Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Кузнецова, Екатерина Михайловна

• Кузнецова, Екатерина Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кузнецова, Екатерина Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Дифференциация подвидов РгапсьчеНа шЬгетгя

1.2. Структурно-функциональная характеристика основных 19 антигенов туляремийного микроба

1.3. Способы детекции и идентификации возбудителя туляремии 32 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Питательные среды и условия культивирования штаммов

2.3. Реактивы и лабораторные животные

2.4. Получение антигенов и их комплексов

2.5. Получение кроличьих иммунных сывороток и антительных препаратов

2.6. Биохимические и иммунохимические методы исследования

2.7. Иммунологические методы исследования

2.8. Статистическая обработка 48 ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННЫХ

КОМПЛЕКСОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА И

ХАРАКТЕРИСТИКА ИХ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА

3.1. Идентификация компонентного состава протективного антигенного комплекса туляремийного микроба

3.2. Оптимизация способов получения антигенных компонентов протективного антигенного комплекса туляремийного микроба и их характеристика

3.2.1. Химический гидролиз протективного антигенного комплекса

3.2.2. Ферментативный гидролиза протективного антигенного комплекса

3.3. Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ РАЗНЫХ ПОДВИДОВ

4.1. Структурная и функциональная характеристика протективного антигенного комплекса, продуцируемого штаммами разных подвидов

4.2. Иммунобиологические свойства препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из штаммов-продуцентов туляремийного микроба разных подвидов

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

5.1. Получение поликлональных антител к протективному антигенному комплексу туляремийного микроба

5.2. Разработка экспериментальных препаратов для детекции возбудителя туляремии

5.3. Разработка экспериментальных препаратов для детекции туляремийных антител

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов»

ВВЕДЕНИЕ

Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция, возбудитель которой, Francisella tularensis, может вызвать вспышки заболевания среди широкого круга хозяев, включая человека, что представляет серьезную проблему для практического здравоохранения. Эндемичные очаги туляремии характеризуются стабильностью проявления и широко распространены, в том числе на территории Российской Федерации и соседних стран [Tärnvik A. et al., 2004; Топорков В. П. и др., 2007; Мещерякова И. С. и др., 2007; Окунев JI. П., Мазепа A.B., 2011; Wang Y. et al., 2011]. Специалистами Роспотребнадзора отмечается, что ослабление внимания к туляремии может привести к серьезным эпидемическим осложнениям, подтверждением чему служит резкий подъем заболеваемости в 2005 г. [Онищенко Г. Г., 2006; Безсмертный В. Е. и др., 2008; Кологоров А. И. и др., 2010]. Кроме того, возбудитель туляремии включен в высшую категорию А как потенциальный агент биотерроризма [Dennis D. et al., 2001; Gallagher-Smith M. et al., 2004]. Несмотря на достигнутые успехи в исследовании особенностей строения и биологии туляремийного микроба, факторы патогенности этого возбудителя, состав капсулы и протективные антигены окончательно не изучены [Havlasova J. etal., 2002; Sjöstedt А., 2003; Eyles J.E., 2007; OystonP.C.F., 2008; Santic M., 2010; Broms J. E. etal., 2011].

Лабораторная диагностика туляремии основывается на иммунологических (се-роаллергологическая диагностика) и бактериологических методах, в настоящее время дополнена молекулярно-генетическими методами [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. Из иммунодиагностических методов в отечественной практике наиболее распространены реакция агглютинации и реакция непрямой гемагглютинации, недостатками которых являются возможность перекрестного реагирования с возбудителем бруцеллеза и невысокая чувствительность [Олсуфьев Н. Г., 1975; Мишанькин Б. Н. и др., 1998; Сырова Н. А., 2008]. Экспресс-методом специфической индикации возбудителя туляремии является широко применяемый метод флуоресцирующих антител, который эффективен для детекции F. tularensis в различных субстратах [МУ 3.1.2007-05]. В области разработки новых способов детекции туляремийного микроба ведутся активные исследования [Splettstoesser W. D. et al., 2005; Осина H. А. и др., 2007; Романова Л. В., 2008; Johansson A. et al., 2010; Ветчинин С. С. и др., 2011; Larson M. F. et al., 2011].

У возбудителя туляремии ЛПС и белки ВМ влияют на специфичность иммунного ответа макроорганизма, обладают уникальной полиэпитопной антигенной структурой и рассматриваются как перспективные антигены для создания профилактических и диагностических препаратов [Родионова И.В., Захаренко В.И., 1990; Хлебников B.C. и др., 1992, 1993; Аронова Н. В., Павлович Н. В. 2000; Ellis J. et al., 2002; Conlan J. W. 2004; OystonP. C. F., 2008; Beasley A. S. et al., 2011; Zarella Т. M. et al., 2011]. Большое внимание уделяется исследованию комплексных антигенов F. tularensis [Tärnvik A., Berglund L., 2003; Splettstoesser W. D. et al., 2005; Pierson T. et

al., 2011]. В частности, оценка эффективности разработанных иммуиодиагностических_

тест-систем показала, что ИФА на основе препаратов ЛПС F. tularensis или отдельных белков ВМ (43 и 17 кДа) обладают более низкой чувствительностью (96,5-99,0 %) и специфичностью (96-97 %), чем на основе комплекса белков ВМ - 100 % специфичность и чувствительность [Carlsson Н. Е. et al., 1979; Koskela Р., Salminen A., 1985; Bevanger L. et al., 1988, 1989; Schmitt P. et al., 2005; Splettstoesser W. D. et al., 2005].

Получаемые по классическому методу A. Boivin (1933) липополисахари-до-белковые комплексы возбудителя туляремии содержат до 10 % белка и характеризуются высокой серологической активностью [Родионова И. В., Шипицина Г. К., 1967]. В зависимости от способа получения ЛПБК имеют различный состав, молекулярную массу и свойства. В частности, установлена высокая иммунобиологическая активность ЛПБК ВМ F. tularensis, полученного с помощью обработки бактериальных клеток ультразвуком с последующим ультрацентрифугированием, с содержанием 12-22 % белка (25 белковых фракций) и 40 % липидов [Хлебников В. С. и др., 1991]. При обработке ВМ растворами детергентов с последующей гель-фильтрацией был получен высокоактивный ЛПБК (IV фракция, 15-35 кДа) с соотношением ЛПС:белок 1:1 [Хлебников В. С. и др., 1992, Кулевацкий Д. П., 1994]. Показано, что в составе препаратов ЛПБК присутствуют иммунодоминантные белки с молекулярными массами 17 и 43 кДа [Аверин С. Ф. и др., 1992; Кулевацкий Д. П., 1994] и белок-шаперон 63 кДа (GroEL) [Коровина О. В., 1993]. Комплекс ЛПС-17 кДа белок рассматривается в качестве прототипа химической туляремийной вакцины [Khlebnikov V. S .et al., 1996], также как и один из препаратов ЛПБК ВМ F. tularensis - С-комплекс [Жемчугов В. Е., 2004; Патенты РФ 2147234,2221591]. При оптимизации схемы выделения С-комплекса туляремийного микроба в условиях масштабированного культивирования штам-

ма-продуцента Ш1агет1х 15 НИИЭГ был разработан метод его изоэлектрической преципитации [Шепелев И. А., 2005]. С использованием этого подхода нами был получен препарат ЛПБК туляремийного микроба, отличающийся от остальных ранее описанных в литературе комплексных антигенов молекулярной массой, увеличением белкового компонента (более 60 %) и высокой протективной активностью при экспериментальной туляремии. Этот препарат ЛПБК получил авторское название протек-тивный антигенный комплекс - ПАК [Кузнецова Е. М. и др., 2011].

Несмотря на достигнутые успехи в исследовании антигенных комплексов ВМ К ш1агет18 важными условиями при разработке современных эффективных медицинских иммунобиологических препаратов, остаются совершенствование приемов выделения антигенов в иммунологически активной форме. Изучение особенностей состава и свойств комплексных антигенов туляремийного микроба разных подвидов позволит провести их детальную характеристику.

Цель исследования. Получить диагностически значимые антигенные комплексы Р. ш1агет1з и сконструировать на их основе экспериментальные иммунодиагности-ческие препараты.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать способы получения иммунохимически активных антигенных комплексов туляремийного микроба.

2. Провести сравнительный анализ полученных препаратов антигенных комплексов туляремийного микроба разных подвидов.

3. Получить высокоактивные поликлональные иммунные сыворотки к про-тективному антигенному комплексу туляремийного микроба и сконструировать на их основе экспериментальные иммунодиагностикумы для детекции возбудителя туляремии.

4. Разработать на основе антигенных комплексов туляремийного микроба экспериментальные препараты для детекции специфических антител.

Научная новизна исследования. Оптимизированы способы получения биомассы Р. tula.ren.sis для последующего выделения биологически активных антигенов. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена оформлением заявки № 2010131275 на изобретение «Способ получения биомассы туляремийного микроба» (приоритет от 26.07.10 г). Для получения иммунохимически активных антигенных

комплексов туляремийного микроба были усовершенствованы способы их выделения и количественного определения. Выделен и охарактеризован гликозилированный белковый комплекс туляремийного микроба, обладающий выраженной иммуноген-ностью и высокой специфичностью, хроматографически гомогенный, с молекулярной массой (57±1) кДа, состоящий из двух белковых субъединиц (43 и 14-17 кДа). Выделен протективный антигенный комплекс, установлен его компонентный состав: субъединицы с молекулярными массами более 23 кДа имеют белковую природу, 14-17 кДа -липопротеидную. С помощью протеомного анализа в составе протективного антигенного комплекса впервые показано наличие следующих идентифицированных белков: белков-шаперонов (GroES и GroEL), ферментов (GAPDH, KatG, АсрР), белков ВМ (OmpH, FTL 0617) и регуляторных белков (EF-Tu, RplL). Установлено, что протективный антигенный комплекс является видоспецифичным антигеном, регистрируется у F. tularensis независимо от подвидовой принадлежности штамма, формы ЛПС бактериальной клетки и наличия капсулы.

Впервые на основе сравнительного анализа структуры и свойств препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из штаммов F. tularensis subsp. holarctica биоваров eryR, eryS, japónica, subsp. nearctica, subsp. mediaasiatica, установлено, что все препараты обладают иммуногенностью, сходны по химическому составу и содержат иммунохимически активные субъединицы (10-85 кДа). Антигенный комплекс из F. tularensis subsp. novicida отличается от ПАК других подвидов более низкой (в 5 раз) иммунохимической активностью, увеличением содержания углеводной части на (70±3) %, наличием субъединиц с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммунореактивных белков в области 57-85 кДа.

Сконструированы экспериментальные антительные и антигенные туляремий-ные диагностику мы. Использование ПАК и гликозилированного белкового комплекса в качестве маркерных антигенов в иммуноблоттинге, ИФА и ДИА позволяет определять туляремийные антитела в крови вакцинированных и экспериментально зараженных лабораторных животных. Чувствительность экспериментальных антительных диагностикумов для детекции возбудителя туляремии разных подвидов иммунодиаг-ностическими методами (ИФА, ДИА) составляет 104-105 м.к./мл. Сконструированный иммуносуспензионный диагностикум в РЛА позволяет выявлять содержащие капсулу (Сар+) и бескапсульные (Сар") штаммы F. tularensis в отличии от коммерческого ди-

агностикума для РНГА, выявляющего только Сар+-штаммы.

Практическая значимость. По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Применение антител к С-комплексу туля-ремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноанализа» и «Получение гликозилированного белкового комплекса внешних мембран клеток ту-ляремийного микроба», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 17.04.2008 г. и протокол № 5 от 22.09. 2011 г., соответственно) и утвержденные директором института.

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован бескапсульный штамм К Ы^гетгэ ¡го1агсйса КМ 9, производный вакцинного штамма Т7. Ш1агет1я 15 линии НИИЭГ, который может быть использован при создании диагностических туляремийных тест-систем для детекции Сар" штаммов.

Выделенные препараты ПАК разных подвидов используются при выполнении научно-экспериментальных работ в лабораториях вакцинологии и иммунопрофилактики, иммунодиагностики и молекулярной диагностики РосНИПЧИ «Микроб». Научные данные об особенностях антигенного строения туляремийного микроба, полученные в результате работы, включены в теоретический материал при чтении лекций цикла «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии» на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования по специальности «бактериология» в институте «Микроб».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», Волгоград, 2005, на Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины», Санкт-Петербург, 2006, на VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ», п. Оболенск, 2006, на IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007, на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора

за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России», Ставрополь, 2007, на IX Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», Волгоград, 2008, на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», п. Оболенск, 2009, на Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», Нижний Новгород, 2009, на X Межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитар-но-эпидемического благополучия населения государств-участников СНГ», Ставрополь, 2010, на научно-практической конференции молодых ученых Роспотребнадзора «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения», Н. Новгород, 2011, на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора, п. Оболенск, 2011, на ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2005-2011 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них 5 статей в изданиях, рекомендованных «Перечнем...» ВАК России.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Оптимизированный метод выделения комплексных антигенов туляремий-ного микроба, основанный на комбинировании способов химического и ферментативного гидролиза с последующей хроматографической очисткой, позволяет получать иммунохимически активные препараты.

2. Протективный антигенный комплекс является общим антигеном для туля-ремийного микроба основных подвидов (зиЬзр. 1ю1агсИса, пеагсйса, тесНаш1айса), обладает сходной структурой и свойствами.

3. Особенности биохимического и иммунохимического строения протектив-ного антигенного комплекса из Р. Ы1агет18 зиЬвр. полпайа обусловливают снижение его иммуногенности по сравнению с аналогичными антигенами, выделенными из штаммов других подвидов.

4. Экспериментальные антительные препараты на основе гипериммунных по-ликлональных кроличьих сывороток к протективному антигенному комплексу туля-ремийного микроба позволяют выявлять в различных вариантах иммуноанализа клетки F. tularensis разных подвидов в минимальном количестве 104-105 м.к./мл, а также антиген в минимальной концентрации (0,5±0Д) нг/мл.

5. Экспериментальные иммунодиагностические препараты на основе антигенных комплексов позволяют выявлять специфические противотуляремийные антитела у лабораторных животных (вакцинированных, инфицированных и переболевших) и в гипериммунных сыворотках.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников. Объем диссертации 150 страниц. Список литературы содержит 321 источник, из них 177 зарубежных. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 18 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Кузнецова, Екатерина Михайловна

выводы

1. С помощью оптимизированного метода выделения комплексных антигенов туляремийного микроба, основанного на способах химического и ферментативного гидролиза с последующей колоночной хроматографией, были получены иммунохи-мически активные препараты: протективный антигенный комплекс и гликозилиро-ванный белковый комплекс.

2. Выявлена высокая иммунохимическая активность и антигенная идентичность препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из клеток штаммов F. tularensis subsp. holarctica биоваров eryR, eryS, japónica, subsp. nearctica и subsp. mediaasiatica. Протективный антигенный комплекс регистрируется у туляремийного микроба независимо от формы липополисахарида и наличия капсулы.

3. Выявлены особенности протективного антигенного комплекса F. tularensis subsp. novicida, состоящие в преобладании углеводного и липидного компонентов над белковым и отсутствии иммунодоминантных полипептидов с молекулярной массой в диапазоне от 50 до 90 кДа, которые приводят к снижению его иммуногенности.

4. Разработанная схема гипериммунизации кроликов-продуцентов с последовательным использованием в качестве иммуногена смеси водно-фенольных экстрактов клеток F. tularensis subsp. holarctica, nearctica, mediaasiatica и протективного антигенного комплекса, позволяет получать активные туляремийные сыворотки с минимальным уровнем содержания гетерологичных антител. Сконструированные на основе полученных поликлональных антител экспериментальные иммунодиагностику-мы (иммуноферментные, иммуносуспензионные, иммунофлуоресцентные) выявляют возбудитель туляремии в концентрациях, соответствующих чувствительности методов.

5. Лабораторные испытания экспериментальных антительных препаратов для детекции F. tularensis в ИФА и ДИА на чистых и смешанных культурах, в искусственно контаминированных пробах биологического материала и внешней среды показали их высокую специфичность и чувствительность. При исследовании органов инфицированных лабораторных животных была отмечена 100 % корреляция результатов экспериментального ИФА с данными бактериологического анализа в ранние сроки после заражения. Эффективность применения экспериментальных иммуноферментных тест-систем подтверждена исследованиями полевого материала, собранного при эпизоотологическом обследовании зеленой зоны г. Саратова.

6. Применение антигенных комплексов туляремийного микроба в качестве сенситинов в ИФА и ДИА и маркерных антигенов в иммуноблоттинге позволяет определять специфические антитела в гипериммунных туляремийных сыворотках и при изучении динамики образования антител у иммунизированных, вакцинированных и экспериментально зараженных лабораторных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Учитывая широкую распространенность и активность природных очагов туляремии на территории Российской Федерации и соседних государств [Топорков В.П. и др., 2007; Окунев Л. П, Мазепа А. В., 2011; Tarnvik A. et al., 2004], актуальными остаются исследования, направленные на изучение поверхностных антигенов F. tularensis и конструирование на их основе препаратов для профилактики и диагностики туляремийной инфекции [Хлебников B.C. и др., 1992; Sjostedt А. 2003; Eyles J. Е. et al., 2007]. В этом аспекте важными условиями являются совершенствование приемов выделения антигенов в иммунологически активной форме и их детальная характеристика. Перспективными для практического применения в иммунодиагностике туляремии являются комплексные антигены F. tularensis [Splettstoesser W. D. et al., 2005], практическая апробация которых осложняется тем, что их компонентный состав до настоящего времени не установлен. Открытым остается вопрос о влиянии формы ЛПС на продукцию антигенных комплексов ВМ туляремийного микроба, а также их участие в образовании капсулоподобного вещества возбудителя. Высокая иммунохимическая активность и поверхностное расположение антигенных комплексов F. tularensis создали предпосылки для разработки на их основе экспериментальных иммунодиагностических препаратов для детекции возбудителя туляремии и ту-ляремийных антител.

Наши исследования были направлены на оптимизацию способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба, изучение строения и состава препаратов протективного антигенного комплекса, выделенных из штаммов разных подвидов, их антигенных, биохимических и иммунобиологических свойств. Проведена работа по конструированию на основе полученных антигенных комплексов и специфических антител экспериментальных иммунодиагностических препаратов.

Протективный антигенный комплекс туляремийного микроба из клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ представляет собой антиген сложной химической природы, в состав которого входят белки, липиды и углеводы в соотношении 3:1:1. Данный препарат взаимодействует со специфическими антителами в ИФА в минимальной концентрации 0,5 нг/мл. Был установлен субъединичный состав

ПАК-15, представленный белками с молекулярной массой от 10 до 85 кДа, мажорные из которых 81-85, 57-60, 43, 32, 23, 19 и 14 кДа были иммунохимически активны.

В результате протеомного анализа в составе протективного антигенного комплекса было достоверно идентифицировано 9 биологически активных молекул, специфичных для F. tularensis. Среди них белки-шапероны (GroES и GroEL), ферменты (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, пероксидаза/каталаза, АС-белок), белки ВМ (50S рибосомальный белок L7/L12, фактор элонгации Tu, FTL0617, FTL0009), играющие, согласно литературным данным, важную роль в патогенезе туляремийной инфекции [Ericsson М. et ah, 1997; Havlasova J. et ah, 2005; Barel M. et al., 2008]. Гипотетический белок BM FTL0617, по данным ряда авторов является бактериоферрити-ном (Bfr), относящимся к группе белков-шаперонов F. tularensis [Su J. et ah, 2007; Savitt A. G. et ah, 2009]. Присутствие описанных выше белковых субъединиц в составе протективного антигенного комплекса обуславливает его высокую иммунобиологическую активность. Полученные данные также позволят паспортизировать препарат ПАК для стандартизации методов получения и контроля этого антигена с целью дальнейшего его практического использования.

Учитывая сложную химическую природу протективного антигенного комплекса туляремийного микроба, а также его высокую иммунохимическую активность, дальнейшая работа была направлена на определение его активных компонентов. Было установлено, что протективный антигенный комплекс F. tularensis термостабилен, устойчив к действию кислот и щелочей в диапазоне рН от 1,0 до 13,0, обратимо преци-питирует при 50-55 % насыщении сульфатом аммония. Химический гидролиз ПАК растворами детергентов привел к изменению электрофоретического белкового профиля антигена и позволил установить белковую природу его основных субъединиц с молекулярными массами от 20 до 58 кДа. Наибольшей устойчивостью к действию детергентов обладали субъединицы с молекулярной массой 81-85 и 14-17 кДа. При этом было отмечено, что раствор саркозила увеличивает иммунохимическую активность ПАК в 2 раза (препарат ПАК-Д), что может в дальнейшем использоваться при конструировании диагностических тест-систем. Фенольная экстракция позволила разделить препарат ПАК-15 на углеводно-липидную и белковую фракции. В обеих фракциях было отмечено содержание двух иммунореактивных компонентов с молекулярными массами в диапазоне 14-17 кДа, что свидетельствует о липопротеидной природе этих субъединиц и согласуется с данными литературы [Sjostedt A. et al., 1991]. Изучение иммунохимической активности полученных фракций ПАК показало, что угле-водно-липидная обладает меньшей активностью (титр в ДИА 1/3200), чем белковая (титр в ДИА 1/25600). Это согласуется с данными об отсутствии уменьшения активности ПАК в ДИА при использовании антител, адсорбированных ЛПС туляремийного микроба.

Установлена высокая чувствительность ПАК к действию пепсина, вызывающего полный его гидролиз, и протеиназы К, приводящей к гидролизу его белковой части и позволяющей получить компонент ЛПС природы, который имеет структуру, типичную для S-формы грамотрицательных бактерий. Иммунохимическая активность данного препарата по отношению к контролю была значительно ниже (титр в ДИА 1/800, по сравнению с контрольным 1/51200), что указывает на зависимость серологической активности компонентов ПАК от содержания в них белка и подтверждает полученные выше данные.

Разработанный нами метод ферментативного гидролиза ПАК-15 проназой Е позволил выделить комплексный антиген углевод-белковой природы (гликозилиро-ванный белковый комплекс). Полученный препарат является хроматографически го-могеным, имеет молекулярную массу около (57±1) кДа, и содержит в своем составе, по данным SDS-PAGE, мембранные белки 41-43 и 14-17 кДа и О-полисахаридный компонент, соотношение белков и углеводов 2:1. Препарат гликозилированного белкового комплекса нетоксичен для лабораторных животных, обладает высокой имму-ногенной активностью. Его однократное введение лабораторным животным вызывает выработку антител и реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Средняя иммунизирующая доза антигенного препарата при экспериментальной туляремийной инфекции для белых мышей составила (2,5±0,3) мкг, для морских свинок (200±10) мкг. Таким образом, полученный гликозилированный белковый комплекс обладает высокой иммунобиологической активностью и содержит иммуноспецифические антигены ВМ F. tularensis - белки с молекулярными массами 14-17 и 43 кДа, ранее описанные в литературе как FopA и Tul4 [Bevanger L. et al., 1989; Sjostedt A. et al., 1991].

В связи с поверхностным расположением ПАК, нами было сделано предположение о возможности экранирования ПАК капсульным веществом F. tularensis. В этой связи перспективным, на наш взгляд, было бы использование бескапсульных штаммов-продуцентов ПАК. Для этого были подобраны такие штаммы, из них выделены препараты ПАК и проведен их сравнительный анализ с препаратом ПАК-15.

В качестве бескапсульных штаммов-продуцентов были использованы Сар" мутант штамма F. tularensis LVS и полученный нами из культуры F. tularensis 15 НИИ-ЭГ Сар" штамм F. tularensis КМ9. При анализе состава ПАК из клеток бескапсульных штаммов-продуцентов F. tularensis LVS Сар" и КМ9 было установлено, что по основным физико-химическим и иммунохимическим свойствам они аналогичны препаратам протективного антигенного комплекса, выделенным из Сар+-штаммов F. tularensis. Бескапсульные штаммы взаимодействовали с Ig «ПАК» в той же концентрации что и Сар+-штаммы F. tularensis. Поскольку бескапсульные штаммы по выходу биомассы не превосходили штамм F. tularensis 15 НИИЭГ в тех же условиях культивирования, а по продукции ПАК уступали в два раза, использовать их в качестве штаммов-продуцентов ПАК в дальнейшей работе было нецелесообразно. Активность субкультуры F. tularensis в R-форме при взаимодействии с антительными препаратами к ПАК-15 в реакциях иммуноанализа не отличалась от активности культуры в S- и SR-форме. Можно предположить, что присутствие протективного антигенного комплекса на поверхности клетки не зависит от формы ЛПС. Вероятно, для формирования этого антигена достаточно наличия R-формы ЛПС (кор + липид А).

На следующем этапе работы был проведен эксперимент по оптимизации условий культивирования штамма-продуцента F. tularensis 15 НИИЭГ с целью увеличения уровня синтеза и экскрекции в культуральную среду основных белков, в том числе белков теплового шока, входящих в состав ПАК. Было установлено, что температурные условия культивирования (от 28 °С до 42 °С, тепловой шок 52 °С) не оказывают влияния на компонентный состав ПАК. Основные иммунодоминантные белки данного антигенного комплекса регистрировались во всех субкультурах независимо от температуры выращивания, что подтверждает сделанный ранее вывод о физико-химической и иммунохимической стабильности данного антигена.

Основываясь на полученных данных о составе и свойствах протективного антигенного комплекса туляремийного микроба, была оптимизирована схема его выделения. Разработанный комплексный подход, включающий комбинирование способов химического и ферментативного гидролиза ПАК с последующей хроматографической очисткой, позволил получить иммунохимически активные антигены - ПАК-Д и гли-козилированный белковый комплекс.

Для оценки возможности получения ПАК из штаммов-продуцентов разных подвидов туляремийного микроба был проведен электрофоретический анализ суммарных клеточных белков штаммов F. tularensis разных подвидов и биоваров (holarctica: eryR, eryS, japónica; nearctica, mediaasiatica, novicida) и препарата ПАК-15. С помощью нумерического анализа белковых электрофореграмм клеточных лизатов 65 штаммов туляремийного микроба, было доказано наличие белковых фракций поверхностного ПАК в составе протеинограмм всех исследуемых штаммов и выявлена высокая однородность внутри (S = 99 %) и между (S = 95 %) подвидами F. tularensis.

Анализ препаратов ПАК из следующих штаммов-продуцентов: F. tularensis subsp. holarctica eryR 503/840, holarctica eryS В 300, holarctica japónica Miura, nearctica B399 A'Cole, mediaasiatica A-179, mediaasiatica A-61 (117) KM 4 дал возможность установить структурное сходство между ними и препаратом из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Все препараты были хроматографически гомогенны. Электрофоретический белковый профиль ПАК из клеток вирулентных штаммов не отличался от препарата из вакцинного штамма. Кроме того, иммуноблоттинг с экспериментальными антительными препаратами к ПАК-15 позволил установить иммуно-доминантные полипептиды с молекулярной массой около 81-85, 57-60, 43, 32, 23, 19 и 14 кДа, входящие в состав всех исследованных антигенов.

Учитывая высокую иммунохимическую активность препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из штаммов туляремийного микроба разных подвидов и перспективность использования их в качестве антигенных компонентов для получения специфических антительных препаратов была проведена работа по определению их иммунобиологических свойств. Впервые было показано, что все полученные препараты ПАК, независимо от подвидовой принадлежности штамма-продуцента, не токсичны, вызывают у лабораторных животных выраженный антительный ответ и активацию клеточного звена иммунитета, не оказывают повреждающего действия на тимоциты и спленоциты. Максимальной иммуномодулирующей активностью обладал ПАК, полученный из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Анализ протективной активности исследуемых препаратов показал, что они защищают лабораторных животных от гибели при экспериментальной туляремийной инфекции, вызванной вирулентными штаммами голарктического, неарктического и среднеазиатского подвидов, а также большими дозами штамма^ tularensis 15 НИИЭГ.

В тоже время ПАК из F. tularensis subsp. novicida Utah 112 отличался по своей структуре и свойствам от аналогичных антигенов других подвидов. В частности, в его составе увеличено содержание углеводов, отмечено наличие высокомолекулярных белков более 110 кДа, не обладающих активностью в иммуноблоттинге, и не содержатся иммунореактивные белки в диапазоне от 50 до 90 кДа. Хроматографический профиль ПАК-Utah 112 был представлен двумя пиками с молекулярными массами около 280 и 160 кДа, что свидетельствует о двухкомпонентном составе этого препарата. В первом пике содержались белки более 43 кДа, а во втором - менее 23 кДа, оба пика обладали одинаковой иммунохимической активностью в ДИА. Было установлено наличие различных антигенных детерминант между препаратом ПАК-Utah 112 и аналогичными антигенами других подвидов. Кроме того, ПАК-Utah 112 проявлял более низкую иммунохимическую и протективную активность. Полученные данные согласуются с литературными, указывающими на особенности строения и антигенного состава F. tularensis subsp. novicida по сравнению с возбудителями туляремии других подвидов [Аронова Н. В., 2005; Павлович Н. В., 1997].

Следующий этап наших исследований был направлен на разработку экспериментальных препаратов на основе полученных антигенных комплексов F. tularensis для детекции возбудителя и туляремийных антител методами иммуноанализа.

Для получения гипериммунных туляремийных поликлональных антител были разработаны две схемы иммунизации кроликов. Был получен ряд сывороток к каждому препарату ПАК основных подвидов (ПАК-15, ПАК-503, ПАК-А"Со1е). Показано, что все сыворотки этого ряда иммунохимически идентичны и выявляют иммунодо-минантные субъединицы всех препаратов, независимо от подвидовой принадлежности штамма-продуцента, что, наряду с данными сходства строения и свойств, свидетельствует о видовой специфичности протективного антигенного комплекса. Установлено, что применение на первых этапах иммунизации кроликов комплекса водно-фенольных экстрактов штаммов F. tularensis различной подвидовой принадлежности (subsp. mediaasiatica А-61 (117) КМ 4, subsp. nearctica В399 A"Cole, subsp. holarctica 503/840 и 15 НИИЭГ) с последующим внутривенным введением препарата ПАК-15 позволило увеличить специфичность сывороток, которые использовались в нашей дальнейшей работе.

Для оценки эффективности использования экспериментальных сывороток к ПАК туляремийного микроба был проведен анализ их чувствительности и специфичности в сравнении с КТС. Сыворотки исследовали в разведении 1/100. При этом в п

ДИА чувствительность КТС для штаммов F. tularensis составляла 10 м.к./мл, тогда как экспериментальные кроличьи сыворотки выявляли 106 м.к./мл возбудителя. Специфичность последних составляла 100 % для концентрации гетерологичных штаммов о

10 м.к./мл, тогда как при использовании КТС были отмечены перекрестные реакции с клетками Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Е. coli и S. paratyphi в концентрации до 107 м.к./мл. Для повышения специфичности полученных сывороток была проведена сорбция перекрестнореагирующих антител с применением в качестве адсорбентов микробных клеток чумного и псевдотуберкулезного микробов.

Из цельной гипериммунной сыворотки были получены Ig «ПАК», которые использовали при разработке экспериментальных антительных препаратов для детекции возбудителя.

Были сконструированы экспериментальные препараты для детекции возбудителя в ИФА и ДИА. Их активность проверена на расширенной панели чистых культур

E. tularensis разных подвидов (50 штаммов) и в среднем составила в ИФА (3,2±0,3)х105 м.к./мл, в ДИА - (6,5±0,4)х105 м.к./мл. При определении влияния способа инактивации бактериальных клеток на чувствительность ИФА и ДИА было установлено, что экспериментальные тест-системы в 10 раз чувствительнее при обработке культур F. tularensis фенолом без нагревания, чем формалином с прогреванием. Специфичность экспериментальных антительных препаратов была проверена на панели о из 30 гетерологичных штаммов и составила 100 % при концентрации 10 м.к./мл.

На основе антител к ПАК туляремийного микроба был получен экспериментальный латексный диагностикум, позволяющий выявлять Сар+ и Сар" штаммы

F. tularensis в РСА на стекле и PJIA микрометодом. Чувствительность PJIA для Сар+ с 7 штаммов составляла 5^10 м.к./мл, для Сар" - 10 м.к./мл, тогда как коммерческий диагностикум для РНГА не выявлял Сар" штаммы F. tularensis в концентрации 109 м.к./мл.

Отработана экспериментальная технология изготовления на основе Ig «ПАК» и его Р(аЬ')2-фрагментов видоспецифических конъюгатов: иммунопероксидазных и с коллоидными металлами, позволившими повысить чувствительность ИФА и ДИА для клеток F. tularensis до 104 м.к./мл и упростить методику постановки анализа, используя прямой вариант. Были получены экспериментальные ФИТЦ-конъюгаты Ig «ПАК» и F(ab')2-фрагментов. При постановке МФА с использованием экспериментальных препаратов было отмечено специфическое свечение возбудителя в мазках-отпечатках органов зараженных вакцинным и вирулентными штаммами F. tularensis разных подвидов белых мышей на 3 креста, также как при использовании коммерческого диагностикума (ИДТЛ). При бактериологическом анализе отпечатков этих органов в 100 % проб был отмечен рост туляремийного микроба, а при их бактериоскопии (окраска мазков-отпечатков по Романовскому-Гимзе) возбудитель обнаруживали только в некоторых пробах, что согласуется с данными литературы [Сомова Н.М. и др., 1964; Олсуфьев Н.Г., 1975].

Были проведены лабораторные испытания сконструированных антительных иммунодиагностикумов (ИФА и ДИА) для обнаружения возбудителя туляремии у экспериментально зараженных лабораторных животных, в искусственно контамини-рованных пробах и в природном материале. Исследование суспензий печени и селезенки от 41 экспериментально зараженной белой мыши показало, что возбудитель туляремии выявлялся с помощью ИФА в 34 пробах (83 %), ДИА в 29 пробах (71 %), тогда как бактериологическим методом - только в 15 пробах (36,6 %). В период от 1 до 8 суток после заражения была отмечена 100 % корреляция между результатами бактериологического анализа и экспериментальными ИФА и ДИА. При сравнении полученных результатов с использованием коммерческой диагностической тест-системы ИФА-Тул-СтавНИПЧИ было показано, что возбудитель туляремии обнаруживался только в 22 пробе из 41 (54 %). В ранние сроки (до 8 сут.) корреляция полученных результатов с помощью ИФА-Тул-СтавНИПЧИ с результатами бактериологического анализа и экспериментальными антительными диагностическими препаратами соответствовала 95 %.

Пороговый уровень чувствительности экспериментальных тест-систем для детекции туляремийного микроба в ИФА и ДИА в модельных опытах: пробы почвы, речной воды, суспензии паренхиматозных органов и сыворотки белых мышей, искусственно контаминированные различными концентрациями вакцинного штамма

F. tularensis 15 НИИЭГ, составил 2><105 м.к./мл. При апробации разработанной экспериментальной тест-системы для выявления возбудителя туляремии в смешанных культурах использовали взвесь клеток F. tularensis 15 НИИЭГ с Y. pestis EV, Y. pseudotuberculosis I серовара, Y. enterocolitica 121 и Brucella abortus 19ВА. В этом случае чувствительность составила 6x105 м.к./мл при 100 % специфичности для гетео рологичных штаммов в концентрации 10 м.к./мл.

Поскольку Саратовская область относится к энзоотичным по туляремии территориям [Федорова 3. П., 1995; Матросов А. Н. и др., 2007], представляло интерес использовать разработанные экспериментальные иммунодиагностические препараты для анализа природного материала. На обнаружение антигенов туляремийного микроба было проанализировано 106 проб от фоновых животных, собранных при эпизо-отологическом обследовании зеленой зоны Саратова. Положительные результаты получены ИФА и ДИА в 17 (16 %) и 15 (14 %) случаях, соответственно. При этом было отмечено, что положительные пробы встречались в трех из 15 исследованных природных эпитопов.

Поскольку препарат ПАК-15 получен из культуры F. tularensis голарктического подвида, вирулентные штаммы которого циркулируют в природных очагах на территории нашей страны и соседних государств, а по своему строению и свойствам он не отличался от препаратов, полученных из штаммов других подвидов, в дальнейшем этот препарат применяли для разработки экспериментальных антигенных препаратов. Сконструированные антигенные препараты для ИФА на основе ПАК выявляли специфические антитела как в гипериммунных туляремийных сыворотках (в титрах 1/51200-1/204800), так и у зараженных, иммунизированных и вакцинированных лабораторных животных (в титрах 1/800-1/3200). Использование гликозилированного белкового комплекса в качестве сенситина в ИФА также давало возможность выявления туляремийных антител (у лабораторных животных в титре 1/100-1/400, в сыворотках - 1/3200). Специфичность экспериментальных антигенных диагностикумов в обоих случаях составила 100 % в отношении нормальных сывороток и коммерческих гетерологичных антительных препаратов. Показана возможность использования ПАК-15 в иммуноблоттинге для регистрации туляремийной инфекции у лабораторных животных. Идентификация проводилась по антигенам с молекулярной массой около 43 и 17 кДа. Антитела к F. tularensis регистрировались у белых мышей, зараженных вакцинным штаммом туляремийного микроба в дозе 104 м.к./мл в течение 2 месяцев (срок наблюдения). Применение препаратов антигенных комплексов в качестве маркерных антигенов в иммуноблоттинге может использоваться как подтверждающий тест при постановке ИФА и ДИА.

Таким образом, протективный комплекс туляремийного микроба разных подвидов является общим антигеном для F. tularensis, обладающим выраженными имму-номодулирующими свойствами, в состав которого входят ЛПС и биологически активные белки ВМ F. tularensis (белки-шапероны, ферменты, регуляторные белки), а его присутствие на поверхности клетки не зависит от формы ЛПС и наличия капсулы. Полученные в работе данные представляют научный и практический интерес, расширяют существующие представления об антигенном строении возбудителя туляремии и могут быть полезны для понимания биологических особенностей F. tularensis. Сконструированные экспериментальные иммунодиагностические препараты могут быть использованы для детекции штаммов F. tularensis разных подвидов, в том числе Сар" -штаммов, и противотуляремийных антител. Разработанные способы выявления и получения антигенных комплексов, их иммунодоминантных компонентов и специфических антител могут служить основой для создания новых средств диагностики туляремии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кузнецова, Екатерина Михайловна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аверин С. Ф., Хлебников В. С., Головлев И. Р. и др. Выделение протек-тивного антигена из состава внешних мембран возбудителя туляремии и его основные свойства // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ: Матер. Рос. науч. конф. - Волгоград, 1992. - С. 68.

2. Ананова Е. В., Каменова Л. С., Мещерякова И. С., Савельева Р. А. Обнаружение возбудителя туляремии у больных с помощью реакции иммунофлюоресцен-ции // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1989. - №4. - С. 46-49.

3. Анциферов М. И. Сравнительная оценка питательных сред в бактериологической диагностике туляремии // Изв. Иркутск, противочумного ин-та Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1959. - Т. 21. - С. 148-177.

4. Аронова Н. В., Павлович Н. В. Использование препаратов ЛПС F. tularensis в точечном ИФА для обнаружения противотуляремийных антител // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол,- 2000,- № 5.- С. 75-78.

5. Аронова Н. В., Павлович Н. В. Фазовые вариации липополисахарида Francisella tularensis при инфекции человека // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2005. - № 4. - С. 8-12.

6. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: МЕДГИЗ, 1962. - 180 с.

7. Безсмертный В. Е., Горшенко В. В., Попов В. П. К оценке эпидемической и эпизоотической ситуации по туляремии в Российской Федерации // Проблемы особо опасных инф. - 2008 . - Вып. 96. - С. 8-12.

8. Васенин А. С., Вейнблат В. И., Самойлова Л. В. О перекрестном иммунитете против чумы и туляремии // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1980. - № 2,- С.49-52.

9. Васильев Н. Т., Оборин В. А., Васильев П. Г. и др. Спектр чувствительности Francisella tularensis к антибиотикам и синтетическим антибактериальным препаратам // Антибиотики и химиотерапия.- 1989. - Том 34. - № 9. - С. 662-665.

10. Вахрамеева Г. М., Лапин А. А., Павлов В. М. и др. ПЦР дифференциация подвидов Francisella tularensis с помощью одного праймера // Проблемы особо опасных инф. - 2011 . - Вып. 107. - С. 46-48.

11. Вейнблат В. И., Дальвадянц С. М., Веренков М. С. Методы получения и очистки капсульного антигена и эндотоксина возбудителя чумы // Лабораторное дело. - 1983.-№ 12. - С.37-39.

12. Ветчинин С. С., Копылов П. X., Киселева Н. В. и др. Получение имму-номагнитных частиц для определения клеток Francisella tularensis II Проблемы особо опасных инф. - 2011 . - Вып. 109. - С. 50-53.

13. Водопьянов А. С., Водопьянов С. О., Павлович Н. В. и др. Вариабельные тандемные повторы у Francisella tularensis: компьютерный анализ генома и использование для молекулярного типирования // Биотехнология. - 2003. - №1. - С. 7378.

14. Водопьянов А. С., Павлович Н. В., Водопьянов С. О. и др. Генотипиро-вание методом мультилокусного VNTR-анализа штаммов Francisella tularensis, выделенных из природных очагов туляремии Ростовской области // Молекуляр. генетика, микробиол. вирусол.. - 2004. - № 2. - С.24-28.

15. Водопьянов А. С., Павлович Н. В., Водопьянов С. О., Мишанькин Б. Н. Дифференциация подвидов возбудителя туляремии // Чрезвыч. ситуации междунар. значения в общественном здравоохр. и санит. охрана террит. государств-участников СНГ: Матер. VII Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. -Оболенск, 2006. - С. 92-93.

16. Волох О. А., Шепелев И. А., Фирстова В. В. и др. Оценка иммунобиологической активности препаратов С-комплекса туляремийного микроба, как перспективного компонента химических вакцин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол. - 2007. - № 3: 16-21.

17. Галь Э., Медьеши Г., Верецкей Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. - М.: Мир, 1982. - 448 с.

18. Говорун В. М., Мошковский С. А., Тихонова О. В. и др. Сравнительная характеристика протеомных карт клинических изолятов Helicobacter pylory II Биохимия.-2003,-№ 1.-С. 52-60.

19. Гражданов А. К., Рахманкулова Т. К., Белоножкина Л. Б. Усовершенствование питательной среды для выделения возбудителя туляремии // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекцион-

ными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ.- Саратов, 2007. - С. 192-193.

20. Гузаева Т. В., Комаров А. М., Гречко Г. К. и др. Получение меченных европием моноклональных антител к Francisella tularensis и их применение в имму-ноанализе (DELFIA) // Актуальные проблемы профилактики туляремии: Сб. тезисов докл. Всесоюзн. конф. - Москва, 1991. - С. 45-46.

21. Деев С. М., Поляновский О. Л. Моноклональные антитела для диагностики и терапии // Биотехнология. - 2008. - № 2. - С. 3-13.

22. Домарадский И. В. Проблемы патогенности франциселл // Журн. мик-робиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2005. - № 1. - С. 106-110.

23. Дубровина В. И., Коновалова Ж. А., Татарников С. А. и др. Неспецифическая резистентность морских свинок в отношении F. tularensis с разными фено-типическими свойствами // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 198-200.

24. Егоров А. М. Теория и практика иммуноферментного анализа / А. М. Егоров, А. П. Осипов, Б. Б. Дзантиев, Е. М. Гаврилова - М.: Высш. шк., 1991. - 288 с.

25. Емельянова О. С. Микробиология туляремии. - В кн.: Туляремия. - М., 1960.-С. 51-95.

26. Емельянова О. С. К проблеме географической изменчивости туляре-мийного микроба // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1964. - № 3. - С. 7-11.

27. Ефременко В. И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. - Ставрополь: Ставрополье, 1996. - 131 с.

28. Жарникова И. В. Разработка суспензионного диагностикума для выявления возбудителя туляремии // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 2004.

- №1. - С.67-69.

29. Жарникова И. В. Носители биотической и абиотической природы для иммобилизации антител и конструирования диагностикумов // Биотехнология. - 2005.

- №1. - С. 27-33.

30. Жемчугов В. Е. Как мы делали химические вакцины. Записки о современных «охотниках за микробами». - М.: Наука, 2004 - 368 с.

31. Загоскина Т. Ю., Голубинский Е. П., Меринов С. П. и др. Современные подходы к конструированию диагностических тест-систем с использованием неорганических корпускулярных меток // Бюл. Вост.-Сиб. научного центра. - 2004. - Вып. 2. - №1. - С. 176-180.

32. Заднова С. П. Влияние полипептида с молекулярной массой 22 кДа на свойства клеточной поверхности штамма возбудителя чумы: Дис. ... канд. биол. наук. -Саратов, 1998.- 139 с.

33. Зайцева А. А., Гнусарева О. А., Остапович В. В. и др. Перспективы применения иммунохроматографической тест-системы для экспресс-выявления и идентификации возбудителя туляремии из природных очагов туляремии Северного Кавказа // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Матер, науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 170-172.

34. Звягинцева И. С., Быкова С. А., Гальченко В. Ф. Таксономическая структура галоархей, выявленная методом гель-электрофореза клеточных белков // Микробиология. - 1999. - Т. 68, № 2. - С. 283-288.

35. Кологоров А. И., Дмитриева Л. Н., Шиянова А. Е. и др. Эпидемиологическая ситуация по природно-очаговым и зоонозным инфекциям в Приволжском федеральном округе в 2000-2009 гг. и прогноз на 2010 г. // Проблемы особо опасных инф. - 2010. - Вып. 104. - С. 5-10.

36. Коновалова Ж. А., Дубровина В. И., Войткова В. В. и др. Влияние ли-пополисахарида туляремийного микроба на метаболическую активность фагоцитов // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2008. - Вып. 60, № 2. - С. 65-67.

37. Коноплева М. В., Кормилицына М. И., Фельдшерова А. А. и др. Разработка автоматизированного количественного агглютинационного теста (АКАТ) на основе РПГА для иммунодетекции ГгапЫзеПа шЬгетгя II Сб. материалов IX Съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. - Т. 3- С. 47-48.

38. Коровина О. В. Иммуноглобулинсвязывающий белок 63 кДа внешней мембраны возбудителя туляремии: Дис. ... канд. мед. наук. - Любучаны. - 1993. - 136 с.

39. Коротаева Н. Е. Низкомолекулярные белки теплового шока злаков в период действия высокой температуры и водного дефицита: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Иркутск, 2007. - 24 с.

40. Куанбаев Д. Н., Чимиров О. Б., Темиралиева Г. А. и др. Иммуноглобу-линовый пенициллиназный конъюгат для выявления антигена возбудителя туляремии // Лабораторное дело. - 1990. - № 1. - С. 44-46.

41. Кудрявцева Т. Ю., Комбарова Т. И., Павлов В. М. FOPA белок внешней мембраны вакцинного штамма Francisella tularensis: выделение и моделирование структуры // Чрезвыч. ситуации междунар. значения в общественном здравоохр. и са-нит. охрана террит. государств-участников СНГ: Матер. VII Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Оболенск, 2006. - С. 110.

42. Кулевацкий Д. П. Липополисахаридобелковые комплексы внешней мембраны возбудителя туляремии: Дис. ... канд. биол. наук. - Любучаны. - 1994. -133 с.

43. Куличенко А. Н., Осина Н. А., Портенко С. А. и др. Алгоритм многофакторной генной диагностики особо опасных инфекций // Чрезвыч. ситуации междунар. значения в общественном здравоохр. и санит. охрана террит. государств-участников СНГ: Матер. VII Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Оболенск, 2006. - С. 215-216.

44. Куница Г. М., Айкимбаев М. А., Тлеугабылов М. К. и др. Биохимическая характеристика штаммов туляремийного микроба среднеазиатской географической расы // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1972. - № 2. - С. 124-127.

45. Куница Т. Н., Айманова О. Я., Темиралиева Г. А. и др. Обнаружение антигенов туляремийного микроба в крови экспериментально зараженных животных //Проблемы особо опасных инф. - 2001. - Вып. 81. - С. 159-161.

46. Курчева С.А., Бабий A.M. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - № 2 (22), приложение, чЛ. — С. 180-181.

47. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии: учеб. пособие. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1983.-272 с.

48. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: практическое руководство/ под ред. Онищенко Г. Г., Кутырева В. В. - М.: ОАО Медицина, Шико, 2009. - 472 с.

49. Левичкин И. В., Арсеньева Д. А., Шульга А. А. Внутриклеточная растворимость гибридных гормонов роста // Молекулярная биология. - 1998. - Т. 32, № 2.-С. 317-322.

50. Лунин В. Г., Мещерякова И. С., Народницкий Б. С. и др. Суперэкспрессия гена белка TUL4 - основного белка наружной мембраны Francisella tularensis - в рекомбинантных штаммах К tularensis и Escherichia coli: новые подходы к созданию генно-инженерных живых и субъединичных вакцин для профилактики туляремии // Медицинская микробиология - XXI век: Матер. Всерос. науч.-практ. конф. - Саратов, 2004.-С. 136-137.

51. Луцик М. Д., Панасюк Е. Н., Луцик А. Д. Лектины. - Львов.: Вища Школа, 1981,- 155 с

52. Лящук А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4 из F. tularensis, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины // Биотехнология. -2006.-№5.-С.32-38.

53. Майский В. Г., Шишов И. Н., Басилова Г. И. Питательные потребности Francisella tularensis II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1984. - №6. -С. 20-23.

54. Маслова Н. Н., Павлович Н. В. Иммуномодулирующие и антитоксические свойства препаратов липополисахарида представителей рода Francisella II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1999.- № 4. - С. 50-53.

55. Матросов А. Н., Щербакова С. А., Слудский А. А. и др. Эпизоотологи-ческий мониторинг в природных очагах зоонозных инфекций в Саратовской области // Сб. материалов IX Съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - Москва, Т. 3. - С. 201.

56. Мезенцева О.Н., Мезенцев В.М. Совершенствование лабораторной диагностики туляремии при эпизоотологическом обследовании // Актуальные вопросы ООИ: Матер, регионал. науч.-практ. конф. - Нальчик, 2000. - С. 47-49.

57. Методические указания «Эпидемиологический надзор за туляремией»: МУ 3.1.2007-05 // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. - М. - 2005. - № 4(22). - С. 101-142.

58. Методические указания «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба»: МУ 3.3.1.2161-07. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. - 2007.

59. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке: в 3 т. / пер. с англ. А. Е. Браунштейна, Л. М. Гинодмана, Е. С. Северина; науч. ред. Л. Г. Тер-Саркисян. -М.: Мир, 1980.

60. Мещерякова И. С., Умнова Н. С., Шаханина К. Л., Павлова И. П. Использование иммуноферментного метода ELISA для выявления возбудителя туляремии // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1988. - № 2. - С. 109-112.

61. Мещерякова И. С., Кормилицына М. И., Родионова И. В., Константинова Н. Д. Характеристика новых видов патогенных микроорганизмов рода Francis ella // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1995. - № 5. - С. 3-10.

62. Мещерякова И. С. Туляремия // Сб. Природная очаговость болезней: исследования института Гамалеи РАМН. - Москва, 2003. - С. 137-160.

63. Мещерякова И. С., Демидова Т. Н., Горшенко В. В. Актуальные аспекты эпидемиологии и профилактики туляремии // Сб. материалов IX Съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов- Москва, 2007.-Т. 3,-С. 204-205.

64. Мишанысин Б. Н., Павлович Н. В., Романова Л. В. и др. Туляремия // Лабораторная диагностика возбудителей ООИ. - Саратов, 1998. - Т. 1. - С. 111-143.

65. Мокриевич А. Н., Платонов М. Е, Вахрамеева Г. М. и др. Влияние но-каутной мутации в гене QSEC на биологические свойства туляремийного микроба // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 252254.

66. Мокриевич А. Н., Кондакова А. Н., Валаде Э. и др. Биологические свойства и строение липополисахарида вакцинного штамма ЕгапЫвеНа ш1агет1$, полученного при инактивации гена системы «чувства кворума» qseQ, II Биохимия. -2010. - Т. 75, Вып. 4. - С. 539-548.

67. Морозова Т. П., Храмов М. В., Домотенко Л. В. и др. Оценка диагностических свойств сухой питательной среды для культивирования и выделения туля-ремийного микроба (БТ-агар) // Чрезвыч. ситуации междунар. значения в общественном здравоохр. и санит. охрана террит. государств-участников СНГ: Матер. VII Меж-госуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Оболенск, 2006. — С. 222-224.

68. Морозова О. В., Гуляко Л. Ф., Зайнулина 3. У. и др. ПЦР-детекция Е ш1агет1$ II Сб. материалов III Российской научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2006. - С. 199-200.

69. Никифоров В. В., Кареткина Г. Н. Туляремия: от открытия до наших дней // Инфекционные болезни. - 2007. - Т. 5. - №1. - С. 67-76.

70. Николаев В. Б. Характеристика иммунологических методов обнаружения антигенов ЕгапсхъеИа Ыагет1з и антител к ним // Бюл. Вост.-Сиб. научн. центра. - 2004. - Вып.2. - № 1. - С. 184-189.

71. Окунев Л. П., Мазепа А. В. Эпизоотолого-эпидемиологическая ситуация в природных очагах туляремии Сибирского и Дальневосточного федеральных округов в 2010 г. и прогноз на 2011 г. // Проблемы особо опасных инф. - 2011. - Вып. 107.-С. 29-30.

72. Олсуфьев Н. Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. - М.: Медицина. - 1975,- 190 с.

73. Олсуфьев Н. Г., Мещерякова И. С. Дальнейшее изучение внутривидовой таксономии возбудителя туляремии // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммуноби-ол.-1981.-№ 10.-С. 16-21.

74. Онищенко Г. Г. Постановление гл. гос. сан. врача РФ «Об усилении мероприятий по предупреждению распространения туляремии в РФ» №33 от 20.12.05 г. // Сибирь-Восток - 2006. - № 1,- С. 38-39.

75. Оноприенко Н. Н., Павлович Н. В. Роль липополисахарида в токсичности бактерий рода ЕгаызеПа II Молекулярная генетика. - 2003. - № 3.- С. 23-28.

76. Оноприенко Н. Н., Павлович Н. В. Влияние хемотипа липополисаха-ридов Francisella tularensis на аффинитет к липополисахаридсвязывающему белку сыворотки крови человека // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 260-261.

77. Оноприенко Н. Н., Павлович Н. В. Взаимодействие S- и R-липополисахаридов Francisella tularensis с липополисахаридсвязывающим белком сыворотки крови человека // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -2008. № 4. С. 16-21.

78. Осин Н. С., Храмов Е. Н., Злобин В. Н. Технические средства индикации биопатогенов как основа обеспечения биологической безопасности // Молекулярная медицина,- 2006. - № 3. - С. 24-33.

79. Осина Н. А., Мошкова М. С., Уткин Д. В. и др. Идентификация подвидов туляремийного микроба методом мультиплексной полимеразной цепной реакции // Проблемы особо опасных инф. - 2007. - Вып. 93. - С. 92-93.

80. Остерман JI. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. - М.: Наука, 1981. - 288 с.

81. Павлов В. М., Родионова И. В., Мокриевич А. Н., Мещерякова И. С. Выделение и молекулярно-генетическая характеристика криптической плазмиды из штамма Francisella Novicida Like F6168 // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1994.-№3,-С. 39-40.

82. Павлова В. И., Тараненко Т. М., Киреев М. Н. и др. N-ацетилгексозамины как маркеры липополисахаридов у возбудителей чумы, холеры и туляремии // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. -С. 265-266.

83. Павлович Н. В., Шиманюк Н. Я., Мишанькин Б. Н. Механизм природной пенициллиноустойчивости у возбудителя туляремии // Антибиотики. - 1983. - № 7. С. 517-521.

84. Павлович Н. В., Шиманюк Н. И., Мишанькин Б. Н. Нейроминидазная активность у представителей рода Fracisella И Журн. микробиол. эпидемиол. и имму-нобиол. -1992. - № 9 - 10. - С. 8 - 12.

85. Павлович Н. В., Мишанькин Б. Н. Фосфатазная и пенициллиназная активности как стабильные признаки для дифференциации расовой принадлежности Francisella tularensis // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1992. - № 1-12. -С. 5-7.

86. Павлович Н. В., Мишанькин Б. Н., Данилевская Г. И. и др. Получение бескапсульных вариантов Francisella tularensis 11 Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1993. -№ 2. - С. 7-11.

87. Павлович Н. В., Цимбалистова М. А., Маслова Н. Н. Быстрый метод оценки вирулентности Francisella tularensis in vitro II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1997.- №2,- С. 17-20.

88. Павлович Н. В., Тынянова В. П., Аронова Н. В. Модификация ЛПС как механизм реализации токсического потенциала патогенных бактерий // Сб. материалов Всерос. научно-практич. конф. «Медицинская микробиология - XXI век». - Саратов, 2004. - С. 175 - 176.

89. Пат 2147234 Российская Федерация, А61К 31/70, А61К 38/08. Препарат для профилактики и лечения особо опасных инфекционных заболеваний / Жемчугов В. Е., Кутырев В. В. - 10.04.2000.

90. Пат 2221591 Российская Федерация, А61К 39/40, C12N 1/00, А61Р 31/00. Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии / Жемчугов В. Е., Дятлов И. А., Кутырев И. А., Волох О. А. - 20.01.2004.

91. Пат 2352633 Российская Федерация, C12N7/00. Штамм туляремийного бактериофага ГАЛ / Григорьев А. А., Бондарев В. П., Борисевич И. В., Дармов И. В., Кузнецов С. Л., Погорельский И. В. - 20.04.2009.

92. Пекшев А. В., Елагин Г. Д., Пятков В. А. Разработка эритроцитарного диагностикума для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария. - Киров, 1998.-С. 185-186.

93. Полтавченко А. Г., Яковченко А. М., Кривенчук Н. А., Зайцев Б. Н. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. Выбор формата бел-

ковых чипов и материала для изготовления подложки // Биотехнология,- 2006. - № 5. -С. 77-87.

94. Пономарева И. В. Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением для определения туляремийных антигенов и антител к ним // Актуальные проблемы профилактики туляремии: Сб. тезисов докл. Всесоюзн. конф. - Москва, 1991.-С. 149.

95. Преображенский H.A. Химия биологически активных природных соединений (углевод-белковые комплексы, хромопротеиды, липиды, липопротеиды, обмен веществ) / Под ред. H.A. Преображенского и Р.П. Евстигнеевой. - М.: «Химия», 1976.-С. 72-99.

96. Родионова И. В., Шипицина Г. К. Иммунохимическая характеристика двух географических разновидностей туляремийного микроба // Биохимия. - 1967. -№6.-С. 1161-1167.

97. Родионова И. В. Дыхание географических разновидностей Francisella tularensis в присутствии глицерина // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол.-1967,-№5.-С. 21-25.

98. Родионова И. В. Дифференциация географических рас Francisella tularensis на основании активности цитруллинуреидазы // Лабораторное дело. -1970. -№ 1. - С. 42-43.

99. Родионова И. В. Некоторые особенности метаболизма Francisella tularensis Media Asiatica AIKIMB II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол.-1972. -№3._ С. 7-11.

100. Родионова И. В., Константинова Н. Д., Бруханский Г. В. Наружные мембраны туляремийного микроба и их белковый состав // Молекулярная генетика. -

1989.-№12,-С. 22-25.

101. Родионова И. В., Захаренко В. И. Антигенный состав белков наружней мембраны туляремийного микроба // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -

1990. - № 11.-С. 16-18.

102. Рокицкий П. Ф. Биологическая статистика. - 3-е изд., испр. - Минск: Вышэйш. школа, 1973. - 320 с.

103. Романова Л. В., Мишанькин Б. Н., Павлович Н. В. ДНК-зонд для идентификации представителей р. Francisella II Биотехнология. - 1992. - № 4. - С. 52-55.

104. Романова JI. В., Мишанькин Б. Н., Сучков И. Ю. Полимеразная цепная реакция: генотипический скрининг штаммов Francisella tularensis с использованием неспецифических прайм еров // Биотехнология. -1993. - № 6. - С. 8-9.

105. Романова Л. В., Мишанькин Б. Н. Праймеры для родоспецифического обнаружения Francisella tularensis в полимеразной цепной реакции // Журн. микро-биол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1995. - № 5. - С. 77-80.

106. Романова Л. В., Водопьянов С. О., Саямов С. Р. и др. Тепловой стресс и белок теплового стресса GroEL у возбудителя туляремии // Биотехнология. - 2004.- № 5,-С. 33-38.

107. Романова Л. В. Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики: Автореф. дис.... докт. биол. наук. - Ставрополь, 2008. - 35 с.

108. Сборник инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов: утв. приказом МЗ СССР№31 от 13.01.83.-М, 1983.-С. 52-53.

109. Скатов Д. В., Хлебников В. С., Василенко Н. Р. и др. Влияние антигенных фракций внешней мембраны Francisella tularensis на функциональную активность макрофагов // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1993.- № 4,- С. 87-91.

110. Скатов Д. В., Галактионов В. Г., Семенкова Л. Н., Хлебников В. С. Влияние антигенных фракций внешней мембраны Francisella tularensis на некоторые показатели Т-клеточного звена иммунитета // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1994,- № 3,- С. 100-103.

111. Скопинская С. Н., Тамулевич Я. А., Ярков С. П. и др. Высокочувствительный, гомогенный метод определения антител и антигенов с помощью липосом, моноклональных антител и комплемента // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол.-1993.-№ 1. - С. 77-82.

112. Скопинская С. Н., Ярков С. П., Храмов Е. Н. Применение флуоресцентного липосомального иммуноанализа для выявления антител к возбудителям туляремии, холеры, брюшного тифа, сапа и мелиоидоза // Проблемы особо опасных инф. - 2007. - Вып. 94. - С. 67-71.

113. Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1985. - С. 337 - 350.

114. Смирнов В.В., Чаплинский В.Я., Андреева З.М. и др. Научные основы производства диагностических препаратов. - Киев: Наукова думка, 1980. - 195 с

115. Смирнова Ю. А., Кордюкова JI. В., Серебрякова М. В. и др. Вирион вируса гриппа как субстрат протеолитических ферментов // Биоорганическая химия.-2008. - Том. 34, № 3. - С. 409-415.

116. Сомова Н. М., Гурьянова JL И. Обнаружение возбудителя чумы и туляремии в органах животных методом люминесцентной микроскопии // Микробиология и иммунобиология ООИ: Сб. науч. работ противочум. учреждений страны. - Саратов, 1964. - С. 240-242.

117. Сорокин В. М., Павлович Н. В., Прозорова А. А. Роль поверхностных структур в проявлении вирулентности Francisella tularensis // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ: Сб. материалов Российской науч. конф. - Волгоград, 1992.-С. 130.

118. СП 1.3.1285-03. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». - М., 2003.

119. СП 1.3.2322-08. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». М., 2008.

120. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. - 1958. - Т. 23, Вып. 5,- С. 656-662.

121. Сухарь В. В., Непомнящая Н. Б. Липоолигосахаридный О-антиген Francisella tularensis II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 2009. - № 5. -С. 110-113.

122. Сырова Н. А., Терешкина Н. Е., Девдариани 3. Л. Современное состояние иммунодиагностики туляремии // Проблемы особо опасных инф. - 2008. -Вып. 97,-С. 12-15.

123. Топорков В. П., Величко Л. Н., Васенин А. С. Состояние заболеваемости туляремией в Федеральных округах Российской Федерации с 1998 по 2005 год // Проблемы особо опасных инф. - 2007. - Вып. 93. - С. 46-48.

124. Третьяков С. И., Ярков С. П., Злобин В. Н., Калинин Ю. Т. Использование твердофазного липосомального иммуноанализа для определения бактериально-

го антигена липополисахаридной природы // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммуно-биол. - 1992. - №11. - С.43-46.

125. Туляремия: руководство / под ред. проф. Н. Г. Олсуфьева, Г. П. Руднева. - М.: Медгиз, I960,-458 с.

126. Турцева М. А., Кресова У. А., Матросов А. Н. и др. Новые данные о распространении иксодовых клещей и переносимых ими возбудителей природно-очаговых инфекций в Саратовской области // Проблемы особо опасных инф. - 2009. -Вып. 102.-С. 40-44.

127. Уткин Д. В., Куличенко А. Н., Кутырев В. В. Биочипы, как средство многофакторного анализа // Сб. материалов IX Съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - Москва, 2007. - Т. 3. - С. 87.

128. Федорова 3. П. Туляремия в Саратовской области: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1995. - 26 с.

129. Фримель Г. Иммунологические методы / пер. с нем. А. П. Тарасова. -М.: Медицина. - 1987. - 472 с.

130. Хлебников В. С., Головлев И. Р., Кулевацкий Д. П. и др. Изучение биохимических, антигенных и протективных свойств внешней мембраны возбудителя туляремии // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 1991. - № 7. - С. 15-20

131. Хлебников В. С., Ветчинин С. С., Гречко Г. К. и др. Превентивная активность моноклональных антител, специфичных к липополисахариду Francisella tularensis II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1992. - № 9-10. - С. 67-70.

132. Хлебников В. С., Кулевацкий Д. П., Головлев И. Р. и др. Исследование ЛПС-белкового комплекса из внешней мембраны Francisella tularensis II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1992. - № 3. - С. 13-17.

133. Хлебников В. С., Головлев И. Р., Тохтамышева Н. В. и др. Определение антигенной детерминанты превентивных моноклональных антител специфичных к липополисахариду Francisella tularensis II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1993. -№ 1. - С. 83-88.

134. Хлебников В. С., Головлев И. Р., Чугунов А. М. и др. Защитные свойства внешних мембран Francisella tularensis при экспериментальной инфекции морских свинок // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1994, № 1. - С.84-88.

135. Цимбалистова М. В., Павлович Н. В. Фосфотазная активность у представителей рода Francisella И Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1998. -№1,-С. 10-13.

136. Цимбалистова М. В., Павлович Н. В. Внутривидовая дифференциация штаммов F. tularensis subsp. holarctica var. Japónica 11 Медицинская микробиология — XXI век: Матер. Всерос. науч.-практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 232-233.

137. Шеенков Н. В., Опочинский Э. Ф., Валышев А. В. и др. Факторы пер-систенции Francisella tularensis II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -2006.-№ 1.-С. 63-66.

138. Шепелев И. А., Волох О. А., Еремин С. А., Дятлов И. А. Оптимизация способа получения «С»-комплекса туляремийного микроба // Проблемы особо опасных инф. - 2006. -Вып. 92. - С. 61-64.

139. Шепелев И. А. Оптимизация условий масштабируемого культивирования туляремийного микроба в технологиях получения протективных анитигенов: Дисс. ... канд. биол. наук. — Саратов, 2005. - 133 с.

140. Шиманюк Н. Я., Павлович Н. В., Мишанькин Б. Н. Супер оксид дисму-тазная активность у представителей рода Francisella II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1992. - № 5-6. - С. 7-9.

141. Щербаков А. А. Мембранные белки чумного микроба (теоретические и прикладные аспекты): Автореф... доктора биол. наук. - Саратов, 1991. - 44 с.

142. Юров С. В., Пчелинцева С. Ю., Афанасьев С. С. и др. Использование микроточечного иммуноферментного анализа с визуальной индикацией для определения туляремийных антител // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. —1991. - № 3.-С. 61-64.

143. Юров С. В., Пчелинцева С. Ю., Афанасьев С. С. и др. Особенности антительного ответа у животных иммунизированных компонентами поверхностных структур Francisella tularensis // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1991,-№8,- С. 54-58.

144. Яшечкин Ю. И., Куличенко А. Н., Ивашенцева JI. Н. и др. ПЦР-тест-система для детекции возбудителя туляремии // Проблемы особо опасных инф. - 2003. - Вып. 81- С.159-163.

145. Abel К., Deschmertzing H., Peterson J. I. Classification of microorganisms by analysis of chemical composition //1. Feasibility of utilizing gas chromatography. J. of Bacteriology. - 1963. - Vol. 85. - P. 1039-1044.

146. Amenta J. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-bayer chromatography // J. Lipid Res. - 1964. - Vol. 5. - P. 270-272.

147. Ark N. M., Mann B. J. Impact of Francisella tularensis pilin homologs on pilus formation and virulence // Microb. Pathog. - 2011. - Vol. 51, N 3. - P. 110-120.

148. Baker C. N., Hollis D. G., Thornsberry C. Antimicrobial susceptibility testing of Francisella tularensis with a modified Mueller-Hinton broth // J. Clin. Microbiol. -1985.-Vol. 22,- P. 212-215.

149. Bakshi C. S., Malik M., Mahawar M., et al. An improved vaccine for prevention of respiratory tularemia caused by Francisella tularensis SchuS4 strain // Vaccine. -2008.-Vol 41, N26.-P. 5276-5288.

150. Balonova L., Hernychova L., Bilkova Z., et al. Mapping the presence of Francisela tularensis glycoproteins // 6th Int. Conference on Tularemia. - Berlin, 2009 (13-16.09).-P. 75.

151. Balonova L., Hernychova L., Mann B. F., et al. Multimethodological approach to identification of glycoproteins from the proteome of Francisella tularensis, an intracellular microorganism // J Proteome Res.- 2010. - Vol. 9, N 4. - P. 1995-2005.

152. Bandara A. B., Champion A. E. ., Wang X., et al. Isolation and mutagenesis of a Capsule-Like Complex (CLC) from Francisella tularensis, and contribution of the CLC to F. tularensis virulence in mice // PLoS ONE. - 2011 Apr. - 6 (4): el9003. Режим доступа: http://www.plosone. org.

153. Barker J. R., Klose К. E. Molecular and genetic basis of pathogenesis in Francisella tularensis // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2007. - Vol. 1105. P. - 138-159.

154. Barel M., Hovanessian A. G., Meibom K., et al. A novel receptor-ligand pathway for entry of Francisella tularensis in monocyte-like THP-I cells: interaction between surface nucleolin and bacterial elongation factor Tu // BMC Microbiology. - 2008. -Vol. 145, N8.-P. 1-19.

155. Barel M., Meibom K., Charbit A. Nucleolin, a shuttle protein promoting infection of human monocytes by Francisella tularensis II PLoS One. - 2010. - 5 (12): el4193. Режим доступа: http://www.plosone. org.

156. Barloge В., Spidzer G., Hart G. S., et al. DNA histogram analysis of human hemopoetic cells // Blood. - 1976. - Vol. 48, N 2. - P. 245-258.

157. Bavykin S. G., Lysov Y. P., Zakhariev V., et al. Use of 16S rRNA, 23S rRNA, and gyrB gene sequence analysis to determine phylogenetic relationships of Bacillus cereus group microorganisms // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 42. - P. 3711-3730.

158. Beasley A. S., Cotter R. J., Vogel S. N., et al. A variety of novel lipid a structures obtained from Francisella tularensis live obtained from Francisella tularensis live // Innate Immun. - 2011 Jun 27. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed.

159. Belyi Y. F., Petrosov V. V., Tartakovskii I. S., Suchkov Y. G. Live tularaemia vaccine but not proteins purified from Francisella tularensis can confer protection against lethal Listeria infection in mice // Acta Pathologica, Microbiol. Immunolog. Scand. - 1995. - Vol. 103.-P. 107-112.

160. Berdal B. R., Mehl R., Haaheim H., et al. Field detection of Francisella tularensis II Scand. J. Infect. Dis., 2000. - Vol. 3, N 3. - P. 287-291.

161. Bernard K., Tessier S., Winstanley J., et al. Early recognition of atypical Francisella tularensis strains lacking a cysteine requirement // J. Clin. Microbiol. - 1994. -Vol. 32.-P. 551-553.

162. Beutin L., Bode L., Richter Т. H., et al. Rapid visual detection of E. coli and Vibrio cholerae heat-labile enterotoxins by nitrocellulose enzyme-linked immunosorbent assay//J. Clin. Microbiol. - 1984.-Vol. 19, N. 3.-P. 371-375.

163. Bevanger L., Maeland J. A., Naess A. I. Agglutinms and antibodies to F. tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia // J. Clin. Microbiol. - 1988. - Vol. 26. - P. 433-437.

164. Bevanger L., Maeland J. A., Naess A. I. Competitive enzyme immunoassay for antibodies to a 43 000-molecular-weight Francisella tularensis outer membrane protein for the diagnosis of tularemia 11 J. Clin. Microbiol. - 1989. - Vol. 27. - P. 922-926.

165. Bevanger L., Maeland J. A., Kvam A. I. Comparative analysis of antibodies to Francisella tularensis antigens during the acute phase of tularemia and eight years later // J. Clin, and Diagnostic Lab. Immunology. - 1994. - Vol. 1, N 2. - P. 238-240.

166. Bhatti A. R., Wong J. P., Woods D. E. Production and partial characterization of hybridoma clones secreting monoclonal antibodies against Francisella tularensis II Hybridoma. - 1993. - Vol. 12. - P. 197-202.

167. Bochet P., Rugheimer F., Guina Т., Brooks P., et al. Fragmentation-free LC-MS can identify hundreds of proteins // Proteomics.- 2011.- Vol. 11. -P. 22-32.

168. Boivin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Extraction d un complex toxique et antigenique a partir du tecilli dAertrycke // C. R. Soc. Biol. - 1933. - Vol. 114, N 3. - P. 307-310.

169. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem.

- 1976.-V. 72. - P. 248 - 254.

170. Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A., et al. Genomewide DNA micro-array analysis of Francisella tularensis strains demonstrates extensive genetic conservation within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent F. tularensis subs, tularensis II J. Clin. Microbiol. -2003. - Vol. 41. - P. 2924-2931.

171. Broms J. E., Lavander M., Meyer L., Sjostedt A. IglG and Igll of the Francisella pathogenicity island are important virulence determinants of Francisella tularensis LVS // Infect. Immun. - 2011. - Vol. 79, N 9. - P. 3683-3696.

172. Carlsson H. E., Lindberg A. A., Lindberg G., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for immunological diagnosis of human tularemia // J. Clin. Microbiol.

- 1979.-Vol. 10.-P. 615-621.

173. Colquhoun D. J., Duodu S. Francisella infections in farmed and wild aquatic organisms // Veterinary Research. - 2011 Mar 8. - 42 (1): 47. - Режим доступа: http ://www. veterinaryresearch.

174. Conlan J. W. Vaccines against Francisella tularensis - past, present and future // Expert Rev. Vaccines. - 2004. - Vol. 3, N 3. - P. 307-314.

175. Corey D. C., Soni S., Gunn J. S., Schlesinger L. S. Evasion of complement-mediated lysis and complement C3 deposition are regulated by F. tularensis lipopolisaccharide О antigen // J. Immunol. - 2008. - Vol. 181, N 8. - P. 5568-5578.

176. Cowley S. C., Myltseva S. V., Nano F. E. Phasa variation in Francisella tularensis growth, lipopolisaccharide antigencity and nitric oxide production // Mol. Microbiol.- 1996. - Vol. 20, N 4. - P. 867-874.

177. Crowe E., Valladares R., Vu C., et al. Determination of Francisella tularensis AcpB acid phosphatase substrate preferences // J Mol. Microbiol. Biotechnol. -2010.-Vol. 19,N4.-P. 198-203.

178. DeBey В. M., Andrews G. A., Chard-Bergstrom C., Cox L. Immunohistochemical demonstration of Francisella tularensis in lesions of cats with tularemia // J. Vet. Diagn. Invest., 2002. - Vol. 14. - P. 162-164.

179. Dennis D. Т., Inglesby Т. V., Henderson D. A., et al. Tularemia as a biological weapon-medical and public health management // JAMA. - 2001. - Vol. 285. - P. 27632773.

180. Dice L. R. Measurement of the amount of ecologic association between species // Ecology. - 1945. - Vol. 26. - P. 297-302.

181. Dieppedale J., Sobral D., Dupuis M., et al. Identification of a putative caperone involved in stress resistance and virulence in Francisella tularensis II Infect. Immun. - 2011. - Vol. 79, N 4. - P. 1428-1439.

182. Inzana T. J., Glindemann G. E., Snider G., et al. Characterization of a wildtype strain of Francisella tularensis isolated from a cat 11 J Vet. Diagn. Invest. - 2004. - Vol. 16.-P. 374-381.

183. Egge-Jacobsen W., Salomonsson E. N., Aas F. E., et al. O-linked glycosyla-tion of the PilApilin protein of Francisella tularensis: identification of the endogenous protein-targeting oligosaccharyltransferase and characterization of the native oligosaccharide // J Bacterid. - 2011 July 29. - 193 (14), doi:10.1128/JB.00383-ll. Режим доступа: http://jb.asm.org/papbyrecent.dtl.

184. Ellis J., Petra C. F. Oyston, Green M., Titball R. Tularemia // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 15. - P. 631-646.

185. Emanuel P. A., Bell R., Dang J. L., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using hand-held PCR thermocycler // J. Clin. Microbiol. -2003,- Vol. 41.-P. 689-693.

186. Ericsson M., Golovliov I., Sandstrom G., et al. Characterization of the nucleotide sequence of the groE operon encoding heat shock proteins chaperone-60 and -10 of Francisella tularensis and determination of the T-cell response to the proteins in individuals vaccinated with F. tularensis II Infection and Immunity. - 1997. - Vol. 65. - P. 1824-1829.

187. Eyles J. E., Unal В., Hartley M.G., et al. Immunodominant Francisella tularensis antigens identified using proteome microarray // Proteomics. - 2007. - N 7. - P. 2172-2183.

188. Farlow J., Wagner D. M., Dukerich M., et al. Francisella tularensis in the United States // Emerg. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 11, N 12. - P. 225-30.

189. Fenselau C., Demirev P. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry // Mass Spectrometry Reviews. - 2001. - Vol. 20. - P. 157-171.

190. Fomsgaard A. Antibodies to LPS: some diagnostic and protective aspects // AMPIS Suppl.- 1990. - Vol. 18. - P. 1-38.

191. Forslund A. L., Salomonsson E., Kuoppa K., et al. Role of Type IV pilin genes in virulence of Francisella tularensis subspecies holarctica and tularensis II 6th Int. Conference on Tularemia. - Berlin, 2009 (13-16.09). - P.88.

192. Forsman M., Sandstrom G., Jaurin B. Identification of Francisella species and discrimination of type A and type В strains of F. tularensis by 16S rRNA analysis // Applied and Environmental Microbiology. - 1990. - Vol. 56. - P. 949-955.

193. Francis E. Tularemia // JAMA. - 1983. - Vol. 259. - P. 3216-3223.

194. Fujita O., Tatsumi M., Tanabayashi K., Yamada A. Development of a realtime PCR assay for detection and quantification of Francisella tularensis // Japanese J. of Infectious Diseases. - 2006. - Vol. 59. - P. 46-51.

195. Fulop M., Webber Т., Manchee R. J., Kelly D. C. Production and characterization of monoclonal antibodies directed against the lipopolysaccharide of F. tularensis // J. of Clinical Microbiology. - 1991. - Vol. 29, N. 7. - P. 1407-1412.

196. Fulop M., Leslie D., Titball R. A rapid highly sensitive method for the detection of F. tularensis in clinical // J. Trap. Med. Hyg. -1996. - Vol. 54. - P. 364-366.

197. Fulop M., Manchee R., Titball R. Role of two membrane antigens in inuction of different virulence // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1996. - Vol. 13. - P. 245-247.

198. Fulton К. M., Zhao X., Petit M. D., et al. Immunoproteomic analysis of the human antibody response to natural tularemia infection with Type A or Type В strains or LVS vaccination // Int. J Med. Microbiol. — 2011 Aug 27. Режим доступа: http ://www.unboundMEDLINE.

199. Gallagher L. A., Ramage E., Jacobst M. A., et al. A comprehensive trans-poson mutant library of Francisella novicida, a bioweapon surrogate // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2007.-Vol. 104.-P. 1009-1014.

200. Gallagher-Smith M., Kim J., Al-Bawardy R., Josko D. Francisella tularensis: possible agent in bioterrorism // Clin. Lab. Sei. - 2004. - Vol. 17, N 1. - R 35-39.

201. Garcia del Blanco N., Dobson M. E., Vela A. I., et al. Genotyping of Francisella tularensis strains by pulsed-field gel electrophoresis, amplified fragment length polymorphism fingerprinting, and 16S rRNA gene sequencing // J. of Clinical Microbiology. - 2002. - Vol. 40. - P. 2964-2972.

202. Garcia del Blanco N., Gutierrez C. B., de la Puente V. A., Rodriguez Ferri E. F. Biochemical characterization of Francisella tularensis strains isolated in Spain // Vet. Ree. - 2004. - Vol. 154. - P. 55-56.

203. Gaspar A. J., Tresselt H. B., Ward M. K. New solid medium for enhanced growth of Pasteurella tularensis II J. of Bateriology. - 1961. - Vol. 82. - P. 564-569.

204. Gee J. E., De B. K., Levett P. N., et al. Use of 16S rRNA gene sequencing for rapid confirmatory identification of Brucella isolates // J. of Clinical Microbiology. -2004. - Vol. 42. - P. 3649-3654.

205. Gil H., Thanassi D. G. Pilus-like surfase structures expressed by Francisella tularensis II Fourth International Conf. On Tularemia. - City of Bath, United Kingdom, 2003.-P 29.

206. Golovliov I. K., Kuoppa A., Sjöstedt A., et al. Cytokine expression in the liver of mice infected with higly virabut strain of Francisella tularensis II FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1996. - Vol. 13. - P. 239-244.

207. Gray C. G., Cowley S. C., Cheung K. K., Nano F. E. The identification of five genetic loci of Francisella novicida associated with intracellular growth // FEMS Microbiol. Lett. - 2002. - Vol. 215. - P. 53-56.

208. Greiser-Wilke I., Soine C., Moenning V. Monoclonal antibodies reacting specifically with Francisella sp. 11 J. Vet. Med. B. - 1989 - Vol. 36, N 8. - P. 593-600.

209. Grunow R., Bosold A., Schmitt P., et al. New approaches for the laboratory diagnosis of Francisella tularensis and human serum antibodies using specific ELISA and Westernblot // Jahrestagung der Gesellschaft fur Hygiene und Mikrobiologie. - 1999. - Vol. 14. - P. 335-338.

210. Grunow R. W., Splettstoesser S., McDonald C., et al. Detection of Francisella tularensis in biological specimens using a capture enzyme-linked

immunosorbent assay, an immunochromatographic handheld assay, and a PCR // Clin. Diagn Lab. Immunol. - 2000. - Vol. 7. - P. 86-90.

211. Gunn J. S., Ernst R. K. The structure and function of Francisella lipopoly-saccharide//AnnN YAcad Sei. -2007. - Vol. 1105. - P. 202-218.

212. Gutierrez M. P., Bratos M. A., Garrote J. I., et al. Serologic evidence of human infection by Francisella tularensis in the population of Castilla y Leon (Spain) prior to 1997 // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2003. - Vol. 35. - P. 165-169.

213. Havlasova J., Hernychova L., Halada P. et al. Mapping of immunoreactive antigens of Francisella tularensis live vaccine strain // Proteomics. - 2002. - Vol. 2. - P. 857-867.

214. Havlasova J., Hernychova L., Brychta M., et al. Proteomic analysis of anti-Francisella tularensis LVS antibody response in murine model of tularemia // Proteomics. -2005.-Vol. 5.-P. 2090-2103.

215. Hickey A. J., Hazlett K. R., Kirimanjeswara G. S., Metzger D. W. Identification of Francisella tularensis outer membrane protein A (FopA) as a protective antigen for tularemia // Vaccine. - 2011. - Vol 29 (40). - P. 6941-6947.

216. Higgins J. A., Hubalek Z., Halouzka J., et al. Detection of Francisella tularensis in infected mammals and vectors using a probe-based polymerase chain reaction // Am. J. Trop. Med. - 2000. - Vol. 62. - P. 310-318.

217. Hofer E., Schildorfer H., Fiatscher J., Müller M. Zum Nachweis der Tularämie bei Feldhasen (Lepus europaeus) in Österreich // Wien. Tierärztel. Monatsschr. - 1997. - Vol. 81,-P. 301-308.

218. Hollis D. G., Weaver R. E., Steigerwalt A. G., et al. Francisella philomiragia comb. nov. (formerly Yersinia philomiragia) and Francisella tularensis biogroup novicida (formerly Francisella novicida) associated with human disease II J. Clin. Microbiol. - 1989. -Vol. 27.-P. 1601-1608.

219. Hood A. M. Virulense factors of Francisella tularensis II J Hyg (Lond). -1977.-Vol. 79.-P. 47-60.

220. Horzempa J., O'Dee D. M., Stolz D. B., et al. Invasion of erythrocytes by Francisella tularensis II J Infect. Dis. - 2011. - Vol. 204, N 1. - P. 51-59.

221. Hotta A., Akihiko U., Fujita O., et al. Preparation of monoclonal antibodies for detection and identification of Francisella tularensis // Clin, and Vaccine Immunology. -2007.-Vol. 14, N 1. - P. 81-84.

222. Hotta A., Tanabayashi K., Yamamoto Y., et al. Seroprevalence of tularemia in wild bears and hares in Japan // Zoonoses Public. Health. - 2011 Jul 25, doi:10.1111/j.l 863-2378.2011.01422.x. Режим доступа: http://www.nobi.nlm.nihgov/pubmed.

223. Hubalek M., Hernychova L., Brychta M., et al. Comparative proteome analysis of cellular proteins extracted from highly virulent Francisella tularensis ssp. tularensis and less virulent F. tularensis ssp. holarctica and F. tularensis ssp. mediasiatica II Prote-omics. - 2004. - Vol. 4. - P. 3048-3060.

224. Huber В., Escudero R., Busse H. J., et al. Description of Francisella hispaniensis sp. nov., isolated from human blood, reclassification of Francisella novicida (Larson et al. 1995) Olsufiev et al. 1959 as Francisella tularensis subsp. novicida comb, nov. and emended description of the genus Francisella // Int J Syst Evol Microbiol. - 2010. -Vol.-60.-P. 1887-1896.

225. Hulseweh В., Ehricht R., Marschall H.-J. A simple and rapid protein array based method for the simultaneous detection of biowarfare agents // Proteomics. - 2006. -Vol. 6.-P. 2972-2981.

226. Huntley J.F., Conley P.G., Hagman K.E., Norgard M.V. Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins // J. Bacteriol. - 2007. - Vol. 189, N 2. - P. 561-574.

227. Huntley J. F., Conley P. G., Rasko D. A., et al. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis II Infect, and Immun. - 2008. - Vol. 76, N 8. - P. 3664-3671.

228. Jacob D., Natterman H.R., Kruger R., et al. Enhanced growth of Francisella tularensis in a liquid nutrient medium (medium T) // 6th Int. Conference on Tularemia. -Berlin, 2009 (13-16.09). - P. 108.

229. Jellison W. L. Tularemia: Dr. Edward Francis and his first .23 isolates of Francisella tularensis II J. Clin. Microbiol. - 1995. - Vol. 34. - P. 2894-2896.

230. Jia Q., Lee B. Y., Bowen R., et al. A Francisella tularensis live vaccine strain (LVS) mutant with a deletion in capB, encoding a putative capsular biosynthesis pro-

tein, is significantly more attenuated than LVS yet induces potent protective immunity in mice against F. tularensis challenge // Infect. Immun. - 2010. - Vol. 78, N 10. - P. 43414355.

231. Johansson A., Berglund L., Eriksson U., et al. Comparative analysis of PCR versus culture for diagnosis of ulceroglandular tularemia // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol. 38. - P. 22-26.

232. Johansson A., Goransson I., Larsson P., Sjostedt A. Extensive allelic variation among Francisella tularensis strains in a short-sequence tandem repeat region // Ibid. -2001. - Vol. 39. - P. 3140-3146.

233. Johansson A., Forsman M., Sjostedt A. The development of tools for diagnosis of tularemia and typing of Francisella tularensis IIAPMIS - 2004. - Vol. 112. - P. 898907.

234. Johansson A., Petersen J. M. Genotyping of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia // J AO AC Int. - 2010. - Vol. 93, N 6. - P. 1930-1943.

235. Junhui Z., Ruifu Y., Jianchun L., et al. Detection of Francisella tularensis by the polymerase chain reaction // J. Med. Microbiol. - 1996. - Vol. 45. - P. 477-482.

236. Khlebnikov V. S., Golovliov I. R., Kulevatsky D. R., et al. Outer membranes of a lipopolysaccharide-protein complex (LPS-17 kDa protein) as chemical tularemia vaccines // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1996. - Vol. 13, N 3. - P. 227-233.

237. Kilmury S. L., Twine S. M. The Francisella tularensis proteome and its recognition by antibodies // Front Microbiol. - 2010. - Vol. 1, Article 143. Режим доступа: http ://www. frontiersin. org.

238. Kischel N. Vergleich von ELISA, Immunfluoreszenz, DurchfluBzytometrie, Westernblot und Agglutinationstest zum Nachweis von Serumantikorpern gegen Francisella tularensis. - Miinchen, 2002. - 76 S.

239. Klee S. R., Jacob D. Nattermann H., Appel B. Bioterroristisch relevante Erreger // Bundesgesundheitsblatt. - 2003. - Vol. 46. - P. 935-948

240. Koskela P., Salminen A. Humoral immunity against Francisella tularensis after natural infection // J. Clin. Microbiol. - 1985. - Vol. 22. - P. 973-979.

241. Kudelina R. I., Olfsufjev N. G. Sensitivity to macrolide antibiotics and lincomycin in Francisella holarctica II J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. - 1980. - N 24.-C. 84-91.

242. Larsson P., Svensson K., Karlsson L., et al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis II Emerg. Infect Dis. - 2007. - Vol. 13.-N 11.-P. 1725-1732.

243. Larson M. A., Fey P. D., Bartling A. M., et al. Francisella tularensis molecular typing using differential insertion sequence amplification // J of Clinical Microbiol. - Vol. 49, N 8. - P. 2786-2797.

244. Lilliehook B., Sandstrom G. Production of murine monoclonal antibodies against Francisella tularensis antigens and characterization of antibody-reactive epitopes // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. - 1989. - Vol. 90, N 1. - P. 71-77.

245. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

246. Lee B., Clemens D., Horwitz M. Identification of early culture filtrate proteins of Francisella tularensis II Fourth International Conf. On Tularemia. - City of Bath, United Kingdom, 2003. - P 02.

247. Levesque B., de Serres G., Higgins R., et al. Seroepidemiologic study of three zoonoses (Leptospirosis, Q fever and Tularemia) among trappers in Quebec, Canada / Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1995. - Vol. 2. - P. 496-498.

248. Long G. W., Oprandy J. J., Narayanan R. B., et al. Detection of Francisella tularensis in blood by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol.- 1993. - Vol. 31. - P. 152-154.

249. Lowry O. H., Risebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265.

250. Lu Z., Roche M. I., Hui J. H., et al. Generation and characterization of hybridoma antibodies for immunotherapy of tularemia // Immunol Lett. - 2007. - Vol. 112, N2.-P. 92-103.

251. Lundquist M., Caspersen M. B., Wikstrom P., Forsman M. Discrimination of Francisella tularensis subspecies using surface enhanced laser desorption ionization mass spectrometry and multivariate data analysis // FEMS Microbiology Letters. - 2005. - Vol. 243.-P. 303-310.

252. Mack K., Fulop M., Manchee R. J., Stirling C. J. A new cell assay to determine the virulence of Francisella tularensis II Lett. Appl. Microbiol. - 1994. - Vol. 19. -P. 158-160.

253. Maier Т. M., Casey М., Becker R., et al. Identification of Francisella tularensis Himar /-based transposon mutants defective for replication in macrophages // Infect. Immun. - 2007. - Vol. 75. - P. 5376-5389.

254. Marshall J. D., Eveland W. C., Smith C. W. Superiority of fluorescein isothiocyanate (Riggs) for fluorescent-antibody technic with a modification of its application // Proc. Soc. exp. Biol, and Med. - 1958. - Vol. 98, N 4. - P. 898-900.

255. McCoy G. W., Chapin C. W. Bacterium tularense the cause of a plague-like disease of rodents // Public Health Bull. - 1912. - Vol. 53. - P. 17-23. □

256. McRae S., Pagliai F. A., Mohapatra N. P., et al. Inhibition of AcpA phosphatase activity with ascorbate attenuates Francisella tularensis intramacrophage survival //J Biol. Chem. - 2010. - Vol. 285, N 8. - P. 5171-5177.

257. Mikalsen J., Olsen А. В., Tengs Т., Colquhoun D. J. Francisella philomiragia subsp. noatunensis subsp. nov., isolated from farmed Atlantic cod (Gadus morhua L.) II Int J Syst Evol Microbiol. -2007. - Vol. 57, N 9. - P. 1960-1965.

258. Nallaparaju К. C., Yu J.-J., Rodriguez S. A. et al. Evasion of IFN-c signaling by Francisella novicida is dependent upon Francisella outer membrane protein С // PLoS ONE. - 2011 Mar 31. - 6 (3): е18201.Режим доступа: http://www.plosone. org.

259. Nano F. E. Identification of a heat-modifiable protein of Francisella tularensis and molecular cloning of the encoding gene // Microb. Pathogen. - 1988. - Vol. 5. -P. 109-119.

260. Nichols P. D., Mayberry W. R., Antworth C. P., White D. C. Determination of monosaturated double-bond position and geometry in the cellular fatty acids of the pathogenic bacterium Francisella tularensis II J. Clin. Microbiol. - 1985. - Vol. 21. - P. 738-740.

261. Olsen А. В., Mikalsen J., Rode M., et al. A novel systemic granulomatous inflammatory disease in farmed Atlantic cod, Gadus morhua Z., associated with a bacterium belonging to the genus Francisella II J Fish Dis. - 2006. - Vol. 29. - P. 307-311.

262. Ottem K. F., Nylund A., Karlsbakk E., et al. Elevation of Francisella philomiragia subsp. noatunensis Mikalsen et al. (2007) to Francisella noatunensis comb, nov. [syn. Francisella piscicida Ottem et al. (2008) syn. nov.] and characterization of Francisella noatunensis subsp. orientalis subsp. nov., two important fish pathogens // J Appl Microbiol. - 2009. - Vol. 106, N. 4. - P. 1231-1243.

263. Owen C. R. Genus Francisella. In R.E. Buchanan and N.E. Gibbons (ed.), Bergey s manual of determinative bacteriology // The Williams and Wilkins Co., Baltimmore. Md. - 1974. - P. 283-285.

264. Oyston P. C. F., Quarru J.E. Tularemia vaccine: past, present and future // Antonie van Leeuwenhoek. - 2005. - Vol. 87. - P. 277-281.

265. Oyston P. C. F. Francisella tularensis: unravelling the secrets of an intracellular pathogen // J. Med. Microbiol. - 2008. - Vol. 57. - P. 921-930.

266. Peruski A. H., Johnson III L. H., Peraski Jr. L. F. Rapid and sensitive detection of biological warfare agents using time-resolved fluorescence assays // J. of Immunological Methods. - 2002. - Vol. 263. - P. 35-41.

267. Petersen J. M., Schriefer M. E., Garter L. G., et al. Laboratory analysis of tularaemia in wild-trapped, commercially traded prairie dogs, Texas, 2002 // Emerg. Infect. Dis. - 2004a. - Vol. 10. - P. 419-425.

268. Petersen J. M., Schriefer M. E., Gage K. L., et al. Methods for enhanced culture recovery of Francisella tularensis // Appl. Environ. Microbiol. - 2004b. - Vol. 70. -P. 3733-3735.

269. Pierson T., Matrakas D., taylor Y. U. et al. Proteomic characterization and functional analysis of outer membrane vesicles of Francisella novicida suggests possible role in virulence and use as a vaccine // J Proteome Res. - 2011. - Vol. 10, N 3. - P. 954967.

270. Pohanka M., Skladal P. Piezoelectric immunosensor for Francisella tularensis detection using immunoglobulin M in limiting dilution // Analytcal Letters. -2005.-Vol. 38. -P. 411-422.

271. Pohanka M., Hubalek M., Neubaueerova V., et al. Current and emerging assays for Francisella tularensis detection: a review // Vet. Med. - 2008. - Vol. 53. - P. 585594.

272. Pohanka M., Skladal P. Bacillus anthracis, Francisella tularensis and Yersinia pestis. The most important bacterial warfare agents — review II Folia Microbiol. -2009. - Vol. 54, N. 4. - P. 263-272.

273. Posthaus H., Welle M., Morner T., et al. Tularemia in a common marmoset (Callithrix jacchus) diagnosed by 16S rRNA sequencing // Vet. Microbiology - 1998. - Vol. 61.-P. 145-150.

274. Prior J. L., Prior R. G., Hitchen P. G. Characterisation of the liopopolysaccharide of F. tularensis subspecies tularensis II Fourth International Conf. On Tularemia. - City of Bath, United Kingdom, 2003. - S 27.

275. Qin A. & Mann B. J. Identification of transposon insertion mutants of Francisella tularensis tularensis strain Schu S4 deficient in intracellular replication in the hepatic cell line HepG2 // BMC Microbiol. - 2006. - Vol. 6. - P. 69.

276. Raynand C., Meibom K. L., Lety M. A., et al. Role of wbt locus of Francisella tularensis in lipopolysaccharide O-antigen biogenesis and pathogenicity // Infect. Immun. - 2007. - Vol. 75, N 1. - P. 536-541.

277. Rane L., Newhauser L. R. A method for the separation of protein fraction // Armed Forces med. J., 1954. - V. 5, N 3. - P. 368 - 370.

278. Roche M. I., Lu Z., Hui J. H., Sharon J. Characterization of monoclonal antibodies to terminal and internal O-antigen epitopes of Francisella tularensis lipopolysaccharide // Hybridoma (Larchmt.). - 2011. - Vol. 30, N 1. - P. 19-28.

279. Salomonsson E. N., Forslund A. L., Forsberg A. Type IV pili in Francisella tularensis — a virulence trait in an intracellular pathogen // Front Microbiol. -2011.-2 (29). Режим доступа: http://www.nobi.nlm.nihgov/pubmed.

280. Sandstrom G., Tarnvik A., Wolf-Watz H. Antigen from Francisella tularensis: nonidentity between determinants participating in cell-mediated and humoral reactions // Infect. Immun. - 1984. - Vol. 45, N 1. - P. 101-106.

281. Sandstrom G., Tarnvik A., Wolf-Watz H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis II J. clin. Microbiol. - 1987. -Vol. 25. - P. 641-644.

282. Sandstrom G., Lofgren S., Tarnvik A. A capsule deficient mutant of Francisella tularensis LVS exhibits enhanced sensitivity to killing by serum but diminished sensitivity to killing by polymorphonuclear leukocytes // Infect. Immun.- 1988. - Vol. 56, N 5.-P. 1194-1202.

283. Sandstrom G., Sjostedt A., Johansson Т., et al. Immunogenicity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS // FEMS Microbiol. Immunol. -1992.-Vol. 5. - P. 201-210.

284. Sandstrom G., Sjostedt A., Forsman M., et al. Characterization and classification of strains of Francisella tularensis isolated in the central Asian focus of the Soviet Union and in Japan // J. Clin. Microbiol. - 1992. -Vol. 30. - P. 172-175.

285. Santic M., Al-Khodor S., Kwaik Y. A. Cell biology and molecular ecology of Francisella tularensis II Cell. Microbiology. - 2010. - Vol. 12, N 2. - P. 129-139.

286. Savitt A.G., Mena-Taboada P., Monsalve G., Benach J.L. Francisella tularensis infection-derived monoclonal fntibodies provide detection, protection, and therapy // Clinical and Vaccine Immunology. - 2009. - Vol. 16, N 3. - P. 414-422.

287. Schmitt P., Splettstoesser W., Porsch-0 M., et al. A novel screening ELISA and a confirmatory Western blot useful for diagnosis and epidemiological studies of tularemia // Infect. Epidemiol. - 2005. - Vol. 133. - P. 757-766.

288. Shchyogolev S. Y., Khlebtsov N. G., Schwartsburd B. I. Spectroturbidimetry as applied to biomedical and immunological investigations // Proc. SPIE. - 1993. - Vol. 1981. - P. 67-87.

289. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels // Anal. Chem. - 1996. - Vol. 68, N 5. -P. 850-858.

290. Siddaramappa S., Challacombe J. F., Petersen J. M., et al. Common ancestry and novel genetic traits of Francisella novicida-Like isolates from North America and Australia as revealed by comparative genomic analyses // Appl. Environ. Microbiol. — 2011. — Vol. 77,N15.-P. 5110-5122.

291. Sjostedt A., Sandstrom G., Tarnvik A. Several membrane polypeptides of the live vaccine strain Francisella tularensis LVS stimulate T cells from naturally infected individuals // J. clin. Microbiol. - 1990. -Vol. 28, N 1. - P. 43-48.

292. Sjostedt A., Tarnvik A., Sandstrom G. The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein // Infect, and Immun. - 1991. - Vol. 59, N. 9,-P. 3163-3168.

293. Sjostedt A.., Eriksson U., Berglund L., Tarnvik A. Detection of Francisella tularensis in ulcers of patients with tularemia by PCR // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol, 35. - P. 1045-1048.

294. Sjostedt A. Virulence determinants and protective antigens of Francisella tularensis II Curr. Opin. In Microbiol. - 2003. - Vol. 6. - P. 66-71.

295. Skladal P., Symerska Y., Pohanka M., et al. Electrochemical immunosensor for detection of Francisella tularensis II In: Defence against bioterror: detection technologies, implementation strategies and commercial opportunities. - Springer, Netherlands, 2005.-P. 221-232.

296. Soni S., Ernst R. K., Muszynski A., et al. Francisella tularensis blue-gray phase variation involves structural modifications of lipopolysaccharide O-antigen, core and lipid A and affects intramacrophage survival and vaccine efficacy // Front Microbiol. -2010. - Vol. 1, Article 129. Режим доступа: htpp://www.frontiersin.org.

297. Splettstoesser W. D., Tomaso H., Dahouk S. A., et al. Diagnostic procedures in tularemia with spezial focus on molecular and immunological techniques // J. Vet. Med. -2005,- Vol. 52.-P. 249-261.

298. Stulik J., Cerna J., Kovarova H., Macela A. Protein heterogeneity of Francisella tularensis: detection of proteins with antigenic determinants // Folia microbiol. (Praha). - 1989. - Vol. 34, N 4. - P. 316-323.

299. Su J., Yang J., Zhao D. Genome-wide identification of Francisella tularensis virulence determinants // Infect, and Immun.- 2007. - Vol. 75, N 6. - P. 3089-3101.

300. Surcel H. M., Sarvas M., Helander J. M., Herva E. Membrane proteins of Francisella tularensis LVS differ in ability to induce proliferation of lymphocytes from tularemia-vaccinated individuals // Microbiol. Patogen. - 1989. - Vol. 7. - P. 411 - 419.

301. Svensson K., Larsson P., Johansson D., et al. Evolution of subspecies of Francisella tularensis // J. Bacteriol. - 2005. - Vol. 187, N 11. - P. 3903-3908.

302. Tàrnvik A., Lofgren S., Ohlunnd L., Sandstrôm G. Detection of antigen in urine of a patient with tularemia// Eur. J. Clin. Microbiol. - 1987. - Vol. 6. - P. 318-319.

303. Tàrnvik A., Berglund L. Tularaemia // J Eur. Respiratory. - 2003. - Vol. 21. -P. 361-373.

304. Tàrnvik A., Priebe H. S., Grunow R. Tularaemia in Europe: an epidemiological overview // Scand J Infect Dis. - 2004. - Vol. 36, N 5. - P. 350-355.

305. Tempel R., Lai X. H., Crosa L., Kozlowicz В., Heffron F. Attenuated Francisella novicida transposon mutants protect mice against wild-type challenge // Infect. Immun. - 2006. - Vol. 74. - P. 5095-5105.

306. Thomas R.M., Titball R. W., Oyston P. C. F., et al. The immunologically distinct O-antigens from Francisella tularensis subspecies tularensis and novicida are both

virulence determinants and protective antigens // Infect. Immun. - 2007. - Vol. 75, N 1. - P. 371-378.

307. Thomas R. M., Titball R. W., Twine S. M., et al. Phenotypical analysis of the putative 2nd polysaccharide gene cluster of of Francisela tularensis II 6th Int. Conference on Tularemia. - Berlin, 2009 (13-16.09). - P. 50.

308. Towbin H., Stacbelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.

309. Tresselt H.B., Ward M.K. Blood-free medium for the rapid growth of Pasteurella tularensis //Applied Microbiology. - 1964. - Vol. 12. - P. 504-507.

310. Twine S.M., Petit M.D., Shen H., et al. Immunoproteomic analysis of the murine antibody response to successful and failed immunization with live anti-Francisella vaccines // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2006. - Vol. 346. - P. 999-1008.

311. Twine S. M., Petit M. D., Fulton К. M., et al. Immunoproteomics analysis of the murine antibody response to vaccination with an improved Francisella tularensis live vaccine strain (LVS) // PLoS One. - 2010 Apr 2- 5 (4): el0000. Режим доступа: http://www.plosone.org.

312. Versage J. L., Severin D. D., Chu M. C., Petersen J. M. Development of a multitarget real-time TaqMan PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41. - P. 5492-5499.

313. Vinogradov E. V., Shashkov A. S., Knirel Y. A., Kochetkov N. K. Structure of the O-antigen of Francisella tularensis strain 15 // Carbohydrate Research. - 1991. - Vol. 214.-P. 289-297.

314. Vinogradov E., Perry M. В., Conlan J. W. Structural analysis of Francisella tularensis lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. - 2002. - Vol. 269. - P. 6112-6118.

315. Waag D.M., Sandström G., England M.J., Williams J. C. Immunogenecity of a new lot of F. tularensis LVS in human volonteers // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -1996.-Vol. 13. - P. 205-209.

316. Wang Y., Hai R., Zhang Z., et al. Genetic relationship between Francisella tularensis strains from China and from other countries // Biomed Environ Sei. - 2011. - Vol. 24, N3,-P. 310-314.

317. Westphal О. Bacterial endotoxins. The second Karl Prausnits memorial lecture // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. - 1975. - Vol. 28, N 1-2. - P. 205-209.

318. Wilson G.S., Miles A.A. Brucella tularensis. In Topley and Wilson's principles of bacteriology and immunity // The Williams and Wilkins Co., Baltimmore. Md. -1964.-P. 1013-1014

319. Whipp, M. J., Davis, J. M., Lum, G., et al. Characterization of a novicida-like subspecies of Francisella tularensis isolated in Australia // J Med Microbiol. - 2003. -Vol. 52. - P. 839-842.

320. Zarrella T. M., Singh A., Bitsaktsis C., et al. Host-adaptation of Francisella tularensis alters the bacterium's surface-carbohydrates to hinder effectors of innate and adaptive immunity // PLoS One. - 2011. - 6 (7): e22335. Режим доступа: http://www.plosone.org.

321. Zeidner N.S., Carter L.G., Monteneiri J.A., et al. An outbreak of Francisella tularensis in captive prairie dogs: an immunohistochemical analysis // J. Vet. Diagn. Invest. -2004,- Vol.16.-P. 150-152.