Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Кочнова, Елизавета Александровна

• Кочнова, Елизавета Александровна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Кочнова, Елизавета Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Номенклатура стероидов

1.2 Биосинтез и метаболизм стероидов

1.3 Определение стероидов в моче

1.3.1 Гидролиз коньюгатов стероидов

1.3.2 Методы определения эндогенных стероидов

1.3.3 Проблема количественного анализа эндогенных стероидов

1.4 Стероидный профиль

1.4.1 Исследование стероидного профиля

1.4.2 Стероидный профиль и основные метаболиты

1.4.3 Стероидный профиль и минорные метаболиты

1.4.4 Стероидный профиль и генетика

1.4.5 Стероидный профиль и разбавление мочи

1.4.6 Популяционные нормы концентраций и соотношений эндогенных стероидов в моче

1.4.7 Переход от популяционных границ к индивидуальным

2 ОБОРУДОВАНИЕ, ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

2.1 Оборудование

2.2 Исходные вещества и материалы

2.3 Приготовление растворов и буферов

2.3.1 Приготовление раствора внутреннего стандарта метилтестостерона

2.3.1.1 Приготовление рабочего раствора метилтестостерона

2.3.2 Приготовление буферной смеси

2.3.3 Приготовление фосфатного буфера

2.3.4 Приготовление карбонатного буфера

2.3.5 Приготовление концентрированного раствора для дериватизации

2.3.6 Приготовление модельных растворов для оптимизации условий хроматографического разделения

2.3.7 Приготовление градуировочных растворов

2.3.7.1 Приготовление растворов 1 группы

2.3.7.2 Приготовление растворов 2 группы

2.3.7.3 Приготовление растворов 3 группы

2.3.7.4 Приготовление растворов 4 группы

2.3.7.5 Приготовление растворов 5 группы

2.3.8 Подготовка матриц для проведения градуировки

2.3.8.1 Подготовка матрицы мочи без стероидов, содержащихся в свободной фракции - «свободная моча»

2.3.8.2 Подготовка матрицы мочи, прошедшей через патрон для твердофазной экстракции - «ТФЭ моча»

2.4 Подготовка пробы мочи для анализа и проведения градуировки

2.4.1 Подготовка пробы мочи

2.4.2 Подготовка пробы для проведения градуировки

2.4.3 Препараты эндогенных стероидов, использованные в работе

2.5 Прием препаратов эндогенных стероидов

2.6 Статистические программы и математические модули, используемые в работе

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка способа определения эндогенных стероидов в моче

3.1.1 Выбор температурной программы и хроматографической колонки

3.1.2 Определение времен удерживания и характеристичных ионов

3.1.3 Масс-спектры исследуемых соединений

3.1.4 Построение градуировочных зависимостей для количественного определения эндогенных стероидов

3.1.4.1 Выбор матрицы для построения градуировочных кривых

3.1.4.2 Сравнение коэффициентов чувствительности

3.1.4.3 Сравнение отношений эндогенных стероидов

3.1.5 Эффективность гидролиза и степень извлечения

3.1.6 Метрологическая аттестация разработанного способа анализа

3.1.7 Заключения об итогах исследований от лабораторий, аккредитованных В АДА. Межлабораторная сходимость результатов

3.2 Статистический анализ полученных данных

3.2.1 Статистический анализ концентраций эндогенных стероидов

3.2.2 Статистический анализ данных соотношений эндогенных стероидов

3.2.3 Использование установленных популяционных пределов для определения приема запрещенных препаратов

3.2.3.1 Анализ проб после приема тестостерона

3.2.3.2 Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона

3.3 Переход от популяционных границ к индивидуальным

3.3.1 Использование разработанной программы для определения приема запрещенных препаратов

3.3.1.1 Анализ проб после приема тестостерона

3.3.1.2 Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона

3.4 Поиск новых значимых соотношений эндогенных стероидов

3.4.1 Анализ проб после приема тестостерона

3.4.2 Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона

3.4.3 Установление популяционных границ для новых соотношений

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1. Вауеягак Вюмаюсекз

Работа с программой

Модули программы Вауез1ап Вютагкеге

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

' 11а«каппе соединении Сокращение

Метилтестостерон ВС

Тестостерон т

Эпитестостерон Е

5 а-андростан-3 а, 17(3-диол 5<хЗа17р

5 (З-андростан-З а, 17Р-диол 5рЗа17р

5а-андростан-За,11 р-диол-17-он 11РОНА

5р-андростан-За, 11 Р-диол-17-он 11РОНЕ

Дегидроэпиандростерон ДГЭА

Дигидротестостерон дгт

Андростерон А

Этиохоланолон Этио

5 р-прегнан-3 а,20а-диол (прегнандиол) ПД

5 Р-прегнан-3 а, 17а,20а-триол (прегнантриол) пт

5-холестен-З Р-ол хол

5а-андростан-3,17-дион 5адион

5Р-андростан-3,17-дион 5Рдион

Андростендион Адион

11-оксо-этиохоланолон ПоксоЕ

4-андростен-бр, 17Р-диол-3-он бронт

Эпиандростерон ЭпиА

Эстрадиол ЭД

Эстриол эл

Эстрон эн

За,5-цикло-5а-андростан-бр-ол-17-он ДГЭА (М)

5а-андрост-16-ен-За-ол 5а16енЗаол

Тетрагидрокортизол ТГЛ

Тетрагидрокортизон ТГН

5-андростен-Зр,17Р-диол 5енЗр17р

5-андростен-ЗаД7р-диол 5енЗа17р

4-андростен-6а-ол-3,17-дион Форместан

5 а-андростан-3 р, 17р-диол 5<хЗр17р

5 Р-андростан-За, 17а-диол 5рЗа17а

5р-андростан-3(3,17а-диол 5рзр17а

4-андростен-З а, 17а-диол 4енЗа17а

5а-андростан-3 а, 17а-диол 5аЗа17а

5-андростен-З р, 17а-диол 5енЗр17а

5а-андростан-Зр,17а-диол 5аЗр17а

1 ба-гидроксиандростерон 1баОНА

1бр-гидроксидегидроэпиандростерон 16рОНДГЭА

4р-гидроксидегидроэпиандростерон 4РОНДГЭА

7а-гидроксидегидроэпиандростерон 7аОНДГЭА

7-оксодегидроэпиандростерон 7оксоДГЭА

7р-гидроксидегидроэпиандростерон 7рОНДГЭА

бр-гидроксиандростерон 6РОНА

6 Р-гидроксиэтиохоланолон брОНЕ

Никотинамидадениндинуклеотид НАД

Всемирное антидопинговое агентство ВАДА

Газовая хроматография/масс-спектрометрия ГХ-МС

Helix pomatia Н. pomatia

Escherichia coli Е. coli

N-метил-М-трифторацетамид МТФА

триметилсилилимидазол ТМСИм

триметилсилил ТМС

К-метил-К-(триметилсилил)трифторацетамид МСТФА

триметилсилилиодид ТМСИ

газовая хроматография-сжигание-изотопная масс-спектрометрия ГХ/С/ИМС

твердофазная экстракция ТФЭ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Употребление анаболических стероидов распространено в спорте, и по этой причине они внесены в Запрещенный список Всемирного антидопингового агентства (ВАДА). Тестостерон относится к наиболее часто выявляемым эндогенным анаболическим стероидам, но при установлении случаев его употребления возникает ряд проблем. Тестостерон вырабатывается в организме человека в больших количествах, а любые принятые эндогенные стероиды активно метаболизируют с образованием многочисленных продуктов. С точки зрения антидопингового контроля такие препараты являются сложно определяемыми, и большинство современных методов не способно достоверно выявить факт их употребления уже через 36 часов после приема. Исключение составляет метод газовой хроматографии-сжигания-изотопной масс-спектрометрии (ГХ/С/ИМС), но этот анализ не распространен из-за дороговизны и сложности пробоподготовки. Для выявления приема синтетических эндогенных стероидов предложено использовать определение стероидного профиля, то есть количественное определение совокупности концентраций и соотношений стероидов. Впервые использовать стероидный профиль для выявления применения тестостерона было предложено еще около 30 лет назад, однако проблема выявления приема запрещенных эндогенных стероидов не решена и в настоящее время. Для обнаружения применения различных эндогенных стероидов существует несколько критериев, установленных ВАДА, однако наибольшее диагностическое значение имеет только один - соотношение концентраций тестостерона/эпитестостерона (Т/Е). Однако одного данного соотношения недостаточно, поскольку применение запрещенных в спорте прогор-монов может оказывать значительное влияние на спортивную форму, оставаясь при этом «незаметным» для лабораторий допинг-контроля. Данная ситуация показывает, что используемая методика определения приема стероидов тесто-стеронового ряда может быть улучшена за счет мониторинга ряда других перспективных соотношений.

С 2007 года ВАДА ввело понятие «атипического» результата, то есть сейчас любая аккредитованная лаборатория при обнаружении некоторых несоответствий пробы стандартным параметрам обязана сообщить об «атипическом» результате. В таком случае будут изучены и сравнены предыдущие и последующие пробы спортсмена. Чтобы упростить решение этой проблемы, ВАДА предложило составлять индивидуальный стероидный паспорт и собирать данные по концентрациям и соотношениям эндогенных стероидных гормонов для каждого спортсмена, что впоследствии позволит установить индивидуальные нормы, составляющие часть так называемого «Биологического паспорта спортсмена». «Биологический паспорт спортсмена» состоит из трех модулей. Первый - паспорт крови - существует с 2009 года, второй - стероидный - планируется создать в 2012 году, а эндокринный - к 2014 году.

В настоящее время существуют следующие критерии ВАДА: соотношение Т/Е >4, концентрации тестостерона (Т) и эпитестостерона (Е) > 200 нг/мл, концентрации андростерона (А) и этиохоланолона (Этио) > 10000 нг/мл и концентрация дегидроэпиандростерона (ДГЭА) >100 нг/мл. Проба, в которой наблюдается превышение одного или нескольких данных параметров считается атипической и подвергается дальнейшему анализу методом ГХ/С/ИМС.

Традиционно для определения эндогенных стероидов используется метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), позволяющий разделять большое количество исследуемых соединений за один анализ. Для успешного определения эндогенных стероидов методом ГХ-МС необходимо проведение предварительной дериватизации для перевода исследуемых соединений в соответствующие летучие производные. Данный подход позволяет определять большинство эндогенных стероидов на уровне 10 нг/мл в реальных образцах.

В настоящее время антидопинговые лаборатории определяют не более восьми эндогенных стероидов, причем данные по условиям их определения очень противоречивы - авторы предлагают различные условия для гидролиза, проводят построение градуировочных зависимостей с использованием разных

матриц, а чаще всего даже не указывая их. При определении популяционных норм для концентраций эндогенных стероидов не всегда используется нормировка на плотность мочи, что приводит к повышенной вариативности полученных данных. В последнее время в литературе появились данные, что традиционно изучаемый стероидный профиль, состоящий из восьми стероидов и их соотношений, не чувствителен к приему новых прогормонов, поэтому необходимо определять дополнительные эндогенные стероиды, которые впоследствии могут стать новыми маркерами приема запрещенных препаратов.

Цели работы заключались в:

1. разработке способа выявления факта употребления эндогенных стероидов, основанного на определении в моче ряда эндогенных стероидов, а именно андрогенов, эстрогенов и прогестинов;

2. составлении индивидуального стероидного профиля, представляющего совокупность концентраций и соотношений исследуемых стероидов, изучении его стабильности во времени;

3. определении популяционных и индивидуальных границ для соотношений и концентраций эндогенных стероидов;

4. поиске новых наиболее значимых маркеров приема эндогенных стероидов.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• разработать способ анализа мочи на стероидный профиль, заключающийся в ферментативном гидролизе, жидкостно-жидкостной экстракции и дериватизации эндогенных стероидов с последующим определением этих веществ методом ГХ-МС;

• провести сравнение коэффициентов чувствительности градуировочных графиков, полученных при различных условиях, и выбрать оптимальные матрицы для построения градуировочных зависимостей всех исследуемых эндогенных стероидов;

• провести метрологическую аттестацию разработанного способа определения эндогенных стероидов;

• провести анализ образцов, получаемых от В АДА в рамках межлабораторного сравнения результатов, и статистически сравнить полученные данные с другими лабораториями, аккредитованными ВАДА;

• провести анализ статистически значимого количества проб мочи российских спортсменов и получить значения концентраций и соотношений исследуемых стероидов для данной специфической популяции, а затем установить популяционные пределы для основных концентраций и соотношений эндогенных стероидов российских спортсменов с учетом пола и плотности мочи;

• разработать программный модуль, позволяющий в соответствии с теоремой Байеса и на основе полученных популяционных данных рассчитывать доверительные интервалы для каждого спортсмена с учетом его собственных параметров стероидного профиля, при содействии факультета Вычислительной математики и кибернетики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова (ВМК МГУ);

• провести апробацию разработанной методики и программного модуля на реальных образцах мочи;

• найти новые значимые маркеры приема эндогенных стероидов с помощью программного пакета 81айзйса;

• установить популяционные пределы для найденных новых маркеров приема эндогенных стероидов и внести данные параметры в разработанную методику.

Научная новизна. Разработана методика определения стероидного профиля мочи, состоящая из количественного определения 43 эндогенных стероидов. Получены масс-спектры электронной ионизации триметилсилильных производных всех исследуемых соединений, причем часть спектров получена впервые. В работе показаны преимущества и недостатки построения градуировоч-

ных графиков с использованием различных матриц мочи. Показано, что основным преимуществом использования в качестве матрицы мочи, из которой предварительно удалены неконъюгированные стероиды, является повышение точности определения стероидного профиля.

На основе определения стероидного профиля более 5000 проб мочи спортсменов и описательной статистики установлен вид распределения концентраций и соотношений всех исследуемых стероидов. Показано, что вид популя-ционного распределения соотношения Т/Е сильно отличается в зависимости от пола.

На основании проведенных систематических исследований установлены популяционные пределы для определяемых параметров стероидного профиля. Показано, что популяционные пределы для российских спортсменов заметно различаются в зависимости от пола, вследствие чего данный фактор предложено использовать при анализе. Выявлены аналитические перспективы использования данного подхода для повышения чувствительности определения стероидного профиля.

Разработан программный модуль Вауез1ап Вютагкеге, позволяющий вычислять индивидуальные пределы для разнообразных параметров стероидного профиля, используя теорему Байеса. Использование индивидуальных границ для концентраций или соотношений эндогенных стероидов вместо популяци-онных при определении приема запрещенных препаратов позволяет увеличить время их детектирования в целом в 2 раза.

Применение одного из подходов хемометрики, реализованного в программе 81айзйса в сочетании с разработанной программой Вауез1ап Вютагкеге, позволило найти новые значимые маркеры приема запрещенных препаратов. Использование данного подхода позволило увеличить время детектирования приема запрещенных препаратов в среднем в 3 раза, а в некоторых случаях в 5 раз по сравнению с использованием традиционных маркеров, предложенных ВА-ДА.

Практическая значимость. Предложенная методология позволяет решить проблему определения эндогенных стероидов в моче человека. Изученные матрицы для построения градуировочных зависимостей позволяют выбрать наиболее подходящие условия для проведения градуировки, обеспечивающие наибольшую точность при проведении количественного определения эндогенных стероидов.

Разработанный программный модуль позволяет составлять индивидуальный гормональный паспорт с учетом собственного метаболизма и особенностей стероидного профиля.

Предложенная методика определения стероидного профиля мочи человека в течение более чем трех лет используется в Федеральном государственном унитарном предприятии «Антидопинговый центр» (ФГУП АДЦ). За это время проанализировано более 5000 проб спортсменов.

Также разработанная методика используется при анализе проб добровольцев, участвующих в проекте «Марс 500» во время 105-ти и 520-ти суточной изоляции. Показана зависимость экскреции половых стероидных гормонов от солевой диеты, стресса и других факторов внешнего воздействия.

На защиту выносятся:

• сравнение матриц для построения градуировочных зависимостей и выбор оптимальной;

• метрологически аттестованный способ определения стероидного профиля мочи и внесение методики определения эндогенных стероидов в область аккредитации ФГУП АДЦ;

• установленные референсные пределы для российских спортсменов с учетом пола и плотности мочи;

• программный модуль Вауез1ап Вютагкегэ, позволяющий вычислять индивидуальные границы для параметров стероидного профиля в зависимости от пола, возраста, вида спорта и других параметров;

• методология выявления приема эндогенных стероидов с использованием установленных референсных пределов, а также разработанного программного модуля, и соответствующие им времена определения приема допинговых препаратов;

• новые маркеры приема запрещенных эндогенных стероидов и соответствующие им сроки определения приема допинговых препаратов.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 28-ой рабочей встрече по проблемам антидопингового контроля (7-12 марта 2010 г., Кёльн, Германия), на московском семинаре по аналитической химии (28 октября 2009 г. Москва, Россия), на III Всероссийской конференции «Аналитика России» (27 сентября - 3 октября 2009 г., Краснодар, Россия) и на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (14-18 апреля, 2008 г., Клязьма, Москва, Россия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов. Подана заявка №2011109874 и получено положительное заключение о выдаче патента «Способ определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка использованной литературы.

Материал диссертации изложен на 169 страницах, содержит 41 таблицу и 83 рисунка. Список литературных источников состоит из 111 наименований.

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Кочнова, Елизавета Александровна

выводы

1. Разработана методика определения 43 эндогенных стероидов в моче человека методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Получены масс-спектры электронной ионизации для ТМС-производных всех исследуемых соединений, установлены времена удерживания и выбраны характеристичные ионы для дальнейшего определения эндогенных стероидов в режиме регистрации селективных ионов.

2. Проведено сравнение градуировочных коэффициентов для 6-ти исследованных матриц. Показано, что наиболее пригодной матрицей для построения градуировочных зависимостей является моча, с предварительно удаленными неконъгированными стероидами.

3. Предложенная методика определения эндогенных стероидов после проведения метрологической аттестации добавлена в область аккредитации ФГУП АДЦ. Подана заявка №2011109874 и получено положительное заключение о выдаче патента «Способ определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов».

4. В течение более трех лет разработанная методология анализа стероидного профиля мочи использовалась во ФГУП АДЦ в работе по Государственным контрактам № 08/ОД-Ю9 от 19.09.2008, № 09ЮД-10 от 19.01.2009, № 9/УС-10 от 24 мая 2010 и № 406 от 30.12.2010. За это время проанализировано 5796 проб, принадлежащих российским спортсменам, и на основе этого установлены популяционные нормы для концентраций и соотношений большинства эндогенных стероидов в популяции российских спортсменов.

5. Разработан программный модуль Вауезгап Вютагкеге, позволяющий в соответствии с теоремой Байеса и на основе полученных популяционных данных рассчитывать индивидуальные нормы концентрации и соотношений каждого исследованного стероида с учетом пола, возраста, вида спорта и других параметров. Использование разработанного программного модуля Bayesian Biomarkers позволило увеличить время определения приема запрещенных препаратов в среднем в 2 раза (на примере тестостерона и ДГЭА) при анализе проб, полученных от трех добровольцев.

6. Проведена апробация разработанной методики определения стероидного профиля для анализа проб мочи добровольцев, участвующих в проектах «Марс 105» и «Марс 500». Выявлены параметры стероидного профиля мочи, испытывающие влияние условий жизнедеятельности в гермообъек-те у здорового человека. Определены параметры индивидуальной вариабельности показателей стероидного профиля и их зависимость от определенных условий эксперимента, таких как смена периодов различного со-лепотребления, автономность жизнедеятельности.

7. После поиска новых значимых маркеров приема запрещенных препаратов с помощью одного из подходов хемометрики, реализованного в программе Statistica, выбраны новые соотношения, для которых построены индивидуальные границы в разработанном модуле Bayesian Biomarkers. Данный подход позволил увеличить время определения приема эндогенных стероидов в среднем в 3 раза по сравнению с использованием индивидуальных границ для традиционных маркеров. При этом время определения приема эндогенных стероидов увеличилось в среднем более чем в 6 раз и составило 50 - 150 часов после приема. Для всех новых маркеров установлены популяционные пределы в зависимости от пола.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования 43 эндогенных стероидов получены их полные масс-спектры, времена удерживания и характеристичные ионы. При построении градуированных зависимостей проведено сравнение нескольких матриц и показаны их достоинства и недостатки. Оптимальной оказалась матрица «свободная моча», из которой предварительно удалены стероиды, содержащиеся в неконъгированном виде. При построении градуировочных зависимостей с помощью этой матрицы наблюдали наименьшее отклонение коэффициентов чувствительности от матрицы сравнения, что в свою очередь привело к наименьшей ошибке. На основе комплексных исследований предложен способ количественного определения эндогенных стероидов в моче человека.

После проведения метрологической аттестации предложенного способа определения эндогенных стероидов, разработанная методика определения эндогенных стероидов была внесена в область аккредитации Федерального государственного унитарного предприятия "Антидопинговый центр". Разработанную методику в течение более трех лет использовали в работе по государственным контрактам № 08/ОД-Ю9 от 19.09.2008, № 09/ОД-Ю от 19.01.2009, № 9/УС-10 от 24 мая 2010 и № 406 от 30.12.2010. За это время проанализировано 5796 проб, принадлежащих российским спортсменам.

На основе полученных данных впервые установлены популяционные интервалы для российских спортсменов, причем вид полученных данных согласуется с литературными данными, а значения максимальных концентраций, установленные для мужской и женской популяции российских спортсменов, заметно отличаются от пределов, установленных ВАДА. Проведенное исследование показывает необходимость тщательного изучения стероидного профиля спортсменов, а также определение более чувствительных к приему эндогенных препаратов популяционных пределов.

Данные, полученные после анализа проб спортсменов, использовали при разработке программного модуля Вауез1ап Вютагкеге. Разработанная программа позволяет устанавливать нормы для каждого спортсмена, исходя из его собственных параметров стероидного профиля, формируя, таким образом, индивидуальный гормональный паспорт спортсмена. Использование данного программного модуля заметно увеличивает чувствительность разработанной методики к определению приема запрещенных препаратов по сравнению с традиционными популяционными границами, установленными ВАДА.

Найдены новые значимые маркеры приема запрещенных препаратов с использованием программы Данный подход открывает принципиально новый метод исследования стероидного профиля, позволяющий оценивать изменение не столько концентраций самих принимаемых стероидов, сколько изменение в соотношениях их метаболитов. Более того, данный подход может использоваться в дальнейшем не только для определения приема запрещенных препаратов, но и для поиска значимых маркеров при определении различных заболеваний, приводящих к изменениям в стероидных гормонах, а также для определения норм и патологий при анализе мочи беременных женщин.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Кочнова, Елизавета Александровна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Наглядная биохимия. Я. Кольман, К. Г. Рем, Москва, «Мир», 2000 г.

2. C.D. Kochakian. Metabolites of testosterone: significance in the vital economy. // Steroids. 1990. 55. 3. P. 92-97.

3. P.F. Hall. Cytochromes P-450 in steroidogenesis: are these enzymes more specific than those of drug metabolism? // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1989. 16. 6. P. 439-453.

4. D.J. Waxman. Interactions of hepatic cytochromes P-450 with steroid hormones: Regioselectivity and stereospecificity of steroid metabolism and hormonal regulation of rat P-450 enzyme expression. // Biochem. Pharmacol. 1988. 37. 1. P. 71-84.

5. L. Dehennin, P. Lafarge, Ph. Dailly, D. Bailloux, J. P. Lafarge. Combined profile of androgen glucuro- and sulfoconjugates in post-competition urine of sportsmen: a simple screening procedure using gas chromatography-mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl.1996. 687. 1. P. 85-91.

6. R. L. Gomes, W. Meredith, С. E. Snape, M. A. Sephton. Analysis of conjugated steroid androgens: deconjugation, derivatisation and associated issues. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2009. 49. 5. P. 1133-40.

7. C. Ayotte, D. Goudreault, A. Charlebois. Testing for natural and synthetic anabolic agents in human urine. // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 1996. 687. 1. P. 3-25.

8. W. Schanzer, M. Donike. Metabolism of anabolic steroids in man: synthesis and use of reference substances for identification of anabolic steroid metabolites. //Anal. Chim. Acta. 1993. 275. 1-2. P. 23-48.

9. G. Opfermann, W. Schanzer. Trimethylsilylation - Aspects for Derivatisation. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch StrauB: Koln. 1997. P. 247-252.

10. S.G. Webster. Catalysed derivatization of trimethylsilyl ethers of ecdysterone: A preliminary study. //J. Chromatogr. 1985. 333. 1. P. 186-190.

11. M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, M. Kraft, F. Mandel, E. Nolteernsting, et al. Dope analysis. // Proceedings International Athletic Foundation World Symposium on Doping in Sport, P. Belloti, G. Benzi and A. Ljungqvist. International Athletic Foundation. 1988. P. 53.

12. W. Schänzer, S. Horning, G. Opfermann and M. Donike. Gas chromatog-raphy/mass spectrometry identification of long-term excreted metabolites of the anabolic steroid 4-chloro-l,2-dehydro-17a-methyltestosterone in humans. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1996. 57. 5-6. P. 363-376.

13. R. Massé, C. Ayotte, R. Dugal. Studies on anabolic steroids: I. Integrated methodological approach to the gas chromatographic-mass spectrometric analysis of anabolic steroid metabolites in urine. // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 1989.489. 1. P. 23-50.

14. R. Massé, H. Bi, P. Du. Studies on anabolic steroids. VII. Analysis of urinary metabolites of formebolone in man by gas chromatography—mass spectrometry. // Anal. Chim. Acta. 1991. 247. 2. P. 211-221.

15. W. Schänzer, M. Donike. Metabolism of boldenone in man: Gas chromato-graphic/mass spectrometric identification of urinary excreted metabolites and determination of excretion rates. // Biol. Mass. Spectrom. 1992. 21. 1. P. 3-16.

16. K. Linnet. Effect of urine matrix on the testosterone/epitestosterone calibration curve. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1992. P. 125.

17. E. Nolteernsting, G. Opfermann, M. Donike. 1 -(N,N-diisopropylamino)-n-alkanes: a new reference system for systematical identification of nitrogen containing substances by gas-chromatography and nitrogen specific or mass spec-trometrical detection. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1996. P. 369.

18. H. Geyer, U. Mareck-Engelke, E. Nolteernsting, G. Opfermann, M. Donike. The matrix problem in calibration of the GC/MS for endogenous steroids. The search for an artificial urine. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1994. P. 199.

19. K. Homma, T. Hasegawa, M. Masumoto, E. Takeshita, K. Watanabe, H. Chiba, T. Kurosawa, T. Takahashi, N. Matsuo. Reference values for urinary steroids in Japanese newborn infants: gas chromatography/mass spectrometry in selected ion monitoring. // Endoer J. 2003. 50. 6. P. 783-92.

20. P. Van Renterghem, P. Van Eenoo, W. Van Thuyne, H. Geyer, W. Schänzer, F.T. Delbeke. Validation of an extended method for the detection of the misuse of endogenous steroids in sports, including new hydroxylated metabolites. // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 2008. 876. 2. P. 225-235.

21. E.C. Horning, M.G. Horning. Metabolic profiles: gas-phase methods for analysis of metabolites. // Clin. Chem. 1971. 17. P. 802-809.

22. C.H.L. Shackleton. Profiling steroid hormones and urinary steroids. // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 1986. 379. P. 91-156.

23. M. Donike, S. Rauth, U. Mareck-Engelke, H. Geyer, R. Nitschke. Evaluation of longitudinal studies, the determination of subject based reference ranges of the testosterone/epitestosterone ratio. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1993. P. 33.

24. M. Donike, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Statistical evaluation of longitudinal studies, part 2: the usefulness of subject based reference ranges. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1994. P. 157.

25. M. Donike, J. Zimmermann, K.R. Barwald. Routinebestimmung von Anabólica in Ham. // Dtsch Z Sportmed 1984. 35. P. 14-24.

26. M. Donike. Steroid Profiling in Cologne. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1993. P. 47-68.

27. M. Donike, K.R. Bärwald, K. Klostermann, W. Schänzer, J. Zimmermann. Nachweis von exogenem testosteron. // Testosterone in sport: leistung und gesundheit. H.H. Hollmann, W. Leisen, H. Rost. Deutsche Ärtze-Verlag Köln, Germany. 1983. P. 293-300.

28. J. Zimmermann Untersuchung zum Nachweis von exogenen Gaben von Testosteron [Doctoral thesis], // Köln: Institute for Biochemistry, German University for Sports Sciences: 1986. P. 249.

29. E. Nolteernsting, W. Schänzer, M. Donike. 191 Experiences with D3Testosterone/D3 Epitestosterone as Internal Standards for Screening and Confirmation of T/E Ratios // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1996. P. 191-199.

30. H. Geyer, U. Flenker, U. Mareck, F. Sommer, W. Schänzer. Preliminary results regarding the detection of the misuse of testosterone gel. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 2004. P. 121-127.

31. M. Donike, H. Geyer, W. Schänzer, J. Zimmermann. Die suppression der endogenen androgenproduktion durch metandienon. // Training und Sport zur Prävention und Rehabilitation in der technisierten Umwelt. I. Franz, H. Mel-lerowicz, W. Noack. Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg, 1985.

32. M. Donike, H. Geyer, M. Kraft, S. Rauth. Longterm influence of anabolic steroid misuse on the steroid profile. // Official Proceedings. Und International Athletic Foundation World Symposium on Doping in Sport Monte Carlo, P. Bellotti, G. Benzi, A. Ljungqvist. International Athletic Foundation: Italy. 1989. P. 107.

33. H. Geyer. Die Gas-chromatographisch/massenspektrometrische Bestimmung von Steroidprofilen im Urin von Athleten. // Thesis. Deutsche Sporthochschule Köln. 1986.

34. D.H. Catlin, B.D. Ahrens, Y. Kucherova. Detection of norbolethone, an anabolic steroid never markted, in athletes' urine. // Rapid Communications in Mass Spectrometry 2002. 16. 13. P. 1273.

35. D.H. Catlin, M.H. Sekera, B.D. Ahrens, B. Starcevic, Y.C. Chang, C.K. Hat-ton. Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urine. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004. 18. 12. P. 1245.

36. M.H. Sekera, B.D. Ahrens, Y.C. Chang, B. Starcevic, C. Georgakopoulos, D.H. Catlin. Another designer steroid: discovery, synthesis, and detection of madol in urine. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. 19. 6. P. 781.

37. M. Donike, S. Rauth, B. Sample. Excretion of ephedrine and endogenous steroids under conditions of controlles water intake and of water diuresis. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1992. P. 163.

38. G.D. Tharp. The role of glucocorticoids in exercise. // Med. Sei. Sports. 1975. 7. l.P. 6.

39. U. Mareck-Engelke, H. Geyer, M. Donike. Stability of steroid profiles (4): the circadian rhythm of urinary ratios and excretion rates of endogenous steroids in female and its menstrual dependency. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1994. P. 135.

40. U. Mareck-Engelke, U. Flenker, M. Donike. Stability of steroid profiles (5): the annual rhythm of urinary ratios and excretion rates of endogenous steroids in female and its menstrual dependency. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1995. P. 177.

41. U. Mareck-Engelke, H. Geyer, M. Donike. Stability of steroid profiles (3): the circadian rhythm of urinary ratios and excretion rates of endogenous steroids in male. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Got-zmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1994. P. 121.

42. U. Mareck-Engelke, H. Geyer, M. Donike. Stability of steroid profiles (2): excretion rates from morning urines. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1993. P. 85.

43. M. Donike, M. Ueki, Y. Kuroda, H. Geyer, E. Nolteernsting, S. Rauth, W. Schänzer, U. Schindler, E. Völker, M. Fujisaki. Detection of dihydrotestos-terone (DHT) doping: alterations in the steroid profile and reference ranges for DHT and its 5a-metabolites. // J. Sports Med. Phys. Fitness. 1995. 35. 4. P. 235.

44. U. Mareck, H. Geyer, U. Flenker, T. Piper, M. Thevis, W. Schänzer. Detection of dehydroepiandrosterone misuse by means of gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry. // Eur. J. Mass Spectrom. 2007. 13.6. P. 419.

45. U. Mareck, H. Geyer, U. Flenker, T. Piper, M. Thevis, W. Schänzer. Population based reference ranges and additional screening marker for the improvement of the detection of dehydroepiandrosterone misuse. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 2008. P. 121.

46. P. Vestergaard. The analysis of urinary hormonal steroids. // Lipids. 1980. 15. 9. P. 710-18.

47. N.A. Schmidt, H.J. Borburgh, T.J. Penders, C.W. Weytkamp. Steroid Profiling-An update. // Clin. Chem. 1985. 31. 4. P. 637-639.

48. O. Nozaki. Steroid analysis for medical diagnosis. // J. Chromatogr. A. 2001. 935. 1-2. P. 267-278.

49. M. Donike. Steroid profiling in Cologne. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1993. P. 47-68.

50. M. Donike. Reference ranges of urinary endogenous steroids determined by gaschromatography/mass spectrometry. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1992. P. 69-87.

51. S. Rauth. Referenzbereiche von urinären Steroidkonzentrationen und Steroidquotienten. // PhD Thesis. Sporthochschule. Institut für Biochemie. Cologne. 1994.

52. M. Saugy, C. Cardis, N. Robinson, C. Schweizer. Test methods: anabolics. // BestPract. Res. Clin. Endocrinol. 2000. 14. 1. P. 111-133.

53. C. Ayotte. Steroid Profiling in Anti-Doping Controls. // 5th Annual US ADA Symposium on Anti-Doping Science. Intra-Individual Reference Ranges. L.D. Bowers, R.L. Hilderbrand, C.C. Zardo, C. O'Connell. Lausanne. 2006. P. 1528.

54. M. Donike. Steroid profile in weightlifting 1989/1990. An overview and a preliminary evaluation of the results. // Steroid profile in weightlifting 1989/1990.

55. T.Z. Bosy, K.A. Moore, A. Poklis. The effect of oral dehydroepiandrosterone (DHEA) on the urine testosterone/epitestosterone (T/E) ratio in human male volunteers. // J. Anal. Toxicol. 1998. 22. 6. P. 455-459.

56. L.D. Bowers. Oral dehydroepiandrosterone supplementation can increase the testosterone/epitestosterone ratio. // Clin. Chem. Lab. Med. 1999. 45. 2. P. 295297.

57. V.P. Uralets, P.A. Gillette. Over-the-counter anabolic steroids 5-androsten-3,17-dione; 5-androsten-3b,17b-diol; dehydroepiandrosterone and 19-or-5-

androsten-3,17-dione: excretion studies in men. // J. Anal. Tox. 2000. 24. 3. P. 188-193.

58. V.P. Uralets, P.A. Gillette. Over-the-Counter Anabolic Steroids 4-Androsten-3,17-dione; 4-Androsten-3b,17b-diol; and 19-nor-4-Androsten-3,17-dione: Excretion Studies in Men. // J. Anal. Tox. 1999. 23. 5. P. 357-366.

59. M. Donike, S. Rauth, A. Wolansky. Reference ranges of urinary endogenous steroid determined by gas-chromatography/mass spectrometry. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß: Köln. 1993. P. 69 - 86.

60. L. Dehennin, M. Ferry, P. Lafarge, G. Peres and J.P. Lafarge. Oral administration of dehydroepiandrosterone to healthy men: Alteration of the urinary androgen profile and consequences for the detection of abuse in sport by gas chromatography mass spectrometry. // Steroids. 1998. 63. 2. P. 80-87.

61. U. Mareck, H. Geyer, U. Flenker, T. Piper, M. Thevis, W. Schänzer. Detection of dehydroepiandrosterone misuse by means of gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry. // Eur. J. Mass Spectrom. 2007. 13. 6. P. 419-426.

62. D. Goudreault, P. Bhérer, J.F. Lévesque, D. Poirier, C. Ayotte. Androstenedi-one metabolism: end of story. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß. Köln. 2001. P. 73-83.

63. C. Saudan, N. Baume, N. Robinson, L. Avois, P. Mangin, M. Saugy. Testosterone and doping control. // Br. J. Sports Med. 2006. 40. 1. P. 21-24.

64. J.-F. Levesque, M. Gaudreault, R. Houle, N. Chauret. Evaluation of human hepatocyte incubation as a new tool for metabolism study of androstenedione and norandrostenedione in a doping control perspective. // J Chromatogr B Bi-omed Appl.. 2002. 780. 1. P. 145-153.

65. D.H. Catlin, B.Z. Leder, B.D. Ahrens, C.K. Hatton, J.S. Finkelstein. Effects of androstenedione administration on epitestosterone metabolism in men. // Steroids. 2002. 67. 7. P. 559-564.

66. D. van de Kerkhof. Steroid Profiling in Doping Analysis. // PhD Thesis. Utrecht University. Faculty of Pharmacy. Utrecht. 2001.

67. J.-F. Lévesque, C. Ayotte. Criteria for the detection of androstenedione oral administration. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß. Köln. 1999. P. 169-179.

68. P. Van Eenoo, F.T. Delbeke, N. Desmet, P. De Backer. Excretion studies with 4-androstene-3,17-dione. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß. Köln. 1998. P. 171-180.

69. A.T. Cawley, R. Kazlauskas, G.J. Trout, J.H. Rogerson, A.V. George. Isotopic fractionation of endogenous anabolic androgenic steroids and its relationship to doping control in sports. // J. Chromatogr. Sei. 2005. 43. 1. P. 32-38.

70. A.T. Cawley, E.R. Hine, G.J. Trout, A.V. George, R. Kazlauskas. Searching for new markers of endogenous steroid administration in athletes: "looking outside the metabolic box". // Forensic Sei. Int. 2004. 143. 2-3. P. 103-114.

71. J.-F. Lévesque, C. Ayotte. The oral administration of DHEA: the efficiency of steroid profiling. // In Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß. Köln. 1999. P. 213-221.

72. WAD A, Reporting and evaluation Guidance for testosterone, epitestosterone, T/E ratio and other endogenous steroids, Technical document TD2004EAAS, 2004.

73. R. Hampl, M. Hill, L. Stârka. 7-Hydroxydehydroepiandrosterone epimers in the life span. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2001. 78. 4. P. 367-372.

74. R. Hampl, L. Starka. 16alpha-hydroxylated metabolites of dehydroepiandros-terone and their biological significance. // Endocr. Regul. 2000. 34. 3. P. 161163.

75. L. Starka, R. Hampl, M. Hanus , M. Matouskova, M. Hill. Plasma levels of 7-hydroxymetabolites of dehydroepiandrosterone in healthy Central European aging men. // Clin. Chem. Lab. Med. 2005. 43. 11. P. 1218-1222.

76. O. Lapcik, R. Hampl, M. Hill, M. Bicikova, L. Starka. Immunoassay of 7-hydroxysteroids: 1. Radioimmunoassay of 7beta-hydroxy dehydroepiandrosterone. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998. 67. 5-6. P. 439-449.

77. O. Lapcik, R. Hampl, M. Hill, L. Starka. Immunoassay of 7-hydroxysteroids: 2. Radioimmunoassay of 7a-hydroxy-dehydroepiandrosterone. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1999. 71. 5-6. P. 231-237.

78. M. Davidson, A. Marwah, R.J. Sawchuk, K. Maki, P. Marwah, C. Weeks, H. Lardy. Safety and pharmacokinetic study with escalating doses of 3-acetyl-7-oxo-dehydroepiandrosteronein healthy male volunteers. // Clin. Invest. Med. 2000. 23. 5. P. 300-310.

79. C.H.L. Shackleton, R.W. Kelly, P.M. Adhikary, C.J.W. Brooks, R.A. Hark-ness, P.J. Sykes, F.L. Mitchell. The identification and measurement of a new steroid 16a-hydroxydehydroepiandrosterone in infant urine. // Steroids. 1968. 12. 6. P. 705-716.

80. M. Ingelman-Sundberg, A. Anders Rane, J.F. Gustafsson. Properties of hydroxylase systems in the human fetal liver active on free and sulfoconjugated steroids. //Biochem. 1975. 14. 2. P. 429-437.

81. A.M.H. Brodie, V.C.O. Njar. Aromatase inhibitors in advanced breast cancer: mechanism of action and clinical implications. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998.66. 1-2. P. 1-10.

82. F.A. Mac Neill, S. Jacobs, M. Dowsett, P.E. Lonning, T.J. Powles. The effects of oral 4-hydroxyandrostenedione on peripheral aromatisation in post-

menopausal breast cancer patients. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1995. 36. 3. P. 249-254.

83. D.J. Handelsman. Testosterone: use, misuse and abuse. // Med. J Aus. 2006. 185. 8. P. 436-439.

84. M.E. Van Houten, L.J.G. Gooren. Differences in reproductive endocrinology between Asian men and Caucasian men - a literature review. // Asian J. Androl. 2000. 2. 1. P. 13-20.

85. D.P. Lookingbill, L.M. Demers, C. Wang, A. Leung, R.S. Rittmaster, R.J. San-ten. Clinical and Biochemical Parameters of Androgen Action in Normal Healthy Caucasian Versus Chinese Subjects. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1991.72. 6. P. 1242-1248.

86. M. Okamoto, C. Setaishi, Y. Horiuchi, K. Mashimo, K. Moriya, S. Ito. Urinary excretion of testosterone and epitestosterone and plasma levels of LH and testosterone in the Japanese and Ainu. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1970. 32. 5. P. 673-674.

87. C. Ayotte. Detecting the Administration of Endogenous Anabolic Androgenic Steroids. // Doping in Sports. D. Thieme, P. Hemmersbach. Springer. London. 2010. 195. P. 78-93.

88. J.J. Schulze, L. Ekstrom, N. Inotsume, M. Garle, M. Lorentzon, C. Ohlsson, H.K. Roh, K. Carlstrom, A. Rane. Large differences in testosterone excretion in Korean and Swedish men are strongly associated with a UDP-glucuronosyl transferase 2B17 polymorphism. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2006. 91. 2. P. 687-693.

89. J. J. Schulze, J. Lundmark, M. Garle, I. Skilving, L. Ekstrom, A. Rane. Doping Test Results Dependent on Genotype of UGT2B17, the Major Enzyme for Testosterone Glucuronidation. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008. 93. 7. P. 25002506.

90. T. Sten, I. Bichlmaier, T. Kuuranne, A. Leinonen, J. Yli-Kauhaluoma, M. Finel. UDPGlucuronosyltransferases (UGTs) 2B7 and UGT2B17 Display

Converse Specificity in Testosterone and Epitestosterone Glucuronidation, whereas UGT2A1 Conjugates Both Androgens Similarly. // Drug Metab. Disp. 2009. 37. 2. P. 417-423.

91. L. Dehennin. On the Origin of Physiologically High Ratios of Urinary Testosterone to Epitestosterone - Consequences for Reliable Detection of Testosterone Administration by Male Athletes. // J. Endocrinol. 1994. 142. 2. P. 353360.

92. E. Strahm, P.E. Sottas, C. Schweizer, M. Saugy, J. Dvorak and C. Saudan. Steroid profiles of professional soccer players: an international comparative study. // Br. J. Sport. Med. 2009. 43. 14. P. 1126-1130.

93. R.C. Miller, E. Brindle, D.J. Holman, J. Shofer, N.A. Klein, M.R. Soules, K.A. O'Connor. Comparison of Specific Gravity and Creatinine for Normalizing Urinary Reproductive Hormone Concentrations. // Clin. Chem. 2004. 50. 5. P. 924-932.

94. H. Geyer, U. Mareck-Engelke, W. Schanzer and M. Donike. The Cologne protocol to follow up high testosterone/epitestosterone ratios. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Straufi. Koln. 1997. P. 107-126.

95. W. Schanzer. Metabolism of anabolic androgenic steroids. // Clin. Chem. 1996. 42. P. 1001-1020.

96. A.T. Kicman, D.B. Gower. Anabolic steroids in sport: biochemical, clinical and analytical perspectives. // Ann. Clin. Biochem. 2003. 40. 4. P. 321-356.

97. A.T. Kicman, S.B. Coutts, C.J. Walker, D.A. Cowan. Proposed Confirmatory Procedure for Detecting 5a-Dihydrotestosterone Doping in Male Athletes. // Clin. Chem. 1995. 41. 11. P. 1617-1627.

98. D.H. Catlin, C.K. Hatton and S.H. Starcevic. Issues in detecting abuse of xeno-biotic anabolic steroids and testosterone by analysis of athletes' urine. // Clin. Chem. 1997. 43. 7. P. 1280-1288.

99. M. Kohler, M.K. Parr, G. Opfermann, M. Thevis, N. Schlorer, F.-J. Marner, W. Schanzer. Metabolism of 4-hydroxyandrostenedione and 4-hydroxytestosterone: Mass spectrometric identification of urinary metabolites. // Steroids. 2007. 72. 3. P. 278-286.

100. K. Deventer, P. Van Eenoo, P. Mikulcikova, W. Van Thuyne, F.T. Delbeke. Quantitative analysis of androst-4-ene-3,6,17-trione and metabolites in human urine after the administration of a food supplement by liquid chromatog-raphy/ion trap-mass spectrometry. // J Chromatogr B Biomed Appl. 2005. 828. 1-2. P. 21-26.

101. W. Van Thuyne, P. Van Eenoo, P. Mikulcikova, K. Deventer, F.T. Delbeke. Detection of androst-4-ene-3,6,17-trione (6-OXO) and its metabolites in urine by gas chromatographymass spectrometry in relation to doping analysis. // Biomed. Chromatogr. 2005. 19. 9. P. 689-695.

102. F. Callies, W. Arlt, L. Siekmann, D. Hubler, F. Bidlingmaier, B. Allolio. Influence of oral dehydroepiandrosterone (DHEA) on urinary steroid metabolites in males and females. // Steroids. 2000. 65. 2. P. 98-102.

103. M.K. Parr, G. Opfermann. Analytical properties of 4-hydroxysteroids and some esters. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Got-zmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Straufl. Koln. 2004. P. 129-138.

104. P. Van Renterghem, P. Van Eenoo, H. Geyer, W. Schanzer, F. T. Delbeke. Reference ranges for urinary concentrations and ratios of endogenous steroids, which can be used as markers for steroid misuse, in a Caucasian population of athletes. // Steroids. 2010. 75. 2. P. 154-63.

105. C.W. Weykamp, T.J. Penders, N.A. Schmidt, A.J. Borburgh, J.F. van de Calseyde, B.J. Wolthers. Steroid profile for urine: reference values. // Clin. Chem. 1989. 35. 12. P. 2281-4.

106. H. Geyer, U. Flenker, U. Mareck, P. Platen, T. Piper, A. Schmechel, Y. Schrader, M. Thevis, W. Schanzer. The detection of the misuse of testosterone

gel. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Got-zmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß. Köln. 2007. P. 133-142.

107. P. E. Sottas, C. Saudan, C. Schweizer, N. Baume, P. Mangin, M. Saugy. From population- to subject-based limits of T/E ratio to detect testosterone abuse in elite sports. // Forensic Sei. Int. 2008. 174. 2-3. P. 166-172.

108. Eurachem. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method validation and related topics. Eurachem. Teddington. 1998.

109. P. E. Sottas, M. Saugy, C. Saudan. Endogenous steroid profiling in the athlete biological passport. // Endocrinol. Metab. Clin. North. Am. 2010. 39. 1. P. 5973.

110. E. Kochnova, I. Shevtsova, T. Sobolevsky, G. Rodchenkov. Software for analysis of urinary and blood parameters using Bayesian approach. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strauß. Köln. 2010. P. 250-258.

111. A. P. Worth, M. T. D. Cronin. The use of discriminant analysis, logistic regression and classificationtree analysis in the development of classification models for human health effects. // J Mol. Struct. (Theochem). 2003. 622. 1-2. P. 97111.

Приложение 1. Bayesian Biomarkers

Работа с программой Конфигурации

Конфигурация - это совокупность параметров модели, определяющих распределение ¡л и CV, а также уровень у, используемый при вычислении доверительных интервалов. Программа поддерживает две параметрические модели: Urine - является смесью двух логнормальных распределений, CV имеет лог-нормальное распределение; Blood - fi и CV имеют логнормальное распределение.

Элементы управления приложения, отвечающие за конфигурацию

Новая конфигураций Открыто «мфиг/рэцию Сахрздать конфигурацию Сохранить иомфигувцщо поддругам именем

■J f^ew ccnfig JjQpen coniig ^ Ssve config Save config ¿s Щ £[e[p » GbseJYaisam

j ^

вам—

ШЖ.Ш-.....■ ■

STiTJ

lipM (ШШ'. .'£1

IP*

¡ЯШ • Щ\

MtfTli

ieled all

T >"-

S Ш

Corixlencz inrsrvals lower:

я^шшшшяшшшш

I - ■

ЩШ til' i\

ШШШЁ I

: l; *

Load : С^л^ Пгч seized. j ..... l&^J^jl gfeiirtavaB |

Загрузка и сохранение конфигурации

Конфигурация хранится в конфигурационном файле - текстовом файле с расширением xml. Для манипуляции с конфигурационными файлами служат кнопки "New config", "Open config", "Save config" и "Save config as". Вместе с

приложением устанавливается демонстрационный файл конфигурации, соответствующий статье Sottas et al. Данный файл расположен на рабочем столе пользователя, установившего программу, в файле Demo Configurations\Sottas\Sottas.xml.

Редактирование конфигурации Конфигурация редактируется при помощи полей ввода внутри рамки Configutaion.

Применение конфигурации Чтобы отредактированная конфигурация учитывалась при расчете вероятностей, конфигурацию необходимо применить. Для этого следует нажать кнопку Apply.

Оценка параметров модели

Кроме ввода параметров модели вручную, параметры модели возможно оценить при по набору наблюдений /л и CV. Для этого следует нажать на кнопку Estimate parameters. В открывшемся окне необходимо указать наборы наблюдений и нажать на кнопку OK - это приведет к отображению оцененных параметров в главном окне приложения. Наблюдения можно ввести в соответствующие таблицы вручную, либо загрузить из текстовых файлов. В текстовых файлах каждое наблюдение должно размещаться на отдельной строке, разделителем дробной части служит символ точка.

Распределение р

Распределение CV

Тип распределения

\

Parameter

_____•

CV

*

щшх

* V': 1

Г Ts- J

I j

Шёшшшшшж

Iii *

■ -♦$<

S;

lg

j "SÏ 1 фл ., •:, Шш

Load

..........j. Lo3é-......

Загрузить соответствующие наблюдения файла

Построение графиков плотности модели

На графиках плотности модели отображаются графики распределения плотности вероятности параметров ¡л и CV. Наблюдения

Под наблюдениями понимается совокупность измерений биомаркера для различных спортсменов, исходя из значений которых позже можно вычислить вероятности. Наблюдения загружаются из файла в формате Microsoft Excel. Вместе с приложением устанавливается демонстрационный файл наблюдений. Данный файл расположен на рабочем столе пользователя, установившего программу, в файле Demo Configumtions\file_fonnat_urine.xls.

Б увести таблицу спортсемоа а файл Ехсе?

Соортстмвны

Выделить асех слартсменоа в таблице

Вычягл< до веритель HOfi кнтервз

Загрузить таблицу спортсменов Выделить из файла Excel строху с m ax/m in значением

^sr

Измерения, соответствующие Вычисление вероятности Вывод график

выделенному стрелкой спорте «еау и доверительны* интервалов доверительных интервал

для зыделенных спортсменов для текущего спортсмена

Вычисление условной и безусловной вероятностей

Нажатие кнопки "Compute" в рамочке Probabilities приводит в вычисление следующей вероятности: Р(Х < xsel\xcond), где xsel - равняется выделенному наблюдению (см. картинку к разделу «наблюдения»), a xcond - все остальные наблюдение (т.о. что они играют роль условий). Если задано лишь одно наблюдение - то вычисляется безусловная вероятость.

Вычисление доверительного интервала (центрального) Нажатие кнопки "Compute" в рамочке Confidence intervals приводит вычислению центрального доверительного интервала при условиях задаваемых совокупностью текущих наблюдений (включая выделенное наблюдение). Под центральным доверительным интервалом понимается пара величин lower и upper таких, что:

1 — у 1 — у

P(lower < X < upper;xobs) = у, Р (lower > X;xobs) = —P{X > upper;xohs) = —

Групповые операции

Приложение позволяет вычислить вероятность и/или доверительный интервал сразу для нескольких спортсменов. Для выполнения этой задачи необходимо выделить интересующих спортсменов в таблице с их именами и нажать на кнопку Compute Р for selected... (вычисление вероятности для выделенных спортсменов) и Compute intervals for selected... (вычисление доверительных интервалов для выделенных спортсменов). Результаты вычислений отображаются в таблице со списком спортсменов в колонках Р (вероятность), а и b (левая и правая границы доверительного интервала соответственно). При вычислении вероятности производится вычисление следующей величины: Р(Х>last_row,other_rows), где last_row соответствует значению измерения в последней строке таблицы измерений, other_rows — остальным строкам. Эта особенность позволяет вычислить для выделенных спортсменов, например, такие величины: P(X>wax_obs;other_obs), Р(Х >mm_obs;other _obs). Рассмотрим данную возможность на примере вычисления Р(Х > max_obs;other _obs). Поскольку групповой подсчет вероятностей вычисляет величину Р(Х > last_row,other _rows) , необходимо добиться того, чтобы в списке измерений строка с максимальным значением Value оказалась последней. Для этого необходимо изменить порядок сортировки наблюдений путем нажатия на заголовок колонки Value - это приведет к сортировке наблюдений по возрастанию, и наблюдение с максимальным Value окажется внизу таблицы (последней строкой).

Отметим, что при групповых операциях кнопки Мах и Min не влияют на результат вычисления и потому не должны быть использованы.

Модули программы Bayesian Biomarkers Модули собственной разработки

BayesianBiomarkersGui Тип: исполняемый файл

Назначение: пользовательский интерфейс программы

Платформа: Microsoft .NET Framework 3.5 SP1

Среда разработки: Microsoft Visual C# 2008 SP1

BayesianBiomarkersLib

Тип: динамически связываемая библиотека

Назначение: математическая модель программы (вычисление вероятностей и доверительных интервалов) Платформа: Windows

Среда разработки: Microsoft Visual С++ 2008 SP1 EmjToEps

Тип: динамически связываемая библиотека

Назначение: преобразование из формата Windows Enhanced Metafile в формат Adobe Encapsulated PostScript Платформа: Windows

Среда разработки: Microsoft Visual С++ 2008 SP1 Модули сторонней разработки

GNU Scientific Library

Тип: статически связываемая библиотека

Назначение: численное интегрирование, поиск корней уравнений Версия: 1.8 Платформа: Windows Intel OpenCV

Тип: динамически связываемая библиотека

Назначение: определение параметров смеси двух нормальных случайных величин

Версия: 2.0 Платформа: Windows Microsoft Chart Controls Тип: сборка

Назначение: построение графиков Версия: 1.0

Платформа: Microsoft .NET Framework 3.5 SP1 LyXMetafile to EPS Converter Тип: драйвер принтера

Назначение: виртуальный Adobe Enhanced PostScript принтер Версия: 1.0 Платформа: Windows