Оптимальные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат медицинских наук Пичковская, Виктория Анатольевна

• Пичковская, Виктория Анатольевна
• кандидат медицинских наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Пичковская, Виктория Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ВирусгепашгаВ.

1.1.1. Морфология вирусных частиц.

1.1.2. Организация генома и продукты вирусных генов.

1.1.3. Жизненный цикл вируса.

1.1.4. Мутационные изменения генома вируса.

1.1.4.1. Precore-мутация в С-гене.

1.1.4.2. YMDD-мутация в Р-гепе.

1.1.5. Изменение концентрации вируса в крови.

1.2. ПЦР-диагностка вирусного гепатита В.

1.2.1. Количественная ПЦР-диагностика.

1.2.2. ПЦР-диагностикаprecore- и YMDD-мутаций.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Создание банка сывороток.

2.2. ВьшорпраймеровдляПЦР.

2.3. полимеразная цепная реакция.

2.4. Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция.

2.5. Гель-электрофорезамплифицированнойДНК.

2.6. Клонирование внутреннего стандарта.

2.7. Определение концентрации плазмидной ДНК.

2.8. Количественное определение ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Получение внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР.

3.2. Количественное определение ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.

3.3. Детекция YMDD/precore-мутаций в ДНК вируса гепатита В.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимальные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В»

Актуальность темы диссертации.

Вирусный гепатит В занимает одно из первых мест в инфекционной патологии человека, поэтому возбудитель данного заболевания - ДНК-содержащий гепатотропный вирус гепатита В является предметом пристального внимания и всестороннего изучения. В настоящее время показано, что в репликации этого вируса присутствует стадия обратной транскрипции РНК-прегенома. Обратная транскриптаза, осуществляющая этот процесс, лишена 3'—>5' корректирующей функции, что определяет вариабельность вирусного генома. В сочетании с высокой репликативной активностью вируса гепатита В это приводит к повышению вероятности ошибки считывания РНК-матрицы и появлению мутантных штаммов. В свою очередь, мутации вирусного генома могут изменять профиль серологических маркеров, приводить к снижению эффективности стандартных схем противовирусной терапии и т.д. Отсюда возникла необходимость в комплексной диагностике вирусного гепатита В, включающей количественную оценку вируса в крови больного и анализ мутаций вирусного генома. С этой целью сегодня применяются различные методы генодиагностики, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Наиболее распространенным методом количественной оценки вируса гепатита В является конкурентная ПЦР, основанная на коамплификации ДНК патогена и количественно охарактеризованного внутреннего стандарта. Создание подобного внутреннего стандарта составляет определенную сложность, что ограничивает применение количественных тест-систем, основанных на методе конкурентной ПЦР, в клинической диагностике.

В ПЦР-диагностике мутаций генома вируса гепатита В приоритетным направлением является детекция клинически значимых 4

YMDD- и precore-мутаций, ассоциирующихся со снижением/отсутствием эффективности противовирусной терапии нуклеозидными аналогами или препаратами интерферона. Кроме того, ргесоге-мутация определяет отсутствие основного маркера активной репликации вируса — НВе-антигена. YMDD- и ргесоге- мутации вызваны однонуклеотидными заменами в ДНК вируса гепатита В. Поэтому для их выявления применяются методы, предназначенные для детекции SNPs (single nucleotide polymorphisms). В большинстве случаев с этой целью используют методы секвенирования и определения длин рестрикционных фрагментов. Но данные методики обладают рядом недостатков: они технически сложны в исполнении и с их помощью довольно трудно оценить долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Тем не менее, такая информация необходима для выработки эффективной тактики лечения больных вирусным гепатитом В.

Цель работы.

Создать оптимальные диагностические тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В.

Задачи исследования.

1. Разработать методически простую технологию конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР на примере вируса гепатита В.

2. Разработать диагностическую тест-систему для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР, в которой будет использоваться полученный внутренний стандарт.

3. Найти оптимальный метод для выявления дикого и YMDD/precore-мутантных штаммов вируса гепатита В, позволяющий оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.

4. Апробировать разработанные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В на сыворотках больных вирусным гепатитом В.

Научная новизна.

Впервые предлагается универсальный и методически простой способ конструирования внутреннего стандарта для одностадийной конкурентной ПЦР. Доказывается, что метод аллель-специфической ПЦР для выявления мутаций в вирусном геноме применим в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл. Причем проведение аллель-специфической ПЦР в указанных концентрационных пределах позволяет оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.

Практическое значение работы.

Предложенная технология конструирования внутреннего стандарта упрощает разработку тест-систем для определения количества ДНК вируса гепатита В, основанных на методе конкурентной ПЦР. Применение конкурентной и аллель-специфической ПЦР для оценки количества и детекции мутаций в геноме вируса позволяет контролировать эффективность терапии больных вирусным гепатитом В и корректировать протокол лечения в случае выявления мутантных штаммов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), I Всероссийском съезде гематологов (Москва, 2002), научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", проводимом в рамках международной научно-практической конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 2002).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе получен патент на изобретение № 2194761, Государственный реестр изобретений РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 86 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 21 рисунок и 2 таблицы. Список цитируемой литературы включает 117 наименований.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Пичковская, Виктория Анатольевна

выводы.

1. Разработана и запатентована новая технология создания внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР

2. Разработана диагностическая тест-система для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.

3. Показано, что аллель-специфическая ПЦР для выявления вирусных мутаций применима в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл.

4. Установлено, что с помощью аллель-специфической ПЦР можно оценить долю мутантных штаммов в общей популяции вируса гепатита В.

5. Разработанные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В апробированы на сыворотках больных вирусным гепатитом В.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Пичковская, Виктория Анатольевна, 2004 год

1. Аммосов А.Д. Гепатит В. Аналитический обзор. Кольцово: Институт средств медицинской диагностики ЗАО «Вектор-Бест», 1998.

2. Апросина З.Г. Последние достижения в изучении вирусных гепатитов: от молекулярной биологии к лечению вирусного гепатита В // Русск. мед. журн. 1996. - Т. 4. - № 3. - С. 174-177.

3. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь -вирусные гепатиты. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. М.: Амипресс, 1999.

4. Ильина Е.Н., Говорун В.М., Иваников И.О., Сюткин В.Е., Петухова С.В. Хронические вирусные заболевания печени. Методическое пособие для врачей. М.: Научно производственная фирма «Литех», 2001.

5. Клиническая онкогематология. Руководство для врачей / Под ред. М.А.Волковой.-М.:Медицина, 2001. 576 с.

6. Клименко С.М. Биология вируса гепатита В // Бюллетень «Вакцинация». 1999. - №4. - С. 39-44.

7. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Часть 2 (лекция). // Клин, лаб. диагностика. — 2000. № 5. - С.25-37

8. Нетесов С.В. Вирусные гепатиты // СОЖ. 1997. - №2. - С.35-43.

9. Пичковская В.А. Разработка тест-системы, основанной на методеполимеразной цепной реакции, для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови. // Вестник РГМУ. 2001. - № 2 (17). -С.153.

10. П.Рахманова А.Г., Демиденко Т.П., Кузнецов Н.И., Степанова. Е.В. Этиопатогенетическая терапия репликативных форм вирусных гепатитов В и С. Пособие для врачей. СПб.: Медицинская академия-постдипломного образования, 1998.

11. Февралева И.С., Пичковская В.А., Судариков А.Б. Новая технология конструирования внутреннего стандарта для количественной полимеразной цепной реакции. // Проблемы гематологии и переливания крови. 2002. - № 1. - С. 89.

12. Февралева И.С., Пичковская В. А., Судариков А.Б. Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной полимеразной цепной реакции. Патент на изобретение № 2194761. М.:

13. Государственный реестр изобретений РФ, 2002.

14. Хендерсон Д.М. Патофизиология органов пищеварения. — М.-СПб.: Бином Невский Диалект, 1997. - С. 182-184.

15. Abe A., Inoue К., Tanaka Т. et al. Quantitation of hepatitis В virus genomic DNA by real-time detection PCR // J. Clin. Microbiol. 1999. -37: 2899-2903.

16. Allen M.I., Gauthier J., Deslauriers M. et al. Two Sensitive PCR-Based Methods for Detection of Hepatitis В Virus Variants Associated with Reduced Susceptibility to Lamivudine // J. Clin. Microbiol. — 1999. -37(10): 3338-3347.

17. Arbuthnot P., Capovilla A., Kew M. Putative role of hepatitis В virus X protein in hepatocarcinogenesis: effects on apoptosis, DNA repair, mitogen-activated protein kinase and JAK/STAT pathways // J.Gastroenterol.Hepatol. 2000. - 15: 357-368.

18. Arts E.J., Wainberg M.A. Mechanisms of Nucleoside Analog Antiviral

19. Activity and Resistance During Human Immunodeficiency Virus Reverse Transcription // Antimicrob.Agents Chemother. 1996. - 40(3): 527-540.

20. Badur S., Akgun A. Diagnosis of hepatitis В infections and monitoring of Treatment//J.Clin.Virol. -2001. -21: 229-237.

21. Bartholomeusz A, Locarnini S. Hepatitis В virus mutants and fulminant hepatitis B: fitness plus phenotype // Hepatol. 2001. - 34:432-435.

22. Buti M., Sanchez F., Cotrina M. et al. Quantitative Hepatitis В Virus DNA Testing for the Early Prediction Of the Maintenance of Response during Lamivudine Therapy in Patients With Chronic Hepatitis В // J.InfectDis. -2001. 183:1277-80.

23. Chang C.-N., Skalskis V., Zhou J.H., Chengo Y.-C. Biochemical Pharmacology of (+)- and (-)-2',3'-Dideoxy-3'- Thiacytidine as Anti-hepatitis В Virus Agents // J.Biol.Chem. 1992. - 267(31): 22414-22420.

24. Chu C.J., Hussain M., Lok A.S. Quantitative serum HBV DNA levels during different stages of chronic hepatitis В infection. // Hepatol. 2002. - 36(6):1408-15.

25. Chu CJ., Suk-Fong Lok A. Clinical utility in quantifying serum HBV DNA levels Using PCR assays // J.Hepatol. 2002. -36: 549-551.

26. Chu C.-M.,. Yeh C.-T, Lee C.-S. et al. Precore Stop Mutant in HBeAg-Positive Patients with Chronic Hepatitis B: Clinical Characteristics and Correlation with the Course of HBeAg-to-Anti-HBe Seroconversion // J.Clin.Microbiol. 2002. - 40(1): 16-21.

27. Clementi M. Quantitative Molecular Analysis of Virus Expression And Replication // J. Clin. Microbiol. 2000. - 38: 2030-2036.

28. Clementi M., Bagnarelli P., Manzin A., Menzo S. Competitive Polymerase chain reaction and analysis of viral activity at the molecular level // Genet. Anal. Tech. Appl. 1994. - 11:1-6.

29. Conjeevaram H. S., Suk-Fong Lok A. Management of chronic hepatitis В // J.Hepatol. 2003. - 38: S90-S103.

30. Da Silva L.C., Fonseca L.E.P., Carrilho F.J. et al. Predictive factors for response to Lamivudine in chronic hepatitis В // Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. 2000. 42(4): 189-196.

31. Dai M.S., Lu J.J., Chen Y.C. et al. Reactivation of precore mutant hepatitis В virus in chemotherapy-treated patients // Cancer. 2001. -92(11): 2927-2932.

32. Das K., Xiong X., Yang H. et al. Molecular Modeling and Biochemical Characterization Reveal The Mechanism of Hepatitis В Virus Polymerase Resistance To Lamivudine (3TC) and Emtricitabine (FTC) // J.Virol. — 2001.-75(10): 4771-4779.

33. De Clercq E. Perspectives for the treatment of hepatitis В virus infections // IntJ.Antimicrob.Agents 1999. - 12: 81-95.

34. Doo E., Liang T.J. Molecular Anatomy and Pathophysiologic Implications of Drug Resistance in Hepatitis В Virus Infection // Gastroenterol.-2001. 120: 1000-1008.

35. Drosten C., Weber M., Seifried E., Roth W.K. Evaluation of a new PCR assay with competitive internal control sequence for blood donor screening // Transfusion. 2000. - 40: 718-724.

36. Feng J.Y., Johnsoni A.A., Johnsoni K.A., Anderson K.S. Insights into the Molecular Mechanism of Mitochondrial Toxicity by AIDS Drugs //

37. J.Biol.Chem. -2001. 276(26): 23832-23837.

38. Francois G., Kew M., Van Damme P. et al. Mutant hepatitis В viruses: a matter of academic interest only or a problem with far-reaching implications? // Vaccine. -2001. 19: 3799-3815.

39. Gaillard R.K., Barnard J., Lopez V. et al. Kinetic Analysis of Wild-Type and YMDD Mutant Hepatitis В Virus Polymerases and Effects of Deoxyribonucleotide Concentrations On Polymerase Activity // Antimicrob.Agents Chemother. 2002. - 46(4): 1005-1013.

40. Ganem, D., Pollack J.R., and Tavis J. Hepatitis В virus reverse transcriptase and its many roles in hepadnaviral genomic replication // Infect. Agents Dis. 1994. - 3: 85-93.

41. Halpern M.S., Egan J., Mason W.S., England J.M. Viral antigen in endocrine cells of the pancreatic islets and adrenal cortex of Pekin ducks infected with duck hepatitis В virus // Virus Res. 1984. - 1:213-223.

42. Hammerle Т., Himmelspach M., Dorner F., Falkner F. G. A sensitive PCR assay system for the quantitation of viral Genome equivalents: human immunodeseciency virus type 1 (HIV-1) and hepatitis В virus (HBV) // Arch. Virol. 1997. - 142: 1297±1306.

43. Hendricks D.A., Stowe В J., Hoo B.S. et al. Quantitation of HBV DNA in human serum using a branched DNA (bDNA) signal amplification assay // Am. J. Clin. Pathol. 1995. - 104: 537-546.

44. Hilleman M.R. Overview of the pathogenesis, prophylaxis and therapeusis of viral hepatitis B, with focus on reduction to practical applications // Vaccine 2001. - 19: 1837-1848.

45. Hirsch R.C., Lavine J.E., Chang L.J. et al. Polymerase gene products ofhepatitis В viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription // Nature 1990. - 344: 552-555.

46. Jardi R., Buti M., Rodriguez-Frias F. et al. Rapid detection of lamivudine-resistant hepatitis В vims polymerase gene variants // J Virol Methods -1999.-83(1-2): 181-187.

47. Kamisango K., Kamogawa C., Sumi M. et al. Quantitative detection of hepatitis В virus by transcription-mediated amplification and hybridization protection assay // J. Clin. Microbiol. 1999. - 37: 310-314.

48. Kessler H.H., Pierer K., Dragon E. Evaluation of a new assay for HBV DNA quantitation in patients with chronic hepatitis В // Clin. Diagn. Virol.-1998.-9:37-43.

49. Kessler H.H., Preininger S., Stelzl E. et al. Identification of Different States of Hepatitis В Virus Infection With a Quantitative PCR Assay // Clin.Diagn.Lab.Immunol. 2000. - 7(2): 298-300.

50. Kessler H.H., Stelzl E., Daghofer E. et al. Semiautomated Quantification of Hepatitis В Virus DNA in a Routine Diagnostic Laboratory // Clin.Diagn.Lab.Immimol. 2000. - 7(5): 853-855.

51. Kidd-Ljunggren K., Miyakawa Y., Kidd A. H. Genetic variability in hepatitis В viruses // J.Gen.Virol. 2002. - 83: 1267-1280.

52. Kidd-Ljunggren K., Oberg M., Kidd A. H. Hepatitis В virus X gene 1751 to 1764 mutations: Implications for HBeAg status and disease // J.Gen.Virol. 1997. - 78: 1469-1478.

53. Kidd-Ljunggrena K., Zukerb M., Hofackerc I.L., Kiddd A.H. The Hepatitis В Virus Pregenome: Prediction of RNA Structure and Implications For the Emergence of Deletions // Intervirol. 2000. -43:154.164.

54. Kirby G.M., Batist G., Fotouhi-Ardakani N et al. Allele-specific PSR analysis of p53 codon 249 AGT transversion in liver tissues from patients with viral hepatitis // Int. J. Cancer 1996. - 68(l):21-25.

55. Kirishima Т., Okanoue Т., Daimon Y. et al Detection of YMDD mutant using a novel sensitive method in chronic Liver disease type В patients before and during lamivudine treatment // J.Hepatol. 2002. - 37: 259265.

56. Kobayashi S., Ide Т., Sata M. Detection of YMDD motif mutations in some lamivudine-untreated Asymptomatic hepatitis В vims carriers // J.Hepatol. 2001. - 34: 584-586.

57. Kreutz C. Molecular, immunological and clinical properties of mutated hepatitis В viruses // J.Cell.Mol.Med. 2002. - 6(1): 113-143.

58. Kwok P.-Y. Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms // Annu.Rev.Genomics Hum.Genet. 2001. - 2: 235-258.

59. Lampertico P., Iavarone M., Lunghi G. et al. Monitoring serum HBV-dna during lamivudine therapy by quantitative PCR assay may predict development of YMDD mutants // J.Hepatol. 2002. - 32(S2): 104.

60. Lau G.K, Liang R., Chiu E.K. et al. Hepatic events after bone marrow transplantation in patients with hepatitis В infection: a case controlled study // Bone Marrow Transplant. 1997. - 19: 795-799.

61. Lewin S., Walters Т., Locarnini S. et al. Hepatitis В treatment: rational combination chemotherapy Based on viral kinetic and animal model studies // Antiviral Res. 2002. - 55: 381-396.

62. Li J., Buckwold V. E., Hon M.-W., Ou J.-H. Mechanism of Suppression of Hepatitis В Virus Precore RNA Transcription by a Frequent Double Mutation // J.Virol. 1999. - 73(2): 1239-1244.

63. Li N., Tan W.G., Tsang R.Y. et al. Quantitative polymerase chain reaction using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection: Analysis of duck hepatitis В // Anal. Bioanal. Chem. 2002. -374: 269-273.

64. Liang R.H., Lok A.S., Lai C.L. et al. Hepatitis В infection in patients with lymphomas // Hematol. Oncol. 1990. - 8: 261-270.

65. Liao C.A., Lee C.M., Wu H.C. et al. Lamivudine for the treatment of hepatitis В virus reactivation following chemotherapy for non-Hodgkin's lymphoma // Br. J. Haematol. 2002. - 116: 166-169.

66. Lin O.S., Keeffe E.B. Current treatment strategies for chronic hepatitis В and С // Annu. Rev. Med. 2001. - 52: 29-49.

67. L0 E.S., Lo Y.M., Fleming K.A. J. Detection of hepatitis В precore mutant by allele specific polymerase chain reaction // Clin. Pathol. -1992. 45(8): 689-92.

68. Locarnini S. Hepatitis В viral resistance: mechanisms and diagnosis // J.Hepatol. 2003. - 39(S1): 124-132.

69. Locarnini S., McMillan J., Bartholomeusz A. The Hepatitis В Virus and Common Mutants // Semin. Liver Dis. 2003. - 23(1): 5-20.

70. Lopez J.L., Mbayed V.A., Telenta P.F.S. et al. "HBe" minus' mutants of hepatitis В virus. Molecular Characterization and its relation to viral genotypes // Virus Res. 2002. - 87: 41-49.

71. Louie M., Louie L., Simor A. E. The role of DNA amplification Technology in the diagnosis of infectious diseases // Can.Med.Assoc,J. -2000. 163(3): 301-9.

72. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Real-time PCR in virology // NucLAcids Res. 2002. - 30(6): 1292-1305.

73. Maini M.K., Bertoletti A. How can the cellular immune response control hepatitis В virus replication? // J.Viral Hepat. 2000. - 7: 321-326.

74. Mantero G., Zonaro A., Albertini A. et al. DNA enzyme immunoassay: general method for detection products of polymerase chain reaction // Clin Chem. -1991.-37: 442-429.

75. Nagata I., Colucci G., Gregorio G. V. et al. The role of HBV DNA quantitative PCR in monitoring the response to Interferon treatment in chronic hepatitis В virus infection // J.Hepatol. 1999. - 30: 965-969.

76. Nakamoto Y., Guidotti L.G., Kuhlen C.V. et al. Immune Pathogenesis of Hepatocellular Carcinoma // J. Exp. Med. 1998. - 188(2): 341-350.

77. Nakamura Y., Motokura Т., Fujita A. et al. Severe hepatitis related to chemotherapy in hepatitis В virus carriers with hematologic malignancies. Survey in Japan, 1987-1991 // Cancer. 1996. - 78: 2210-2215.

78. Niesters H.G. M., de Man R.A., Pas S.D. et al. Identification of a new variant in the YMDD motif Of the hepatitis В virus polymerase gene selected During lamivudine therapy // J. Med. Microbiol. 2002. — 51: 695-699.

79. Nowak M.A., Bonhoeffer S., Hill A M. Viral dynamics in hepatitis В virus infection // Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996. - 93: 4398-4402.

80. Papatheodoridis G.V., Dimou E., Laras A., Papadimitropoulos V., Hadziyannis S.J. Course of virologic breakthroughs under long-term lamivudine in HBeAg-negative precore mutant HBV liver disease // Hepatol. -2002. 36(1): 219-226.

81. Pawlotsky J.M., Bastie A., Lonjon I. et al. What technique should be used for routine detection and quantification of HBV DNA in clinical samples? // J. Virol. Methods. 1997. - 65(2): 245-53.

82. Pawlotsky J.-M. HBV DNA assays (methods and practical use) and viral kinetics // EASL International Consensus Conference on Hepatitis B, September 13-14, 2002, Geneva, Switzerland.

83. Payan C., Veal N., Crescenzo-Chaigne B. et al. New quantitative assay of hepatitis В and С viruses by competitive PCR using alternative internal sequences // J. Virol. Methods. 1997. - 65(2): 299-305.

84. Petrosillo N., Ippolito G., Solforosi L. et al. Molecular epidemiology of an outbreak of fulminant hepatitis В // J. Clin. Microbiol. 2000. - 38(8): 2975-2981.

85. Piatak M. J., Luk K.-C., Williams В., Lifson J. D. Quantitative competitive polymerase chain reaction for accurate Quantitation of HIV DNA and RNA species // Biotechniques. 1993. - 14: 70-81.i

86. Picardi M., Pane F., Quintarelli C. et al. Hepatitis В virus reactivation after fludarabine-based regimens for indolent non-Hodgkin's lymphomas: high prevalence of acquired viral genomic mutations // Haematol. — 2003. 88: 1296-1303.

87. Pollack J.R., Ganem D. An RNA stem-loop structure directs hepatitis В vims genomic RNA encapsidation // J. Virol. 1993. - 67:3254-3263.

88. Prescott L.M. Lamivudine useful against hepatitis B-HIV co-infection // J. Int. Assoc. Physicians AIDS Care. 1995. - 1(5): 34.

89. Radziwill G., Tucher W., Schaller H. Mutational analysis of the hepatitis В virus P gene product: domain structure and RNAseH activity // J.Virol. -1990.-64:613-620.

90. Read S.J., Burnett D., Fink C.G. Molecular techniques for clinical diagnostic virology // J. Clin. Pathol. 2000. - 53: 502-506.

91. Rizzetto M., Marzano A., Lagget M. Treatment of hepatitis В e antigen-negative chronic Hepatitis В with lamivudine // J.Hepatol. — 2003. -39(S1): 168-171.

92. Seeger C., Mason W.S. Hepatitis В Virus Biology // Microbiol.Mol.Biol.Rev. 2000. - 64(1): 51-68.

93. Seigneres В., Aguesse-Germon S., Pichoud C. et al. Duck hepatitis В virus polymerase gene mutants associated with Resistance to lamivudine have a decreased replication capacity In vitro and in vivo // J.Hepatol. — 2001.-34: 114-122.

94. Shibolet O., Ilan Y., Gillis S. et al. Lamivudine therapy for prevention of immunosuppressive-induced hepatitis В virus reactivation in hepatitis В surface antigen carriers // Blood. 2002. - 100: 391-396.

95. Schodel F., Peterson D., Zheng J. et al. Structure of hepatitis В virus core and e-antigen // J.Biol.Chem. 1993. - 2: 1332-1337.

96. Silvestri F., Ermacora A., Sperotto A. et al. Lamivudine allows completion of chemotherapy in lymphoma patients with hepatitis В reactivation // Br. J. Haematol. 2000. - 108: 394-6.

97. Simmonds P. The origin and evolution of hepatitis viruses in humans // J.Gen.Virol. 2001. - 82: 693-712.

98. Stuyver L., Van Geyt C., de Gendt S. et al. Line probe assay for monitoring drug resistance in hepatitis В virus-infected patients during antiviral therapy // J. Clin. Microbiol. 2000. - 38(2): 702-707.

99. Suk-Fong Lok A. Hepatitis В infection: pathogenesis and management // J.Hepatol. 2000. - 32(S1): 89-97.

100. Suzuki F., Suzuki Y., Tsubota A. et al. Mutations of polymerase, precore and core promoter gene in hepatitis В virus during 5-year, lamivudine therapy // J.Hepatol. 2002. - 37: 824-830.

101. Torresi J. The virological and clinical significance of mutations in the overlapping envelope and polymerase genes of hepatitis В virus // J.Clin.Virol. 2002. - 25(2): 97 - 106.

102. Ustun C., Idilman R., Gurman G. et al. Hematopoietic stem cell transplantation from non-replicative hepatitis В virus carriers is safe // J.Hepatol. 1999. - 31(2): 202-209.

103. Valentine-Thon E., Van Loon A. M., Schirm J. et al. European Proficiency Testing Program for Molecular Detection And Quantitation of Hepatitis В Virus DNA // J. Clin. Microbiol. 2001. - 39(12): 44074412.

104. Wang G.H., Seeger C. The reverse transcriptase of hepatitis В virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis // Cell.-1992.-71: 663-670.

105. Waris G., Siddiqui A. Regulatory mechanisms of viral hepatitis В and С // J. Biosci. 2003. - 28(3): 311-321.

106. Waterfall C.M., Eisenthal R., Cobb B.D. Kinetic characterization of primer mismatches in allele-specific PCR: a quantitative assessment // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - 299: 715-722.

107. Wolters L.M.M., Niesters H.G.M., de Man R.A. Nucleoside analogues for chronic hepatitis В // EurJ.Gastroenterol.Hepatol. 2001. - 13(12): 1499-506.

108. Wu J., Sullivan D.E., Gerber M.A. Quantitative polymerase chain reaction for hepatitis В virus DNA // J.Virol.Methods. 1994. - 49(3): 331-41.

109. Yeh C.-T. Hepatitis В virus X protein: Searching for a role in hepatocarcinogenesis // J.Gastroenterol.Hepatol. 2000. — 15: 339-341.

110. Yeo W., Chan P.K., Zhong S. et al. Frequency of hepatitis В virus reactivation in cancer patients undergoing cytotoxic chemotherapy: a prospective study of 626 patients with identification of risk factors // J. Med. Virol. 2000. - 62: 299-307.

111. Yotsuyanagi H., Hino K., Tomita E. et al. Precore and core promoter mutations, hepatitis В virus DNA levels And progressive liver injury in chronic hepatitis В // J.Hepatol. 2002. - 37: 355-363.

112. Zanella I., Rossini A., Domenighini D., Albertini A., Cariani E. Quantitative analysis of hepatitis В virus DNA by real-lime amplification // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2002. - 21(l):22-26.

113. Zeuzem S., de Man R.A., Honkoop P. et al. Dynamics of hepatitis В virus infection in vivo // J. Hepatol. 1997. - 21: 431-436.

114. Zoulim F. Assessing Hepatitis В Virus Resistance In Vitro and Molecular Mechanisms of Nucleoside Resistance // Semin. Liver Dis. —2002.-22(1): 23-31.

115. Zoulim F. Hepatitis В virus resistance to antivirals: clinical implications And management // J.Hepatol. 2003. - 39(S1): 133-138.

116. Zoulim F., Trepo C. Drug therapy for chronic hepatitis B: antiviral efficacy and influence of hepatitis В virus polymerase mutations on the outcome of therapy // J.Hepatol. 1998. - 29: 151-168.1. БЛАГОДАРНОСТИ