Оптимизация параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой пшеницы (Triticum Aestivum L.) и изучение трансгенных растений, несущих гены bar и gst тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Фадеев, Виталий Сергеевич

• Фадеев, Виталий Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фадеев, Виталий Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I Обзор литературы

1.1 Ведение культуры соматических клеток и регенерация мягкой пшеницы in vitro

1.1.1 Зависимость частоты индукции каллуса и регенерации растений пшеницы от типа экспланта

1.1.2 Зависимость частоты индукции каллуса и регенерации растений пшеницы от генотипа

1.1.3 Влияние состава среды на частоту индукции каллусогенеза и регенерации растений пшеницы

1.2 Прямой перенос генов в злаки - биобаллистическая генетическая трансформация мягкой пшеницы

1.2.1 Параметры баллистической трансформации мягкой пшеницы

1.2.2 Маркерные гены

1.2.3 Селективные гены и системы селекции.

1.2.4 Селективный ген bar. Механизм действия

1.2.5 Негативная селекция трансгенной ткани пшеницы in vitro

1.3 Генетика устойчивости растений к абиотическим стрессам

1.3.1 Механизм действия гена глутатион S-трансфераза (GST). Разнообразие генов GST

ГЛАВА II Материалы и методы

2.1 Растительный материал. Получение морфогенетической каллусной культуры соматических клеток и регенерация in 38 vitro растений мягкой пшеницы

2.2 Выделение плазмидной ДНК, работа с бактерией е. coli

2.3 Протокол баллистической трансформация мягкой пшеницы

2.4 Создание векторной конструкции pGSTBAR

ГЛАВА III Оптимизация ведения культуры соматических клеток мягкой пшеницы in vitro

3.1 Влияние генотипа на частоту индукции морфогенетического каллуса мягкой пшеницы

3.2 Влияние обработки зерновок низкой температурой на частоту индукции морфогенетического каллуса

3.3 Изучение влияния различных типов фитогормонов и их концентрации в среде на частоту регенерации растений 59 мягкой пшеницы in vitro

ГЛАВА IV Получение и анализ трансгенных растений мягкой пшеницы несущих гены bar и gst

4.1 Влияние биобаллистического воздействия на морфогенетический потенциал тканей мягкой пшеницы

4.2 Оптимизация параметров баллистической трансформации мягкой пшеницы

4.3 Мониторинг процесса трансформации путем исследования транзиентной и стабильной экспрессии гена gfp 4.4. Сравнительная оценка методов селекции трансгенных тканей пшеницы

4.5 Анализ наследования гена bar у трансгенных линий пшеницы Т

4.6 Определение устойчивости трансгенных растений Т1 поколения к хлоридно-натриевому засолению

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой пшеницы (Triticum Aestivum L.) и изучение трансгенных растений, несущих гены bar и gst»

Пшеница является главной составляющей диеты для большинства населения умеренной климатической зоны планеты. Ежегодный мировой урожай пшеницы колеблется в пределах 550 - 590 миллионов тон. Для России хлебные злаки (пшеница, рожь и ячмень) является стратегическим продуктом, поскольку около половины населения страны получают 80% белка и 70% углеводов исключительно из хлебных и крупяных продуктов. Наращивание производства высококачественного зерна - основа для развития пищевой и перерабатывающей промышленности. Подавляющее большинство сортов пшеницы создано традиционными методами селекции, на основе использования генетического разнообразия исходных видов. За последние 40 лет показана возможность использования генов диких видов Triticum (дикой двузернянки) и растений рода Triticeae (например, ржи -Secale secale и Aegilops ventricosa) методами хромосомной инженерии. Это увеличило размах изменчивости доступный для селекционеров. Развитие генно-инженерных технологий должно продвинуть этот процесс значительно дальше, вовлекая в селекцию единичные гены или группы генов из любых видов растений, животных, микроорганизмов, и ab initio синтезированных генов, которые могут быть, введены в геном пшеницы для придания новых желаемых свойств. На сегодняшний день успешно проходят полевые испытания сотен (413 в США и более 300 в остальных странах) генетически модифицированных растений (ГМР) пшеницы. Испытываются растения, в которые введены гены устойчивости к грибковым заболеваниям, с измененным составом крахмала и запасных белков.

Впервые трансформация злаков баллистическим способом была осуществлена 1988 году под руководством Сенфорд и Клейн [1]. На данном этапе процесс создания трансгенных растений мягкой пшеницы {Triticum aestivum L.) методом биобаллистической трансформации некоторыми авторами объявлен рутинным, однако эффективность трансформации пшеницы не превышает 1-5 % и показана для нескольких высокоотзывчивых генотипов [2-6]. С конца 90-х годов разрабатывается методика агробактериальной трансформации пшеницы, но эффективность данного метода пока очень низкая и не превышает 1-2 % [7, 8], что является следствием того, что пшеница не входит в разряд природных растений-хозяев агробактерий. Увеличение эффективности генетической трансформации пшеницы для практического применения может быть достигнуто:

1. повышением регенерационного потенциала in vitro у широко распространенных сортов путем модификации состава среды и условий получения и ведения культуры соматических клеток;

2. оптимизацией параметров генетической трансформации и селекцией трансгенных клеток и регенерантов.

Существует отрицательная корреляция ухудшения качества белка пшеницы и увеличения урожайности сортов, создаваемых традиционными методами селекции. В настоящее время проводятся работы по изменению питательных и хлебопекарных качеств пшеницы методами генетической инженерии [9]. Улучшения хлебопекарных качеств зерна можно достичь повышением удельной фракции высокомолекулярных глютелинов и изменением соотношения различных форм крахмала (амилоза -амилопектин) в зерне. Это может быть обеспечено изменением экспрессии собственных генов запасных белков пшеницы глиадинов и высокомолекулярных глютелинов путем использования методов антисенс технологий и регуляции экспрессии генов запасных белков методом интерференции РНК, и, возможно, введением в геном пшеницы генов, выделенных из растений других видов рода Triticum [10].

Для России пшеница является, как сказано выше, стратегически важной и основной зерновой культурой. Поэтому создание устойчивых к неблагоприятным условиям среды сортов представляется первостепенной научной и важнейшей экономической задачей.

К числу важнейших абиотических стрессов в Российской Федерации относятся засуха и засоление почв. Более 50 % сельскохозяйственных угодий, занятых посевами пшеницы, требуют усиленной мелиорации.

Среди биотических стрессов для злаков необходимо выделить клопа вредную черепашку (Eurygaster integriceps Put.), который снижает урожайность ячменя на 20-30 % и пшеницы на 40-70 %. Кроме того, при повреждении клопом-черепашкой 1-2% зерновок значительно ухудшаются хлебопекарные качества зерна, которое переводится из разряда продовольственного в фуражное.

Одним из наиболее эффективных, а зачастую и единственным способом повышения толерантности растений к стрессам является генетическая инженерия. Генетическая трансформация растений позволяет использовать широкий круг генов повышающих устойчивость, выделенных из разных видов растений и микроорганизмов, для создания трансгенных растений, которые приобретают заранее спланированные свойства устойчивости к стрессам.

Известно, что поддержание гомеостаза глутатиона является одним из механизмов, обеспечивающих устойчивость растений к различным абиотическим стрессам [11, 12]. Поэтому генно-инженерные манипуляции с метаболическим путем глутатиона представляются привлекательной целью для повышения устойчивости растений к стрессам. Антистрессовые действия фермента глутатион-8-трансферазы (GST) обусловлены детоксикацией гидроперекисей. Важна роль фермента GST в защите клеточных мембран от перекисного окисления липидов и, как следствие, от воздействия активных форм кислорода. Установлена активность изоформ фермента по деактивации различных гербицидов. Исследования показали, что GST является сигнальной молекулой и потенциальным регулятором ультрафиолет-зависимого апоптоза клетки. Ген gst был клонирован из Arabidopsis thaliana в группе профессора С. Сопори (Международный Центр Генетической Инженерии и Биотехнологии, Нью-Дели, Индия).

Цель настоящего исследования заключалась в повышении частоты регенерации in vitro и генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой пшеницы; получении выборки трансгенных растений, несущих гены bar, gst, и определении устойчивости полученных растений к гербициду широкого действия Баста и хлоридно-натриевому засолению. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи.

3. Оптимизировать параметры ведения культуры клеток и регенерации растений in vitro мягкой пшеницы сортов Лада, Эстер, Мис, Норис и Амир.

4. Оптимизировать параметры биобаллистической трансформации мягкой пшеницы сортов Лада, Эстер и Мис.

5. Провести сравнительный анализ эффективности трех методов негативной селекции (отложенной, градационной и регенерационной) трансгенных тканей пшеницы in vitro, для повышения частоты получения трансформантов.

6. Получить выборки растений трансгенной пшеницы, несущей гены bar, gfp и bar, gst и изучить характер наследования введенных трансгенов.

7. Выявить трансгенные растения, толерантные к натриево-хлоридному засолению.

Научная новизна. Все представленные в диссертации результаты являются новыми и оригинальными.

1. Впервые показан стимулирующий эффект кратковременного воздействия (48 ч.) пониженной температуры (+4° С) на частоту индукцию морфогенетического каллуса.

2. Впервые оптимизированы условия культивирования in vitro генотипов мягкой пшеницы Лада, Эстер, Мис, Амир, районированных в 4 зонах РФ, и регенерации растений in vitro.

3. Впервые оптимизированы параметры (давление, расстояние до ткани-мишени, объем использованного газа) биобаллистической трансформации мягкой пшеницы для широко возделываемых в четырех зонах РФ сортов Лада, Эстер и Мис.

4. Впервые в РФ получены выборки трансгенных растений мягкой пшеницы несущих гены bar и gst.

5. Проведен анализ наследования трансгенов в двух поколениях на примере сорта мягкой пшеницы Лада, Показано, что экспрессия gst может повышать уровень устойчивости растений пшеницы к хлоридно-натриевому засолению.

Практическая значимость Полученные в работе результаты имеют важное практическое значение:

- на основании полученных результатов показана возможность получение достаточного количества трансгенных растений, полученных от независимых трансгенных событий, для широко распространенных сортов мягкой пшеницы, с сочетанием двух генов, необходимых для участия в селекционном процессе.

- полученная выборка трансгенных растений мягкой пшеницы, полученных от независимых трансгенных событий сорта Лада, несущих ген gst, представляет интерес для изучения устойчивости к хлоридно-натриевому засолению.

Апробация работы Основные результаты работы докладывались на 2-ой научной конференции Московского общества генетиков и селекционеров

Актуальные проблемы современной генетики" (Москва февраль 2003); на конференции "Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений" (Краснодар 2003 г.); на III Съезде ВОГИС (Москва 6-12 июня 2004 г.); на международной конференции Second International Conference on Sunn Pest, ICRDA (Aleppo, Syria 19-22 July, 2004); на международном конгрессе XVth International Plant Protection Congress (Beijing, China, May 11-16,2004).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 1 статья в рецензируемом научном издании, 1 статья находится в печати.

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (130 наименований), изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 29 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Фадеев, Виталий Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Впервые показан стимулирующий эффект кратковременного воздействия (48 ч.) низкой температуры (4° С) на частоту индукции морфогенетического каллуса.

2. Определен оптимальный фитогормональный состав среды для индукции регенерации in vitro растений мягкой пшеницы сорта Лада (Triticum aestivum L.), позволяющий достигать регенерацию растений с частотой до 90%.

3. Оптимизированы параметры баллистической трансформации мягкой пшеницы {Triticum aestivum L.) для сортов Лада, Эстер и Мис, с использованием биобаллистической установки PIG. Давление гелия при выстреле - 6 атм., расстояние от источника частиц до ткани мишени (каллус) - 12 см.

4. Определен оптимальный срок проведения генетической трансформации, который соответствует 10-14 суткам культивирования, после инициации морфогенетического каллуса.

5. Показано, что при использовании регенерационной методики селекции трансгенной ткани мягкой пшеницы {Triticum aestivum L.) сорта Лада позволяет получать трансгенные растения мягкой пшеницы с эффективностью 5%.

6. Получена выборка трансгенных растений мягкой пшеницы сорта Лада, несущих гены gfp и bar (14 независимых трансгенных событий) и выборка из 17 трансгенных растений, полученных от независимых трансгенных событий несущих гены gst и bar.

7. Показана устойчивость к гербициду широкого спектра действия БАСТА в Т1 поколении полученных трансгенных растений с генами gst и bar.

8. Выявлена устойчивость к 200 шМ хлорида натрия у растений Т1 поколения, содержащих ген gst.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что кратковременная обработка (48) ч. низкой температурой +4° С увеличивают частоту индукции МК для исследуемых сортов мягкой пшеницы Норис и Лада. Достигнутая частота индукции МК составляет для сорта Лада 74.3±10.51. Для сорта Норис частота индукции МК составила 58.4±15.20, также полученная при 48 часовой обработкой низкой температурой. Показано что наиболее эффективно МК образует сорт Лада до 75 %, сорт Мис показал более низкую частоту образования 20 %МК. Сорта Эстер, Норис и Амир занимают промежуточное положение в способности образовании МК 40-60 %.

В результате сравнения десяти различных регенерационных сред подобрана оптимальная среда для регенерации фертильных растений используемых генотипов. Оптимизированная среда содержит цитокинины: кинетин и 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрациях 1 мг/л: и ауксин: нафтилуксусную кислоту (НУК) в концентрации 0,5 мг/л. Оптимизированная среда позволяет получать растения-регенеранты мягкой пшеницы сорта Лада с эффективностью до 90%.

Выявлено, что степень отрицательного влияния баллистической трансформации уменьшается с увеличением возраста эксплантата с момента инициации культуры тканей in vitro. Сорт Лада наиболее устойчив к баллистическому воздействию на ткань, максимальное уменьшение образования морфогенного каллуса показано для сорта Эстер, сорт Мис занимает промежуточное положение по степени восприимчивости к баллистическому воздействию. Определен оптимальный период для баллистической трансформации мягкой пшеницы: это 10-14 день с момента инициации культуры тканей пшеницы всех исследуемых сортов.

С помощью использования репортерной системы GUS впервые показано, что оптимальным сочетанием физических параметров биобаллистической трансформации мягкой пшеницы с использованием баллистической конструкции PIG являются расстояние от источника частиц до ткани мишени 12 см и давление гелия при выстреле 6 атм.

При использовании методики регенерационной системы селекции получена наибольшая частота получения трансгенных растений, которая составила 4.86%-5%. При использовании градационной и отложенной системы селекции получена меньшая эффективность трансформации. Наблюдаемый, большой разброс данных в генеральной совокупности, определил статистическую недостоверность отличия результатов для отложенной и градационной систем селекции трансгенных тканей мягкой пшеницы.

Проведена оценка наследования устойчивости к гербициду БАСТА в концентрации 1% трансгенных растений поколения Т1. С помощью метода ПЦР анализа показано наличие копии гена bar в полученных растениях, что доказывает истинность растений-трансформантов. Для большинства линий трансгенных растений пшеницы получено расщепление 3:1, что соответствует моногенному расщеплению и показывает наличие одной вставки или множественной вставки трансгена в один локус генома растения-реципиента.

В предварительных опытах показано, что наличие гетерологичного гена gst может повышать уровень толерантности трансгенных растений пшеницы к хлоридно-натриевому засолению. Ген gst, выделенный из Arabidopsis thaliana, кодирующий фермент глутатион-Б-трансферазу, может повышать устойчивость к хлоридно-натриевому засолению.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фадеев, Виталий Сергеевич, 2006 год

1. Sanford J.C., Klein Т.М., Wolf E.D., Allen N. // Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process. II Journal of Particulate Science and Technology 1987, 5 P.27-37

2. Weeks I.T., Anderson O.D., Blechl A.E. // Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). II Plant Physiol. 1993, 1102, P. 1077-1084

3. Chen W. P., Gu X., Liang G. H., Muthukrishnan S. // Introduction and constitutive exspression of a rice chitinase gene in bread wheat using biolistic bombardment and the bar gene as a selectable marker. II Theor. Appl. Genet. 1998, V.97, P.1296-1306

4. Uze M., Potricus I. // Single-stranded DNA lin genetic in trasformation of wheat (Triticum aestivum): transformation freqency and integration patten. //Theor. Appl. Genet., 1999, V.99, P.487-495

5. Jordan M.C. // Green fluorescent protein as a visual marker for wheat transformation. И Plant cell report, 2000, V.19, P. 1069-1075

6. Cheng M, Fry J.E., Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Cuncan D.R., Conner T.W., Wan Y. // Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. II Plant Physiol 1997, V.l 15, P.971-980

7. Пухальский B.A., Смирнов С.П., Коростылева T.B., Билинская Е.Н., Елисеева А.А. // Генетическая трансформация пшеницы Triticumaestivum L. с помощью Agrobacterium tumefaciens II Генетика. 1996. T.32. №11. С. 1596-1600.

8. Sharp P. A. URN A Interference II2001 Genes Dev 15: 485-490

9. Marrs K.A. // The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants. II Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1996, V.47, P. 127-158

10. Wernicke W., Brettell R. // Somatic embryogenesis from Sorghum bicolor L. leaves. //Nature, 1980, V.287, 5778, P.138-139

11. Shimada T. // Plant regeneration from the callus induced from wheat embryo. //Japan. J. Genetic, 1978, V.53, P.371-374

12. Shimada Т., Yamada Y. // Wheat plants regeneration from embryo cell cultures. //Japan. J. Genetics, 1979, V.54, 5, P.379-385

13. Dudits D., Nemet G., Haydu Z. // Study of callus growth and organ formation in wheat (T. aestivum L.) tissue cultures. II Can.J.Bot., 1975, V.53, P.957-963

14. Bhojwani S.S., and Hayward C. // Some observation and comments on tissue culture of wheat. И Pflanzenphisiol., 1977, V.85, 5. P.341-347

15. Chin J.C., Scott K.J. // Studies on formation of roots and shoots in wheat callus cultures. //Ann. Bot. 1977, V.41,173, P.473^177

16. Nabors M.W., Neyser J.N., Dykes T.A., De Mott K.J. // Long duration, high frequency plant regeneration from cereal tissue culture. II Planta, 1983, V.157, 5, P.385-391

17. Sasakuma Т., Kaneko R. // In vitro Treatment of cyclohexanol of cultured tissues ofT. aestivum L. II Seiken Ziho, 1985, V. 33. P. 1192-1199

18. Ahuja P.S., Pental D., Cocking // Plant regeneration from leaf base callus and cell suspension of T. aestivum L. // Z. Pflanzenziichtg, 1982, V.89, P. 139-144

19. Morrish I.V., Vasil I.K., Vasil V.K. // Development morphogenesis and genetic manipulation in tissue and cell cultures of the graminea. II Advantage in genetics, 1987, V.24, P.43 M99

20. Vasil V.K., Vasil I.K. // Somatic embryogenesis and plant regeneration from tissue culture pf Pennisetum americanum and P. americanum x P.puprpureum hybrid. II Am. J. Bot., 1981, V.68, P.864-872

21. Magnusson I., Bernman C.H. // Anatomical observations on somatic embryogenesis from scutellar tissue of immature zygotic embryos of Triticum aestivum L. II Physiol. Plant, 1985, V.63, P.137-145

22. Ozias-Akins P., Vasil I.K. // Plant regeneration from cultured immature embryos and inflorescences of Triticum aestivum L. (wheat) evidence for somatic embryogenesis. II Protoplasma, 1982, V.l 10,2, P.95-105

23. Nabors M.W., Neyser J.N., Dykes T.A., De Mott K.J. // Long duration, high frequency plant regeneration from cereal tissue culture. II Planta, 1983, V.157, 5, P.385-391

24. Bapat S.A., Joshi C.P., Mascarenhas A.F. // Occurrence and frequency of precocious germination of somatic embryos is a genotype depend phenomenon in wheat. II Plant Cell Reports, 1988, V.7, P.538-541

25. Sears R.G., Deckard E.L. // Tissue culture variability in wheat: callus induction and plant regeneration. II Crop Sci., 1982, V.22, P.546-550

26. Maddock S.E., Landcarster V.A., Risiott R., Franklin J. // Plant regeneration fron culture immature embryos and inflorescences of 25 cultivar of wheat (T. aestivum L.). И Jour. Of Experimental Botany, 1983, V.34, 144, P.915-926

27. Lasar M.D., Collins G.B., Vian W.E. // Genetic and environmental effects on the groht and differentiation of wheat somatic cell cultures. II The Journal of Heredity, 1983, V.74, P.353-357

28. Yurkova G. N. Levenko B. A. Novogilov P. V. // Induction of plant regeneration in wheat tissue culture. II Biochem. Physiol. Pflanzen., 1981, V.176, P.236-243

29. Tanzarella O.A., Greco B. // Clonal propagation of Triticum durum Desf. from immature embryos and shoot base explants. II Euphytica, 1985, V.34, P.273-277

30. Mathias R.J., Boyd L.A. // Cefotaxim stimulation callus growth, embryogenesis and regeneration in hexaploid bread wheat (T. aestivum L. em thell). II Plant Science, 1986, V.46, P.217-223

31. Purnhauser L., Medgyesy P., Gzako M., Dix P.J., Marton L. // Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestivum L. and Nicotiana plumbaginiboliaviv. Tissue culture using the ethylene inhibitor AgNOi II Plant cell Reports, 1987, V.6, P. 1-4

32. Carman J.G. // Improved somatic embryogenesis in wheat by particle simulation of the in-ovulo oxygen, growth-regulator and dessication environments. //Planta, 1988, V.l, P.417-424

33. Galia C. Yamada Y. // A novel method for increasing the frequency of somatic embriogenesis in wheat tissue culture by NaCl and KCl supplementation. // Plant Cell Reports, 1988, V.7, P.55-58

34. Murashige Т., Skoog F. // A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. II Physiol Plant 1962, V.l5, P.473^97

35. Linsmaier E. M. Skoog F. // Organic grow factors requirements of tobaco tissue culture. II Phisiol. Plant., 1965, V.18, P.100-127

36. Гапоненко A.K., Мунтян М.И., Маликова Н.И., Созинов А.А. // Регенерация растений пшеницы Triticum aestivum L in vitro. II Цитология и генетика, 1985, Т.19, 5, С.335-339

37. Eapen S., Rao P.S. // Plant regeneration from callus cultures of wheat. II Plant Cell Reports 1982, V.l, P.215-218

38. Гапоненко А. К., Маликова Н. И., Охрименко Г. Н., // Получение соматических линий у злаков (Triticum aestivum L и Hordeum vulgare L.). //Докл. АН СССР, 1985, Т.238, №6, С.1471-1475

39. Elena Е. В., Ginzo H.D. // Effect of auxin level on shoot formation with defferent embryo tissues from a cultivar and commercial hybrid of wheat (Triticum aestivum L.). II J. Plant Phisiol., 1988, V.132, P.600-603

40. Кулаева О. H. // Фитогормоны как регуляторы активности генетического аппарата и синтеза белка у растений. II В кн. "Новые направления в физиологии растений". М., Наука, 1985, С.62-84

41. Finer J.J., Vain P., Jones M.W., McMullen M.D. // Development of the particle inflow gun for DNA delivery to the plant cells. II Plant Cell Reports, 1992, V.ll, P.323-328

42. Takeuchi Y., Dotson M., Keen N.T. // Plant transformation: a simple particle bombardment device based on flowing helium. II Plant Mol Biol. 1992, Feb;18(4) P.835-839

43. Sautter C., Waldner H., Neuhaus-Url G., Galli A., Neuhaus G., Potrykus I. // Micro-targeting: High efficiency gene transfer using a novel approach for the acceleration of microprojectiles. II Bio/Technology, 1991, V.9, P. 1080— 1085

44. Christou P., McCabe D.E., Swain W.F. // Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold particles. I I Plant Physiology, 1988, V.87, P.671-674

45. Lonsdale, D.M., Lindup S., Moisan L.J., Harvey A.J. // Using firefly luciferase to identify the transition from transient to stable expression in bombarded wheat scutellar tissue. I I Physiologia Plantarum, 1998, V.102, P.447-453

46. Vasil V., Castillo A.M., Fromm M.E., Vasil I.K. // Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. II Biotechnology, 1992, V.10, P.667-674

47. Vain P., McMullen M.D., Finer J.J. // Osmotic treatment enhances particle bombardment-mediated transient and stable transformation of maize. II Plant Cell Rep, 1993, V.12, P.84-88

48. Becker D., Brettschneider R., Lorz H. // Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. II Plant J., 1994, V.5, P.299-307

49. Altpeter F., Vasil V., Srivastava V., Stoger E., Vasil I.K. // Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants. И Plant Cell Rep., 1996, V.16, P.12-16

50. Rasco-Gaunt S., Rilye A., Barcelo P., Lazzeri P.A. // Analysis of particle bombardment parameters to optimise DNA deliveryinto wheat tissues. II Plant Cell Report, 1999, V.19, P. 118-127

51. Gaponenko A.K., Finer J., // Sunflower (Helianthus annuus L.) transformation system via Particle Bombardment. И In vitro, 1994, 30:61 (P -1016).

52. Гапоненко А.К. // Баллистический способ трансформации подсолнечника II Патент Российской Федерации на изобретение, №2193066 от 20 ноября 2002.

53. Chalfie М., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C., // Green fluorescent protein as a marker for gene expression.!I Science, 1994, V.263, P.802-805

54. Chiu W, Niwa Y, Zeng W, Hirano T, Kobayashi H, Sheen J // Engineered GFP as a vital reporter in plants. II Curr. Biol. 1996, V.3, P.325-330

55. Gerdes H., Kaether C. // Green fluorescenst protein: application in cell biology. IIFEBS Letters, 1996, V.389, P.44-47

56. Pang S.Z., DeBoer D.L., Wan Y., Ye G. // An improved green fluorescent protein gene as a vital marker in plants. II Plant cell report, 1996, V.15, P. 832-836

57. Jefferson A., Kavamagh A., Bevan W. // GUS fusion: /?-glucuronidase as a sensetive and versatile gene fusion marker in higher plants. II The EMBO Jornal, 1987, V.6, P.3901-3907

58. Wilmink A, Dons J // Selective agents and marker genes for use in transformation of monocotyledonous plants. II 1993 Plant Mol Biol Rep 11:165-185

59. Ortiz J, Reggiardo M, Ravizzini R, Altabe S, Cervigni G, Spitteler M, Morata M, Elias F, Vallejos R // Hygromycin resistance as an efficient selectable marker for wheat stable transformation. II 1996 Plant Cell Rep 15:877-881

60. Witrzens B, Brettell R, Murray F, McElroy D, Li Z, Dennis E // Comparison of three selectable marker genes for transformation of wheat by microprojectile bombardment. II 1998 Aust J Plant Physiol 25:39-44

61. Franz, J.E., M. К. Мао, and J.A. Sikorski. // Uptake, Transport and metabolism of Glyphosate in Plants. II 1997 in Glyphosate: A Unique Global Herbicide. ACS monograph 189. p. 143-181.

62. Nafzinger E.D., Widholm J.M., Steinrucken H.C., Kilmer J.L. // Selection andcharacterization of a carrot line tolerant to glyphosate. I I 1984. Plant Physiol. 76:571-574.

63. Series on Harmonization of Regulatory Oversight in Biotechnology No. 11 //CONSENSUS DOCUMENT ON GENERAL INFORMATION CONCERNING THE GENES AND THEIR ENZYMES THAT CONFER TOLERANCE TO PHOSPHINOTHRICIN HERBICIDE. II ENV/JM/MONO(99) 13

64. Locci R. // Streptomycetes and Related Genera. II in: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore, 1989, P.2451-2508

65. Cross T. // Other genera. II in: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. S.T., Williams, ed. Williams and Wilkins, Baltimore, 1989, P.2586-2615

66. Bertges W.J., Kinney D.A., Pieters E.P. // Glufosinate ammonium: review and update. //North Cent. Weed Sci. Proc. Soc., 1994, P.49-57

67. Wild A., Manderscheid R. // The effect of phosphinothricin on the assimilation of ammonia in plants. II Z. Naturforsch, 1984, V.39c, P.500-504

68. Wild A., Sauer H., Ruhle W. // The effect of phosphinothricin (glufosinate) on photosynthesis I inhibition of photosynthesis and accumulation of ammonia. HZ. Naturforsch, 1987, V.42c, P.263-269

69. Krieg, L.C., Walker M.A., Senaratna Т., McKersie B.D. // Growth, ammonia accumulation and glutamine synthetase activity in alfalfa (Medicago sativa L.) shoots and cells treated with phosphinothricin. I I Plant Cell Rep, 1990, V.9, P.80-83

70. Wild A., Wendler C. // Effect of glufosinate (phosphinothricin) on amino acid content, photorespiration, and photosynthesis. II Pestic. Sci., 1991, V.30, Р.422Ч24

71. Downs C.G., Christey M.C., Maddocks D., Seelye J.F., Stevenson D.G. // Hairy roots of Brassica napus: I. Applied glutamine overcomes the effect of phosphinothricin treatment. I I Plant Cell Rep., 1994, V.14, P.37^10

72. Sauer H., Wild A., Ruhle W. // The effect of phosphinothricin (glufosinate) on photosynthesis II. The causes of inhibition of photosynthesis. II Z. Naturforsch., 1987, V.42c, P.270-278

73. Bellinder, R.R., R.E. Lyons, S.E. Scheckler, and H.P. Wilson. // Cellular alterations resulting from foliar applications of HOE-39866. II Weed Sci., 1987, V.35, P.27-35

74. Ullrich W.R., Ullrich-Eberius C.I., Kocher H. // Uptake of glufosinate and concomitant membrane potential changes in Lemna gibba Gl. II Pestic. Biochem. Physiol., 1990, V.37, P.l-l 1

75. Steckel G.J., Hart S.E., Wax L.M. // Absorption and translocation of glufosinate on four weed species. // Weed Sci., 1997, V.45, P.378-381

76. Mersey B.G., Hall J.C., Anderson D.M., Swanton CJ. // Factors affecting the herbicidal activity of glufosinate ammonium: Absorption, translocation,and metabolism in barley and green foxtail II Pestic. Biochem. Physiol., 1990, V.37, P.90-98

77. Haas P., Muller F. // Behaviour of glufosinate-ammonium in weeds. II Proc. Brit.Crop Prot. Conf—Weeds, 1987, P.1075-1082

78. Ridley, S.M. McNally S.F. // Effects of phosphinothricin on the isozymes of glutamine synthetase isolated from plant species which exhibit varying degrees of susceptibility to the herbicide. II Plant Sci., 1985, V.39, P.31-36

79. Wanamarta G., Penner D. // Foliar absorption of herbicides. II Rev. Weed Sci., 1989, V.4, P.215-231

80. Droge W., Broer I., Puhler A. // Transgenic plants containing the phosphinothricin-N-acetyltransferase gene metabolize the herbicide Lphosphinothricin (glufosinate) differently from untransformed plants. II Planta, 1992, V.187, P.142-151

81. Thompson J., Rao Mowa N., Tizard R., Crameri R., Davies E. // Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. 11 The EMBO Jornal, 1987, V.6, P.2519-2523

82. Wohlleben W., Arnold W., Broer I., Hillermann D., Strauch E., Puhler A. // Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces TU494 and its expression in Nicotiana tabacum. II Gene, 1988, V.70, P.25-37

83. Wohlleben W., Alijah R., Dorendorf J., Hillerman D., Nussbaumer B. Pelzer S. // Identification and characterization of phosphinothricin-tripeptide biosynthetic genes in Streptomyces viridochromogenes. II Gene, 1992, V.115, P.127-132

84. Wehrmann A., Van Vliet A., Opsomer C., Botterman J., Schulz A. // The similarities of bar and pat gene products make them equally applicable for plant engineers. //Nat. Biotechnology, 1996, V.14, P.1274-1278

85. United States Department of Agriculture, 1995, Environmental Assessment and Determination of Non-regulated Status Petition Number 94-357-0 IP (for glufosinate resistant corn).

86. AgrEvo USA, 1994, Petition for a determination of non-regulated status for glufosinate resistant corn (submitted to United States Department of Agriculture, Petition No. 94-357-0IP).

87. Vasil V., Sherri M. I/Stably transformed callus lines from microprojectile bombardment of cell suspension cultures of wheat. II Biotechnology, 1991,V.19, P.348-359

88. Iser M., Fettig S., Scheyhing F., Viertel K. and Hess D. // Genotype-dependent stable genetic transformation in German spring wheat varieties selected for high regeneration potential. II 1999. J. Plant Physiol. 154: 508516.

89. Manderscheid R., Wild A. // Studies on the mechanism of inhibition by phosphinothricin of glutamine synthetase isolated from Triticum aestivum L. //J. Plant Physiol., 1986, V.123, P.135-142

90. Aono M., Kubo A., Saji H., Tanaka K., Kondo N. // Enhanced tolerance to photooxidative stress of transgenic Nicotiana tabacum with high chloroplastic glutathione reductase activity. II Plant and Cell Physiology, 1993, V.34, P.129-135

91. Foyer C.H., Lelandais M., Kunert K.J. // Photooxidative stress in plants. II Physiologia Plantarum, 1994, V.92, P.696-717

92. Foyer С. H. Rennenberg H // Sulfur Nutrition and Sulfur Assimilation in Higher Plant. II Bern Switzerland, 2000, P. 127-153

93. Ulmasov T, Ohmiya A, Hagen G, Guilfoyle T. // The soybean GH2/4 gene that encodes a glutathione S-transferase has a promoter that is activated by a wide range of chemical agents. II Plant Physiol., 1995, V.108, P.919-927

94. Timmerman K.P. // Molecular characterization of corn glutathione S-transferase isozymes involved in herbicide detoxication. II Plant Physiol., 1989, V.77, P.465-471

95. Kampranis S.C., Damianova R., Atallah M., Toby G., Kondi G., Tsichlis P.N., Makris A.M. // A novel plant glutathione S-transferase/peroxidase suppresses Bax lethality in yeast. II J. Biol. Chem., 2000, V.275, P.29207-29216

96. Sari-Gorla M., Ferrario S., Rossini L., Frova C., Villa M. // Developmental expression of glutathione S-transferase in maize and its possible connection with herbicide tolerance. II Euphytica, 1993, V.67, P.221-230

97. Dixon D., Cole D.J., Edwards R. // Characterization of multiple glutathione transferases containing the GST I submit with activities toward herbicide substrates in maize (Zea mays L.). I I Pestic. Sci., 1997, V.50, P.72-82

98. Marrs K.A., Walbot V. // Expression and RNA splicing of the maize glutathione S-transferase bronze2 gene is regulated by cadmium and other stresses. I I Plant Physiol., 1997, V.l 13, P.93-102

99. Mauch F., Dudler R. // Differential induction of distinct glutathione S-transferases of wheat by xenobiotics and by pathogen attack. II Plant Physiol., 1993, V.l 02, P.l 193-1201

100. Richards H., Rudas V., Sun H., Conger B. // Construction of a GFP-BAR plasmid and its use for switchgrass transformation. II Plant Cell Report, 2001, V.20,P.48-54

101. Hess D., Dressier K., Nimmrichter R. // Transformation experiments by pipetting Agrobacterium into the spikelets of wheat (Triticum aestivum L.). II Plant Sci., 1990, V.72, P.233-244

102. Ou G., Wang W.C., Nguyen H.T. // Inheritance of somatic embryogenesis and organ regeneration from immature embryo cultures of winter wheat. II Theor Appl Genet, 1989, V.78, P.137-142

103. Mohmand A.S., Nabors M.W. // Comparison of two methods for callus culture and plant regeneration in wheat (Triticum aestivum L.). II Plant Cell Tissue Organ Cult., 1991, V.26, P.187-189

104. Mathias R. J., Fukui K. Law C.N. // Cytoplasmic effect on the tissue culture response of wheat (T. aestivum L.) callus. II Theor. Appl. Genet., 1986, V.72, P. 70-75

105. Immonen A.T. // Influence of media and growth regulators on somatic embryogenesis and plant regeneration of primary triticales. II Plant Cell Tissue Organ Cult., 1996, V.44, P.45-52

106. Kiarostami К. H., Ebrahimzadeh H. // Effect of cold treatment on precocious germination in somatic embryogenesis of wheat (Triticum aestivum L.). II New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 2001, V.29, P.209-212

107. Бабаева С. А., Петрова Т. Ф., Гапоненко А. К. // Цитогенетика культивируемых in vitro соматических клеток и растений регенерантов (Triticum aestivum L.) и (Triticum durum Desf). II Генетика, 1995, №3, C.61-68

108. Гапоненко А.К., Мунтян М.А.,Маликова Н.И., Созинов А.А., // Регенерация растений различных генотипов пшеницы Triticum aestivum L. in vitro. //Доклады АН СССР, 1984, т. 278 № 5, стр. 1231-1235.

109. Zhang P., Puonti-Kaerlas J. // PIG-mediated cassava transformation using positive and negative selection. II Plant Cell Reports, 2000, V.19, P.939-945

110. Jakson S.A., Zhang P., Chen W.P., Phillips R.L., Fribe В., Muthukrishan S., Gill. B.S. // High-resolution structural analysis of biolistic trasgene integration into genome of wheat. II Theor. App.Genet., 2001, V.103, P.56-62

111. Milligan A.S., Daly A., Parry M.A.J., Lazzery P.A., Jepson I. // The expression of a maise glutathione S-transferase gene in transgenic wheat confers herbicide tolerance, both in planta and in vitro. II Molecular Breeding, 2001, V.7, P.301-315

112. Филиппов M.B., Мирошниченко Д.Н., Славохотова A.A., Долгов С.В. // Разработка системы трансформации и получение форм пшеницы (Triticum aestivum L.) устойчивых к гербициду. // Достижение науки и техники, 2004 V.1,C.10-12

113. Miroshnichenko D., Filippov M., Dolgov S. // Genetic transformation of Russian wheat varieties for the biotic and abiotic stress resistance. II On line publications, 2005.

114. В заключение автор считает своим приятным долгом выразить глубокую благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук А.К. Гапоненко, а также своим коллегам по работе А.Н Маркееву, Я.В. Мишуткиной и Я.Б. Нескородову.