Оптимизация технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Мостовская, Елена Викторовна

• Мостовская, Елена Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мостовская, Елена Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Технологические особенности получения иммуноглобулинов для внутривенного введения и их характеристики.

1.1. Методы получения внутривенных иммуноглобулинов.

1.2. Состав и параметры лекарственных форм иммуноглобулинов для внутривенного введения.

1.3. Методы определения содержания мальтозы.

1.4. Качественные характеристики препаратов иммуноглобулина для внутривенного введения.

1.5. Методы удаления пирогенов и инактивации вирусов, содержащихся в препаратах внутривенных иммуноглобулинов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Материалы и методы исследований.

Глава 3. Разработка технологии получения стабильной жидкой формы мономерного внутривенного иммуноглобулина.

3.1. Выбор оптимального значения рН.

3.2. Определение концентрации натрия хлорида.

3.3. Оценка влияния различных стабилизаторов на качество готового препарата.

3.4. Определение условий обработки препарата мальтозой.

3.5. Разработка технологической схемы получения жидкой стабильной формы иммуноглобулина для внутривенного введения.

3.6. Разработка качественной и количественной реакций для определения содержания мальтозы в препарате.

Глава 4. Изучение качественных показателей и стабильности внутривенных иммуноглобулинов различного производства.

4.1. Исследование молекулярных параметров и антикомплементарной активности.

4.2. Содержание анти-А, анти-В гемагглютининов,

§А,

§Е и распределение субклассов

4.3. Титры специфических и аутоантител.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения»

Актуальность проблемы исследования. Среди широкого спектра иммунобиологических препаратов внутривенные иммуноглобулины занимают одно из ведущих мест. Препараты иммуноглобулинов являются высокоэффективным, безопасным и широко используемым средством лечения и профилактики многих инфекционных заболеваний [1].

Рынок препаратов нормальных и специфических ВВИТ постоянно расширяется. В России зарегистрирован ряд отечественных и зарубежных препаратов, большинство из которых получено ферментативной или химической модификацией — иммуноглобулин для внутривенного введения (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «ИмБио», Нижний Новгород), иммуновенин (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат», Уфа), сандоглобулин (Novartis, Швейцария), интраглобин (Biotest, ФРГ) и др. К числу нативных ВВИТ, зарегистрированных в России, относятся октагам (Octapharma AG, Австрия), Ig Vena N I.V. (Farma-Biagini, Италия), Gamimune N (США), габриглобин (ОСПК, Иваново), имбиоглобулин (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «ИмБио», Нижний Новгород).

Согласно рекомендациям ВОЗ, препараты ВВИТ должны максимально сохранять интактную структуру молекулы, иметь длительный полупериод полувыведения и близкое к естественному распределение субклассов IgG [117]. Нативные ВВИТ наиболее полно удовлетворяют данным требованиям, поскольку, в отличие от модифицированных, обладают более высокой биологической и функциональной активностью как Fe-, так и Fab-фрагментов молекул и более продолжительным периодом полувыведения из организма.

Препараты иммуноглобулина для внутривенного введения различаются величиной pH, составом стабилизаторов, ионной силой, стабильностью при хранении, уровнем антител разной специфичности.

К основным показателям качества ВВИТ относится не только эффективность их применения, но и безопасность, обусловленная низкой АКА, отсутствием или минимальным содержанием агрегатов, димеров и фрагментов, а также нежелательных примесей, таких как ^А, изогемагглютинины. Обсуждается вопрос о безопасности применения препаратов ВВИТ с повышенным содержанием 1&Е [141].

Технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения должна обеспечивать не только соответствие препарата вышеуказанным требованиям, но и стабильность данных показателей при хранении и транспортировке. Лиофилизация позволяет продлить срок годности препарата и обеспечивает большую стабильность. Однако время приготовления раствора ВВИТ из лиофилизированной формы может быть достаточно продолжительным [47]. Кроме того, антикомплементарная активность препаратов может резко повышаться после сублимационного ^ высушивания [6]. Жидкая форма является более экономичной, удобной для потребителя, однако она требует особого контроля стабильности препарата во время хранения и транспортировки.

Поскольку оценить стабильность качественных характеристик ВВИТ можно только в процессе хранения его в течение установленного срока годности, актуальным является использование при разработке препарата специальных ускоренных тестов, имитирующих условия хранения и транспортировки. В литературе описаны методы, воспроизводящие хранение препарата в течение двух лет [9] и условия транспортирования [94]. Их использование позволяет изучить влияние каждого параметра технологического процесса на стабильность лекарственной формы.

Сохранение параметров иммуноглобулина обеспечивается внесением в препарат определенных стабилизирующих агентов, которые требуют обязательного контроля за их содержанием в готовой лекарственной форме. Однако, контроль отдельных стабилизирующих веществ затруднителен в связи с отсутствием доступных специфических методов их определения.

Процесс изготовления ВВИГ нередко сопровождается потерей или снижением содержания отдельных подклассов [48]. Технологический процесс получения препарата должен обеспечивать максимальную сохранность всех субклассов поскольку антитела к различным видам возбудителей относятся к определенным субклассам что является особенно важным при производстве специфических иммуноглобулинов, например, против цитомегаловируса [73].

Для оценки сохранности антител в процессе производства ВВИГ Р. Ма1е^зсЬик е1 а1. (2002) рекомендуют определять титр антител к возбудителям наиболее распространенных среди населения инфекций, таких как цитомегаловирус, вирус герпеса или гриппа [115].

Кроме того, рекомендуется оценивать уровень антител к НВзА§, что позволяет обеспечивать определенную вирусологическую безопасность ВВИГ. Экспертами ВОЗ рекомендовано ограничить нижний предел содержания антител к НВбА§ величиной 0,1 МЕ/мл, с целью инактивации возможно присутствующих вирусных частиц гепатита В [15]. Определение титра антител к HBsAg до настоящего времени не внесено в отечественную ФС на иммуноглобулин для внутривенного введения.

Согласно требованиям Европейской Фармакопеи, технология получения ВВИГ должна содержать одну или несколько специальных стадий вирусной инактивации. Другой проблемой, существующей при производстве иммуноглобулина для внутривенного введения, является пирогенность отдельных серий препарата. Поэтому перед разработчиками возникает задача выбора способов инактивации вирусов и устранения присутствующего в препарате пирогена, не оказывающих негативного влияния на качественные характеристики готового препарата.

Таким образом, разработка технологии получения стабильной жидкой формы отечественного нативного препарата ВВИГ, максимально удовлетворяющего требованиям Европейской Фармакопеи, остается актуальной. Использование тестов на ускоренное старение и перемешивание позволяет проанализировать влияние каждого параметра производства препарата на его стабильность. На основании вышеизложенного была сформулирована цель и определены задачи настоящего исследования.

Цель исследования. Оптимизировать технологический процесс производства иммуноглобулина для внутривенного введения для получения жидкой формы нативного препарата и провести его сравнительный анализ с отечественными и зарубежными образцами.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать технологическую схему производства внутривенного иммуноглобулина для получения стабильной жидкой лекарственной формы, приготовить экспериментально-производственные серии препарата и представить необходимую нормативно-техническую документацию в Департамент здравоохранения МЗ РФ.

2. Определить оптимальную величину рН и содержание хлорида натрия раствора иммуноглобулина, обеспечивающие стабильность показателя антикомплементарной активности, молекулярных параметров и титров антител препарата во время хранения.

3. Подобрать стабилизатор физико-химических параметров иммуноглобулина и разработать метод качественного и количественного контроля содержания выбранного стабилизатора в готовой лекарственной форме.

4. Провести сравнительный анализ полученного внутривенного иммуноглобулина и ряда отечественных и зарубежных препаратов по основным качественным показателям: антикомплементарной активности и молекулярным параметрам.

5. Оценить содержание нежелательных примесей - ^Е и гемагглютининов в препаратах внутривенных иммуноглобулинов.

6. Изучить распределение субклассов и уровень антител к возбудителям бактериальных и вирусных инфекций в различных препаратах иммуноглобулина для внутривенного введения.

Научная новизна. Разработана технологическая схема производства стабильной жидкой формы препарата нативного иммуноглобулина для внутривенного введения иммуновенин-М.

Предложен оригинальный метод определения мальтозы в препаратах внутривенного иммуноглобулина, сочетающий неспецифическую количественную реакцию на редуцирующие вещества с хроматографическим разделением Сахаров.

Установлено, что падение титра антител к цитомегаловирусу после ускоренного старения корреляционно связано с возрастанием агрегации в препарате.

Выявлена корреляционная связь между уровнем титров антицитомегаловирусных антител и содержанием димеров в препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Найдена корреляция между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Показана зависимость между величиной титра антител к тиреоглобулину и уровнем антител к цитомегаловирусу и вирусу герпеса 8-го типа.

Практическая значимость работы. Адаптированные методы определения изогемагглютининов, антител к HBs-антигену и оригинальный способ качественной идентификации и количественного определения мальтозы используются с 1.10.02 г. в цехе препаратов крови и ОБТК Уфимского филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» для стандартизации иммуноглобулина и внесены в нормативно-техническую документацию на препарат иммуновенин-М.

Проведен комплексный сравнительный анализ ряда отечественных и зарубежных препаратов внутривенных иммуноглобулинов, зарегистрированных в России, показавший преимущества того или иного препарата по содержанию IgA, IgE, гемагглютининов, содержанию антител к различным возбудителям и распределению субклассов IgG. Показано, что препарат иммуновенин-М соответствует требованиям Европейской Фармакопеи.

Внедрение результатов исследования в практику. Стабильная жидкая форма препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, получившего название «Иммуновенин-М», прошла контроль отдела биологического и технологического контроля, его экспериментально-производственный выпуск с 09.2002 г. начат цехом препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе.

Нормативно-техническая документация на препарат иммуновенин-М направлена для утверждения в Департамент здравоохранения РФ.

Модифицированный метод определения изогемагглютининов и адаптированный способ анализа анти-HBs антител для препаратов внутривенных иммуноглобулинов внесены в проект фармакопейной статьи предприятия на препарат иммуновенин-М.

Предложенный оригинальный метод определения содержания мальтозы включен в проект фармакопейной статьи предприятия на препарат иммунове'нин-М, а также в фармакопейные статьи предприятия на препарат габриглобин-IgG производства ЗАО «Иммуно-Гем», Челябинской областной станции переливания крови и Свердловской областной станции переливания крови.

Предложен метод расчета результатов реакции связывания комплемента при определении антикомплементарной активности иммуноглобулинов с использованием стандартных компьютерных программ Excel и Statistika (StatSoft Inc., USA), который используется в цехе препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе и в лаборатории иммуноглобулинов ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизирована технологическая схема производства иммуноглобулина для внутривенного введения, позволяющая получать стабильную жидкую форму нативного препарата, который характеризуется:

- величиной рН 5,5;

- содержанием натрия хлорида менее 0,2 %;

- стабилизатором - мальтозой в концентрации 10 %. Технологическая схема производства включает:

- инкубацию полуфабриката иммуноглобулина с мальтозой при 30 °С (для получения нормального внутривенного иммуноглобулина) или при 37 °С (для производства специфического антицитомегаловирусного иммуноглобулина для внутривенного введения);

- стадии инактивации вирусов и депирогенизации, не ухудшающие свойства препарата.

2. Сравнительный анализ отечественных и зарубежных препаратов продемонстрировал соответствие разработанного иммуноглобулина требованиям Европейской Фармакопеи. Иммуновенин-М отличается высоким содержанием мономерного иммуноглобулина G, низким уровнем IgA и гемагглютининов.

3. Обнаружена корреляция между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (Москва, 2003) и научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).

Апробация проведена на заседании Ученого совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (научного отдела) филиала ФГУП

НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе 10.12.2003 г. (протокол № 11) и на заседании секции Ученого совета «Медицинская биотехнология» ГУ «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ» 16.03.2004 г. (протокол № 2).

Раздел исследований по получению экспериментально-производственных серий препарата иммуновенин-М выполнен в цехе препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе совместно с начальником цеха препаратов крови к.м.н. Г.Б. Кудашевой и микробиологом И.А. Корниловой.

Раздел работы, посвященный исследованию тиров антител к различным возбудителям в препаратах внутривенных иммуноглобулинов выполнен совместно с сотрудником цеха препаратов крови к.б.н. В.В. Хабибуллиной.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Мостовская, Елена Викторовна

116 Выводы

1. Оптимизирована технологическая схема производства иммуноглобулина для внутривенного введения, позволяющая получить жидкую стабильную форму препарата с высоким содержанием мономерного Производственный процесс включает стадии уменьшения антикомплементарной активности, инактивации вирусов и удаления пирогена.

2. Определены оптимальные значения величины рН и концентрации хлорида натрия, обеспечивающие стабильность препарата иммуноглобулина для внутривенного введения по антикомплементарной активности, молекулярным параметрам и содержанию антител различной специфичности.

3. Подобран стабилизатор (мальтоза) и условия его внесения в препарат, предложен оригинальный метод контроля мальтозы в растворе иммуноглобулина, сочетающий хроматографическое разделение Сахаров и неспецифическую количественную реакцию на редуцирующие вещества.

4. Проведенный сравнительный анализ отечественных и зарубежных препаратов продемонстрировал соответствие разработанного иммуноглобулина требованиям Европейской Фармакопеи. Полученный препарат обладал минимальным содержанием агрегатов и фрагментов среди исследованных жидких форм внутривенных иммуноглобулинов и низкой антикомплементарной активностью, составившей (0,3 ± 0,2) СН50/мг белка.

5. По уровню нежелательных примесей (1§А, 1§Е, гемагглютининов) исследованные препараты внутривенного иммуноглобулина были условно разделены на три группы, характеризующиеся низким, средним или высоким их содержанием. Количество данных примесей в препарате иммуновенин-М было незначительным.

6. Полученный препарат после искусственного старения и воспроизведения условий транспортировки был наиболее стабильным среди исследованных жидких форм внутривенных иммуноглобулинов по содержанию антител различной специфичности. Распределение субклассов IgG в препарате иммуновенин-М было близким к их распределению в нормальной плазме крови.

7. Выявлена сильная корреляционная связь (коэффициент корреляции >0,7; Р<0,05) между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Препараты иммуноглобулинов находят широкое применение для лечения больных, страдающих врожденными и приобретенными иммунодефицитами, гипогаммаглобулинемий, тяжелыми формами бактериально-токсических и вирусных инфекций, послеоперационными осложнениями, сопровождающимися бактериемией и септическим состоянием. В настоящее время на Российском рынке существует ряд отечественных и зарубежных ВВИТ, которые различаются технологиями производства (нативные и модифицированные), формой выпуска (жидкие и лиофилизированные), стадиями вирусной инактивации и депирогенизации. Вследствие различия технологических процессов получения данные препараты имеют различный уровень биологической и функциональной активности.

На основании многочисленных исследований безопасности и эффективности применения ВВИТ были выработаны общие требования к технологии получения и качественным характеристикам немодифицированной формы ВВИТ, которые наиболее полно отражены в Европейской Фармакопее [9].

К сожалению, в настоящее время отечественные препараты ВВИГ уступают зарубежным по следующим критериям: соответствие требованиям Европейской Фармакопеи; наличие специальной стадии инактивации вирусов; обеспечение контроля большинства компонентов, входящих в конечный состав препарата.

Поэтому проблема разработки технологии получения ВВИГ, обеспечивающей при высокой лечебной эффективности препарата его максимальную толерантность при внутривенном введении, остается актуальной.

На качество ВВИГ оказывают влияние технологические особенности его получения: величина рН препарата [43, 87, 152, 154], его ионная сила [79, 136], состав стабилизаторов и способы их внесения в препарат [7], наличие специальных стадий инактивации вирусов и депирогенизации. Поэтому при разработке технологии получения стабильной жидкой формы ИГ для внутривенного введения мы обратили особое внимание именно на эти моменты.

Поскольку значение рН препаратов ВВИГ оказывает существенное влияние на АКА, молекулярные параметры, Рс-функции, а также на стабильность [116, 143, 152, 153], первым этапом исследования стал выбор оптимального значения рН препарата. С этой целью были приготовлены экспериментальные серии ВВИГ с различной величиной рН: 4,0; 5,0; 5,5; 6,2; 7,0 и проанализированы в тестах на искусственное старение.

Анализ молекулярных параметров приготовленных ВВИГ показал, что среди свежеприготовленных образцов агрегаты отсутствовали, содержание димеров было менее 5 %, а мономеров - более 95 % в препаратах с величиной рН 4,0; 5,0 и 5,5. При этом минимальное содержание димеров и максимальное - мономеров было отмечено в препарате с величиной рН 4,0. Однако в испытательных тестах на искусственное старение оптимальным оказался препарат с величиной рН 5,5, поскольку после воспроизведения условий транспортировки в нем было отмечено минимальное содержание агрегатов и фрагментов, а после ускоренного старения - максимальное содержание мономерной фракции, по сравнению с другими исследуемыми образцами.

По способности спонтанно активировать систему комплемента все свежеприготовленные экспериментальные серии соответствовали требованиям Европейской Фармакопеи, при этом наиболее низкой АКА обладали препараты с величиной рН 4,0 и 5,5. После ускоренного старения препарат со значением рН 7,0 стал обладать значительной АКА - более 2 СН50/мг белка, при норме не более 1 СН50/мг. Следовательно, при хранении данный препарат склонен к спонтанному увеличению АКА выше допустимого предела. 1.Р.МсСие е1 а1. (1986) и 8.Вагапёип е1 а1. (1962) также сообщают об образовании агрегатов в ИГ с физиологическим значением рН, которое, по их мнению, может стать причиной спонтанной активации комплемента [45, 116].

При разработке технологии получения нормального ВВИТ нас интересовала возможность использования данной технологии и для производства специфического антицитомегаловирусного иммуноглобулина, поэтому все приготовленные экспериментальные серии ВВИТ были проанализированы на сохранность антител к цитомегаловирусу в процессе искусственного старения. Было обнаружено, что наибольшей стабильностью титров АТ к ЦМВ обладал препарат с величиной рН 5,5. После ускоренного старения снижение титра АТ в нем составило всего 11,0 %, при падении его уровня на 63,2 % при величине рН 5,0; на 38,4 % - при величине рН 6,2 и на 42,1 % - при величине рН 7,0. В препарате со значением рН 4,0, наоборот, наблюдалось значительное повышение титра анти-ЦМВ АТ после искусственного старения. Возможно, подобное повышение титра анти-ЦМВ АТ можно объяснить определенными конформационными измененниями структуры молекулы ИГ при кислом рН. Подобное явление описано С.ЗсИгетег е1 а1. (1998) [154], которые связывали появление ложно-положительных реакций на наличие АТ к вирусу гепатита С в препарате gamimune N с величиной рН 4,25 с наблюдаемыми гидрофобными конформационными изменениями (усилением гидрофобности).

Таким образом, сравнительный анализ препаратов с различным значением рН выявил преимущества ВВИТ, формулированного при величине рН 5,5, как по стабильности базовых показателей качества - АКА и молекулярных параметров, гарантирующей его безопасность, так и специфической активности - титров антицитомегаловирусных антител, обеспечивающей эффективность препарата.

В связи с необходимостью определения возможного расширения диапазона рН при производстве ВВИТ по данной схеме, были приготовлены экспериментальные серии препарата со значениями рН от 5,1 до 6,1 с шагом 0,2 единицы.

Все приготовленные серии соответствовали требованиям Европейской Фармакопеи по уровню АКА как до, так и после искусственного старения. По распределению молекулярных параметров в исходных и подвергнутых тесту на перемешивание препаратах также не наблюдалось особого отличия.

После ускоренного старения в препаратах с величиной рН 5,1 и 6,1 было отмечено возрастание агрегации. Кроме того, уровень фрагментации в образце со значением рН 5,1 был максимальным. В связи с этим диапазон допустимых значений рН при производстве ВВИТ по данной схеме был ограничен величинами 5,3 и 5,9.

Другим фактором, влияющим на свойства ВВИТ, является концентрация хлорида натрия в препарате. Содержание NaCl существенно сказывается на переносимости ВВИТ [19, 163]. Еще в 1949 г. Oncley et al. выяснили, что хлорид натрия является причиной агрегации, мутности, понижения титров АТ в препаратах внутривенного иммуноглобулина. Ионная сила влияет и на степень взаимодействия антитела с антигеном [79]. В то же время, проблема влияния концентрации натрия хлорида на качественные характеристики ВВИТ мало изучена.

Для определения оптимальной концентрации NaCl были приготовлены экспериментальные серии ВВИТ с различным его содержанием: 0; 0,3; 0,6; 0,72; 0,9. Изотоничнось раствора поддерживалась добавлением недостающего количества мальтозы, которая одновременно выполняла роль стабилизатора.

В качестве стабилизатора также использовался глицин в концентрации 0,1 М, поскольку добавление в препарат 0,1 М глицина в сочетании с 10 % мальтозы способствует увеличению прозрачности раствора и препятствует образованию преципитатов при хранении и в тесте на термостабильность [112].

При производстве ВВИТ существует серьезная проблема самопроизвольного возрастания АКА препаратов при хранении. Поэтому, согласно рекомендациям S. Barandun, Н. Isliker (1986), была проанализирована возможность использования следовых количеств пепсина для предотвращения помутнения раствора, возрастания АКА, появления агрегатов, увеличения содержания димеров во внутривенном иммуноглобулине [45]. Пепсин добавлялся в препарат в дозах 1:105 и 1:106.

Проведенный сравнительные анализ экспериментальных серий ВВИТ показал, что наилучшими качественными характеристиками обладали препараты следующего состава:

- обработанный пепсином в дозе 1:106 и содержащий в качестве стабилизаторов 10 % мальтозы и 0,1 М глицина, без добавления NaCl (содержание димеров -3,8 %, мономеров - 96,2 %, АКА - 0 СН50/мг белка);

- не обработанный пепсином и содержащий единственный стабилизатор - мальтозу в конечной концентрации 10 %, без добавления NaCl (содержание димеров - 5,0 %, мономеров - 95,0 %, АКА - 0,1 СН50/мг белка).

Исследование титров анти-ЦМВ AT в анализируемых препаратах выявило их наименьшее изменение после искусственного старения во ВВИТ, не подверженном пепсиновой обработке и не содержащем NaCl, стабилизированном мальтозой в концентрации 10 %. Падение титра AT против ЦМВ после ускоренного старения составило в нем 10,8 %, при его падении на 41,3 % в препарате, обработанном пепсином в дозе 1:106 и содержащем в качестве стабилизаторов 10 % мальтозы и 0,1 М глицина, без добавления NaCl.

Таким образом, анализ молекулярных параметров, АКА и сохранности антицитомегаловирусных AT после искусственного старения показал преимущества немодифицированного пепсином препарата ИГ, ф содержащего в качестве стабилизатора мальтозу в концентрации 10 %, с минимальным содержанием натрия хлорида.

Во ВВИТ, подверженных пепсиновой обработке, стабильность титра анти-ЦМВ антител наилучшим образом поддерживалась добавлением ИаС1 в концентрации 0,72 %. При этом снижение титра составило 13,5 % при дозе пепсина 1:105 и 14,6 % при дозе пепсина 1:106. Однако, препарат, обработанный пепсином в дозе 1:106, отличался более низкой АКА и более высоким содержанием мономерной фракции. Поэтому, как один из вариантов производства специфического антицитомегаловирусного ИГ, можно рекомендовать обработку полуфабриката пепсином в дозе 1:106 в присутствие 2 % мальтозы с последующим добавлением натрия хлорида до концентрации 0,72 %.

В ходе анализа обнаружилась сильная корреляционная связь между * содержанием димеров и титром АТ к ЦМВ в свежеприготовленных обработанных пепсином препаратах (ц=0,847±0,019; п=5; Р<0,05). Следовательно, можно предположить, что повышение титра анти-ЦМВ АТ в данных препаратах ВВИТ связано с возрастанием содержания в них димеров. Полученные результаты подтверждаются данными Т.Ь. УаББПеу е1 а1. (1995), показавшими, что обогащение ВВИТ димерами приводит к возрастанию антительной активности [174].

Далее была исследована возможность использования различных стабилизаторов при производстве внутривенного иммуноглобулина. Итогом анализа молекулярных параметров, АКА и титров АТ к ЦМВ в препаратах, содержащих различные стабилизаторы, стало подтверждение того, что оптимальным является использование мальтозы в концентрации 10 % в качестве единственного стабилизатора без добавления других стабилизирующих агентов (пепсина, глицина, маннита, сорбита).

По данным многих исследователей, внесение в препарат мальтозы в концентрации 10 % способствует снижению антикомплементарной активности. Обработка препаратов мальтозой осуществляется в разных ф условиях: при различных температурах, концентрациях мальтозы, времени инкубации [76, 112, 124, 125].

В связи с этим были проанализированы различные способы обработки препарата мальтозой. Результатом данного анализа стал вывод о том, что при производстве препарата нормального ВВИТ с величиной рН 5,5, стабилизированного мальтозой в концентрации 10 %, инкубацию следует проводить при температуре 30 °С (рисунок 12-1). Если же данная технология будет использована для производства специфического антицитомегаловирусного ИГ для внутривенного введения, то инкубацию препарата с мальтозой необходимо проводить при температуре 37 °С для лучшей сохранности титров АТ к цитомегаловирусу (рисунок 12-2).

Согласно Европейской Фармакопее 2000 г. в технологический процесс производства ВВИТ должна быть включена хотя бы одна стадия ^ вирусной инактивации. Инкубация препарата при кислом значении рН для инактивации вирусов получила широкое распространение. Этот способ прост и не требует внесения в препарат химических реагентов и последующего их удаления. Наиболее жестким режимом обработки ИГ при кислом значении рН является его выдерживание в течение 21 суток при температуре 27 °С.

Нами была проанализирована возможность использования данного метода инактивации вирусов для разрабатываемого препарата ВВИТ. Поскольку сравнительный анализ препаратов, полученных из одного полуфабриката с использованием и без использования данной стадии вирусной инактивации не выявил существенных различий их качественных характеристик, в технологическую схему получения ВВИТ была включена стадия инактивации вирусов путем выдерживания полуфабриката после добавления в него мальтозы в течение 21 дня при температуре 27 °С.

При масштабировании разработанной технологии в условиях производства возникла проблема пирогенности некоторых из приготовленных серий ВВИГ при полном их соответствии требованиям ф ФСП по молекулярным параметрам, АКА и другим показателям качества.

Существуют литературные данные о том, что выстаивание препаратов в течение нескольких месяцев приводит к разрушению небактериального пирогена, что во многих случаях позволяет использовать их в дальнейшем [34]. Анализ изменения уровня пирогена в изначально пирогенных сериях ВВИГ при их выстаивании в холодильнике при температуре 2-8 °С в течение 12 суток показал, что содержание пирогена в препарате достигало допустимого уровня через 6 суток после начала выстаивания и не возрастало в дальнейшем. Данный способ очень прост и не требует введения в препарат химических реагентов и их последующего удаления, а также не оказывает негативного влияния на свойства препарата.

Таким образом, была разработана технология получения стабильной жидкой формы препарата ВВИГ, позволяющая полностью отказаться от ^ использования пепсина. Препарат содержит единственный стабилизатор мальтозу в концентрации 10 %. Инкубация с мальтозой проводится при температуре 30 °С (при производстве нормального ВВИГ) или при 37 °С (при производстве специфического антицитомегаловирусного ВВИГ).

Завершающим этапом получения препарата перед стерилизующей фильтрацией и розливом является выдерживание его при температуре 2-8 °С в течение недели с целью депирогенизации.

В связи с тезисом об обязательной идентификации всех веществ, добавленных в препарат, или остающихся в нем после технологической обработки [9] возникла необходимость внесения в проект ФСП качественного и количественного методов контроля содержания мальтозы в готовом препарате.

На сегодняшний день для специфического определения концентрации мальтозы существуют только два метода: ферментативный, с использованием тест-систем с иммобилизованным ферментом мальтазой, которые выпускаются только зарубежными производителями [105] и достаточно дороги, и хроматографический, который требует наличия специального оборудования, что не позволяет использовать его повсеместно. Поэтому был разработан метод контроля содержания мальтозы в препарате, основанный на сочетании неспецифической количественной реакции на редуцирующие вещества с хроматографическим разделением Сахаров.

В проект ФСП на препарат иммуновенин-М, помимо метода контроля за содержанием мальтозы, были внесены методы определения концентрации антител к HBsAg и изогемагглютининов.

Далее был произведен комплексный сравнительный анализ препарата иммуновенин-М и 8-ми ВВИТ различного производства: интраглобин, октагам, Ig Vena N.I.V., цитотект, имбиоглобулин, сандоглобулин, габриглобин, иммуновенин. Технология получения оказывает существенное влияние на качественные характеристики внутривенного иммуноглобулина.

Анализ молекулярных параметров выявил преимущества нативных препаратов над модифицированными. По содержанию мономеров препарат иммуновенин, отличающийся их максимальным содержанием (85,4 %) среди исследованных модифицированных ВВИТ, уступал октагаму, в котором содержание мономерной фракции было минимальным среди нативных ВВИТ (89,8 %). Кроме того, модифицированные препараты отличались повышенным содержанием димеров, которое, по данным W.K. Bleeker et al. (2000), может быть причиной побочных реакций [52]. Также было выдвинуто предположение о том, что именно наличие стадии сольвент-детергентной обработки в технологии получения ВВИТ октагам ухудшает его качественные характеристики.

По уровню АКА все проанализированные препараты ВВИТ соответствовали требованиям Европейской Фармакопеи.

Титры гемагглютининов в проанализированных сериях ВВИТ, зарегистрированных в РФ, а также в препарате иммуновенин-М были минимальны, намного ниже критического уровня 1:32 [9]. Следовательно, данные препараты могут быть использованы без риска возникновения гемолитических реакций, опосредованных анти-А или анти-В -антителами.

Одной из причин возникновения побочных реакций при инфузии ВВИТ является анафилаксия, которая может возникать у IgA-дефицитных пациентов. Поэтому в ходе исследования было определено содержание IgA в анализируемых препаратах ВВИТ. На основании полученных данных, препараты были условно разделены на 4 группы: со следовым (до 10 мкг/мл) - Ig Vena; с низким (менее 300 мкг/мл) - октагам, имбиоглобулин, иммуновенин, иммуновенин-М; со средним (300-350 мкг/мл) - габриглобин, сандоглобулин; с высоким (до 2500-5000 мкг/мл) - интраглобин и цитотект, содержанием IgA. Таким образом, ВВИТ Ig Vena является наиболее безопасным для IgA-дефицитных больных.

Разработанный ВВИТ иммуновенин-М относится к группе препаратов с низким содержанием IgA, и может быть использован с незначительным риском для лечения больных с дефицитом IgA.

Существуют сообщения о том, что обогащение ВВИТ IgE может вызывать побочные реакции немедленного и замедленного типа [141]. Поэтому во всех исследуемых ВВИТ был определен уровень IgE.

По содержанию IgE проанализированные препараты ВВИТ были условно разделены на три группы: с низким (25-45 МЕ/мл) иммуновенин, Ig Vena N.I.V., имбиоглобулин, сандоглобулин; средним (45100 МЕ/мл) - октагам, иммуновенин-М и высоким (более 100 МЕ/мл) -габриглобин уровнем IgE. Таким образом, препараты первых двух групп наиболее безопасны при лечении больных, склонных к аллергическим реакциям.

При производстве ВВИГ необходимо стремиться к тому, чтобы содержание подклассов IgG в препарате было аналогично их распределению в плазме крови. Использование различных технологий при получении ВВИГ, нередко сопровождается потерей или снижением содержания отдельных подклассов IgG [48]. Поэтому все анализируемые препараты ВВИГ были исследованы на распределение субклассов IgG.

Оно оказалось максимально близким к распределению в нормальной плазме в препаратах габриглобин, октагам, иммуновенин-М. Внутривенные иммуноглобулины сандоглобулин, Ig Vena, имбиоглобулин, цитотект и интраглобин отличались пониженным содержанием IgG3 субкласса. Исследователями W.Stephan, Н. Dichtelmuller (1983) и R. Rufenacht, А. Morell (1991) также был зарегистрирован низкий уровень IgG3 в препарате интраглобин [152, 162]. Среди субклассов иммуноглобулина G IgG3 является самым сильным активатором системы комплемента [10], вероятно поэтому препараты Ig Vena N.I.V., цитотект и интраглобин, обладали минимальной АКА. Более высокая АКА препарата сандоглобулин, видимо, обусловлена повышенным содержанием в нем IgGl, который также является сильным активатором комплемента. В обработанных пепсином препаратах иммуновенин и сандоглобулин отмечалось пониженное содержание IgG2, что согласуется с данными G.Robert (1989) о том, что обработка пепсином приводит к снижению уровня субкласса IgG2 [149]. O.E. Beck, P.E. Kaiser (1981) также отмечали пониженное содержание IgG2 в препарате сандоглобулин [48]. Препараты иммуновенин и сандоглобулин отличались повышенным содержанием IgGl.

Таким образом, анализ содержания IgA, IgE и распределения субклассов IgG показал, что разработанный препарат иммуновенин-М по данным показателям не уступает большинству исследованных ВВИГ, зарегистрированных на российском рынке и может быть использован с меньшим риском для лечения больных, склонных к аллергическим реакциям и IgA-дефицитных больных.

Эффективность препаратов ВВИГ определяется содержанием в них AT к различным видам возбудителей. Поэтому во всех анализируемых препаратах были определены титры AT к вирусу простого герпеса, герпес-вирусу человека 8-го типа, вирусу краснухи, антигенам Chlamydophila pneumoniae и Chlamydophila psittaci, Chlamydia trachomatis, цитомегаловирусу, HBs-антигену вируса гепатита В, вирусу Эпштейна-Барр, антигенам рода Trichomonas (Trichomonas vaginalis, Trichomonas tenax), вирусу гепатита A.

Было отмечено, что подвергнутый химической модификации с использованием бета-пропиолактона ВВИГ интраглобин обладал пониженным содержанием AT к большинству проанализированных возбудителей по сравнению с другими исследованными препаратами. J. Romer et al. (1982) также указывали на то, что в результате химического преобразования получают продукты с хорошей толерантностью в отношении внутривенного введения, однако это всегда сопровождается значительным снижением биологической активности [150].

В препаратах ВВИГ были также определены титры аутоантител к денатурированной и неденатурированной ДНК человека и к тиреоглобулину.

Анализ титров антител к различным бактериальным и вирусным антигенам в рассматриваемых ВВИГ показал, что максимальные титры AT к большинству исследованных инфекций наблюдались в препаратах Ig Vena N.I.V., габриглобин и октагам. Однако именно в этих ВВИГ был отмечен самый высокий уровень титров аутоантител.

Одним из основных критериев применения лекарственных препаратов является их эффективность, в частности, ВВИГ должны обладать высокой специфической активностью по отношению к возбудителям инфекций. Разработанный препарат иммуновенин-М по содержанию AT к большинству проанализированных инфекций уступал только трем вышеперечисленным препаратам. При этом уровень титров аутоантител в нем был низким. Иммуновенин-М отличался максимальным ф титром AT к вирусу простого герпеса среди всех проанализированных препаратов, а по содержанию AT к ЦМВ он уступал только габриглобину и имбиоглобулину. Это является свидетельством того, что данная технология может быть использована для производства специфических антицитомегаловирусного и противогерпетического внутривенных иммуноглобулинов.

В ходе анализа полученных данных была обнаружена сильная корреляционная связь (коэффициент корреляции от 0,7 до 1,0) между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина. Вероятно, одна из коррелирующих инфекций может стать тестовой, и по титру антител к ней можно будет судить о величине титров антител к другим коррелирующим инфекциям. Это позволит назначать препараты ВВИТ не только по узким показаниям, для лечения конкретной инфекции, но и для терапии смешанных инфекций.

Также была выявлена сильная корреляционная связь между титрами антител к некоторым возбудителям и уровнем титров аутоантител в препаратах внутривенных иммуноглобулинов. Так, корреляция наблюдалась между титром AT к тиреоглобулину и титрами AT к ЦМВ, вирусу герпеса 8-го типа и Trichomonas vaginalis, а также между титрами AT к денатурированной и неденатурированной ДНК и титрами AT к вирусу краснухи, Эпштейна-Барр, HBsAg, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae.

Поскольку сырьем для получения исследованных ВВИТ была неспецифическая плазма, то возрастание аутоантительной активности в них нельзя связывать с повышенным содержанием AT к определенному fl' виду возбудителей инфекции. Следовательно, можно предположить, что на величину аутоантительной активности препаратов оказывают влияние технологии их получения.

Обнаруженная зависимость между уровнем специфической активности и содержанием аутоантител в препаратах внутривенного иммуноглобулина может стать дополнительным критерием их качества, однако эти данные требуют дальнейшего углубленного изучения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мостовская, Елена Викторовна, 2004 год

1. Анастасиев В.В. Иммуноглобулин для внутривенного введения. — Н. Новгород: Изд-во НГМА. 2000.- С. 168.

2. Анастасиев В.В., Змачинская Т.Б., Короткова Т.В., Ефремова JI.M. Пирогенные вещества в препаратах внутривенных иммуноглобулинов // Вестник службы крови России. 2002. - № 2. - С. 35-37.

3. Герасимова JI.M. Изменение молекулярного состава 41* иммуноглобулинов в процессе хранения // Иммуноглобулины: Сб. науч. тр.

4. НГМИ.-Н. Новгород. 1993.-С. 41-45.

5. Гольдина O.A., Кузнецова Ю.С., Иванова Т.Г. и др. Химические реактивы и высокочистые химические вещества. // Каталог. — 3-е изд., М.: «Химия». 1990.-688 с.

6. Громов А.Е., Климова H.H. Исследование зависимости между специфической активностью иммуноглобулина антирезус и степенью агрегации белковых молекул // Гематология и трансфузиология. 1985. -№ 2. - С.60-61.

7. Доронина H.A., Сарафанова Л.Н., Мигунов В.Н. и др. Влияние стабилизирующих добавок на антикомплементарную активность иммуноглобулина. // Иммуноглобулины. Сб. науч. трудов. Под редакцией В.В.Анастасиева. Изд-во Нижегородского мединститута. 1993.- С. 69.

8. Доссон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика, fr М.: «Мир». 1991. -544 с.

9. Европейская Фармакопея, изд. III-2000., V.2.6.20, монография щ №0918.

10. Змушко Е.И., Белозеров Е.С., Митин Ю.А. Клиническая иммунология: руководство для врачей. СПб: «Питер». - 2001. - 576 с.

11. Исрафилов А.Г., Лютов А.Г., Кудашева Г.Б., Баталова Т.А., Еникеева С.А. Способ депирогенизации препаратов ультрафильтрацией. // RU 2122463, НПО «Иммунопрепарат». 27.11.1998.

12. Камышников B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. Справочник: Т. 2. 2-е изд. - Мн: Интерпрессервис, 2003. -С. 10-13.

13. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. Сер. техн. докл. Женева. - 1992. - 786. - Докл. 39. - С. 168.

14. Часть 2 Уфа: НПО «Иммунопрепарат». - 1995. - С.68-73.

15. Кузмичева В.А., Шинкоренко А.И. Влияние стабилизирующих добавок на антикомплементарную активность иммуноглобулина. // Иммуноглобулины. Сб. науч. трудов. Под редакцией В.В.Анастасиева. Изд-во Нижегородского мединститута. 1993. - С. 69.

16. Маркин С.А. Клиническая осмометрия и онкометрия. // Российский журнал анестезиологии и интенсивной терапии. 1999. - № 2. - С. 2-5.

17. Мартин Т.Д. Вопросы применения вводимого внутривенного иммуноглобулина. // Терапевтический архив. 1996. - № 10. - С. 83-86.

18. Молодовская Э.В., Квасова Н.К., Веселкова Л.А. Опыт внедрения новых технологий в производство препаратов крови // Иммуноглобулины и другие препараты крови: Сб. науч. тр. ГМИ. Горький. - 1986. - С. 83-88.

19. Поляков И.В., Соколова Н.С. Практическое пособие по медицинской статистике, Л: «Медицина». 1975. - С. 103.

20. Практикум по биохимии. Под ред. Н.П. Мешковой и С.Е.Северина. М.: Изд-во Моск. ун-та. - 1979.- С. 38-39.

21. Пушкина H.H. Биохимические методы исследования. Руководство ^ для врачей-гигиенистов и профпатологов. М: Государственноеиздательство медицинской литературы. 1963.

22. Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. М : «Медицина». 1983. — С. 19.

23. Савкина М.А., Киселева И.А., Анастасиев В.В. Использование методов хроматографии для очистки иммуноглобулина от биологически активных примесей // Хроматография в биологии и медицине: Сб. науч. тр. -М.- 1983.-С. 34-35.

24. Скоуп Р. Методы очистки белков. М.: «Мир». - 1985. — С. 312.

25. Степаненко Б.Н. Курс органической химии. М.: Высшая школа. -1966.- С. 551.

26. Тодоров Иордан. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. Перевод под редакцией Г.Г. Газенко. Государственноеff издательство «Медицина и физкультура», София. 1963. - С.498-505.

27. Тукачинский С.Е. К вопросу о стабилизации иммуноглобулиновых препаратов // Прикладная биохимия и микробиология. 1981. - Т. 13. — С. 45-49.

28. Фром A.A., Скобелев Л.И., Русанов В.М., Никитенко A.A. Белки плазмы и их фракционирование в производстве препаратов крови. М: «Медицина». 1974. - С. 18.

29. Хабибуллина В.В. Разработка способа получения препарата иммуноглобулина человека против цитомегаловируса. // Диссертация канд. биол. наук. М. - 2003. - С.80.

30. Чаусовский С.Ш. Применение полярографического метода в контроле качества некоторых избранных групп лекарственных средств. // Диссертация канд. мед. наук. М. - 1971.

31. Чичибабин А.Е. Основные начала органической химии. М.: Щ- «Госхимиздат». 1963.- 912 с.

32. Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П. Аутоантитела к ДНК и иммуноферментный метод их определения. // Иммуноферментный анализ в диагностике заболеваний. Сб. трудов Центрального НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. 1989. - С. 111.

33. Abuaf N., Laperche S., RaJoely B.et al. Autoantibodies to phospholipids and to the coagulation proteins in AIDS. // Thrombosis and Haemostasis. -1997. V. 77. - № 5. - P. 856-861.

34. Ahrens U.E. Method for the preparation of a gamma globulin solution suitable for intravenous use. // US4312949, Blutspendedienst det Landesver. -Jan. 26, 1982.

35. Ahsan N., Palmer B.F., Wheeler D., Greenlee R.G.Jr, Toto R.D. Intravenous immunoglobulin-induced osmotic nephrosis. // Arch. Intern. Med. -1994.-V. 12.-№ 154 (Suppl 17).-P. 1985-7.

36. Alarcon-Segovia D., Llorente L. Antibody penetration into living cells, IV: different effects of anti-native DNA and anti-ribonucleoprotein IgG on the cell cycle of activated T cells. // Clin. Exp. Immunol. 1983. - V. 52. -P.365-371.

37. Anderson W., Bethea W. Renal lesions following administration of hypertonic solutions of sucrose. // Jama. 1940. - V. 114. - P. 1983-1987.

38. ASHP therapeutic guidelines for intravenous immune globulin. Commission on therapeutics. // Clinical Pharmacy. 1992. — V. 11. - № 2. -P. 117-136.

39. Bakimer R., Fishman P., Blank M. et al. Induction of primary antiphoapholipid syndrome in mice by immunization with a human monoclonal anticardiolipin antibody (H-3). // J. Clin. Invest. 1992. - V. 89. - P. 1558.

40. Barandun S., Isliker H. Development of immunoglobulin preparations for intravenous use. // Vox. Sang. 1986. - V. 5. - P. 157-160.

41. Barfield W., Gardner R., Lett S., Johnsen C. Congenital rubella reinfection in mother with anti-cardiolipin and anti-platelet antibodies. // Pediatr. Infect. Dis. J. 1997. - V. 16. - № 2. - P. 249-251.

42. Barucha C., McMillan J.C. Eczema after intravenous infusion of immunoglobulin. // British Medical Journal, 1987.- V. 295.- P. 1141.

43. Beck О. E., Kaiser P. E. Distribution of human IgG subclasses in commercial intravenous immunoglobulin preparations. A rate nephelometric method. // Vox. Sang. 1981. - V. 41. - № 2. - P.79-84.

44. Berg G., Matzkies F. Effect of maltose, following long-term intravenous infusion, on the metabolism. // Z. Ernahrungswiss. 1976. -V. 15. - P. 255-262.

45. Berg G., Matzkies F., Kellner R. Maltose as a substrate for inducing osmotic diuresis. // Arzneimittelforschung. 1977. - V. 27. - P. 2174-2176.

46. Bjorkander J., Cunningham-Rundles C., Lundin P. et al. Intravenous immunoglobulin prophylaxis causing liver damage in 16 of 77 patients with hypogammaglobulinemia or IgG subclass deficiency. // Am J Med., 1988. -V.84.-P. 107-111.

47. Bouvet J.O., Stahl D., Rose S., Quan C.P., Kazatchkine M.D., Kaveri S.V. Induction of natural autoantibody activity following treatment of human immunoglobulin with dissociating agents. // Journal of Autoimmunity. 2001. -V. 16.-P. 163-172.

48. Branigan E.F., Stevenson M.M., Charles D. Blood transfusion reaction in patient with immunoglobulin A deficiency. // Source Obstet Gynecol, 1983.-V.61 (Suppl 3).- P.47-49.

49. Bridonneau P., Marcilly H., Vernois-Martin M. et al. Liquid ^ pasteurization of an immunoglobulin preparation without stabilizer: effects on itsbiological and biochemical properties. // Vox. Sang. — 1996. V. 70. - № 4. — P. 203-209.

50. Brox A.G., Cournoyer D., Sternback M., et al. Hemolytic anemia following intravenous gamma globulin administration.// Am. J. Med., 1987. -V. 82.-P. 633-635.

51. Bucholc B., Banach W., Wysokinska T., Cieslik A., Chodorowska M. Evaluation of antibacterial and antitoxic activity of normal human immunoglobulin for intravenous use. // Med. Dosw. Microbiol. — 1996. -V. 48.-P. 87-94.

52. Burks A.W., Sampson H.A., Buckley R.H. Anaphylactic reaction in common variable agammaglobulinemia (CVA): detection of IgE and IgG antibodies in an ELISA assay // Alergy and Clin. Immunol. 1985. - V. 75. -№1.-P. 335.

53. Cantu T.G., Hoehn-Saris E.W., Burges K.M. et al. Acute renal failure associated with immunoglobulin therapy. // Am. J. Kidney Dis. 1995. — V.25. -№2.-P. 228-234.

54. Cohn E., Strong L., Hughes W. Preparation and properties of serum and plasma proteins // J. Amer. Chem. Soc. 1946. - V. 68. - P. 459.

55. Comenzo R., Malachowski M.E., Meissner H.C., et al. Immune hemolysis, disseminated intravascular coagulation, and serum sickness afterp' large doses of immune globulin given intravenously for Kawasaki disease. // J.

56. Pediatr., 1992. -V 120. P. 926-928.

57. Copelan E.A., Strohm P.L., Kennedy M.S. et al. Hemolysis following ^ intravenous immune globulin therapy. // Transfusion 1986. V. 26. - P. 410-412.

58. Coppola G., Bertolini J., Devies J.R. Pasterization of immunoglobulin solutions. // WO 9803550, CSL LTD. Jan. 29, 1998.

59. Cunningham-Rundles C., Zhou Z., Mankarious S., Courter S. Long-term use of IgA-depleted intravenous immunoglobulin in immunodeficient subjects with anti-IgA antibodies. //J Clin Immunol., 1993.- V.13. P. 272-278.

60. D'Aetlio R., Nisini R., Matricardi P.M. et al. Evaluation of the presence of RF-like activities in immunoglobulin preparations for intravenous use. II. IgG and IgA anti-IgG in intravenous Ig. // J. Clin. Lab. Immunol. 1987. - V. 24. -№ 3. -P.139-142.

61. Decocq G., de Cagny B., Andrejak M., Desablens B. Acute kidney failure secondary to intravenous immunoglobulin administration. 4 cases and review of the literature. // Therapie. 1996. - V. 51 (Suppl 5). - P. 516-526.

62. Dichtelmuller H., Stephan W., Prince A.M., Gurtler L., Deinhardt F. Inactivation of HIV in plasma derivatives by beta-propiolactone and UV irradiation. // Infection. 1987. - V. 15. -№ 5. - P. 367-369.

63. Dichtelmuller H., Stephan W. Monitoring o sterilization procedures for plasma derivatives using bacteriophages. // Immun. Infect. 1988. - V. 16. -№ 1. - P. 18-20.

64. Dolhofer R., Siess E.A., Wieland O.H. Nonenzymatic glycation of immunoglobulins leads to an impairment of immunoreactivity. // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1985. - V. 366. - № 4. - P. 361-366.

65. Erhan S., Greller L.D. Do immunoglobulins have proteolytic activity? // Nature. 1974. - V. 251, № 5473. - P. 353-355.

66. Friedli H. Problems in the development of immunoglobulin preparations. // Beitr Infusionther.- 1989. V. 24. - P. 95-101.

67. Gao F, Prince A M, Pascual D, Horowitz B. Enhancement in the safety p of immune globulins prepared from high risk plasma. // Vox. Sang. - 1993.1. V. 64. № 4. - P. 204-209.

68. Gao Y., Wang P., Tajima A., Matsumura M. Physical and biological studies on DNA/anti-DNA immune complex formed in vitro. // Cytotechnology. 1997.-V. 25.-P. 165-167.

69. Gehringer W., Selosse P. Method for the preparation of virus-inactivated Immunoglobuline solutions. // EP 0525502, Octapharma AG. Feb. 3, 1993.

70. Gluck P., Stephen L. Acid-base. // Lancet. 1998. - V. 352. -p. 474-476.

71. Gordon J.M., Cohn P., Finlayson J.S. Levels of anti-A and anti-B in commercial immune globulins. //Transfusion 1980.-V.20.- P. 90-92.

72. Gronski P., Kanzy E.J., Ronneberger H.J., Geursen R., Seiler F.R. Quality criteria for I.V. immunoglobulins: importance of tests and product properties. // Develop. Biol. Standard. S. Karger, Basel. 1987. - V. 67. -P. 239-256.

73. Haase M., Mengel H. Bacterial antibodies and isoagglutinins in intravenous immunoglobulin preparations. // Immunitaet und Infektion 1983.-V. 11.-P. 135-139.

74. Hamalainen E., Suomela H., Ukkonen P. Virus inactivation during intravenous immunoglobulin production. // Vox Sang. 1992. - V. 63. -P. 6-11.

75. Handsfield H.H., Wandell M., Goldstein L., Shriver K. Screening and ♦ diagnostic performance of enzyme immunoassay for antibody tolymphadenopathy-associated virus. // Journal of clinical microbiology. — 1987. 1. P. 879-884.

76. Hansen-Schmidt S., Silomon J., Keller F. Osmotic nephrosis due to high-dose immunoglobulin therapy containing sucrose (but not with glycine) in a patient with immunoglobulin A nephritis. // Am. J. Kidney Dis. 1996. - V. 28 (Suppl 3).-P. 451-453.

77. Hao I., Ingham K., Wickerhauser A. Fractional precipitation of proteins with polyethylene glycol // In: Methods of plasma protein fractionation. -1980. Ed. Curling. - P. 57-74.

78. Harry R., Hill M.D., Nancy Hogan Augustine B.S., Ann O'Neill Shigeoka M.D. Comparative opsonic activity of intravenous gamma globulin preparations for common bacterial pathogens. // American Journal of Medicine. 1984. -V. 30. - P.61-66.

79. Haskin J.A., Warner D.J., Blank D.U. Acute renal failure after largedoses of intravenous immune globulin. // Ann. Pharmacother. 1999. - V. 33. -P. 800-803.

80. Heimer H. Outer causes inner conflicts: environment and autoimmunity. // Environ Health Perspect. 1999. - V. - № 10. - P. 504-509.

81. Henin Y., Marechal V., Barre-Sinoussi F. et al. Inactivation and partition of human immunodeficiency virus during Kistler and Nitschmann fractionation of human blood plasma. // Vox. Sang. 1988. - V. 54. ■ № 2. -P. 78-83.

82. Heremans J., Masson P.L. FR2279419, Merieux Inst. Feb. 20, 1976.

83. Hiemstra P.S., Brands-Tajouiti J., van Furth R. Comparison of antibody activity against various microorganisms in intravenous immunoglobulin preparations determined by ELISA and opsonic assay. // J. Lab. Clin. Med. -1994.-V. 123.-№2.-P. 241-246.

84. Hill H.R., Bathras J.M. Protective and opsonic activities of a native,pH 4,25 intravenous immunoglobulin G preparation against common bacterialpathogens. // Reviews of infectious diseases. 1986. - V. 8 (Suppl 4). -P. 396-400.

85. Hirao Y., Hashimoto M., Kitamura T., Kamimura Y. Immunoglobulin preparation. //JP 10265406, Green Cross Corp. June 10, 1998.

86. Hofstaetter T., Grjnski P., Kanzy E.J. et al. S-sulfonation: a reversible chemical modification of human immunoglobulins permitting intravenous application. II. Effect on Fc-mediated effector functions // Vox. Sang. 1983. -V. 4, №2.-P. 155-165.

87. Hofstee B.H.J. Fractionation of protein mixtures through differential adsorption on a gradient of substituted agaroses of increasing hydrophobicity. // Preparative Biochemistry 1975. - V. 5 (Suppl 1). - P. 7-19.

88. Horowitz B. Ways to reduce the risk of transmission of viral infections by plasma and plasma product. International Forum. // Vox. Sang. -1988. -V. 54.-P. 235.

89. Improvements in or relating to a glutathione composition for parenteral injection and process of preparing such composition. // GB 741498, Schwarz Lab. Inc.-Des. 7, 1955.

90. Kaden H. The use of asbestos filter beds in the production of sterile and pyrogen free solutions. // Pharmazie. 1975. - V. 29. - (Suppl 11). - P. 752-753.

91. Kotitschke R., Harbauer G. Safety tests of the intravenous tolerance of immunoglobulins. // Infusionstherapie. 1992. - V. 19. - P. 23-28.

92. Labarca J.A., Rabaggliati R.M., Radrigan F.J. et al. Antiphospholipid syndrome associated with cytomegalovirus infection, Case report and review. // Clinical Infectious Diseases. 1997. - V. 24. - № 2. - P. 197-200.

93. Labrousse H., Adib-Conquy M., Avrameas S. Effects of pH or ionic strength on the reactivities of mono- and polyspecific IgG antibodies. // Res. Immunol.- 1994,-V. 145.-№7.-P. 541-552.

94. Lacroix-Desmazed S., Kaveri S.V., Mouthon L. et al. Self-reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals // Journal of Immunological Methods. 1998.-V. 216. - P. 117-137.

95. Laursen I., Teisner B. Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products. // WO 9964462, Statens Seruminstitut. Dec. 16, 1999.

96. Lebing W., Remington K.M., Schreiner C.et al. Properties of new intravenous immunoglobulin (IGIV-C, 10 %) produced by virus inactivation with caprilate and column chromatography. // Vox. Sang. 2003. - V. 84. -P. 193-201.

97. Lichtiger B. Laboratory serologic problems asociated with administration of intravenous IgG. // Current Issues in transfusion medicine. April-june. 1994.

98. Linzman J., Broz P., Krai V., Lokaj J. Uspesna gammaglobulinova lecba u nemocneho s anti-IgA protilatkami // Vnitr. Lek. 1997. - 43. - № 2. -P. 102-104.

99. Litwinska B., Bucholc B., Biesiadecka A., Kantoch M. // Antiviral activity of IgG subclasses of immunoglobulin preparations for intravenous use. // Med. Dosw. Microbiol. 1993. - V.45. -№ 4. - P. 523-528.

100. Louie R.E., Galloway C.J., Dumas M.L., Wong M.F., Mitra G. Inactivation of hepatitis C virus in low pH intravenous immunoglobulin. // Biologicals.- 1994.-V.22.-№ l.-P. 13-19.

101. Love P.E., Santoro S.A. Antiphospholipid antibodies, anticardiolipin and lupus anticoagulant in systemic lupus erythematosus (SLE) and in non-SLE disorders. Prevalence and clinical significance. // Ann. Intern. Med. 1990. -V. 112.-P. 682-698.

102. Lundblad J.L., Warner K., Willis L. et al. Stabilized immune serum globulin.// US 4186192, Cutter Laboratories.-Des. 18, 1978.

103. Lundblad J.L., Mitra G., Sternberg M.M. Comparative studies of impurities in intravenous immunoglobulin preparations.// Rev. Infect. Dis., 1986.- V. 8.- P. 382-390.

104. Magnin AQ.A., Wah P.S. Liquid pasteurization of immunoglobulins without stabilizer. // Vox Sang. 1997. - V. 72. - № 4. - P. 252-253.

105. Matejtschuk P., Chidwick K., Prince A. et al. A direct comparison of the antigen-specific antibody profiles of intravenous immunoglobulins derived from US and UK donor plasma. // Vox. Sang. 2002. - V. 83. - P. 17-22.

106. McCue J.P., Hein R.H., Tenold R. Three generations of immunoglobulin G preparations for clinical use. // Reviews of infectious diseases. -1986. V. 8 (Suppl 4). - P. 374-381.

107. McCue J.P. Changes in therapeutic proteins caused by preparation techniques. // Ann. Intern. Med. 1989. - V. 111. - № 4. - P. 271-272.

108. Mendlovic S., Brocke S., Shoenfeld Y. et al. Induction of a systemic lupus erythematosus-like disease in mice by a common human anti-DNA idiotype. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.- 1988. V. 85. - P. 2260.

109. Michail S., Nakopolou L., Stravrianopolous I., et al. Acute renal failure associated with immunoglobulin administration. // Nephrol. Dial. Transplant. 1997. - V. 12. - P. 1497-1499.

110. Miekka S.I., Busby T.F., Reid B., Pollock R., Ralston A., Drohan W.N. New methods for inactivation of lipid-enveloped and non-enveloped viruses. // Haemophilia. 1998. - V. 4. - № 4. - P. 402-408.

111. Miller G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. // Anal. Chem. № 31. P. 426-428.

112. Misbah S.A., Chapel H.M., Johnston B.J., Ali M.H. et al. Attempt to reverse atrophic gastritis associated with common variable immunodeficiency. // J Clin Gastroenterol, 1993.- V.15.- P. 354-5.

113. Misra R., Venables P.J.W., Plater-Zyberk C. et al. Anti-cardiolipin antibodies in infectious mononucleosis react with the membrane of activated lymphocytes. // Clin. Exp. Immunol. 1989. - V. 75. - P. 35-40.

114. Mitra G., Mozen M.M. Preparation of retrovirus-free immunoglobulins. // US 4762714, Miles Lab. Aug. 9, 1988.

115. Mitra G., Mozen M.M., Louie R.E. Preparation of human immunoglobulin free of hepatitis C. // US 5419906, Miles Inc.-May 30, 1995.

116. Mitra G., Wong M.F., Mozen M.M., Mc Dougall J.S., Levy J.A. Elimination of infectionus retroviruses during preparation of immunoglobul ins.// Transfusion. 1986. V. 26. - P. 394-397.

117. Mohr H., Lambrecht B., Schmitt H. Photo-inactivation of viruses in therapeutical plasma. // Dev. Biol. Stand. 1993. - V. 81. - P. 177-183.

118. Morel 1 A., Schurch B., Ryser D., Hofer F., Skvaril F., Barandun S. In vivo behavior of gamma-globulin preparations // Vox. Sang. 1980. - V. 38. -P. 272-283.

119. Muscat C., Bertotto A., Ercolani R., Bistoni O. et al. Long term treatment of rheumatoid arthritis with high doses of intravenous immunoglobulins: effects on disease activity and serum cytokines // Ann. Rheum. Dis. 1995. - 54. - № 5. - P. 382-385.

120. Norbert C., Rodolphe F. Intravenously administrable human Immunoglobuline and process for its preparation. // EP 0085747, Schweiz Serum & Impfinst. Aug. 17, 1983.

121. Ochs H.D., Fischer S.H., Wedgwood R.J. Modified Immune globulin: its use in the prophylactic treatment of patients with immune deficiency. //Journal of Clinical Immunology. — 1980. V. 2. - № 2. - P. 27.

122. Ochs H.D., Fischer S.H., Virant F.S., Lee M.L., Kingdon H.S., Wedgwood R.J. Non-A, non-B hepatitis and Intravenous Immunoglobulin. // Lancet. 1985. - V. 1. - P. 404-405.

123. Ohmoto Y., Ogushi F., Muraguchi M., Yamakawa M., Sone S. Age-related increase of autoantibodies to interleukin 1 alpha in healthy Japanese blood donors. // J. Med.Invest. 1997. - V. 44 (Supple 1-2). - P. 89-94.

124. Omar A , Kempf C., Immelmann A., Rentscch M., Morgenthaler J.J. Virus inactivation by pepsin treatment at pH 4 of IgG solutionis: factors affecting the rate of virus inactivation. // Transfusion. 1996. - V. 36. - № 10. — P. 866-872.

125. Oncley J.L., Melin M., Richert D.A. et al. The separation of antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and beta lipoproteins into sub-fractions of human plasma. // J. Am. Chem. Soc. 1949. - V. 71. -P. 541-550.

126. Peter Barland M.D. The antinuclear antibody test. http://www.cyberounds.com/conferences/rheumatology/conferences/0896/confer ence.html.

127. Points to Consider in the manufacture and testing of monoclonal antibody products for human use. 1997. - V. 28. - P. 1-49.

128. Poison A., Potgieten G., Largier J., Mars G. et al. The fraction of protein mixtures by linear polymers of high molecular weight // Biochem. et Biophys. acta. 1964. - V. 82. - P. 463-475.

129. Prince A.M., Plet M., Horowitz B. Effect of Cohn fractionation conditions on infectivity of the AIDS virus. // N. Eng. Med. 1986. - V. 314. -P. 386-387.

130. Quinti I., Papetti C., Paganelli R., et al. Evaluation of the presence of RF- like activities in immunoglobulin preparations for intravenous use. I. IgG anti-IgE in intravenous Ig. //J. Clin. Lab. Immunol. 1987. - 24. - №3. -P. 135-138.

131. Ralph H., Rousell M. Sc., Michael S., Cjllins Ph.D. et al. Antibody levels in reduced/alkylated intravenous immune globulin. // American Journal of Medicine. 1984. - V. 30. - P. 40-45.

132. Ramasamy I., Tran E., Farrugia A. Measurement of anticomplementary activity in therapeutic intravenous immunoglobulin preparations. // Biological. 1997. - V. 25. - № 1. - P. 87-92.

133. Rault R., Piraino B., Johnston J. et.al. Pulmonary and renal toxicity of intravenous immunoglobulin. // Clin. Nephrol. 1991. - V. 36. - P. 83-86.

134. Renal insufficiency and failure associated with immune globulin intravenous therapy. // Morb. Mortal. Wkly CDC. 1999. - V 48. - P. 518-521.

135. Richard S., Schwartz M.D. Overview of the biochemistry and safety of a new native intravenous gamma globulin, IGIV, pH 4,25. // American Journal of Medicine. 1987. - V. 83 (Suppl 4A). - P. 47.

136. Rigal D., Baboin-Jaubert M., Rousset E., Monier J. Immunomodulation induced by immunoglobulins. I. Action of placental immunoglobulin on in vitro spontaneous synthesis of IgE in man // Clin. Immunol. And Immunopathol. 1988. - V. 49. - № 1. - P. 1-5.

137. Rigdon R.H., Cardwell E.S. Renal lesions following the intravenous injection of a hypertonic solution of sucrose: a clinical and experimental study. // Arch. Intern. Med. 1942. - V. 69. - P. 678-690.

138. Robert G., Hamilton H. The human IgG subclasses. // Calbiochem Corporation. 1989. - P. 31-37.

139. Römer J., Morgenthaler J.J., Scherz R., Skvaril F. Characterization of various immunoglobulin preparations for intravenous application. I. Protein composition and antibody content. // Vox Sang, 1982. V. 42. - P. 62-73.

140. Rousell R.H., McCue P. Antibody purification from plasma. In: Blood separation and plasma fractionation. Wiley-Liss, Inc. 1991. - P. 323-330.

141. Rufenacht R., Morell A. Immunochemical characterization of intravenous immunoglobulin preparations. // Allergologia et immunopathologia.-1991.-V. 19. -№ 5. P. 197-200.

142. Schmelzer A.E. Dissertation. Effects of elevated osmolality and carbon dioxide on the glycosylation of neural cell adhesion molecule andmonoclonal antibody: osmoprotectant compounds as mitigatins agents. // PhD. Northwestern university. 2001.

143. Schreiner C., Musmanno L., Kuenzi M., Torres J. Solid-phase immunoassays for HCV antibodies in Gamimune N. // Vox Sang.- 1998. -V. 74. № 3. - P. 156-160.

144. Sisti A.M., Vitali M.S., Manfredi M.J., Zarzur J.A. Preparation of lyophilized and liquid intravenous immunoglobulin G: development and scale-ap. // Vox. Sang. 2001. - V. 80. - P. 216-224.

145. Skvaril F. The question of specificity in binding human IgG subclasses to protein A-sepharose // Immunochemistry. 1976. - V. 13, № 10. - P.871-872.

146. Skvaril F., Roth-Wicky B., Barandun S. IgG subclasses in human gamma-globulin preparations for intravenous use and their reactivity with staphylococcus protein A. // Vox. Sang. 1980. - V. 38. - № 3. - P. 147-155.

147. Soderberg C., Sumitran Karuppan S., Ljungman P., Moller E. CD13-specific autoimmunity in cytomegalovirus infected immunocompromised patients. // Transplantation. 1996. - V. 61. - № 4. - P. 594-600.

148. Steele R.W., Augustine R.A., Tannenbaum A.S., Charlton R.K. A comparison of native and modified intravenous immunoglobulin for management of hypogammaglobulinemia. // Am. J. Med. Sci. 1987. - V. 293. -№ 2. - P. 69-74.

149. Stephan W. Undegraded human immunoglobulin for intravenous use. // Vox. Sang. 1975. - V. 65. - № 6. - P. 422-437.

150. Stephan W., Dichtelmuller H., Prince A., Brotman B. et al. Inactivation of the nutchison strain of hepatitis non-A, non-B, virus in intravenous immunoglobulin by beta-propiolacton. //J. Med. Virology. 1988. -V. 26.-№6.-P. 227-232.

151. Stiller S., Bonnie-Schorn et al., A critical review of sodium profiling for hemodialysis. // Seminars in dialysis. 2001. - V. 14 (Suppl 5). -P. 337-347.

152. Sweadner K.J., Forte M., Nelsen L.L. Filtration removal of endotoxin (pyrogens) in solution in different states of aggregation. // Appl Environ Microbiol. 1977. - V. 34. - № 4. - P. 382-385.

153. Tabor E., Aronson D.L., Gerety R. Removal of hepatitis B infectivity from factor-IX complex by hepatitis B immune-globulin. // Lancet. 1980. — V. 11.-P. 68-70.

154. Tan E., Hajinazarian M., Bay W., Neff J., Mendell J.R. Arch. Neurol., 1993. V. 50 (Suppl 2). - P. 137-139.

155. Tenold G., Robert A. Intravenously injectable immune serum globulin. // US 4396608, Cutter Laboratories. Dec. 18, 1978.

156. Trejo S.R., Hotta J.A., Lebing W., Stenland C. et al. Evaluation of virus and prion reduction in a new intravenous immunoglobulin manufacturing process. // Vox. Sang. 2033. - V. 84. - P. 176-187.

157. Troccoli N.M., Mclver J., Losikoff A., Poiley J. Removal of viruses from human intravenous immune globulin by 35 nm nanofiltration. // Biologicals. 1998. -V. 26. - № 4. - P. 321-329.

158. Ueremura Y., Yang Y., Helderbrant C., Takechi K., Yokoyama K. Inactivation and elimination viruses during preparation of human intravenous immunoglobulin. // Vox. Sang. 1994. - V. 67. - P. 246-254.

159. Vassilev T.L., Bineva I.L., Dietrich G., Kaveri S.V., Kazatchkine M.D. Variable region-connected, dimeric fraction of intravenous immunoglobulin enriched in natural autoantibodies. // J. Autoimmun. 1995. -V. 8. -№ 3. — P. 405-413.

160. Vincenzi D., Lama G., Mignani E. et al. Anti-A, anti-B agglutinins in some commercial intravenous gammaglobulins.// Vox Sang., 1989.-V.57.-P. 219.

161. Wadsworth C., Hanson L.A. IgA in commercial gamma-globulin preparations. // Scand J Immunol. 1976. - V. 5.- P. 15-22.

162. Weisman L.E., Fisher G.W., Marinelli H., Hemming V.G., Pierce J.R., Golden S.M., Peck C.C. Pharmacokinetics of intravenous immunoglobulin in neonates // Vox. Sang. 1989. - V. 57, № 4. - P. 243-248.

163. Wiward D.B., Brophy M.T. Acute renal failure after administration of intravenous immunoglobulin: review of the literature and case report. // Pharmacotherapy. 1995. - V. 15. - P. 765-772.

164. Yap P.L. Applications of intravenous immunoglobulin. // Malaysian Journal of Pathology. 1990. - V. 12(Suppl 1).-P. 1-10.

165. Zav'ylov V.P., Tetin S.Y., Abramov V.M., Troitsky G.V. Effect of salt concentration on immunoglobulin G structure. // Biochim. Biophis. Acta. -1978.-V. 26.-P. 496-503.

166. Zhang R., Szerlip H.M. Reemergence of sucrose nephropathy: acute renal failure caused by high-dose intravenous immune globulin therapy. // South. Med. J. 2000. - V. 93 (Suppl 9). - P. 901-904.

167. Zhao, Zi-Shan, Granucci, Francesca et al. Molecular mimicry by herpes simplex virus-type 1: autoimmune disease after viral infection. // Academic Search Premier. 1998. - V. 279. - Issue 5355.