Определение влияния гидроксиламингидрохлорида на состав и свойства антигенов Shigella dysenteriae 1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Захарова, Наталия Евгеньевна

• Захарова, Наталия Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Захарова, Наталия Евгеньевна

Список сокращений Введение

Обзор литературы

Глава 1. Химические свойства и применение гидроксиламина и его производных

Глава 2. Использование солянокислого гидроксиламина для получения вакцинных препаратов

2.1. Гидроксиламиновые вакцины - историческая справка

2.2. Особенности получения гидроксиламиновых препаратов и их характеристика

Глава 3. Антигенные и иммуногенные свойства S. dysenteriae

3.1. Антигенный состав S. dysenteriae

3.2. Иммунный ответ к S. dysenteriae

3.3. Вакцины против S. dysenteriae 1 Собственные исследования

Глава 4. Материалы и методы исследований

4.1. Штаммы S. dysenteriae

4.2. Условия культивирования штаммов S. dysenteriae

4.3. Методы выделения бактериальных антигенов

4.4. Получение гипериммунных сывороток

4.5. Методы химического и физико-химического анализа

4.6. Методы иммунохимического анализа

4.7. Методы оценки биологических свойств препаратов

4.8. Методы статистической обработки результатов исследования

Глава 5. Изучение влияния гидроксиламингидрохлорида на состав и свойства антигенных препаратов, полученных го целых микробных клеток

S. dysenteriae

5.1. Характеристика химического состава гидроксиламиновых препаратов, полученных из целых микробных клеток

5.2. Антигенный состав и О-специфическая активность гидроксиламиновых препаратов, полученных из целых микробных клеток

5.3. Физико-химическая характеристика гидроксиламиновых препаратов, полученных из целых микробных клеток

5.4. Характеристика токсических и протективных свойств гидроксиламиновых препаратов, выделенных из целых микробных клеток

Глава 6. Изучение влияния гидроксиламингидрохлорида на свойства антигенных препаратов S. dysenteriae 1, полученных с помощью ультразвуковой дезинтеграции

6.1. Характеристика химического состава дезинтегратов, подвергшихся воздействию гидроксиламингидрохлорида

6.2. Иммунохимическая характеристика антигенных препаратов, полученных с помощью ультразвуковой дезинтеграции

6.3. Молекулярно-весовое распределение дезинтегратов и препаратов, полученных из них с помощью гидроксиламингидрохлорида

6.4. Оценка токсических и иммуногенных свойств дезинтегратов и препаратов, полученных из них с помощью гидроксиламингидрохлорида

Глава 7. Изучение влияния гидроксиламингидрохлорида на структуру липолисахаридов S. dysenteriae

7.1. Влияние гидроксиламингидрохлорида на жирнокислотный состав липополисахарида S. dysenteriae

7.2. Иммунохимическая характеристика липополисахарида до и после обработки гидроксиламингидрохлоридом

7.3. Характеристика молекулярно-весового распределения липополисахаридов S. dysenteriae

7.4. Оценка токсических и иммуногенных свойств препаратов липополисахарида

Обсуждение результатов

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение влияния гидроксиламингидрохлорида на состав и свойства антигенов Shigella dysenteriae 1»

Актуальность проблемы. Бациллярная дизентерия, вызываемая шигеллами разных видов, продолжает оставаться серьезной медико-социальной проблемой, особенно в развивающихся странах, где по разным источникам регистрируется от 165 млн. до 250 млн. случаев этого заболевания в год, причем более чем 650 тыс. — со смертельным исходом, преимущественно среди детей младше 5 лет (94). При инфекционных заболеваниях с алиментарным путем передачи возбудителя мероприятия, направленные на улучшение санитарно-гигиенических условий жизни, могут снижать активность эпидемического процесса. Однако это дорогостоящие меры, и в тех регионах, где бациллярная дизентерия наиболее часто встречается, они, вряд ли смогут быть реализованы в ближайшее время (100). Дизентерия, вызванная Shigella dysenteriae 1 (дизентерия Шига), протекает особенно тяжело, по сравнению с заболеваниями этиологически связанными с другими видами шигелл. Тяжесть течения заболевания свидетельствует о чрезвычайно высокой вирулентности S. dysenteriae 1.

Интерес к созданию вакцины против дизентерии, вызванной S.dysenteriae 1, вновь возникшей в последние 30 лет, связан с мировой пандемией этого заболевания (52). Хотя в России это заболевание не приняло массового характера, опасность его распространения существует из-за возможности заноса инфекции из соседних областей. Следствием такого заноса с территории Афганистана явилось появление дизентерии Шига в СССР в середине 80-х годов (47).

В настоящее время разработка вакцин против шигеллезов ведется по двум основным направлениям. Первое- живые пероральные вакцины, второе -химические и синтетические пероральные и инъекционные вакцины. Тем не менее, ни одна из существующих вакцин не является достаточно эффективной (71).

Известно, что для получения эффективных вакцинных препаратов большое значение имеет выбор штамма, условий его культивирования и метода извлечения антигенов. Одним 7 из широко применяемых методов выделения антигенов является способ экстракции гидроксиламингидрохлоридом (ГГ), предложенный в 1964 г. Синяшиным Н.И. и Лобачевой JI.A. (50). Применение этого реагента позволило получить эффективные вакцины из ряда условно-патогенных микроорганизмов, характеризующихся высокой иммуногенностью и слабой токсичностью: протейная вакцина (38), поликомпонентная вакцина ВП-4, содержащая в своем составе антигены Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris и водный экстракт клеток Staphylococcus aureus (25), дизентерийная вакцина, полученная с помощью ГГ из трех сероваров Shigella flexneri (la,lb,2а) (51). Эффективность антигенных препаратов, полученных с помощью ГГ, доказана и для других грамотрицательных бактерий - Salmonella typhimurium (30), Shigella sonnei (29), Salmonella typhi (49).

В связи с вышеизложенным, представляется актуальным получение препаратов, из бактерий S.dysenteriae 1. Изучение условий получения препарата, отличающегося высокой иммуногенностью и слабой токсичностью, позволило бы в дальнейшем использовать полученные данные для разработки высокоэффективной вакцины против S.dysenteriae 1.

Несмотря на большое количество работ вопрос о влиянии ГГ на бактериальные клетки изучен недостаточно. Изучались, главным образом, различия в химическом составе и свойствах гидроксиламиновых препаратов (ГАП), полученных из бактерий, выращенных на питательных средах различного состава (35, 44), которые связывали только с морфологией клеток, экспрессией протективных антигенов при использовании различных способов культивирования. Никогда ранее не изучали влияние состава питательной среды на свойства препаратов, роль клеточных ферментов в процессе гидроксиламиновой экстракции, а также качественные и количественные особенности влияния ГГ на цельную микробную клетку и отдельные антигенные препараты, в частности, липополисахарид (ЛПС).

В настоящем исследовании решение этих вопросов проводили на модели бактерий S.dysenteriae 1. 8

Целью исследования было определение влияния гидроксиламингидрохлорида на состав и свойства различных антигенных препаратов Shigella dysenteriae 1.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить влияние ГГ на состав и свойства антигенных препаратов, полученных из целых микробных клеток S. dysenteriae 1.

2. Определить влияние протеолитических ферментов в процессе экстракции антигенов с помощью ГГ из клеток S. dysenteriae 1.

3. Определить роль компонентов питательной среды в составе антигенных препаратов, получаемых с помощью гидроксиламингидрохлорида.

4. Изучить влияние ГГ на состав и свойства антигенов, полученных с помощью ультразвуковой дезинтеграции из S. dysenteriae 1.

5. Изучить влияние ГГ на состав и свойства липополисахаридов S. dysenteriae 1. Научная новизна

1. Впервые охарактеризованы по химическим, иммунохимическим, физико-химическим параметрам и биологическим свойствам гидроксиламиновые препараты, полученные из целых микробных клеток S. dysenteriae 1. Установлено, что гидроксиламиновые препараты из S. dysenteriae 1 обладают, главным образом, антигенной специфичностью ЛПС.

2. Выявлено, что процесс получения антигенов из целых клеток S. dysenteriae 1 с помощью ГГ сочетается с действием эндогенных ферментов.

3. Показано, что общепринятый способ получения ГАП при условии добавления ГГ в культуру, содержащую питательную среду, ведет к контаминации антигенных препаратов компонентами субстрата.

4. Впервые показано, что взаимодействие ГГ с комплексом растворимых антигенов приводит к деструкции части антигенов со снижением их иммуногенности.

5. Действие ГГ на ЛПС S. dysenteriae 1 сопровождается снижением токсичности и гммуногенности, что связано с частичным удалением жирнокислотных компонентов. 9

Практическая значимость

1.Показано, что экстракция ГГ целых микробных клеток при 5 6° С приводит к получению малотоксичных и высокоиммуногенных ГАП из S. dysenteriae 1, которые могли бы использоваться в качестве вакцин.

2. Разработан иммуносорбент для определения антител к ЛПС S. dysenteriae 1 с помощью ИФА.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Состав и свойства препаратов, полученных из целых микробных клеток S. dysenteriae 1 с помощью ГГ зависят от штамма, среды культивирования, температурного режима экстракции и действия эндогенных ферментов. ГАП, выделенный при 56°С из бактерий S. dysenteriae 1 шт. 613, культивированных в полусинтетической среде обладает высокой иммуногенностью и слабой токсичностью.

2. Действие ГГ на растворимые антигены S. dysenteriae 1 приводит к деструктивному эффекту и измененяет их химический состав, молекулярно-весовую гетерогенность и биологические свойства. Препараты, полученные воздействием ГГ при 56°С на дезинтеграт S. dysenteriae 1 шт. 613 обладают средней иммуногенностью и наименьшей токсичностью.

3. ГГ в процессе взаимодействия с ЛПС S. dysenteriae 1 вызывает деструкцию этого антигена, сопровождающуюся удалением части высших жирных кислот и изменением его надмолекулярной структуры и биологических свойств. Препараты ЛПС S. dysenteriae 1 шт. 613 после воздействия ГГ при 56°С обладают умеренной токсичностью и средней иммуногенностью.

XXX

Диссертация изложена на 121 страницах, иллюстрирована 21 таблицей и 13 рисунками. Указатель цитированной литературы включает 149 источник, из них 58 - на русском языке.

10

Материалы диссертационной работы доложены на двух конференциях молодых ученых НИИВС им. И.И.Мечникова (Москва, 1994, 2000гг.); на заседании секции медицинской микробиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Москва 1997г.)

По теме диссертации опубликовано три работы в центральной печати.

11

Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Захарова, Наталия Евгеньевна

105 Выводы

1. Препараты, выделенные из бактерий S.dysenteriae 1 с помощью гидроксиламингидрохлорида представляют собой полисахаридно-белковые комплексы, обладающие, главным образом, антигенной специфичностью липополисахарида.

2. Процесс выделения антигенов из бактериальных клеток S.dysenteriae 1 с помощью гидроксиламингидрохлорида заключается в разрушении клетки этим агентом с одновременным действием протеолитических ферментов бактериальной клетки. Высокая активность протеолитических ферментов при 37°С приводит к повышению токсичности гидроксиламиновых препаратов.

3. Антигенные препараты, полученные из целых клеток S.dysenteriae 1 с помощью гидроксиламингидрохлорида при 4, 37 и 56°С отличаются по химическому составу, О-специфической активности, молекулярно-весовому распределению и биологическим свойствам. Для выделения гидроксиламиновых препаратов из S.dysenteriae 1, обладающих высокими иммуногенными свойствами и слабой токсичностью, предпочтительнее использовать экстракцию при 56°С.

4. При внесении гидроксиламингидрохлорида в бактериальную суспензию S.dysenteriae 1, содержащую остатки питательной среды, получаемые в результате гидроксиламиновые препараты оказываются контаминированы компонентами этой среды. Такая контаминация изменяет О-специфическую активность полученных препаратов.

5. Гидроксиламингидрохлорид оказывает деструктивное действие на антигены, полученные ультразвуковой дезинтеграцией, что выражается в исчезновении отдельных (отрицательно заряженных) субстанций с одновременным изменением химического состава и биологических свойств. После взаимодействия дезинтеграта с гидроксиламингидрохлоридом при 56°С снижается его токсичность.

6. Гидроксиламингидрохлорид оказывает дезагрегирующее и детоксицирующее действие на липополисахарид за счет частичного удаления жирнокислотных компонентов.

106

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Захарова, Наталия Евгеньевна, 2001 год

1. Айтбаева Ж.Т., Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Каверина К.Г. Эритроцитарные диагностикумы для определения антител к О-антигенам протеев. // Журнал микробиол., иммун. И эпидем. 1989. - № 5. - С. 16-20.

2. Александрова Н.И.,Егорова Н.Б., Ефремова В.Н. и др. / 3 национальный конгресс по болезням органов дыхания.// С.-Петербург, 1992. 7/ Пульмонология. - С. 152.

3. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. / пер. с англ. М.: Мир, - 1978. - 462с.

4. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград. - 1962. - 180с.

5. Балашов М.П, Сравнительная оценка иммунологической эффективности химических и живых дизентерийных Зонне вакцин в эксперименте. // Дисс. канд. мед. наук. Л., 1976.-179с.

6. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М.: Медицина. - 1992. - 191с.

7. Баснакьян И.А., Мирясова Л.В., Соколова Т.В. й др. Оптимизация технологии культивирования вакцинных штаммов Shigella flexneri. II Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1993. - № 5. - С. 6-10.

8. Белая Ю.А. Биология и антигенная структура шигелл в связи с патогенезом дизентерии. Дисс. докг. мед. наук.//-М. 1970.- 535с. \ •

9. Белая Ю.А., Белая О.Ф., Кудрявцева Л.Ю., Петрухин В.Г. и др/Выявление антигена Шига-токсйша в связи с другими факторами вирулешносга О- и К-антигенами энтеробактерий. // Журнал микробиол., иммун.и эпидем. - 1993, -№ 4. -С. 13-20.

10. Беспалова И.А., Пустовалов В.Л., Львов В.Л. и др. Получение и некоторые свойства модифицированного производного липополисахарида Yersinia pestis. II Биотехнология. -1995.-№ 9—10.-С. 31-34.

11. Блинникова Е.И., Шихман А.Р. Биохимический и иммунохимический анализы белковых компонентов клеточной стенки стрептококкков группы А, выделенных щадящим химическим методом. // Микробиология. 1992. - № 11-12. - С. 2-5.

12. Ванеева Н.П., Цветкова Н.В., Жукова Л.Ф. и др. Антигенный состав протективных фракций S.typhimurium. II Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1978. - № 10. - С. 73-76.

13. Ванеева Н.П., Алексеева Н.Ю., Торсунова Г.Н. и др. Особенности О-специфического гуморального иммунного ответа у мышей, вакцинированных антигенами Salmonella choleraesuis. II Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1990. - № 11. С. 56-59.

14. Ванеева Н.П., Ёлкина С.И., Ястребова Н.Е. и др. Химические и иммунохимические характеристики антигенов Shigella dysenteriae 1, выделенных с использованием гидроксиламина гидрохлорида. // Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1995. - № 6. - С. 45-46.

15. Васюренко З.П. Профили жирных кислот микроорганизмов патогенных для человека и животных. // Киев. 1992. -263с.

16. Волгарёва Г.М. Исследование повреждающего хромосомы действия двух химических контаминантов вакцин на мышах. // Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1991. - № 4 - С. 41-44.

17. Гааль Э., Медьеши Г., Верецки Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. / Пер. с англ. М. Мир. - 1982. - С.269.108

18. Геннис. Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. / Пер. с англ. 1997. - М., «Мир». - С. 49-107.

19. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика /пер. с англ. М.; Мир,- 1991.-543с.

20. Егорова Н.Б., Курбатова Е.А., Мирошниченко И.В. и др. Получение антигенных комплексов Klebsiella pneumoniae щадящими методами и изучение их протективной активности. // Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1983. - №2. - С.96-101.

21. Егорова Н.Б., Мансурова H.JL, Кузьмина JI.A., Каверина К.Г. Протективная активность поликомпонентной вакцины из антигенов условно-патогенных микроорганизмов при оральном введении. // Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1993. - № 1. -С. 48-51.

22. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Кузьмина JI.A. Итоги экспериментального и клинического изучения поликомпонентной вакцины их антигенов условно патогенных микроорганизмов. // Журнал микробиол., иммун. И эпидем. 1997. - № 6. - С. 96-101.

23. Жукова Л.Ф. Энтеральная иммунизация антигенными комплексами сальмонелл и шигелл в эксперименте. // Дисс. канд.мед. наук. М., 1980. - 167с.

24. Зайцева Е.В., Левина Л.А. Протейный перитонит-бактериемия мышей модель для изучения поствакцинального антипротейного иммунитета. // Журнал микробиол., иммун. и эпидем. - 1990. - № 7. - С. 74-78.

25. Захарова Н.Е. Ванеева Н.П., Ястребова Н.Е. и др. Влияние гидроксиламина гидрохлорида на бактерии Shigella dysenteriae 1 и антигены выделенные из них. // Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1998. - № 6. -С. 82-83.

26. Каверина К.Г., Красикова И.Н., Левина Л.А. и др. Характеристика химического состава и биологической активности антигенов протея, изолированных с помощью гидроксиламина. // Журнал микробиол., иммун. И эпидем. 1989. - № 11. - С. 23-26.

27. Каверина К.Г., Замятина Т.А., Филатова Т.Н. Характеристика белкового состава антигенов протея, полученных с помощью гидроксиламина. // Журнал микробиол., иммун. и эпидем.- 1990.-№7,- С.114-115.

28. Каверина К.Г., Баснакьян И.А., Мирясова Л.В., Захарова Н.Е. Зависимость растворимых антигенов протея от условий культивирования бактерий //.Сб. тр. НИИВС им. Мечникова «Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии». М. 1992. - С. 166-170.

29. Костина Г.И. К вопросу о механизмах химической инактивации микроорганизмов.// Журнал микробиол., иммун. и эпидем.- 1981. № 8. - С.25-32.

30. Крейнин Л.С., Каверина К.Г., Левина Л.А., Бутакова Л.Ю. Доклиническое изучение безвредности вакцинных препаратов. Определение токсичности лечебных вакцин в хронических опытах. // Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1981. - № 9. - С. 106-109.110

31. Крейнин JI.C., Каверина К.Г., Левина Л.А. и др. Вакцина из растворимых антигенов для специфической терапии протейной инфекции. // Журнал микробиол., иммун. и эпидем. -1983.-№ 10.-С. 88-92.

32. Куклина С.И. Морфологическое изучение токсичности протейной вакцины в хроническом опыте. // Семинар мол. учёных по мед. микробиол. и инфекц. иммунологии: Тез. докл. -М„ 1981. С. 62-63.

33. Ленинджер А. Основы биохимии. / Пер. с англ. 1985. - М.: Мир. - Т. 1. - 367с.

34. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. / Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96.

35. Мирясова Л.В., Ефимцева О.В., Карабак И.В. и др. Изучение фракционного состава гидроксиламиновых препаратов и липополисахарида вакцинного штамма Klebsiella pneumoniae. И Журнал микробиол., иммун. и эпидем. 1997. - № 3. - С.73-76.

36. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. М.; Наука. 1991. - С. 106-116.

37. Рубинов Г.У. Шигеллезы. Современные научные и практические аспекты эпидемиологического надзора. Дис. докт. мед. наук. -М., 1997.- 270с.

38. Сергеев В.В., Крейнин Л.С., Ёлкина С.И. и др. Полевые испытания с оральной бесклеточной вакциной из Shigella flexneri. 11 Журнал микробиол., иммун. И эпидем. 1989. -№ 10.-С. 54-59.

39. Сергеев В.В., Цветкова Н.В., Ястребова Н.Е. и др. Характеристика антигенного препарата Salmonella typhi TY2 4446, выделенный с помощью солянокислого гидроксиламина. // Журнал микробиол., иммун. И эпидем. 1993. - № 6. - С.65.

40. Синяшин Н.И., Лобачёва Л.А. Щадящий метод выделения растворимых антигенов из патогенных бактерий. // Использование разных методов в изучении и изготовлении вакцин и анатоксинов: Сб. науч. тр. М., 1964. - С. 8-9.

41. Соколова Т.В. Создание и изучение поливакцины, состоящей из антигенных комплексов S. flexneri la, lb и 2а. // Дисс. канд. мед. наук. М.- 1995. - 109с.

42. Солодовников Ю.П., Рубинов Г.Е. Дизентерия Григорьева-Шига новая эпидемическая угроза. - М. - 1990.- 60 с.

43. Спирин А.С. Спектрометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. // Биохимия. 1958. - № 23, 5. - С. 656.

44. Химическая энциклопедия под ред. И.Л.Кнунянц // М., «Советская энциклопедия». -1988. С.1094-1096.

45. Шарп Д., Госни И., Роуми А. // Практикум по органической химии. Изд. "Мир". - М. -1993.-240с.112

46. Шереметьев Н.Н. Изучение химического суммарного брюшнотифозного антигена в эксперименте на морских свинках. // Актуальные вопросы эпидемиологии, микробиологии, иммунологии, кишечных инфекционных заболеваний. Ташкент . 1980. - С. 33-34.

47. Шпилюк Г.Ф.,Селькина JI.E., Дадалова А.И. и др. Экспериментальная дизентерийная вакцина Зонне для перорального применения. /В сб.: Научные основы вакцинно-сывороточного дела // Ташкент. 1978. - С. 32-33.

48. Ahmed F., Clements J.D., Rao M.R. et al. Epidemiology of shigellosis among children exposed to cases of Shigella dysentery: a multivariate assessment. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997. - Mar. -56(3).-P. 258-264.

49. Amano K., Fukushi K. Electron microscopic studies of endotoxins treated with alkaline and acid reagents. // Microbiol. Immunol. 1984. -V. 28(2). - P. 161-168.

50. Arnon R. Syntetic peptides as the basis for vaccines against Influenza-virus and bacterial toxinns. // J. Contr. Release. 1992. - V. 19. - Iss. 1-3. - P. 7-14.

51. Ashkenasi S., Cleary K.R., Pickering L.K. et al.The associating of Shiga toxin and other cytotoxins with the Neurologic manifestations of shigellosis. // J. Infect. Dis. 1990. - V. 161. - P. 961-965.

52. Barlett A.V. Ill, Prado D.,Cleary T.G. et al. Prodaction of Shiga toxin and other cytotoxins by serogroups of Shigella. // J. Inf. Dis. 1986. - V. 154. - № 6. - Dec. - P. 996-1002.

53. Boyer M.J., Wise K.S. Lipid-modified surface protein antigens expressing size variation within the species Mycoplasma hyorhinis. II Infect. Immun. 1989. - Jan. - V.57(l). - P. 245-254.

54. Brown J.E., Moran T.P., Obrig T.G. Shiga toxin from Shigella dysenteriae 1 inhibits protein synthesis in reticulocyte lysates by inactivation of aminoacyl-transfer RNA-binding. // Microb. Pathogen. 1986. - V. 1. - Iss. 4. - P. 325-334.

55. Burnette В., Kahn R., Glover C.J., Felsted R.L. Bacterial expression, purification, and in vitro N-myristoylation of HIV-lpl7gag. // Protein Expr. Purif. 1992. -Oct. - V. 3(5). - P. 395-402.113

56. Canova-Davis E., Eng M., Mukku V. et al. Chemical heterogeneity as a result of hydroxylmine cleavage of a fusion protein of human insulin-like growth factor I. // Biochem. J. 1992. - Jul. 1.-V/ 285(Pt 1). - P. 206-213.

57. Chakraharti S., Sinha A.K. Antibody response to outer membrane proteins in Shigella dysenteriae type 1 infection with special reference to appearence of murine antibodies. // Indian J. Med. Res. 1996. - Jul. -V. 104. - P. 142-147.

58. Chacrabarti S., Sinha A.K. Release of interleukin-2 by a major antigenic outer membrane protein of Shigella dysenteriae type lin natural infection. // Microbios. 1997. - V. 92 (371). - P. 123-132.

59. Corinne P. Un vaccin contre la shigellose ? // Rechersh. 1996. -N 291 - P. 38-39.

60. Coxon В., Sari N., Pozsgay V. NMR spectroscopy, molecular dynamics, and conformation of a synthetic octasaccharide fragment of the O-specific polysaccharide of Shigella dysenteriae type 1. // Carbohydr. Res. 2000. -Jan. 29. - V.324(l). - P. 53-65.

61. Development of vaccines against shigellosis. Memorandum from a WHO meeting // Bull. WHO. 1987. - V. 65(1). - P. 17-25.

62. Dmitriev B.A., Knirel U.A., Kochetkov N.K. Structural investigation on the O-specific polysaccaride chain of Shigella dysenteriae type 1 lipopolysaccharide. // Eur. J. Biochem. 1976. -V. 66.-P. 559-566.

63. Donohuerolf A., Jacewicz M., Keusch G.T. Shiga toxin as inhibitor of protein syntesis. // Metods in Ensymol. 1988. - V. 165. - P. 231-235.

64. Dubois M., Gillor K.A., Hamilton J.K. et al. A colometrie method for the determination of sugars. // Anal. Chemistry. 1959. - V. 28. - P. 350.114

65. Ferreira A.J.P., Ir W.P.I., Pelayo J.S. et al. Culure supernatant of Shiga toxin-producing Esherichia coli strains provoke fluid accumulation in rabbit ileal loops. // FEMS Imm. Med. Microbiol. 1998. - V. 19. - P. 285-288.

66. Fontaine A., Arondel J., Sansonetti P.J. Role of Shiga Toxin in the pathogenesis of bacillary dysentery, studied by using a Tox ~ mutant of Shigella dysenteriae 1. // Infec. Immun. 1988. -Dec.-P. 3099-3109.

67. Fontaine A., Arondel J., Sansonnetti P.J. Construction and evalustion of attenuated vaccine strains of Shigella flexneri and Shigella dysenteriae 1. // Res. Microbiol. 1990. - V. 141. - P. 907-912.

68. Ghosh A.R.,Sehgal S.C. Shigella infections among children in Andaman an archipelago of tropical island in Bay of Bengal. // Epidemiol. Infect.- 1998. - Aug. - 121 (1). - 43-48.

69. Glin A.A., Ison G Ensime immunoassays bacteriology/ In: Immunoassay sin 80. 1982. - P. 431-440.

70. Harari I., Arnon R. Carboxy-terminal peptides from the В subunit of Shiga toxin induce a local and parenteral protective effect. // Molec. Immunol. 1990. - V. 27. - No. 7. - P. 613-621.

71. Hase S. and Rietschel E.T. Isolation and analysis of the lipid A backbone. Lipid A structure of lipopolisaccharides from various bacterial groups. // Eur. J. Biochem. 1976. - V. 63(1). - P. 101107.

72. Hsu P.L., Chamberlain N.R., Orth K. et al. Sequence analysis of 47-kilodalton major integral membraine immunigen of Treponema pallidum. II Infect. Immun. 1989. - Jan. - V. 57(1). - P. 196-203.115

73. Jiang W., Luft B.J., Schubach W. et al. Mapping the major antigenic domains of the native flagellar antigen of Borrelia bugdorferi. II J. Clin. Microbiol. 1992. - Jun. - V. 30(6). - P. 15351540.

74. Kaye S.A., Louse C.B., Boyd B. Shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome -interleicin-l-beta enhancement of Shiga toxin cytotoxity toward human vascular endotelial cells in vitro. // Infect. Immun. 1993. - V. 61. - Iss. 9. - P. 3886-3891.

75. Keren D.F., Brown J.E., McDonald R.A. Secretory immunoglobulin a response to Shiga toxin in rabbits: kinetics of the initial mucosal immune response and inhibition of toxicity in vitro and in vivo. // Infect. Immun. 1989. - Jul. - P. 1885-1889.

76. Khan W.A., Dhar U., Salam M.A. et al.Central system manifestations of childhood shigellosis: prevalence, risk factor, and outcome. // Peddiatrics. 1999. - Feb. - V. 103 (2). - P. 18.

77. Klee S.R., Tzschaschel B.D., Fait I. et al. Construction and characterization of a live attenuated vaccine candudate against Shigella dysenteriae type 1. // Infect. Immun. 1997. - Jun. - P. 21122118.

78. Klingebiel H. und Grossgebauer K. Untersuchungen iiber die toxizitat, pyrogenutat und antigenitat eines mit hydroxylamin behandelten bakteriellen lipopolisaccharids. // Zentralbl. Bacteriol. Hyg. I. Abt. Orig. A. 1972. - V. 221. - P. 539-543.

79. Kotloff K.L., Winickoff I.P., Ivanoff B. et al. Global burden of Shigella infection: implication for vaccine development and implementation of control strategies. // Bull. Word Health Organ.-1999,- 77 (8).-P.-651-666.

80. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature 1970. - V. 227. P. 680-685.

81. Lanzillo J.J., Dasarathy Y., Fanburg B.L. Amino acid residues essential for catalysis by peptidil dipeptidase-4 from Pseudomonas maltophilia.JI Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. - Jan. 16.-V. 158 (10).-P. 45-51.

82. Legros D. et al. Risk factor for death in hospitalized dysentery patients in Rwanda. // Trop. Med. Int. Health. 1999. - Jun. - 4 (6). - 428-432.

83. Levine M.M., Mcewen J., Losonsky G. Antobodies to Shiga holotoxin and to 2 synthetic peptides of the Bb-subunit in sera of patients with Shigella dysenteriae 1 dysentry. // J.Clin. Microbiol. 1992. - V. 30. - Iss. 7. P. 1636-1641.

84. Li В., Yang X., Jiang Z. Et al. Fusion expression vectors for recombinant gene products processed easily and purifieed rapidly by affinity chromatography. // Chin. J. Biotechnol. 1994. -V. 10(3).-P. 153-161.

85. Lindberg A.A., Pal T. Strategies for development of potential candidate Shigella vaccines. // Vaccine-1993.-V. 11.-Iss. 2.-P. 168-179.

86. Louise C.B., Tran M.C., Obrig T.G. Sensitization of human umbilical vein endothelial cells to Shiga toxin: involvement of protein kinase С and NF-kappaB. // Infect. Immun. 1997. - Aug. - V. 65. - P. 3337-3344.

87. Lowry O.H., Rosebrougt N.F., Farr A.L., Kandall R.J. Protein measurement with the Folin reagent. // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 265-275.117

88. Liideritz О. et al. Lipoppolysaccarides of gran-negative bacteria. // In: Rasin S. and Rottem S. Membran lipid of procaryotes 1982. - P. 79-151.

89. Nardella F.A., Schroderr A.K., Svensson M.L. et al. T15 group A streptococcal Fc receptor binds to the same location on IgG as staphylococcal protein A and IgG rheumatoid factors. // J. Immunol.- 1987.-Feb. l.-V. 138(3).-P.922-926.

90. Nasher K., Ciznar I. Characterization of Shigella dysenteriae type 1 capsular polysaccaride by immunuchemical methods. // Folia Microbiol. (Praha). 1998. - V. 43(6). - P. 707-712.

91. Nathoo K.J.et al. Predictors of mortality in children hospitalized with dysentry in Harare, Zimbabwe. // Cent. Afr. J. Med.- 1998. Nov. - 44 (11). - P. 272-276.

92. Newlin G.E., Bussell R.H. Characterisation of inactivation of myxoviruses and paramyxoviruses by hydroxylamine, N-methylhydroxylamine and O-methylhydroxylamine. // Arch. Virol. 1975. - V. 47(2). - P. 97-107.

93. O'Brien A.D.O., Holmes R.K. Shiga and Shiga-like toxins. // Microbiologic. Rev. 1987. -Jun.-P. 206-220.

94. O'Brien A.D., Tesh V.L., Donohuerolfe A. et al. Shiga toxin biochemistry, genetics, mode of action and role in patogenesis. // Current Topics Microbiol. Immunol. - 1992. - V. 180. - P. 64-94.

95. Obrig T.G., Brown J.E., Moran T.P. The mode of action of of Shiga toxin on peptide elongation of eukariotic protein syntesis. // Biochem. J. 1987. - V. 244. - Iss. 2. - P. - 287-294.

96. Ohmi K., Kiyokava N., Takeda Т., Fujimoto J. Human microvascular endothelial cells are strongly sensitive to Shiga toxin. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. -Oct. - 9. - V. 251(1). — P. 137-141.

97. Ouchterlony O. Antigen-antibody reaction in gels. IV. Types of reactions in coordinated systoms of diffussion //Acta Patol. Microbiol. Scand. 1953. - V. 32. - P. 231-240.118

98. Qadri F., Ragib R., Husain I.A., Ciznar I. Cell surface proteins from Shigella dysenteriae type 1. // Zbl. Bact. 1990. - V. 273. -P. 287-299.

99. Qadri F., Hag S., Hossain S.A. et al. The association of haemagglutination and adhesion with lipopolisaccaride of Shigella dysenteriae serotype 1. // J. Med. Microbiol. 1991. - V. 34. - P. 259264.

100. Qadri F., Haque M.A., Hossain A. Production of slime polisaccarides by Shigella dysenteriae type 1. // Microbiol. Immunol. 1994. - V. 38(1). - P. 11-18.

101. Rietschel E.T., Gottert H., Ltideritz O.et al. Nature and linkages of the fatty acids present in the lipid A component of Salmonella lipopolisaccharides. // Eur. J. Biochem. 1972. - V.28. - P. 166173.

102. Rietschel E.T., Brade L., Schade U. et al. Endotoxic properties of synthetic pentaacyl lipid A precursor lb and a structural isomer. // Eur. J. Biochem. 1987. - V. 169. - P. 27-31.

103. Robbins J.B., Chu C., Watson D.C. et al. O-specific side-chain toxin-protain conjugates as parenteral vaccines for the prevention of shigellosis and related diseases. // Rev. Infect. Dis. —1991. V.13 (Suppl 40). - S. 362-365.119

104. Roy S., Das A.B., Ghosh A.N., Biswas T. Purification, pore-forming ability and antigenic relatedness of the major outer membran protein of Shigella dysenteriae type 1. // Infect. Immun. -1994. V. 62. Iss. 10. - P. 4333-4338.

105. Sandvig K., Dubinina E., Garred O. et al. Entry of Shiga toxin into cells. // Zentrbl. Bacter. Intern. J. Med. Microbiol., Vir., Parasit. Dis. // 1993. V. 278. - Iss. 2-3. P. 296-305.

106. Sansonetti P.J. Genetic and molecular basis of epitelial cell invasion by Shigella species. // Rev. Infect. Dis. 1991. - V. 13. - Iss. S4. - P. S285-S292.

107. Schmidt H., Grossgebauer K., Langmaack H. Die detoxifizierende wirkung von hydroxylamin auf bakterielle lipopolisaccharide. // Zentralbl. Bacteriol. Hyg. I. Abt. Orig. A. 1971. - Sep. - V. 218(1).-P. 105-115.

108. Schmutz C., Rindisbacher L., Galmiche M.C., Wittek R. Biochemical analysis of the major vaccinia virus envelope antigen. // Virology. 1995. - Oct. 20. - V. 213(1). - P. 19-27.

109. Schultsz C., Qadri F., Hossain S.A. et al. Shigella-specific IgA in saliva of children with bacillary dysentery // FEMS Microbiol.Immunol. 1992. - V. 89. P. 65-72.

110. Shibolet O., Shina A., Rosen S. et al. Shiga toxin induces medullary tubular injuri in isolated prfused rat kidneys.// FEMS Imm. Med. Microbiol. 1997. - V. 18. - P. 55-60.

111. Simonis S. and Cullen S.E. Fatty acylation of murine la a, p, and invariant chains. // J.Immunol. 1986. - V. 136.-No. 8.-Apr. 15.-P. 2962-2967.

112. Sinha A.K., Chakraborti S. Immunblot analysis of antibody responses to Shigella dysenteriae type 1 infection. // Indian J. Med. Res. Sect. A-Infect. Dis. 1992. - V. 95. - Iss. May. - P. 112114.

113. Sirivichayakul C. et al. Severe shigellosis in childhood. // Southeast Asian J. Trap. Med. Public Health. 1998. - Sep. - 29 (3). - P. 555-556.120

114. Snellings N.J., Tall B.D., Venkatesan M.M. Characterisation of Shigella dysenteriae type 1 fimbriae: expression, FimA,sequence, and phase variation. // Infect. Immun. 1997. - Jun. - V. 65(6).-2462-2467.

115. Sohn M.J., Cho S.H., Jang W.H. et al. Rapid and simple purification of human immunodeficiency virus 1 epitope gp41. //J. Virol. Methods. 1993. - Jan. - V. 41(1). - P. 93-100.

116. Sourek J., Levin J., Trnka T. et al. // New trends in the use of Al(OH)3 conjugated endotoxins and their subunits from the S-forms of Shigella dysenteriae serovar 1 for model vaccination purposes. // Vaccine. -1991. - V. 9. - Iss. 2. - P. 106-110.

117. Sricumar R., Chin A.C., Vachon V. et al. Monoclonal antibodies specific to porin of Haemofhilus influenzae type b: localization of their cognate epitipes and test of their biological activities. // Mol. Microbiol. 1992. - Mar. - V. 6(5). - P. 665-676.

118. Tech V.L., O'Brien D.O. The pathogenic mechanism of Shiga toxin and Shiga-like toxins. // Molec. Microbiol. 1991. - 5 (8). - P. 1817-1822.

119. Thomashow M.F., Rittenberg S.C. Intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacteriovorus 109J: attachment of long-chain fatty acids to Escherichia coli peptidoglycan. // J. Bacteriol. 1978. - Sep. - V. 135(3). - P. 1015-1023.

120. Tsai, Frasch C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolisaccharides in polyacrylamide gels. // Anal. Biochem. 119. -1982. - P. 115-119.121

121. Walker J.C., Verma N.K. Clonic and characterisation of the aroA and aroD genes of Shigella dysenteriae typel. // Microbiol. Immunol. 1997. - V. 41(10). - P. 809-813.

122. Westphal O., Luderitz O., Bistes F. Uber die extraction von bacterien mit phenol-wasser. Z. Naturforsch. 1952. - 73. - P. 148-155.

123. Wise K.S., Kim M.F. Major membrane surface proteins of Mycoplasma hyopneumoniae selectively modified by covalently bound lipid. // J.Bacteriol. 1987. - Dec. - V. 169(12). - P. 5546-5555.

124. Wyckoff E.E., Duncan D., Torres A.G. et al. Structure of the Shigella dysenteriae haem transport locus and its phylogenetic distribution in enteric bacteria. // Mol. Microbiol. 1998. - Jun. -V. 28(6).-P. 1139-1152.