa reniformis) используется для внутреннего контроля, который позволяет

корректировать данные в зависимости от количества клеток в образце и эффективности

62

трансфекции в каждом случае, что при использовании транзиентной трансфекции является очень важным. Система детекции двух последовательно активируемых ферментов позволяет провести корректную нормировку результатов.

Рисунок 7. Векторы, использованные в работе. Обозначены гены устойчивости к антибиотикам (красный); ген люциферазы (желтый); промоторы, сайты полиаденилирования и ой репликации (зеленый), выносками с названиями эндонуклеаз рестрикции обозначены полилинкеры.

Нами было получено две серии генно-инженерных конструкций (рисунок 9). В первой серии к 5'-концу от гена люциферазы был клонирован один из промоторов главного локуса глобиновых генов Danio ^гю. В качестве промоторов были использованы участки между глобиновыми генами, транскрибирующимися в противоположных направлениях и расположенными «голова к голове» (три двунаправленных промотора глобиновых генов взрослого типа и участок между эмбриональными а-глобиновым геном первой пары и Р-глобиновым геном второй пары), а также фрагмент перед первым эмбриональным геном (рисунок 8).

Во второй серии генно-инженерных конструкций к З'-концу от гена люциферазы был клонирован исследуемый фрагмент МКЕ в двух возможных ориентациях по отношению к промоторам, геномной и обратной (рисунок 9). Встраивание

осуществлялось на некотором расстоянии от промотора, после гена люциферазы, так как интересующая нас область расположена на расстоянии около 26 тыс. п.о. от ближайшего глобинового гена в главном локусе, что предполагает регуляцию экспрессии глобиновых генов на значительном удалении. После создания конструкций все вставки в них были секвенированы, и анализ последовательности показал, что вставки соответствуют промоторам глобиновых генов и участку предполагаемого МКБ.

ßa2 аа2 ßa1.1 аа1.1 ßa1.2 аа1.2 ße1 ae1 ße1.1 ael.1 ße1.2 ae1.2 ae1.3

Ф » » » M * » * » » » ¥4

взрослые эмбриональные и личиночные а- и [3-глобиновые гены а- и ß-глобиновые гены

Рисунок 8. Промоторы главного локуса, по отношению к которым была исследована энхансерная активность МКЕ.

Схемы полученных конструкций представлены на рисунке 9.

Рисунок 9. Схема генетических конструкций, содержащих один из промоторов глобиновых генов главного локуса. Промотор обозначен светлой однонаправленной стрелкой, а энхансер - темной однонаправленной стрелкой. Прямоугольником обозначен репортерный ген люциферазы светлячка.

В качестве положительного контроля для анализа и нормировки результатов в разных экспериментах мы выбрали вектор pGL3-Control, в котором ген люциферазы светлячка находится под контролем универсальных промотора и энхансера вируса SV40, которые обеспечивают высокий уровень экспрессии во всех типах клеток, использованных в нашей работе.

Для изучения энхансерной активности MRE в отношении промоторов глобиновых генов проводилась транзиентная трансфекция полученными конструкциями линии клеток HD3 (клетки эритробластоза кур). Клетки данной линии были получены посредством трансформации куриных эритроидных клеток ранней стадии дифференцировки вирусом птичьего эритробластоза (Beug et al, 1982). Есть основания считать, что в этом клеточной линии присутствуют все необходимые для функционирования энхансера эритроид-специфичные транскрипционные факторы. В предыдущих работах она уже была успешно использована для изучения влияния регуляторных элементов на работу промоторов у костистых рыб, а именно рыбы-фугу (Flint et al., 2001).

Результаты измерения активности люциферазы в экспериментах с разными генетическими конструктами представлены в виде диаграмм на рисунках 10 и 11. Слева показаны схемы конструкций, а с правой стороны на диаграммах для каждой из них представлены результаты измерения относительной люциферазной активности в клетках HD3. Активность люциферазы в экстрактах клеток, трансфецированных вектором pGL3-Control, была принята нами за 100%.

Рисунок 10. Результаты измерения активности люциферазы в экстрактах из клеток ИБ3, трансфецированных конструкциями, содержащими промоторы взрослых глобиновых генов главного локуса. Слева показаны схемы генно-инженерных конструкций (промотор обозначен двунаправленной стрелкой, МКЕ обозначен однонаправленной стрелкой, ген люциферазы светлячка - прямоугольником). Справа, на диаграммах для каждой конструкции указана относительная люциферазная активность в клетках ИБ3. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от среднего по пяти независимым экспериментам.

Рисунок 11. Результаты измерения активности люциферазы в экстрактах из клеток ИБ3, трансфецированных конструкциями, содержащими промоторы эмбрионально-личиночных глобиновых генов главного локуса. Слева показаны схемы генно-инженерных конструкций (промотор обозначен двунаправленной стрелкой, МКЕ обозначен однонаправленной стрелкой, ген люциферазы светлячка - прямоугольником). Справа, на диаграммах для каждой конструкции указана относительная люциферазная активность в клетках ИБ3. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от среднего по пяти независимым экспериментам.

Анализируя представленные диаграммы, можно сделать следующие выводы: (1)

все исследованные участки, расположенные между глобиновыми генами главного локуса,

действительно являются промоторами, так как люциферазная активность значительно

повышается при включении этих участков в состав генетической конструкции; (2) самым

сильным является промотор, расположенный между а- и Р-глобиновыми генами второй

пары во взрослом суб-локусе; (3) транскрипция репортерного гена, находящегося под

контролем каждого из промоторов главного локуса, повышается при включении

тестируемого геномного элемента МКЕ в состав конструкции. В этой связи можно

67

заключить, что анализируемый фрагмент ДНК обладает энхансерной активностью в отношении промоторов глобиновых генов как взрослого, так и эмбрионально-личиночного типа. Чаще всего регуляторное воздействие МЯЕ является более эффективным, если этот элемент расположен в «антигеномной» ориентации (рисунок 10, 11). Таким образом, можно утверждать, что по результатам функционального теста исследуемый нами элемент МКЕ в модельной системе ведет себя как энхансер по отношению к промоторам глобиновых генов главного локуса Вато гегго в эритроидных клетках.

Нам представлялось интересным выяснить, отличается ли действие МКЕ в отношении промоторов глобиновых генов взрослого и эмбрионально-личиночного суб-локусов. На рисунке 12 представлены обобщенные данные предыдущих экспериментах, показывающие уровни люциферазной активности, детектированные в экспериментах только с одной ориентацией исследуемых промоторов и МКБ. В случае фрагментов, работающих в качестве промоторов в обоих направлениях (фрагменты между генами, расположенными "голова к голове"), показаны результаты, полученные с наиболее эффективным промотором (его направление обозначено под схемой тонкой стрелкой).

Рисунок 12. Сравнительный анализ результатов трансфекции эритроидных клеток ИБ3 конструкциями, содержащими промоторы различных глобиновых генов взрослого и эмбрионально-личиночного типов и МЯЕ. Светло-серые столбцы соответствуют конструкциям, в составе которых содержится только промотор, темно-серые столбцы - и промотор, и энхансер. Снизу представлена схема локуса, а также МИЕ в виде овала. Цифрами обозначено во сколько раз увеличивается относительная люциферазная активность при включении МИЕ в состав генетической конструкции. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению от среднего по пяти независимым экспериментам.

Из представленных данных видно, что энхансерная активность МКЕ проявляется в отношении всех изученных промоторов. Нужно отметить, что в наибольшей степени он активирует промотор третьей пары глобиновых генов взрослого типа, в этом случае относительная люциферазная активность повышается в 9,9 раз при включении МКЕ в состав конструкции. При этом МКЕ в меньшей степени активирует промоторы эмбрионально-личиночных глобиновых генов главного локуса, это особенно справедливо в отношении более сильного промотора.

5.2 Анализ пространственных взаимодействий МКЕ в эритроидных клетках на различных стадиях индивидуального развития Danio гсгЮ

Известно, что для костистых рыб так же, как и для теплокровных животных, характерно переключение экспрессии глобиновых генов с эмбрионально-личиночного на взрослый тип (Вго^Не й а1., 2003; 1985). Гены эмбрионально-личиночного и

взрослого типов кодируют различающиеся полипептидные цепи гемоглобина, приспособленные к транспорту кислорода в разных условиях. На сегодняшний день остается неизвестным механизм стадиеспецифичного переключения экспрессии глобиновых генов с эмбрионально-личиночного на взрослый тип и регуляции экспрессии разных глобиновых генов главного локуса глобиновых генов Danio rerio. В первой части работы мы продемонстрировали, что МЯЕ способен увеличивать активность промоторов как взрослых, так и эмбрионально-личиночных глобиновых генов этого локуса в экспериментах по транзиентной трансфекции эритроидных клеток генетическими конструкциями. В дальнейшем нам представлялось интересным выяснить, регулирует ли МКЕ исследуемые промоторы в естественном геномном окружении, и участвует ли он в переключении экспрессии глобиновых генов в процессе онтогенеза. Считается, что для активации промотора энхансер должен находиться рядом с этим промотором, что достигается посредством выпетливания разделяющего их сегмента хроматиновой фибриллы. Мы решили проанализировать вопрос о том, существуют ли пространственные взаимодействия МКЕ с глобиновыми генами главного локуса, и меняется ли спектр его взаимодействий после переключения экспрессии с эмбрионально-личиночного на взрослый тип.

5.2.1 Анализ уровня транскрипции глобиновых генов главного локуса на разных стадиях индивидуального развития

Перед тем, как изучать спектры контактов МКЕ с промоторами глобиновых генов главного локуса Danio rerio, которые экспрессируются на разных стадиях индивидуального развития Danio ^гю, необходимо было уточнить время переключения экспрессии глобиновых генов с эмбрионально-личиночного типа на взрослый. Ранее в работах других авторов было показано, что переключение экспрессии генов главного локуса Danio ^гю происходит на стадии 22-24 дней после оплодотворения (ОашБ е! а1., 2012). Однако известно, что в различных популяциях Danio rerio время переключения экспрессии генов может несколько отличаться. Опираясь на литературные данные, мы решили проанализировать профили транскрипции глобиновых генов в эритроцитах 18-, 20-и 26-дневных Danio rerio с тем, чтобы выбрать такую стадию развития, когда переключение еще не произошло, и экспрессируются только эмбрионально-личиночные глобиновые гены, но не глобиновые гены взрослого типа. В то же время необходимо было убедиться, что у взрослых особей, наоборот, наблюдается экспрессия генов взрослого типа, но не эмбрионально-личиночных глобиновых генов.

Для решения поставленной задачи была выделена тотальная РНК из клеток крови 18-, 20- и 26-дневных Danio ^гю, после чего методом обратной транскрипции была синтезирована кДНК, которую в дальнейшем анализировали с помощью ПЦР в реальном времени с TaqMan пробами (см. таблица 2). Мы сравнивали представленность транскриптов глобиновых генов главного локуса с использованием праймеров, которые были выбраны таким образом, чтобы они находились на границе между экзоном и интроном. Такое расположение праймеров позволяет анализировать новосинтезированные транскрипты. Калибровочный график для ПЦР в реальном времени мы строили, используя четыре последовательных десятикратных разведения геномной ДНК Danio ^гю, начиная с 50 нг ДНК на одну реакцию амплификации.

Представленные на рисунке 13 результаты демонстрируют, что в эритроидных клетках 26-дневных Danio ^гю экспрессируются гены взрослого типа (аа1, аа2, Ра1, Ра2), но не экспрессируются эмбрионально-личиночные глобиновые гены главного локуса. Максимальный уровень экспрессии при этом имеют гены ае1 и Ре1, в то время как уровень экспрессии первой пары генов взрослого суб-локуса существенно ниже. Низкий уровень экспрессии первой пары глобиновых генов взрослого суб-локуса может быть связан с второстепенной ролью кодируемых ими а- и Р-полипептидных цепей в переносе кислорода.

Рисунок 13. Анализ уровня транскрипции глобиновых генов главного локуса в эритроидных клетках на разных стадиях индивидуального развития Вато ггпо. А - общая схема домена, показывающая расположение основных структурно-функциональных элементов. Б, В. Г - представленность глобиновых генов главного локуса в препаратах тотальной РНК, выделенной из эритроидных клеток восемндцатидневных (Б), двадцатидневных (В), а также взрослых (Г) Вато гепо. Результаты выравнены по количеству РНК, взятой для обратной траскрипции. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от среднего по трем независимым экспериментам.

В эритроцитах 20-дневных личинок экспрессируются и эмбрионально-личиночные глобиновые гены, и глобиновые гены взрослого типа. Это означает, что, по крайней мере, у некоторых особей в популяции уже произошло переключение, и взрослый эритропоэз начал замещать эмбрионально-личиночный. В эритроцитах 18-дневных личинок экспрессируются эмбрионально-личиночные глобиновые гены (ае1, Ре1, аеЗ), но не гены взрослого типа.

Таким образом, мы выяснили, что в используемой нами популяции Бато гепо переключение экспрессии глобиновых генов с эмбрионально-личиночного на взрослый тип происходит после 18 дня развития. Так как для нашего исследования важно сравнивать организацию главного локуса глобиновых генов в условиях, когда активны только эмбрионально-личиночные гены, или только гены взрослого типа, то во всех дальнейших экспериментах мы использовали 18-дневных личинок как источник эритроидных клеток до переключения эритропоэза, а рыб старше 26 дня как источник эритроидных клеток после переключения эритропоэза.

На выбранных стадиях развития мы исследовали пространственные взаимодействия MRE с эмбрионально-личиночным и взрослыми суб-локусами главного локуса.

5.2.2 Анализ пространственных взаимодействий MRE с регуляторными элементами главного локуса глобиновых генов

Для ответа на вопрос, взаимодействует ли MRE с различными участками главного локуса глобиновых генов внутри клеточного ядра, а также меняется ли спектр его взаимодействий в эритроидных клетках до и после переключения экспрессии генов с эмбрионально-личиночного на взрослый тип, был применен метод фиксации конформации хромосом или 3С (рисунок 14). Это техника позволяет определять пространственную организацию участков генома in vivo. В соответствии с экспериментальным протоколом мы фиксировали формальдегидом клетки крови Danio rerio и далее, после лизиса клеток и выделения ядер, переваривали ДНК высококонцентрированной эндонуклеазой рестрикции MboI. Мы выбрали эту эндонуклеазу рестрикции, так как она специфично расщепляет последовательность GATC, которая встречается в геноме достаточно часто, что позволяет разбить исследуемый глобиновый локус на фрагменты, содержащие различные регуляторные элементы, и оценить возможные взаимодействия MRE с каждым из них. После расщепления мы проводили лигирование молекул ДНК при низкой концентрации (рисунок 14). В результате проведения этих процедур возможно появление химерных фрагментов ДНК, получающихся в результате сшивки пространственно сближенных фрагментов. Именно такие химерные фрагменты анализировались далее с использованием техники количественной ПЦР (рисунок 14).

Для количественного анализа продуктов лигирования была применена техника полимеразной цепной реакции в реальном времени с TaqMan-пробами (см. таблица 3). Праймеры для амплификации подбирались на концах рестриктных фрагментов так, чтобы 3'-конец праймера был обращен к концу фрагмента. В каждой серии экспериментов один из праймеров выбирался в качестве «якорного». Этот праймер использовался в комбинациях со всеми остальными праймерами, которые отжигаются на рестриктных фрагментах, включаюших в себя различные участки главного локуса глобиновых генов. Данные ЗС-анализа позволяют определить частоты сшивки «якорного» рестриктного фрагмента с другими фрагментами (а эта частота, в свою очередь, определяется количеством соответствующих продуктов лигирования).

Рисунок 14. Основные этапы 3С-анализа. Живые клетки обрабатывают формальдегидом и лизируют с помощью SDS, после чего добавляют тритон Х-100 (не показано) и переваривают ДНК эндонуклеазой рестрикции. Фрагменты ДНК религируют при низкой концентрации ДНК. Продукты лигирования очищают и анализируют с помощью ПЦР: праймеры подбирают на концах рестриктных фрагментов навстречу друг другу) (Gavrilov et а!., 2009)

Эффективность лигирования ДНК в ЗС-образцах оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле (рисунок 15).

Рисунок 15. Электрофоретическое разделение препаратов ДНК, изолированной на разных стадиях процедуры 3С. Дорожка 1 -после лизиса эритроцитов. Дорожка 2 -после инкубирования в течение 16 часов без добавления рестриктазы (контроль активности эндогенных нуклеаз). Дорожка 3 - после обработки эндонуклеазой

рестрикции в течение 16 часов. Дорожка 4 - после проведения лигирования. М - маркер молекулярного веса фрагментов ДНК, слева - размеры фрагментов (п.о.).

При определении количества ДНК-матрицы по интенсивности сигнала ПЦР,

необходимо было учесть, что реакция амплификации может проходить с разной

эффективностью в зависимости от выбранных праймеров. Для того, чтобы оценить

эффективность работы каждой пары праймеров обычно используется образец, в котором

73

присутствует одинаковое количество матрицы для ПЦР Для получения такого образца мы использовали ДНК искусственной бактериальной хромосомы (ВАС), которая включает в себя главный локус глобиновых генов Danio ^гю и область, прилегающую к нему с 5'-конца (в том числе и ген ^Е£3). Искусственная бактериальная хромосома была обработана рестриктазой Sau3A (изошизомер MboI, нечувствительный к dam-метилированию) и после этого была религирована при высокой концентрации ДНК, что приводит к эффективному лигированию фрагментов. Полученный препарат был использован в реакциях ПЦР в реальном времени в качестве стандартного (был использован для определения относительного количества продуктов лигирования в 3С-образцах), так как он представляет собой эквимолярную смесь всех возможных продуктов лигирования рестриктных фрагментов исследуемого участка генома. Для построения калибровочной кривой с помощью каждой пары праймеров была амплифицирована ДНК четырех последовательных 10-ти кратных разведений полученной эквимолярной смеси продуктов лигирования. Параллельно с четырьмя последовательными разведениями эквимолярной смеси продуктов лигирования реакцию амплификации проводили на исследуемых ЗС-образцах. Значения, полученные для образцов, были отложены на калибровочной кривой, и это позволяло определять относительные количества того или иного продукта лигирования в исследуемом образце. Для того, чтобы учесть вклад всех последовательностей генома в полимеразную цепную реакцию, концентрация ДНК в разведениях эквимолярной смеси всех продуктов лигирования была доведена до концентрации ДНК ЗС-образцов с помощью геномной ДНК Danio ^гю. Таким образом, данные, полученные на основании ПЦР в реальном времени, соответствовали стартовым количествам матрицы в ЗС-образцах. Для их анализа были построены ЗС-зависимости, отражающие частоту сшивки между «якорным» и тестовым фрагментами.

Для того, чтобы сравнивать результаты ЗС в клетках различного типа, необходимо нормировать полученные данные на значения ЗС-анализа такого участка генома, который предположительно имеет одинаковую пространственную конфигурацию во всех типах клеток, которые используются в работе. Для этого был проведен ЗС-анализ небольшого фрагмента генома вокруг МКБ. Мы предположили, что укладка хроматина около МЯБ не меняется при переключении экспрессии глобиновых генов, а зависит только от близости «якорного» и тестовых фрагментов. В каждом типе клеток для полученных частот лигирования было посчитано среднее, после чего результаты ЗС-анализа были нормированы на это значение.

В первой серии экспериментов «якорный» праймер отжигался на рестриктном фрагменте в пределах пятого интрона гена который содержит в своем составе

74

MRE. Результаты анализа, проведенного на эритроидных клетках взрослых Danio rerio, представлены на рисунке 16Б.

Рисунок 16. Анализ пространственных взаимодействий геномных элементов главного локуса глобиновых генов Danio rerio в эритроидных клетках. А - общая схема домена, показывающая расположение основных структурно-функциональных элементов, а также соответствующие им ЗС-праймеры. Якорями сверху обозначены фрагменты, которые использовались в качестве «якорных» в каком-либо из экспериментов. Б, В - результаты ЗС-анализа, проведённого с использованием эндонуклеазы рестрикции MboI, на эритроидных клетках Danio rerio после и до переключения экспрессии глобиновых генов, соответственно. По вертикальной оси отложена частота сшивки якорного фрагмента с тестовыми, выраженная в относительных единицах. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от среднего по трём независимым экспериментам.

Из представленных данных видно, что в эритроидных клетках взрослых рыб MRE преимущественно взаимодействует с промоторами глобиновых генов взрослого типа (тест-фрагменты «3», «5», «6»), а также с областью, которая находится между суб-локусами (тест-фрагмент «7»). Эти взаимодействия являются достаточно сильными, так как уровень межмолекулярного лигирования MRE с этими тест-фрагментами превышает таковой в случае фрагмента, который находится на расстоянии всего около 4000 п.н. от MRE (тест-фрагмент «0»), а особенностью техники является то, что соседствующие с

якорным рестрикционные фрагменты всегда дают высокий сигнал, и это является хорошим внутренним контролем. Взаимодействие с промоторами эмбрионально-личиночных глобиновых генов практически не детектируется (тест-фрагменты «8», «9», «10», «11»).

Результаты, полученные с якорным фрагментом, который соответствует МЯБ, в экспериментах на эритроидных клетках 18-дневных личинок, представлены на рисунке 16В. Видно, что на этой стадии МЯБ очень слабо взаимодействует как с промоторами генов взрослого типа (тест-фрагменты «2», «3», «5», «6»), так и с промоторами эмбрионально-личиночных (тест-фрагменты «8», «9», «10», «11») глобиновых генов главного локуса. Из этого можно сделать вывод, что МКЕ не участвует в регуляции экспрессии эмбрионально-личиночных глобиновых генов главного локуса. Это также подтверждается в реципрокной серии экспериментов с якорным праймером «8», который отжигается на промоторе эмбрионально-личиночного глобинового гена и для которого была показана низкая частота межмолекулярного лигирования с фрагментом «1», включающим МКБ. Можно предположить, что гены эмбрионально-личиночного суб-локуса не нуждаются в энхансере, либо активацию транскрипции эмбрионально-личиночных генов обеспечивает альтернативный, до настоящего времени некартированный, геномный элемент. В клетках крови 18-дневных личинок Danio rerio повышенный уровень межмолекулярного лигирования с МКЕ детектируется только для участка, который располагается между взрослым и эмбрионально-личиночным суб-локусами (тест-фрагмент «7»). Можно предполагать, что в этой области присутствует «архитектурный» геномный элемент, который акцептирует на себя МКЕ и препятствует его взаимодействию с промоторами эмбрионально-личиночных глобиновых генов.

Для подтверждения полученных данных во второй серии экспериментов в качестве якорного использовался праймер, который отжигался в рестриктном фрагменте, включающем в себя неисследованный геномный элемент на границе суб-локусов, (тест-фрагмент «7» в предыдущей серии экспериментов). Результаты этой серии экспериментов, представленные на рисунке 16, подтверждают наличие взаимодействия между пограничной областью взрослого и эмбрионально-личиночного суб-локусов (якорный праймер на фрагменте «7») и МЯБ (тест-фрагмент «1») в эритроидных клетках до переключения экспрессии глобиновых генов главного локуса. Также в этих клетках наблюдается высокий уровень межмолекулярного лигирования якорного праймера номер «7» и тест-фрагментов номер «8» и «1З». Что касается тест-фрагмента «8», включающего один из промоторов эмбрионально-личиночных генов, то в этом случае, скорее всего, высокая частота лигирования связана с близким расположением рестриктных фрагментов

76

«7» и «8». В случае фрагментов «7» и «13» высокий уровень лигирования, возможно, означает формирование петли, включающей в себя практически все промоторы эмбриональных генов. Это взаимодействие в дальнейшем подтверждается в реципрокной серии экспериментов с якорным праймером, который отжигается в «13» фрагменте.

В эритроидных клетках взрослых Бато гегго «якорный» фрагмент «7» участвует во взаимодействиях с МЯЕ (тест-фрагмент «1»), а также с промоторами глобиновых генов взрослого типа (тест-фрагменты «2», «3», «5», «6»). Это полностью подтверждает данные, полученные в результате первой серии экспериментов с якорным фрагментом, который включает в себя МЯЕ, в эритроидных клетках после переключения эритропоэза.

В следующей серии экспериментов в эритроидных клетках 18-дневных личинок якорные праймеры фиксировали на рестриктных фрагментах, содержащим промоторы эмбрионально-личиночных генов - фрагменты «8» и «13». В обоих случаях можно отметить, что уровень лигирования с тест-фрагментами, которые включают в себя промоторы эмбрионально-личиночных генов (тест-фрагменты «8», «9», «10», «13», «14»), и уровень лигирования между одним из эмбрионально-личиночных промоторов и межгенным участком (якорный фрагмент «8» и тест-фрагмент «12») примерно одинаковы. Это означает, что промоторы глобиновых генов эмбрионально-личиночного суб-локуса взаимодействуют друг с другом не чаще, чем с другим нефункциональным участком генома. По-видимому, эти промоторы не собираются в общий комплекс для активации экспрессии, а скорее перемещаются независимо друг от друга в небольшом объеме.

В эритроидных клетках взрослых рыб при проведении экспериментов с якорными праймерами, фиксированными на рестриктных фрагментах, содержащих промоторы глобиновых генов взрослого типа главного локуса («2» и «5»), было показано, что уровень лигирования с другими промоторами генов взрослого типа (тест-фрагменты «2», «3», «5», «6») выше, чем между промотором взрослого глобинового гена и межгенным участком (якорный фрагмент «5» и тест-фрагмент «4»). Это означает, что промоторы глобиновых генов взрослого типа взаимодействуют между собой, когда они транскрипционно-активны. Также эти промоторы взаимодействуют с тест-фрагментами «1» и «7», включающими МЯЕ и геномный элемент на границе суб-локусов, соответственно.

Опираясь на данные, полученные в результате экспериментов 3С, можно предположить следующую модель взаимодействия между геномными элементами на разных стадиях развития Бато гегго (рисунок 17).

Рисунок 17. Схематическое представление пространственных взаимодействия MRE с регуляторными элементами главного локуса глобиновых генов в эритроцитах 18-дневных личинок (А) и взрослых особей (Б). Светло-серые кружки показывают промоторы эмбрионально-личиночных генов главного локуса, темно-серые - промоторы генов взрослого типа. Шестиугольник - участок интрона гена NPRL3, включающий МКЕ. Удлиненный овал -неисследованный геномный элемент, расположенный на границе между суб-локусами.

У взрослых Danio ^гю МКБ, который располагается в пятом интроне гена NPRL3, взаимодействует с промоторами глобиновых генов взрослого типа, активируя их экспрессию. При этом взаимодействие с промоторами эмбрионально-личиночных глобиновых генов во взрослых эритроцитах не наблюдается. Помимо взаимодействий с промоторами глобиновых генов взрослого типа, детектируется взаимодействие МКЕ с геномным элементом, расположенным между взрослым и эмбрионально-личиночным суб-локусами. Это взаимодействие наблюдается также и в эритроцитах 18-дневных рыб, при этом промоторы активных эмбрионально-личиночных глобиновых генов с МКЕ не взаимодействуют. Возможно, потенциальный регуляторный элемент, расположенный между эмбрионально-личиночным и взрослым суб-локусами блокирует действие энхансера, ограничивая возможность МКЕ взаимодействовать с эмбрионально-личиночным суб-локусом. Иными словами, можно полагать, что перехватывающий регуляторный элемент инсулирует весь эмбрионально-личиночный суб-локус от действия МКЕ независимо от стадии индивидуального развития. В таком случае должен существовать независимый от МКЕ специфичный для эмбриональных эритроидных клеток способ регуляции экспрессии глобиновых генов.

5.3 Детекция участков связывания CTCF в главном локусе

У позвоночных животных энхансер-блокирующие геномные элементы обычно осуществляют свои функции при участии многофункционального белка CTCF (Bell & Felsenfeld, 2000; Bell et al., 1999b; Valadez-Graham et al., 2004). Поэтому мы решили исследовать главный локус глобиновых генов Danio rerio на наличие потенциальных участков связывания CTCF. Проведенный нами анализ нуклеотидной последовательности позволил выявить 4 участка с высокой степенью гомологии с CTCF-связывающей последовательностью человека (база данных JASPAR) (Sandelin et al, 2004). Для этого мы использовали метод поиска мотивов, доступный в библиотеке Biopython. Мы использовали частоты четырех нуклеотидов в каждой хромосоме в качестве фона и искали мотивы на обеих цепях геномной ДНК. Минимальное качество мотивов, использованных для дальнейшего анализа было выбрано с помощью программы APE (Approximate P-value Estimation), (Vorontsov et al, 2013) и соответствует P-value 0.05. Три участка (в дальнейшем будут обозначены как CBS 1,2,3 в порядке расположения с 5'-конца локуса) были обнаружены к 5'-концу от MRE, внутри гена NPRL3, а один из участков (CBS4) был детектирован на границе между суб-локусами (в рестриктном фрагменты «7», согласно обозначениям на рисунке 16).

Для того, чтобы определить, связывается ли CTCF с потенциальными участками узнавания CBS 1-4 в эритроидных клетках Danio rerio до и после переключения эритропоэза, мы провели эксперименты по иммунопреципитации хроматина (X-ChIP). Этот метод позволяет определять позиции ДНК-белковых комплексов, существующих в живых клетках. Фиксированный формальдегидом хроматин из эритроидных клеток 18-дневных личинок, а также взрослых Danio rerio был фрагментирован с помощью ультразвука, после чего антителами против CTCF осаждалась фракция хроматина, которая содержит CTCF и связанные с ним последовательности ДНК. После депротеинизации и очистки ДНК был проведен количественный анализ с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени с TaqMan-пробами (см. таблица 4). Для построения калибровочной кривой в качестве стандартных образцов мы использовали препараты ДНК, выделенные из контрольных порций хроматина, который не подвергался иммунопреципитации (так называемый input). Мы последовательно разводили эти препараты в 10 раз так, чтобы полученные относительные значения для анализируемых образцов представляли собой долю от input, которая выражена в процентах.

В качестве отрицательного контроля, чтобы убедиться в отсутствии неспецифического действия антител, мы параллельно проводили иммунопреципитацию хроматина с антителами к иммуноглобулинам кролика (IgG).

Перед проведением иммунопреципитации хроматин из эритроидных клеток Danio rerio смешивали с хроматином из эритроцитов кур, что позволило нам использовать в качестве положительного контроля известный CTCF-связывающий сайт, который находится в гене лизоцима (Steiner et al, 1987). В качестве отрицательных контролей выступали экзоны глобиновых генов главного локуса, так как не предполагается связывание CTCF в этих участках.

Рисунок 18. Результаты иммунопреципитации хроматина, выделенного из эритроцитов 18-дневных (А) и взрослых (Б) особей, антителами к белку CTCF. Результаты представлены в процентах от загрузочного контроля (input). Экзоны трех глобиновых генов главного локуса были использованы в качестве отрицательного контроля. Снизу показана схема локуса с предполагаемыми сайтами связывания CTCF. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение от величины среднего по трем независимым экспериментам.

Результаты, представленные на рисунке 18, показывают, что CTCF связывается с участками CBS 1, 2 и 4 в эритроидных клетках Danio rerio как до, так и после переключения эритропоэза с эмбрионально-личиночного на взрослый тип. При этом уровень связывания CTCF в этих участках превышает таковой в отрицательных контролях - экзонах глобиновых генов, в среднем примерно в 5 раз. Такой же уровень обогащения CTCF был показан для известного CTCF-связывающего сайта из гена лизоцима кур по сравнению с отрицательным контролем. Таким образом, мы продемонстрировали, что

80

CTCF локализован на сайтах связывания CBS 1, 2 и 4 на всех стадиях онтогенеза Danio rerio. В противоположность этому, для сайта CBS3 не было детектировано связывание с CTCF ни в эритроидных клетках 18-дневных личинок, ни в эритроидных клетках взрослых Danio rerio.

5.4 Анализ энхансер-блокирующего действия CBS4

Учитывая все данные, полученные нами в экспериментах с использованием техники 3С и иммунопреципитации хроматина, можно предположить, что участок связывания CTCF на границе между эмбрионально-личиночным и взрослым суб-локусами (CBS4) является CTCF-зависимым энхансер-блокирующим элементом, который обеспечивает функциональное разграничение главного локуса Danio rerio на два суб-локуса. Для проверки этого предположения был использован стандартный тест на энхансер-блокирующую активность (Recillas-Targa et al, 1999; Valadez-Graham et al., 2004). Было сконструировано несколько рекомбинантных плазмид, которые были транзиентно трансфецированы в эритроидные клетки. В базовой конструкции репортерный ген люциферазы находился под контролем промотора первого эмбрионально-личиночного глобинового гена главного локуса (на рисунке 19 отмечен как Pe1.1). Далее в конструкцию к 3'-концу от репортерного гена люциферазы был клонирован участок, включающий MRE, для которого ранее была показана энхансерная активность. Анализируемый фрагмент ДНК (CBS4) длиной 277 п.о. был встроен в генетическую конструкцию между репортерным геном и энхансером (рисунок 19). Чтобы предотвратить активирующее действие MRE в другом направлении между промотором и энхансером были встроены два сайта связывания ранее известного инсулятора FII из Р-глобинового локуса кур (Recillas-Targa et al., 2002).

После проведения трансфекции и измерения люциферазной активности были получены следующие результаты: MRE активировал экспрессию репортерного гена примерно в 5,5 раз, но после встраивания участка CBS4 между ним и промотором этот эффект был полностью подавлен (рисунок 19). Это подтверждает энхансер-блокирующее действие CBS4. Необходимо было подтвердить, что этот элемент не проявляет сайленсерной активности, для этого были созданы конструкции, в которых не было сайтов связывания инсулятора FII. В таком случае MRE мог избежать энхансер-блокирующего действия CBS4 и активировать промотор в другом направлении. В составе этих конструкций экспрессия люциферазы выросла в 5 раз, что подтверждает тот факт, что наличие элемента CBS4 не супрессирует MRE, а лишь препятствует осуществлению его энхансерной активности, при нахождении между MRE и промотором.

Рисунок 19. Анализ энхансер-блокирующей активности СТСЕ-связывающего участка СБ84 в экспериментах по транзиентной трансфекции эритроидных клеток кур кольцевыми конструкциями. Изучаемый фрагмент ДНК СБ84 длиной 277 п.о. (темно-серый прямоугольник) был встроен в генетическую конструкцию, которая содержит репортерный ген люциферазы светлячка (серый прямоугольник) под контролем промотора первого эмбрионально-личиночного глобинового гена главного локуса (светло-серая стрелка) и МКЕ (темно-серая стрелка). Для предотвращения активации промотора энхансером МКЕ в другом направлении перед промотором встроены два сайта связывания эритроидного инсулятора Ш. Справа, на диаграмме для каждой конструкции указана относительная люциферазная активность в клетках ИБ3. Активность репортерного гена люциферазы под контролем только промотора принята за единицу. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от среднего по трем независимым экспериментам.

5.5 Анализ пространственных взаимодействий между CTCF-связывающими сайтами

Напомню, что в экспериментах по фиксации конформации хромосом единственное

взаимодействие, которое было детектировано как до, так и после переключения

эритропоэза, - это контакт между MRE и CBS4. После обнаружения еще двух CTCF-

связывающих сайтов к 5'-концу от MRE, предполагалось очень интересным выяснить,

опосредован ли контакт между MRE и CBS4 взаимодействием между CTCF-

связывающими сайтами: к 5'концу от MRE (CBS1 и CBS2) и на границе между суб-

локусами (CBS4), или MRE связывается с участком на границе суб-локусов независимо от

CTCF-связывающих сайтов. Для ответа на поставленный вопрос нами была проведена

еще одна серия экспериментов 3С, в которых якорный праймер фиксировался на

рестриктном фрагменте, включающем CBS4 (якорный праймер «7»), а тест-фрагменты

82

включали МКЕ (тест-фрагмент «1»), СББ1 (тест-фрагмент «-2») и участок между ними (тест-фрагмент «-1»). Полученные данные, представленные на рисунке 20, показывают, что в эритроцитах 18-дневных личинок СББ1 и МЯБ взаимодействуют с СББ4 независимо друг от друга, так как сигнал 3С, который отражает взаимодействие между СББ4 и спейсерным участком между МЯБ и СББ1 значительно ниже, что означает выпетливание этого участка. В эритроцитах взрослых Бато гегго для всех тест-фрагментов («1», «-1» и «-2») был детектирован примерно одинаковый уровень межмолекулярного лигирования с СББ4, что означает, что все исследуемые геномные элементы и спейсерный участок между ними собираются в единый комплекс и взаимодействуют с друг другом.

Рисунок 20. Анализ пространственных взаимодействий CTCF-связывающих сайтов между собой и с MRE в эритроидных клетках. А - общая схема домена, показывающая расположение основных структурно-функциональных элементов, а также соответствующие им ЗС-праймеры. «Якорями» обозначены фрагменты, которые использовались в качестве якорных в одном из экспериментов. Б, В - результаты ЗС-анализа, проведённого с использованием эндонуклеазы рестрикции MboI, на эритроидных клетках Danio rerio после и до переключения, соответственно. По вертикальной оси отложена частота сшивки якорного фрагмента «7» с тестовыми, выраженная в относительных единицах. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от среднего по трём независимым экспериментам.

С учетом всех данных, полученных в предыдущих экспериментах, можно дополнить модель, представленную на рисунке 17, включив в нее сайт связывания CTCF. Становится очевидным, что взрослый и эмбрионально-личиночный суб-локусы главного локуса глобиновых генов Danio rerio являются независимыми генными кластерами,

которые активны на разных стадиях индивидуального развития и разделены СТСБ-связывающим энхансер-блокирующим элементом, при этом только взрослый суб-локус регулируется МКБ.

5.6 Анализ топологии главного локуса глобиновых генов Вато

гвпо

Нам представлялось интересным выяснить, связано ли переключение экспрессии глобиновых генов с какими-либо крупными изменениями топологии изучаемого геномного локуса. Для этого мы использовали метод 5С, который позволяет исследовать весь спектр пространственных взаимодействий в рамках выбранного участка генома. При проведении экспериментов 5С сначала готовят стандартную 3С библиотеку, после чего на ней проводят мультиплексный отжиг 5С-олигонуклеотидов, которые подбираются комплементарно концам рестриктных фрагментов таким образом, чтобы они при этом перекрывали половину сайта узнавания рестриктазы, которая была использована для приготовления ЗС-библиотеки (рисунок 21). Все 5С-олигонуклеотиды разбиваются на две группы: прямые и обратные, при этом рестриктные фрагменты, на которых отжигаются прямые и обратные олигонуклеотиды, чередуются между собой. Все прямые праймеры дефосфорилируют с 5'-конца, а обратные, наоборот, фосфорилируют с 5'-конца. Это необходимо для того, чтобы впоследствии могли лигироваться только праймеры противоположной ориентации (прямой+обратный). После отжига 5С-олигонуклеотиды лигируются с помощью термостабильной Taq ДНК-лигазы, в результате чего продукты лигирования рестриктных фрагментов ЗС конвертируются в продукты лигирования 5С-олигонуклеотидов, подобранных к этим фрагментам (рисунок 21). Библиотека лигированных 5С-олигонуклеотидов амплифицируется с помощью праймеров к универсальным последовательностям, которые располагаются по краям в составе олигонуклеотидов (ТЗ и Т7 последовательности), и подвергается глубокому секвенированию. Подсчет частот лигирования 5С-олигонуклеотидов позволяет построить двумерную карту топологии исследуемого региона. Для построения такой карты весь исследуемый участок разбивается на отдельные фрагменты, бины, которые в наших экспериментах составляют 5 тыс. п.о. На пересечении двух бинов представлено количество контактов между ними, выявленных посредством процедуры 5С. Построенную карту называют «тепловой картой» (ЬеаШар) пространственных взаимодействий, так как интенсивность красного на ней отражает частоту взаимодействий

между двумя участками генома - таким образом осуществляется визуализация матрицы контактов (рисунок 21).

Для нормировки результатов 5С мы применяли метод итеративной коррекции (Imakaev et al., 2012). Согласно этому методу предполагается, что все рестриктные фрагменты генома образуют одинаковое количество контактов, поэтому каждое значение матрицы контактов мы делили на сумму всех значений строки и столбца, в которых это значение находится. Этот способ позволяет учитывать различные технические артефакты метода, такие как переамплификация при подготовке библиотеки. Данные 5С размещены в базе данных GEO под номером GSE87604.

Глубокое секвенирование

Рисунок 21. Основные этапы 5С-анализа. Объяснения см. в тексте.

Для того, чтобы проанализировать данные, полученные методом 5С, мы разделили

главный локус глобиновых генов Danio rerio на два контактных локуса: CD1 (contact

domain 1) и CD2 (contact domain 2). Контактный локус 1 (CD1) включает в себя

глобиновые гены взрослого типа, а также MRE, так как ранее было показано, что он

взаимодействует с этими генами. Контактный локус 2 (CD2) содержит эмбрионально-

личиночный суб-локус глобиновых генов. Сначала мы посчитали распределение

плотности взаимодействий (количество 5С контактов) между кластером глобиновых генов

взрослого типа (показан розовой чертой снизу под картой взаимодействий) и участками к

5'-концу (фиолетовый пунктир очерчивает на тепловой карте область данных

85

взаимодействий) и 3'-концу (голубой пунктир очерчивает на тепловой карте область данных взаимодействий) от этих генов (рисунок 22).

Рисунок 22. Анализ данных 5С главного локуса глобиновых генов в эритроидных клетках 18-дневных (А), а также взрослых (Б) Бато гепо. Данные 5С нормированы на общее количество ридов, локус разбит на «бины» размером 5кБ, проведена итеративная коррекция. Контактные домены СБ1 и СБ2 соответствуют участкам главного локуса, которые включают в себя глобиновые гены взрослого типа и эмбрионально-личиночные глобиновые гены, соответственно. Под картами тепловых взаимодействий (А и Б) приведены схемы домена, показывающие расположение основных структурно-функциональных элементов; направления транскрипции глобиновых генов на них отмечены стрелками. В - распределение частот лигирования 5С между взрослыми глобиновыми генами главного локуса (на рисунках А и Б выделены розовой чертой) и оставшейся частью СБ 1 (на рисунках А и Б фиолетовая пунктирная линия) и СБ2 (на рисунках А и Б голубая пунктирная линия). Толстые черные линии показывают медианные значения. Звездочками отмечены достоверные различия, посчитанные с помощью одностороннего критерия Уилкоксона. (Г) Распределение частот лигирования 5С в рамках СБ1 и СБ2 в эритроидных клетках 18-дневных (синие боксплоты) и взрослых (красные боксплоты) Бато гепо. Количество пикселей в составе контактного домена указано снизу, под боксплотами. Толстые черные линии показывают медианные значения. Звездочками отмечены достоверные различия, посчитанные с помощью одностороннего критерия Уилкоксона

В эритроидных клетках 18-дневных Бато гегго до переключения эритропоэза глобиновые гены взрослого типа взаимодействуют с этими регионами с очень низкой

частотой, но переключение экспрессии глобиновых генов сопровождается значительными изменениями уровня взаимодействий внутри контактного локуса 1: во взрослых эритроцитах интенсивность взаимодействия между глобиновыми генами (розовая полоска) и остальной частью контактного локуса 1 (фиолетовый прямоугольник на тепловой карте) значительно возрастает (Р-уа1ие 7,6*10-4) (рисунок 22). По-видимому, это связано с формированием активаторного хроматинового хаба между МЯБ и промоторами глобиновых генов взрослого типа, которое было показано в экспериментах 3С с высоким разрешением. В то же время частота взаимодействия между глобиновыми генами взрослого типа и контактным локусом 2 (голубой прямоугольник на тепловой карте) остается на низком уровне (рисунок 22) на всех стадиях индивидуального развития.

В целом, переключение экспрессии глобиновых генов главного локуса приводит к обогащению контактного локуса 1 пространственными взаимодействиями по сравнению с количеством контактов в эритроидных клетках 18-дневных личинок (рисунок 22) (Р-уа1ие 0,027), и к формированию компактной хроматиновой глобулы. Напротив, эмбрионально-личиночный суб-локус обеднен пространственными взаимодействиями на всех стадиях индивидуального развития Бато тетю: частота взаимодействий внутри контактного локуса 2 остается на низком уровне как до, так и после переключения эритропоэза (рисунок 22). Это может означать, что эмбрионально-личиночный суб-локус находится в расправленной (линейной) конфигурации на всех стадиях онтогенеза.

Результаты 5С анализа позволяют заключить, что эмбрионально-личиночный и взрослый суб-локусы главного локуса Бато тетго в трехмерном пространстве устроены различным образом. При этом они изолированы друг от друга в пространстве ядра, особенно в эритроидных клетках взрослых рыб. Можно сказать, что суб-локусы главного локуса организованы в различные единицы топологии на уровне упаковки хроматина.

5.7 Анализ эпигенетических модификаций гистонов главного локуса

Мы предположили, что разделение главного локуса глобиновых генов Бато тетго на два суб-локуса может коррелировать с их различным эпигенетическим статусом в эритроидных клетках на разных стадиях индивидуального развития. Для проверки этого предположения мы исследовали распределение основных активирующих и репрессивных меток гистонов в эритроидных клетках. Мы использовали технику полногеномной иммунопреципитации нативного хроматина (К-СЫр) с антителами к панацетилированному гистону Н3, а также триметилированному по лизину 27 гистону Н3.

Для исследуемых модификаций гистонов обычно характерно распространение на десятки и сотни тысяч пар нуклеотидов вдоль геномной ДНК (Bickmore & Van Steensel, 2013; Calestagne-Morelli & Ausio, 2006; de Wit et al, 2008) и формирование протяженных участков, локусов, включающих в себя по несколько генов и расположенные между ними межгенные области, которые принято называть хроматиновыми доменами.

Для иммунопреципитации использовали хроматин, изолированный из эритроидных клеток 18-дневных и взрослых Danio rerio. Клетки лизировали, изолировали ядра и далее обрабатывали их микроккоковой нуклеазой. Для иммунопреципитации был выбран хроматин, представленный в виде моно-, ди- и тринуклеосом. Хроматин осаждали антителами к модифицированным формам гистонов H3panAC и H3K27me3. После депротеинизации и очистки ДНК было проведено глубокое секвенирование образцов.

В качестве отрицательного контроля, параллельно проводилась иммунопреципитация хроматина с антителами к иммуноглобулинам кролика (IgG). Нормирование полученных данных осуществлялось на «фоновый сигнал», в качестве которого использовался хроматин, не подвергавшийся иммунопреципитации (input). Данные ChlPseq размещены в базе данных GEO под номером GSE86548.

Панацетилирование гистона H3 маркирует активные участки генома и обычно формирует протяженные ацетилированные локусы, а не отдельные пики. Мы использовали два различных алгоритма, которые с помощью техники скользящего окна могут идентифицировать геномные фрагменты, обогащенные исследуемой хроматиновой меткой. Представленные на рисунке домены, обогащенные панацетилированным гистоном H3, были выявлены с помощью обоих использованных алгоритмов. Характер распределения панацетилированного гистона H3 очень сильно различается для эмбрионально-личиночного и взрослого суб-локусов (рисунок 23). В эритроцитах 18-дневных Danio rerio эмбрионально-личиночный суб-локус, в который входят активно транскрибирующиеся в этих клетках глобиновые гены, состоит из небольших сегментов с высоким уровнем ацетилирования Н3, которые соответствуют отдельным эмбрионально-личиночным генам, межгенные участки при этом не ацетилированы (рисунок 23). Во взрослом суб-локусе, который транскрипционно не активен до переключения эритропоэза, полностью отсутствует ацетилирование. Напротив, в эритроидных клетках взрослых Danio rerio ацетилирование полностью отсутствует в эмбрионально-личиночном суб-локусе, в то время как во взрослом суб-локусе детектируются три сегмента с высоким уровнем ацетилирования (рисунок 23). Самый большой из них включает в себя две пары глобиновых генов взрослого типа (aa1+Pa1), которые транскрибируются на этой стадии сильнее всего. Уровень ацетилирования в этом локусе примерно в 4 раза превышает

88

таковой для эмбрионально-личиночного суб-локуса до переключения эритропоэза. Необходимо отметить, что межгенные участки в рамках этого сегмента также ацетилированы. К 5'-концу от самого большого сегмента ацетилирования в границах взрослого суб-локуса располагается еще один, чуть меньший домен с высоким уровнем ацетилирования, включающий первую пару глобиновых генов взрослого типа (аа2+Ра2), транскрипция которых в исследуемых эритроидных клетках происходит на низком уровне. Уровень ацетилирования этого небольшого участка также значительно ниже, чем уровень ацетилирования в соседнем, более протяженном домене.

Рисунок 23. Рисунок 8. Результаты полногеномной иммунопреципитации нативного хроматина, выделенного из эритроцитов 18-дневных (сверху) и взрослых (внизу) особей Вато ггпо, антителами к панацетилированной форме гистона Н3. Черные прямоугольники под профилями соответствуют доменам, полученным с помощью обоих используемых алгоритмов. Под профилями показаны схемы домена, отображающие расположение основных структурно -функциональных элементов.

Небольшой сегмент с высоким уровнем ацетилирования Н3, который включает

СББ4, детектируется в эритроидных клетках как 18-дневных личинок, так и взрослых

Вате гвгю (рисунок 23). Также в обоих типах клеток есть небольшой сегмент

ацетилирования, соответствующий МКБ. Так как МКЕ сближен в пространстве только с

промоторами глобиновых генов взрослого типа главного локуса, а значит, скорее всего,

89

участвует в активации глобиновых генов только после переключения эритропоэза, ацетилированное состояние MRE в эритроидных клетках 18-дневных Danio rerio, скорее всего, говорит о его «подготовленном» «молчащем» состоянии.

В следующем цикле экспериментов мы исследовали распределение репрессивной модификации хроматина (триметилирование гистона Н3 по лизину 27) в главном локусе глобиновых генов Danio rerio. Известно, что именно эта модификация привлекает комплекс PRC1, играющий ключевую роль в установлении долговременной репрессии генов по ходу развития у высших эукариот (Lanzuolo & Orlando, 2012; Lewis, 1978; Pirrotta, 1998).

Результаты анализа распределения модификации H3K27me3 в главном кластере глобиновых генов Danio rerio в эритроидных клетках представлены на рисунке 24.

Рисунок 24. Результаты полногеномной иммунопреципитации нативного хроматина выделенного из эритроцитов 18-дневных (сверху) и взрослых (внизу) Вато ггпо, антителами к триметилированному по лизину 27 гистону Н3. Под профилями показаны схемы домена, показывающие расположение основных структурно-функциональных элементов.

Видно, что в главном кластере глобиновых генов формируются протяженные

области Н3К27те3, положение которых меняется в зависимости от стадии

индивидуального развития. В эритроидных клетках 18-дневных личинок Вато гегго

90

глобиновые гены взрослого суб-локуса образуют большой хроматиновый локус, который характеризуется триметилированием гистона H3 по 27-ому лизину (рисунок 24). Такой же локус образуют эмбрионально-личиночные глобиновые гены в эритроидных клетках взрослых особей (рисунок 24), где эти гены не активны. Это позволяет предположить, что стадиеспецифичная репрессия эмбрионально-личночных глобиновых генов и глобиновых генов взрослого типа в эритроидных клетках Danio rerio осуществляется при участии комплексов PRC 1.

6) ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эволюция и усложнение организмов сопровождаются постоянными изменениями в организации генома. Наряду с эволюцией белок-кодирующих последовательностей, огромный вклад в эти процессы вносит усложнение регуляторных систем. У позвоночных животных регуляторные элементы генома часто располагаются на значительных расстояниях друг от друга, что существенно повышает роль пространственной организации генома в осуществлении регуляторных функций.

Кластеры глобиновых генов являются классической моделью при изучении регуляции транскрипции и принципов трехмерной организации генома у позвоночных животных. Однако, несмотря на это, многие вопросы, связанные с регуляцией экспрессии глобиновых генов, до сих пор изучены недостаточно. Рассмотрение моделей эволюции глобиновых генов привело к пониманию того, что кластеры а- и Р-глобиновых генов современных теплокровных произошли от предкового локуса, в котором глобиновые гены были локализованы в одном локусе с геном домашнего хозяйства NPRL3 (Gillemans et al., 2003; Hardison, 2012; Hoffmann et al, 2012; Opazo et al., 2013). У современных птиц и млекопитающих этот локус включает в себя только а-глобиновые гены, которые находятся под контролем эволюционно-консервативного сильного эритроид-специфичного энхансера MRE, расположенного в одном из интронов гена NPRL3. При этом Р-глобиновые гены при транслокации в новый локус, скорее всего, были перенесены туда с собственными инсуляторами (Hardison, 2008). Происхождение этих инсуляторов может быть напрямую связано с сегрегацией предкового локуса глобиновых генов. Можно предположить, что такой локус состоял из относительно независимых генных кластеров.

В отличие от теплокровных, у костистых рыб наблюдается совсем другой тип организации локусов глобиновых генов: а- и Р-глобиновые гены образуют слитые

кластеры, и можно предположить, что как раз такая организация глобиновых генов была характерна для общего предка всех позвоночных. В связи с этим нам было интересно охарактеризовать устройство одного из локусов глобиновых генов костистых рыб.

В геноме тропической рыбы Danio rerio один из двух слитых кластеров глобиновых генов, так называемый главный локус, располагается к 3'-концу от гена NPRL3. Он состоит из двух суб-локусов, эмбрионально-личиночного и взрослого, гены в составе которых экспрессируются на разных стадиях индивидуального развития. Основной задачей нашего исследования представлялось охарактеризовать регуляцию экпрессии а- и Р-глобиновых генов главного локуса и механизмы переключения экспрессии с эмбрионально-личиночных генов на гены взрослого типа, проанализировать связанные с этим изменения в пространственной организации главного локуса на разных стадиях индивидуального развития Danio rerio, а также выявить геномные элементы, ответственные за эти изменения и эпигенетические модификации гистонов, характерные для активных и репрессированных глобиновых генов главного локуса.

В первую очередь в экспериментах по транзиентной трансфекции эритроидных клеток генетическими конструктами нами был охарактеризован регуляторный геномный элемент MRE, расположенный в пятом интроне гена NPRL3. Было показано, что этот геномный элемент обладает энхансерной активностью и в модельных экспериментах по транзиентной трансфекции в эритроидные клетки конструктов с репортерным геном способен стимулировать работу всех исследованных промоторов глобиновых генов главного локуса (промоторов генов как взрослого типа, так и эмбрионально-личиночных генов). Результаты, свидетельствующие о наличие регуляторного элемента в составе гена NPRL3 у костистых рыб, подтверждаются и в других работах. Так в геноме рыбы-фугу, для MRE, расположенного в пределах одного из интронов гена NPRL3, была показана эритроид-специфичная энхансерная активность, в отношении как а-, так и Р-глобиновых генов (Flint et al., 2001; Maruyama et al., 2007). Кроме того, ранее была охарактеризована функциональная активность MRE Danio rerio в экспериментах по инъекции ооцитов генетическими конструкциями, содержащими репортерный ген под контролем одного из промоторов, направляющих транскрипцию первой пары а- и Р-глобиновых генов главного локуса (Ganis et al., 2012). В рамках этой работы было продемонстрировано, что данный регуляторный элемент является энхансером глобиновых генов и, возможно, участвует в переключении эритропоэза. При этом в качестве регуляторного элемента рассматривался фрагмент ДНК протяженностью около 6000 п.н. (который может содержать целый ряд регуляторных элементов), и его активность была продемонстрирована только в отношении первого промотора, входящего в состав главного локуса глобиновых генов. Из

92

полученных нами данных следует, что уровень экспрессии этих генов невысок. Более того, наиболее вероятно, что один из них не является эритроид-специфичным (Ganis et al., 2012). С другой стороны, существенным достоинством цитированной работы явилось использование трансгенных линий рыб, у которых генетическая конструкция была стабильно интегрирована в геном, а использование GFP в качестве репортерного гена позволило локализовать сайт эритропоэза на анатомическом уровне. Однако, в этой работе активность MRE исследовали вне естественного геномного контекста, поэтому вывод об участии MRE в активации транскрипции и эмбрионально-личиночного и взрослого суб-локусов, а тем более в переключении эритропоэза, не является вполне обоснованным.

В нашей работе в экспериментах по трансфекции эритроидных клеток генетическими конструкциями было показано, что MRE больше всего усиливает транскрипцию глобиновых генов взрослого типа. Сильнее всего его энхансерная активность проявлялась в отношении промотора третьей пары глобиновых генов взрослого типа. Однако, мы показали, что MRE активирует, хотя и в меньшей степени, промоторы эмбрионально-личиночных глобиновых генов главного локуса (рисунок 12). Эти наблюдения могут означать, что МЯЕ в большей степени необходим для экспрессии глобиновых генов взрослого типа и в меньшей - для эмбрионально-личиночных глобиновых генов. С другой стороны, нельзя было исключить и то, что МЯЕ вообще не принимает участия в регуляции эмбрионально-личиночного суб-локуса в геномном контексте: в отсутствие геномного контекста эффект сглаживается, и мы наблюдаем асимметрию в действии МЯЕ.

Для проверки этой гипотезы нами был проведен анализ пространственных взаимодействий MRE с различными генами и межгенными участками главного локуса глобиновых генов в эритроидных клетках на разных стадиях индивидуального развития Вате гвпе. Было продемонстрировано, что MRE устанавливает пространственные контакты с промоторами глобиновых генов взрослого типа только в тех эритроидных клетках, где эти гены транскрибируются. Контактов MRE с эмбрионально-личиночными генами выявлено не было, в том числе и на личиночной стадии развития (18 дней после оплодотворения), когда эти гены транскрибируются. Это указывало на некую структурную сегрегацию главного локуса глобиновых генов Вате гвпе.

В последующих экспериментах мы продемонстрировали, что эта сегрегация осуществляется при участии CTCF-зависимого энхансер-блокирующего элемента, расположенного между взрослым и эмбрионально-личиночным суб-локусами главного локуса глобиновых генов. Если предковый локус глобиновых генов был устроен сходным

93

образом, то можно предположить, что наличие энхансер-блокирующего элемента позволило суб-локусам главного локуса сохранить определенную степень автономности при транслокации на другую хромосому.

Стоит отметить, что инсуляторы присутствуют в доменах глобиновых генов у разных организмов. Классическим примером инсуляторов являются инсуляторы домена Р-глобиновых генов кур (Recillas-Targa et al, 1999) и доменов Р-глобиновых генов других позвоночных животных (Razin et al, 2003). Однако, в литературе нет прямых указаний на то, что эти геномные элемент играют существенную роль в регуляции экспрессии Р-глобиновых генов, так как при их делеции не было отмечено никаких значительных изменений уровня их экспресии (Razin et al., 2003). В то же время стоить отметить, что биологическая роль инсуляторов необязательно связана с энхансер-блокирующей и барьерной активностями этих геномных элементов (см. раздел 3.7 литературного обзора). CTCF-связывающие сайты часто выполняет архитектурную роль (Kurukuti et al., 2006; Splinter, 2006). На этих же моделях глобиновых генов было показано, что при утрате, либо перемещении сайтов связывания CTCF происходит изменение пространственной конфигурации протяженного геномного сегмента, которое коррелирует со значительными изменениями в уровне экспресии глобиновых генов (Hanssen et al., 2017; Razin et al., 2007). Следуя этой логике рассуждения, можно предположить, что обнаруженный нами CTCF-зависимый энхансер-блокирующий элемент акцептирует на себя MRE, препятствуя его пространственным взаимодействиям с промоторами эмбрионально-личиночных глобиновых генов главного локуса Danio rerio.

При изучении трехмерной организации глобиновых генов других позвоночных животных было показано, что они имеют тенденцию формировать глобулярные структуры (Bau et al., 2011; Sanyal et al, 2011) (рисунок 25), которые способствуют взаимодействию регуляторных геномных элементов между собой и формированию активаторных хроматиновых блоков (de Laat & Grosveld, 2003). Так, домен а-глобиновых генов кур формирует глобулярную структуру в эритроидных клетках HD3 как до, так и после терминальной эритроидной дифференцировки, которая, в свою очередь, приводит к значительному увеличению количества контактов внутри домена (Razin et al., 2007). Наша работа позволила проследить эту тенденцию на более ранних этапах эволюции. С использованием техники 5С мы показали, что только взрослый суб-локус главного локуса глобиновых генов Danio rerio образует компактную глобулярную структуру в эритроидных клетках как до, так и после переключения эритропоэза (рисунок 22). Необходимо отметить, что в эритроидных клетках взрослых рыб частота лигирования внутри взрослого суб-локуса существенно возрастает (рисунок 22), что, по-видимому,

94

связано с формированием активаторного хроматинового блока, включающего в себя MRE и глобиновые гены взрослого типа. Формирование и поддержание такой глобулярной структуры, скорее всего, происходит благодаря взаимодействию между CTCF-связывающими сайтами, которые фланкируют локус, включающий в себя глобиновые гены взрослого типа и MRE. В то же время, для эмбрионально-личиночного суб-локуса характерна низкая частота пространственных взаимодействий на всех стадиях индивидуального развития (рисунок 22). Это, скорее всего, связано с тем, что для экспрессии эмбрионально-личиночных генов не требуются дополнительные регуляторные геномные элементы, так как им достаточно своих промоторов. В связи с этим эмбрионально-личиночный суб-локус имеет расправленную конфигурацию (для него характерно отсутствие специфических взаимодействий между геномными элементами). Такие различия в пространственной организации отражаются в распределении панацетилированного гистона H3 в суб-локусах: участки между глобиновыми генами ацетилированы только во взрослом суб-локусе из-за формирования хроматиновой глобулы (рисунок 23) (Razin & Vassetzky, 2017), в то время как для эмбрионально-личиночного суб-локуса характерно наличие отдельных небольших сегментов панацетилирования, совпадающих с позициями активных глобиновых генов (рисунок 23).

При исследовании точечных взаимодействий между регуляторными геномными элементами с помощью техники 3С нами было подтверждено, что MRE не взаимодействует в пространстве с промоторами эмбрионально-личиночных глобиновых генов Danio rerio ни на одной из исследованных стадий онтогенеза (рисунок 16). Хотя, как уже говорилось выше, это может быть связано с высокой активностью собственно промоторов, нельзя исключить и того, что у эмбрионально-личиночных генов есть дополнительные, не известные в настоящий момент энхансеры. Например, в домене а-глобиновых генов кур, помимо главного регуляторного элемента (MRE) также были обнаружены энхансеры глобиновых генов, которые расположены внутри гена TMEM (Philonenko et al., 2009), а также с 3'-конца глобинового локуса (Knezetic & Felsenfeld, 1989; Recillas-Targa et al, 1993), которые входят в состав активаторного хроматинового хаба, формирующегося в эритроидных клетках (Gavrilov & Razin, 2008). Однако, учитывая имеющиеся на сегодняшний день данные о полногеномном распределении сайтов связывания эритроид-специфичных транскрипционных факторов Danio rerio, мы не обнаружили подходящих кандидатов на роль потенциальных регуляторных элементов эмбрионально-личиночного суб-локуса. Это согласуется с тем, что по результатам 5С для этого суб-локуса характерна расправленная конфигурация.

Из всего сказанного можно заключить, что экспрессия глобиновых генов эмбрионально-личиночного суб-локуса Вато тетю, скорее всего, контролируется только промоторами этих генов. Это отличает глобиновые гены исследуемого организма от глобиновых генов млекопитающих, у которых и эмбрионально-личиночные глобиновые гены, и глобиновые гены взрослого типа стадиеспецифично регулируются одними и теми же энхансерами (ёе Ьаа1 & ОгоБуеЫ, 2003; Уегшшшеп й а1., 2007). Однако, у птиц экспрессия эмбрионального а-глобинового гена п контролируется только промотором этого гена. Промотор этого гена содержит сайты связывания эритроид-специфичных транскрипционных факторов GATA-1, Sp1, №1, и в экспериментах по транзиентной трансфекции в куриные эритробласты экспрессия репортерного гена под контролем данного промотора гена п практически не зависела от того, какой энхансер находился в составе плазмиды (3" -энхансер домена альфа-глобиновых генов или RSV-энхансер из вируса саркомы Рауса). Из этого можно заключить, что вся информация, необходимая для регуляции работы промотора гена п содержится в нуклеотидной последовательности самого промотора, которая представляет собой промотор-энхансерный блок (Knezetic & БеЬепАеЫ, 1993). В согласии с этим заключением было продемонстрировано, что данный промотор не контактирует с удаленным энхансером МЯЕ (Gavrilov & Razin, 2008). Не контролируется удаленным энхансером (областью контроля локуса) и ранне-эмбриональный Р-глобиновый ген кур (Ulianov et а1, 2012).

С использованием метода иммунопреципитации хроматина мы продемонстрировали, что стадиеспецифичная репрессия эмбрионально-личиночного и взрослого суб-локусов главного локуса глобиновых генов Вато тетго коррелирует с внесением в гистоны модификации (И3К9ше3), привлекающей репрессорный комплекс РЯС1 (рисунок 24). Репрессия глобиновых генов при посредстве комплекса белков РЯС1 в неэритроидных клетках уже была ранее показана для локуса а-глобиновых генов человека (ватек е; а1., 2008).

На основании полученных данных нами предложена модель эволюции трехмерной организации локусов глобиновых генов: мы предполагаем, что линейный сегмент главного локуса глобиновых генов, включающий в себя эмбрионально-личиночные глобиновые гены, частично или полностью был утрачен по ходу эволюции (Коуша е; а1., 2017), так как глобиновые гены других позвоночных организованы в глобулярные структуры, как и глобиновые гены взрослого типа в составе главного локуса глобиновых генов Вато тетю (рисунок 25). Некоторые черты более примитивной организации кластеров глобиновых генов, когда экспрессия эмбриональных генов не контролируется МКБ, сохранились у птиц (ОаугПоу & 2008; ИНапоу е; а1., 2012).

Рисунок 25. Эволюция трехмерной организации глобиновых генов позвоночных.

Эмбрионально-личиночные глобиновые гены и глобиновые гены взрослого типа обозначены как светло-серые и темно-серые круги, соответственно. Главный регуляторный элемент главного локуса глобиновых генов Danio rerio, а также а-глобиновых генов курицы и мыши, показан в виде красного шестиугольника. Область контроля локуса Р-глобиновых генов теплокровных показана в виде нескольких красных прямоугольников. CTCF-связывающие сайты показаны темно-синими овалами. Пространственная организация а-глобинового домена мыши до переключения экспрессии не изучена на сегодняшний день. Остальные схемы пространственной организации глобиновых доменов адаптированы из (Gavrilov & Razin, 2008; Tolhuis et al., 2002; Ulianov et al., 2012; Zhou et al., 2006).

7) ВЫВОДЫ

1) В пятом интроне гена ЫРЯЬЗ Бапго гвгго картирован энхансер, который является гомологом главного регуляторного элемента кластеров а-глобиновых генов теплокровных животных. Показано, что этот энхансер участвует в регуляции экспрессии глобиновых генов взрослого типа, но не эмбрионально-личиночных глобиновых генов в составе главного локуса Бато гвгго.

2) Продемонстрировано, что суб-локусы главного локуса глобиновых генов Бато гвгго, содержащие глобиновые гены взрослого и эмбрионально-личиночного типов, разделены CTCF-связывающим энхансер-блокирующим элементом, который участвует в установлении функционально-значимой конфигурации домена.

3) Продемонстрировано, что содержащий глобиновые гены взрослого типа суб-локус главного локуса глобиновых генов Бато гвгго организован в хроматиновую глобулу в эритроидных клетках взрослых рыб, в то время как эмбрионально-личиночный суб-локус имеет расправленную конфигурацию на эмбрионально-личиночной и взрослой стадиях индивидуального развития.

4) Продемонстрировано, что профили ацетилирования гистонов в границах эмбрионально-личиночного и взрослого сублокусов главного локуса глобиновых генов Бато гвгго существенно различаются.

5) Продемонстрировано, что в главном локусе глобиновых генов Бато гвгго стадиеспецифичная репрессия глобиновых генов взрослого и эмбрионально-личиночного типов осуществляется при участии эпигенетической модификации гистонов, которая может привлекать репрессорный комплекс PRC1.

1. Adams, M. D. (2000). The Genome Sequence of Drosophila melanogaster. Science, 257(5461), 2185-2195.

2. Agalioti, T., Lomvardas, S., Parekh, B., Yie, J., Maniatis, T., & Thanos, D. (2000). Ordered Recruitment of Chromatin Modifying and General Transcription Factors to the IFN-P Promoter. Cell, 103(4), 667-678.

3. Alipour, E., & Marko, J. F. (2012). Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes. Nucleic Acids Research, 40(22), 11202-11212.

4. Anguita, E., Johnson, C. A., Wood, W. G., Turner, B. M., & Higgs, D. R. (2001). Identification of a conserved erythroid specific domain of histone acetylation across the alpha-globin gene cluster. Proceedings of the National Academy of Sciences,M 98(21), 12114-12119.

5. Ansari, S. A., & Morse, R. H. (2013). Mechanisms of Mediator complex action in transcriptional activation. Cellular and Molecular Life Sciences, 70(15), 2743-2756.

6. Antoniani, C., Meneghini, V., Lattanzi, A., Felix, T., Romano, O., Magrin, E., Weber L, Pavani G., El Hoss, S., Kurita, R., Nakamura, Y., Cradick, T.J., Lundberg, A.S., Porteus, M., Amendola, M., El Nemer, W., Cavazzana, M., Mavilio, F., Miccio, A. (2018). Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human P-globin locus. Blood, 131(17), 1960-1973.

7. Aoyagi, N., & Wassarman, D. A. (2000). Genes encoding Drosophila melanogaster RNA polymerase II general transcription factors: diversity in TFIIA and TFIID components contributes to gene-specific transcriptional regulation. The Journal of Cell Biology, 150(2), F45-50.

8. Arnold, C. D., Gerlach, D., Stelzer, C., Boryn, L. M., Rath, M., & Stark, A. (2013). Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science, 339(6123), 1074-1077.

9. Baeuerle, P. A., & Baltimore, D. (1988). Activation of DNA-binding activity in an apparently cytoplasmic precursor of the NF-kB transcription factor. Cell, 53(2), 211-217.

10. Banerji, J., Olson, L., & Schaffner, W. (1983). A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy chain genes. Cell, 33(3), 729-740.

11. Banerji, J., Rusconi, S., & Schaffner, W. (1981). Expression of a P-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell, 27, 299-308.

12. Bank, A. (2006). Regulation of human fetal hemoglobin: new players, new complexities. Blood, 107(2), 435-443.

13. Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.-Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G.,

99

Chepelev I., Zhao, K. (2007). High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell, 129(4), 823-837.

14. Battulin, N., Fishman, V. S., Mazur, A. M., Pomaznoy, M., Khabarova, A. A., Afonnikov, D. A., Prokhortchouk, E.B., Serov, O. L. (2015). Comparison of the three-dimensional organization of sperm and fibroblast genomes using the Hi-C approach. Genome Biology, 16(1), 77.

15. Bau, D., Sanyal, A., Lajoie, B. R., Capriotti, E., Byron, M., Lawrence, J. B., Dekker, J., Marti-Renom, M. A. (2011). The three-dimensional folding of the a-globin gene domain reveals formation of chromatin globules. Nature Structural & Molecular Biology, 18(1), 107-114.

16. Beagan, J. A., Duong, M. T., Titus, K. R., Zhou, L., Cao, Z., Ma, J., Lachanski, C.V., Gillis, D R., Phillips-Cremins, J. E. (2017). YY1 and CTCF orchestrate a 3D chromatin looping switch during early neural lineage commitment. Genome Research, 27(7), 11391152.

17. Beauchemin, H., & Trudel, M. (2009). Evidence for a bigenic chromatin subdomain in regulation of the fetal-to-adult hemoglobin switch. Molecular and Cellular Biology, 29(6), 1635-1648.

18. Beisel, C., & Paro, R. (2011). Silencing chromatin: comparing modes and mechanisms. Nature Reviews. Genetics, 12(2), 123-135.