Определение лекарственных средств неорганической природы методом капиллярного электрофореза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Малинкин Алексей Дмитриевич

• Малинкин Алексей Дмитриевич
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Малинкин Алексей Дмитриевич

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Неорганические ионы в лекарственных средствах

1.2 Методы анализа неорганических ионов

1.3 Метод капиллярного электрофореза в анализе неорганических ионов

1.3.1 Сущность метода капиллярного электрофореза

1.3.1.1 Особенности метода капиллярного электрофореза

1.3.1.1 Основные принципы капиллярного электрофореза

1.3.1.2 Факторы, влияющие на разделение компонентов пробы при капиллярном электрофорезе

1.3.1.4 Разновидности капиллярного электрофореза

1.3.1.5 Капилляры и их кондиционирование

1.3.2 Особенности состава буферного раствора для анализа неорганических ионов методом капиллярного зонального электрофореза

1.3.2.1 Особенности анализа катионов

1.3.2.2 Особенности анализа анионов

Выводы из обзора литературы

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ

2.1 Объекты исследования

2.2 Оборудование

2.3 Реактивы и расходные материалы

ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ РАЗДЕЛЕНИЯ И ДЕТЕКТИРОВАНИЯ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

3.1 Подбор условий разделения и детектирования катионов

3.1.1 Подбор концентрации контрастного вещества

3.2 Тест пригодности электрофоретической системы для определения катионов

3.3 Валидация методики идентификации и количественного определения катионов

3.3.1 Валидация и метрологическая оценка методики для качественного и количественного анализа растворов для инфузий

3.3.2 Валидация и метрологическая оценка методики в диапазоне 80-120 мг/л для качественного и количественного определения катионов калия, кальция, натрия и магния в таблетированных лекарственных препаратах

Выводы по главе

ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАТИОНОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ

4.1 Исследование растворов для инфузий

4.2 Количественное определение катионов калия, натрия, кальция, магния в лекарственных препаратах различной химической структуры

Выводы по главе

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

111

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BP - British Pharmacopoeia

EP - European Pharmacopeia

ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромистый

SDS - натрия додецилсульфат

USP - United States Pharmacopeia

ААС - атомно-абсорбционная спектроскопия

БАД - биологически активная добавка

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГФ - государственная фармакопея

КЭХ (англ. СЕС) - капиллярная электрохроматография

КЗЭ - капиллярный зональный электрофорез

КЭ - капиллярный электрофорез

ЛС - лекарственное средство

МЭКХ (англ. MEKC) - мицеллярная электрокинетическая хроматография

НД - нормативная документация

ОФС - общая фармакопейная статья

ПАВ - поверхностно-активные вещества

УФ - ультрафиолетовый

ФСП - фармакопейная статья предприятия

ЭД - электрохимическое детектирование

ЭОП - электроосмотический поток

ICH (англ. The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) - Международная конференция по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных препаратов для людей.

кЧТТ - кажущееся число теоретических тарелок

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение лекарственных средств неорганической природы методом капиллярного электрофореза»

Введение

Неорганические ионы входят в состав многих лекарственных препаратов неорганической природы, а также в состав витаминно-минеральных комплексов. Они применяются как вещества, обладающие самостоятельным действием, как компоненты действующих веществ (солеобразователи, комплексообразователи и др.), а также как компоненты вспомогательных веществ. В нашей работе мы определяли содержание катионов: калия, натрия, магния, кальция. Выбор обусловлен тем, что данные ионы являются наиболее часто встречающимися в составе лекарственных препаратов.

В настоящее время в нормативной документации на препараты неорганической природы, помимо качественных реакций на подлинность, при количественном определении катионов металлов преимущественно используются методы пламенной фотометрии и комплексонометрии; для анализа анионов применяются различные варианты титрования [5; 22; 36; 66; 67].

Метод капиллярного электрофореза (КЭ) является весьма универсальным, поскольку позволяет определять вещества различной структуры: от полимерных молекул до неорганических ионов. Благодаря этому КЭ находит применение в самых различных отраслях: криминалистике [10; 32; 35], исследованиях окружающей среды [33; 38], фармации [3; 6; 36] контроле пищевых продуктов [2; 3; 40; 41] и т.д.

Как фармакопейный метод анализа КЭ описан в зарубежных фармакопеях и входит в фармакопейные статьи по идентификации эритропоэтина, анализа чистоты соматотропина, апротинина, глутатиона, левокабастинана, определения энантиомерной чистоты галантамина и ропивакаина [22; 36; 66; 67]. Общая фармакопейная статья (ОФС) «Капиллярный электрофорез» представлена для включения в Государственную Фармакопею РФ тринадцатого издания. В сравнении с перечисленными методами при анализе ионов метод капиллярного зонального электрофореза обладает следующими преимуществами: возможность одновременного совместного определения нескольких ионов, простота

подготовки пробы, незначительные затраты времени на анализ, возможность автоматизации [7; 8; 27; 65]. Однако у данного метода имеются и недостатки: необходимость сравнительно точного воспроизведения состава буферного раствора, возможные отклонения в объеме ввода пробы.

Цель работы: Разработка методики определения калия, кальция, магния, натрия в лекарственных средствах неорганической природы методом капиллярного электрофореза.

Задачи исследования:

1. По данным литературы изучить и сравнить существующие методы анализа лекарственных веществ неорганической природы, содержащих ионы калия, натрия, магния, кальция.

2. Разработать условия подготовки инфузионных растворов и таблетированных лекарственных препаратов, содержащих неорганические ионы для их последующего определения.

3. Установить оптимальные условия электрофоретического разделения катионов для их определения в лекарственных препаратах методом капиллярного электрофореза.

4. Оценить электрофоретические параметры (разрешение, соотношение сигнал/шум, порядок и времена миграции) и провести валидацию разработанных методик.

5. Применить разработанную методику для оценки качества различных инфузионных растворов и таблетированных лекарственных препаратов, содержащих неорганические ионы.

Научная новизна. Разработаны методики качественного и количественного определения неорганических катионов в лекарственных веществах различного химического строения, а также биологически активных добавках (БАД) к пище методом капиллярного электрофореза. Доказано, что предложенные методики обладают следующими преимуществами по сравнению с существующими: быстрота анализа, малый расход реактивов, отсутствие необходимости использования дорогостоящих расходных материалов.

Практическая значимость. Методика определения неорганических катионов методом капиллярного зонального электрофореза (КЗЭ) была использована для определения лекарственных веществ, содержащих ионы калия, натрия, кальция, магния в составе лекарственных средств и БАД к пище. Разработанная методика используется при гигиенической экспертизе образцов соковой продукции и БАД к пище в ФГБНУ «НИИ питания». Методика определения неорганических катионов представлена в центр фармакопеи и международного сотрудничества в виде проекта общей фармакопейной статьи для экспертизы с целью последующего в Государственную Фармакопею.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на международной студенческой конференции: «Татьянин день» (г. Москва, 2012 г.), на XVIII, XIX, XX XXI российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, апрель 2011 г., 2012 г., 2013 г., 2014 г.), на XI и XII Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов c международным участием «Питание и здоровье» (г. Москва, ноябрь-декабрь 2009 г., ноябрь-декабрь 2010 г.), на XIII Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов c международным участием «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее» (г. Москва, ноябрь-декабрь 2011 г.), на XIV всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов c международным участием «Алиментарно-зависимая патология: предиктивный подход» (г. Москва, ноябрь-декабрь 2012 г.).

Апробация работы проведена на заседании кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ФГБУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (31 августа 2015 г.).

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в разработке методики, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, применялась методика, разработанная автором, проводилась аналитическая и статистическая обработка результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально -теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях,

докладах и внедрения в практику. Установлены научно обоснованные подходы к этапам исследования лекарственных средств неорганической природы методом капиллярного электрофореза, разработан проект ОФС.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК России.

Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований». Номер государственной регистрации: 01.2.006 06352.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Условия определения ионов калия, натрия, магния, кальция методом капиллярного электрофореза;

2. Обоснование использования в качестве внутреннего стандарта катионов лития для последующей коррекции расчетов относительных времен миграции и количественного содержания исследуемых ионов;

3. Доказательство пригодности разработанной методики оценки качества лекарственных препаратов, содержащих катионы: калия, натрия, магния, кальция (растворы для инфузий, таблетированные лекарственные препараты и БАД к пище).

Объем и структура работы. Диссертационная работа написана на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы

«материалы и методы», двух глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и двух приложений. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 56 рисунками.

Глава 1. Обзор литературы 1.1 Неорганические ионы в лекарственных средствах

Большую часть лекарственных препаратов, содержащих неорганические ионы, помимо классификации по фармакологическому действию мы условно разделили по составу, лекарственной форме и содержанию исследуемых веществ следующим образом:

1. Препараты, имеющие в качестве действующего вещества один неорганический катион. Большинство данных препаратов также можно разделить по лекарственной форме:

а. таблетки;

б. растворы и порошки для приготовления растворов.

2. Многокомпонентые препараты, содержащие несколько неорганических солей в качестве действующих веществ. Их также можно классифицировать по лекарственным формам:

а. растворы для инъекций и инфузий, препараты для приготовления растворов;

б. препараты, содержащие неорганические ионы в качестве солеобразователей и вспомогательных компонентов;

в. минеральные и витаминно-минеральные комплексы.

Основные лекарственные формы и фармакологическое действие препаратов с одним действующим веществом приведены в таблице 1. Помимо использования данных веществ в однокомпонентных препаратах, существует широкий спектр комбинированных лекарственных средств, в него входят различные инфузионные растворы, порошки и таблетированные препараты. Примеры комбинированных препаратов представлены в таблице 2.

Таблица 1. Основные лекарственные формы и применение ряда неорганических солей [1; 9].

Лекарственное Лекарственная Фармакологическое действие и

вещество форма способ применения

противоаллергическое,

противовоспалительное,

кровоостанавливающее,

Кальция хлорид 5-10 % раствор диуретическое, источник кальция, антитоксическое средство при отравлении солями магния (в/в, перорально)

Кальция карбонат таблетки антацидное, противоязвенное, источник кальция (перорально)

Кальция гидрофосфат таблетки источник кальция (перорально)

Магния оксид, магния карбонат таблетки антацидное, слабительное (перорально)

седативное, спазмолитическое,

20-25 % раствор диуретическое, антиаритмическое (в/м, в/в)

раствор 20-40 мг/кг противосудорожное (в/м)

Магния сульфат 5-10 % раствор антитоксическое при отравлении солями тяжелых металлов (в/в)

10-30 % раствор слабительное (перорально)

20-25 % раствор желчегонное, антитоксическое при отравлении солями тяжелых металлов (перорально)

Продолжение таблицы 1. Основные лекарственные формы и применение ряда неорганических солей [1; 9].

Лекарственное Лекарственная Фармакологическое действие и

вещество форма способ применения

Магния аспарагинат раствор, таблетки источник магния, антиаритмическое (в/в,

перорально)

плазмозамещающее,

дезинтоксикационное,

0,9 % раствор гидратирующее, источник хлоридов и натрия (в/в, п/к,

Натрия хлорид местно)

10 % раствор вспомогательный осмотический диуретик (в/в)

5 % раствор слабительное (ректально)

гипертонический раствор противомикробное (местно)

Калия хлорид 4% раствор, таблетки источник калия, диуретическиое, антиаритмическое (в/в, перорально)

Калия аспарагинат раствор, таблетки источник калия, антиаритмическое (в/в,

перорально)

3 % раствор (глазные капли) противогрибковое (местно)

Калия йодид 0,5-2 % раствор противовоспалительное, слюногонное (перорально)

таблетки, источник йода, муколитическое,

порошок радиопротективное (перорально)

Таблица 2. Примеры комбинированных препаратов

Наименование Лекарственная форма Роль неорганических ионов Содержащиеся неорганические катионы

Трисоль раствор для инфузий регуляторы водно-электролитного баланса и кислотно-щелочного состояния в комбинациях натрий, калий

Квинтасоль раствор для инфузий регуляторы водно-электролитного баланса и кислотно-щелочного состояния в комбинациях натрий, калий, кальций, магний

Мафусол раствор для инфузий регуляторы водно-электролитного баланса и кислотно-щелочного состояния в комбинациях; заменители плазмы и других компонентов крови в комбинациях; натрий, калий, магний

Продолжение таблицы 2. Примеры комбинированных препаратов

Наименование Лекарственная форма Роль неорганических ионов

регуляторы водно- натрий,

электролитного калий,

баланса и кислотно- кальций

щелочного

Рингер раствор для инфузий состояния в комбинациях; заменители плазмы и других компонентов крови в комбинациях;

заменители плазмы натрий,

Гемодез раствор для инфузий и других компонентов крови в комбинациях калий, кальций, магний

регуляторы водно- калий,

электролитного натрий,

баланса и кислотно- кальций

щелочного

Раствор Хартмана раствор для инфузий состояния в комбинациях; заменители плазмы и других компонентов крови в комбинациях;

Продолжение таблицы 2. Примеры комбинированных препаратов

Наименование Лекарственная форма Роль неорганических ионов

Регидрон порошок регуляторы водно-электролитного баланса и кислотно-щелочного состояния в комбинациях

Ренни таблетки антациды в комбинациях

Маалокс таблетки антациды в комбинациях

Центрум таблетки макро- и микроэлементы в комбинациях

Компливит таблетки макро- и микроэлементы в комбинациях

Супрадин таблетки макро- и микроэлементы в комбинациях

1.2 Методы анализа неорганических ионов

Опираясь на классификацию в предыдущем разделе, варианты методов анализа неорганических ионов в лекарственных препаратах можно разделить согласно их составу, т. е. на методы анализа в однокомпонентных и многокомпонентных препаратах.

При анализе субстанций и индивидуальных действующих веществ традиционно применяются качественные реакции для определения подлинности и различные варианты титрования для количественного анализа (см. таблицу 3) [5; 22; 36; 66; 67]. Данные подходы являются достаточно простыми и эффективными в данных случаях, поскольку состав препарата является сравнительно простым.

При анализе неорганических ионов в комбинированных препаратах применение подобных подходов, особенно в количественном анализе катионов калия и натрия зачастую оказывается затруднительным. В связи с этим, для данной цели в нормативной документации [5] предложен метод - атомно-

абсорбционной спектроскопии (ААС). Данный метод позволяет с высокой чувствительностью и селективностью определять широкий спектр металлов. Однако, вместе с этим, он обладает рядом недостатков: необходимость минерализации пробы в случае присутствия органических компонентов, сравнительная сложность аппаратурного оформления, невозможность одновременного определения нескольких элементов, возможность негативного влияния элемента, присутствующего в преобладающей концентрации на определение элементов, содержащихся в сравнительно малых количествах. Использование атомно-абсорбционной спектрометрии является основным при анализе катионов металлов в комплексных препаратах. В фармакопее США существует статья, регламентирующая определение металлов в пищевых добавках, содержащих минеральные комплексы [67]. В отечественных фармакопейных статьях предприятий преобладающим методом определения металлов в витаминно-минеральных комплексах также является атомно-абсорбционная спектроскопия, однако для растворов для инфузий, содержащих кальций, для определения кальция используется комплексонометрия, хотя для определения калия и натрия - ААС.

Сравнение методов анализа ионов и метода капиллярного электрофореза показано в таблице 4 (звездочкой отмечены фармакопейные методы).

Таблица 3. Сравнение методов количественного определения субстанций неорганических лекарственных препаратов по различным фармакопеям [5; 22; 36; 66; 67].

Наименование субстанции Количественное определение для субстанций

ГФ ШР-30 БР2012/РИ. Еиг. 7 1Р16

Кальция хлорид Комплексонометрическое определение кальция

индикатор - кислотный хром темно-синий индикатор -гидроксинафтол синий индикатор - кислота кальконкарбоновая индикатор - смесь кислоты кальконкарбоновой с сульфатом натрия 1:10 (индикатор NN

Кальция карбонат - Комплексонометрическое определение кальция -

индикатор -гидроксинафтол синий индикатор - кислота кальконкарбоновая

Кальция гидрофосфат - Комплексонометрическое определение кальция -

индикатор -гидроксинафтол синий индикатор - кислотный хром черный специальный

Магния оксид, магния карбонат Комплексонометрическое определение магния (индикатор - кислотный хром черный специальный) Кислотно - основное титрование (индикатор -метилоранж) Комплексонометрическое определение магния (индикатор -кислотный хром черный специальный)

Продолжение таблицы 3. Сравнение методов количественного определения субстанций неорганических лекарственных препаратов по различным фармакопеям [5; 22; 36; 66; 67].

Наименование субстанции Количественное определение для субстанций

ГФ ШР-36 ВР2012/РИ. Еиг. 7 1Р16

Магния сульфат Комплексонометрическое определение магния (индикатор - кислотный хром черный специальный)

Магния аспарагинат - - Комплексонометрическое определение магния (индикатор - кислотный хром черный специальный) -

Натрия хлорид Аргентометрическое определение хлорид-ионов (индикатор - калия хромат) Аргентометрическое определение хлорид-ионов (потенциометрическое титрование)

Натрия йодид Аргентометрическое определение йодид-ионов (индикатор - натрия эозинат) Йодатометрическое определение йодид-ионов

индикатор - амарант -

Продолжение таблицы 3. Сравнение методов количественного определения субстанций препаратов неорганических солей по различным фармакопеям [5; 31; 45; 75; 76].

Наименование субстанции Количественное определение для субстанций

ГФ ШР-30 БР2012/РИ. Еиг. 7 1Р16

Натрия нитрит Обратная перманганатометрия Перманганатометрическое титрование Обратная цериметрия -

Калия хлорид Аргентометрическое определение хлорид-ионов

индикатор - калия хромат индикатор - эозин индикатор - железоаммониевые квасцы индикатор - натрия флуоресцеин

Калия йодид Аргентометрическое определение йодид-ионов (индикатор - эозинат натрия) Йодатометрическое определение йодид-ионов

индикатор - амарант -

Таблица 4. Сравнение различных методов анализа ионов [5; 7; 8; 61].

Капиллярный электрофорез ВЭЖХ ААС (определение катионов) * Методы титрования *

Разделительный механизм В зависимости от электрофоретической подвижности, взаимодействия со стенкой капилляра и буферной системой Ионный обмен - -

Время анализа на приборе 5-15 мин 10-60 мин 10 сек - 3 мин 5-10 мин

Подготовка пробы (таблетированная ЛФ) Растворение, цетрифугирование или фильтрование Растворение, центрифугирование или фильтрование Минерализация, растворение Растворение, центрифугирование или фильтрование

Детектирование (наиболее распространенные варианты) Косвенное спектрофотометрическое, кондуктометрическое Косвенное спектрофотометрическое, кондуктометрическое Фотоэлектрическое Визуальное, потенциометрическое

Продолжение таблицы 4. Сравнение различных методов анализа ионов [5; 6; 7; 70].

Капиллярный электрофорез ВЭЖХ ААС (определение катионов) * Методы титрования *

Возможность одновременного определения нескольких ионов есть есть нет Присутствует частично (ступенчатое титрование)

Необходимость использования дорогостоящих материалов Возможно использование дорогостоящих компонентов буферных систем Использование дорогостоящих колонок Использование ламп с полым катодом с ограниченным сроком службы нет

1.3 Метод капиллярного электрофореза в анализе неорганических

ионов.

Явление электрофореза было открыто в 1809 году профессорами Московского государственного университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейсом. Однако применение в аналитической химии оно нашло более чем через сто лет - в 1937 году было проведено разделение смеси белков А. В. К. Тизелиусом. Предпосылки к возникновению метода электрофореза в капилляре возникли в 1967 г., когда С. Хьертеном проводились исследования по электрофорезу в полых стеклянных трубках диаметром около 3 мм. Использование полых трубок со сравнительно небольшим диаметром увеличивало эффективность разделения, поскольку в данном случае осуществлялся значительно лучший отвод тепла в сравнении с двухмерным электрофорезом в геле, появившемся ранее.

В 1974 году были опубликованы работы по проведению электрофореза в стеклянных трубках диаметром 250 мкм (Р. Виртанен), через пять лет - по электрофорезу в тефлоновых трубках диаметром 200 мкм (Ф. Е. М. Майккерс и Ф. М. Эверартс), этими же авторами было предложено объяснение миграционной дисперсии при капиллярном зональном электрофорезе.

В 1981 году Дж. Йоргенсон и К. Д. Лукацс применили кварцевые капилляры с диаметром менее 100 мкм и предложили термин «капиллярный электрофорез». При использовании капилляров диаметром 75 мкм и напряжения 30 кВ ими были совершены разделения протеинов и дансилированных аминокислот с ВЭТТ менее 1 мкм.

Следующий существенный шаг в развитии метода произошел в 1984 году, когда Ш. Терабе был описан метод мицеллярной электрокинетической хроматографии в капилляре с добавлением поверхностно активного вещества к буферному раствору, что позволило определять как заряженные, так и незаряженные молекулы.

Дальнейшими этапами развития капиллярного электрофореза стало использование масс-селективного детектора, что значительно повысило универсальность данного метода, а также появление коммерчески доступных систем и электрофореза на чипе.

1.3.1 Сущность метода капиллярного электрофореза

1.3.1.1 Особенности метода капиллярного электрофореза.

В сравнении с другими аналитическими методами можно выделить следующий ряд особенностей капиллярного электрофореза [8; 10; 11; 27; 52]:

1. Высокая эффективность разделения (может превосходить эффективность ВЭЖХ).

2. Использование малых объемов пробы (десятки нанолитров) и буферного раствора.

3. Сравнительная быстрота анализа.

4. Сравнительная простота аппаратурного оформления.

5. Некоторые сложности с воспроизводимым вводом пробы, в связи с чем желательным является использование внутреннего стандарта.

6. Несмотря на использование полиимидного покрытия кварцевого капилляра, он остается хрупким в месте расположения «окна» для применения фотометрического детектора.

7. Широкие возможности оптимизации условий анализа:

а. изменение напряжения;

б. использование давления;

в. термостатирование при различной температуре;

г. использование капилляров с различным диаметром;

д. использование различных (гидродинамический, электрокинетический);

типов ввода пробы гидростатический,

е. использование устойчивого и динамического покрытия стенки капилляра;

ж. использование различных веществ в качестве добавок к буферной системе для изменения селективности;

з. использование буферных систем с различными значениями рН;

и. возможность организации различных видов анализа (капиллярный зональный электрофорез, изотахофорез, изоэлектрическая фокусировка, мицеллярная электрокинетическая хроматография) на одном оборудовании;

8. Возможность использования различных типов детекторов (кондуктометрический, спектрофотометрический, масс-селективный, лазерно-флуоресцентный, термолинзовый). Наиболее распространенным является спектрофотометрический детектор.

Перечисленные особенности показывают применимость капиллярного электрофореза для анализа широкого спектра веществ и решения различных вариантов аналитических задач.

1.3.1.1 Основные принципы капиллярного электрофореза.

Метод капиллярного электрофореза основан на миграции заряженных частиц в электрическом поле. Разделение происходит за счет разницы в подвижностях исследуемых частиц в капилляре, заполненном буферным раствором. Движение частиц в процессе анализа определяется воздействием электрического поля, силы трения и электроосмотического потока.

Если рассмотреть более подробно [10; 27; 52], то ускоряющая электрическая сила может быть описана уравнением:

где ъ - эффективный заряд иона, Б - константа Фарадея (96500 Кл/моль), Е - напряженность электрического поля (В/см), № - число Авогадро (моль-1).

Сила трения описывается уравнением Стокса: Кт = 6 *п*ц*г*и;

где п - число п, п - динамическая вязкость (Па*с), г - стоксовский радиус частицы (см), и - скорость электрофоретического перемещения (см/с).

Поскольку ускоряющая сила приблизительно равна силе трения, то скорость электрофоретического перемещения может быть выражена уравнением:

ц _ z*F*Е

6*n*■q*r*Na,

Если пренебречь параметром напряженности электрического поля, можно выделить выражение электрофоретической подвижности:

z*F

мЧ _-;

6*n*■q*r*Na

где ц - электрофоретическая мобильность (см2*В_1*с_1).

Поскольку под воздействием электрического поля перемещаются заряженные частицы, то эффективная скорость миграции определяется с поправкой на степень диссоциации и может быть выражена уравнением: Уэфф. * М* * Е;

где - степень диссоциации, ц - электрофоретическая мобильность (см2* В-1* с-1). Соответственно эффективная электрофоретическая мобильность выражается уравнением:

Мэфф. _ а1 * М;

Время миграции определяется соотношением эффективной длины капилляра (длина от места ввода пробы до детектора) и эффективной скорости миграции:

^ _ ¿эфф. _ ¿эфф.*^обш,..

1 Уэфф. ^эфф.*^

где Ьобщ. - общая длина капилляра (см), V - напряжение (В). Таким образом время миграции увеличивается с увеличением длины капилляра и уменьшается с увеличением напряжения и увеличением эффективной электрофоретической мобильности.

Другой важной силой, воздействующей на частицы в капилляре, является электроосмотический поток - объемный ток жидкости в капилляре, образующийся вследствие наличия поверхностного заряда на стенке капилляра и приложенного напряжения. Возникновение избыточного заряда на стенке капилляра может быть связано с ионизацией поверхности или адсорбцией ионных частиц. Для сохранения баланса зарядов у поверхности капилляра происходит накопление противоионов, катионов в случае кварцевого капилляра, и формирование двойного слоя. На очень малом расстоянии от стенки формируется разность потенциалов - дзета-потенциал. При приложении напряжения противоионы, недостаточно сильно связанные со стенкой, начинают мигрировать, создавая объемное смещение жидкости в капилляре. В случае использования кварцевого капилляра происходит миграция катионов в сторону катода, следовательно электроосмотический поток также направлен к катоду. Электроосмотический поток может быть выражен в единицах скорости миграции или мобильности [27; 52]. Скорость миграции электроосмотического потока может быть определена уравнением:

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Малинкин Алексей Дмитриевич, 2016 год

тот - |

50 -

0 -

■50 - литый

-ТО0-- калий ьальцнй

■150 -

2 Э- 4 я е 7 ГШП

Рисунок 36. Электрофореграмма пробы препарата «Раствор Рингера», а202036.

Рисунок 37. Электрофореграмма пробы препарата «Трисоль», 0020212.

Полученные электрофореграммы показывают, что в предложенных условиях происходило полное разделение всех присутствующих катионов в исследованных образцах. Также имеется возможность определения примеси иона аммония в присутствии катионов калия.

Метрологическая оценка полученных результатов представлена на примере препаратов: «Квинтасоль» (ОАО «Биосинтез», 30911) в таблице 18, препарата «Мафусол» (ОАО «Биосинтез», 60412) в таблице 19, препарата

«Мафусол» (ОАО «Биосинтез», 40511) в таблице 20, препарата «Рингер» (ОАО «Биосинтез», 40511) в таблице 21.

Таблица 18. Метрологическая оценка результатов количественного определения неорганических катионов в препарате Квинтасоль (ОАО «Биосинтез», 30911).

Катион Норма по нормативной документации, мг/л Найденная концентрация в пробе, мг/л Среднее, мг/л Дисперсия Ф) Стандартное отклонение Полуширина доверительного интервала (при P=0,95) Относительная ошибка среднего результата, %

34,68

34,73

Магний 34,0-41,3 34,54 35,86 5,40 2,32 2,44 6,80

34,54

40,41

36,27

102,21

94,30

Кальций 92,2-112,0 101,32 102,57 57,02 7,55 7,92 7,73

98,58

116,68

102,35

181,18

184,65

Калий 156,0-235,0 187,63 185,34 6,24 2,50 2,62 4,28

184,53

186,08

187,98

3101,9

3147,0

Натрий 2300-3540 3106,4 3122,7 758,7 27,5 28,9 0,93

3150,8

3086,7

3143,2

Таблица 19 Метрологическая оценка результатов количественного определения неорганических катионов в препарате «Мафусол» (ОАО «Биосинтез», 60412).

Катион Найденная концентрация в пробе, мг/л Среднее Дисперсия (О) Стандартное отклонение Полуширина доверительного интервала (при Р=0,95) Относительная ошибка среднего результата, %

51,07

50,93

Магний 24,8-33,5 51,97 51,76 0,53 0,73 0,76 1,48

51,46

52,67

52,48

146,90

146,76

Калий 133,0-180,0 139,20 143,55 30,61 5,53 5,81 4,04

140,13

151,23

137,07

6303,7

6383,5

Натрий 5800-7080 6329,7 6331,0 1028,0 32,1 33,6 0,53

6349,4

6323,9

6295,6

Таблица 20 Метрологическая оценка результатов количественного определения неорганических катионов в препарате «Мафусол» (ОАО «Биосинтез», 40511).

Катион Норма по нормативной документации, мг/л Найденная концентрация в пробе, мг/л Среднее Дисперсия Ф) Стандартное отклонение Полуширина доверительного интервала (при P=0,95) Относительная ошибка среднего результата, %

25,41

23,98

Магний 24,8-33,5 23,90 24,63 0,54 0,74 0,77 3,14

25,66

24,49

24,38

150,72

146,54

Калий 133,0-180,0 146,31 152,03 37,39 6,11 6,42 4,22

151,66

154,05

162,90

6403,6

6445,1

Натрий 5800-7080 6397,5 6413,9 1043,9 32,3 33,9 0,53

6458,9

6371,6

6406,5

Таблица 21 Метрологическая оценка результатов количественного определения неорганических катионов в препарате «Рингер» (ОАО «Биохимик», 160410).

Катион Норма по нормативной документации, мг/л Найденная концентрация в пробе, мг/л Среднее Дисперсия (О) Стандартное отклонение Полуширина доверительного интервала (при Р=0,95) Относительная ошибка среднего результата, %

91,61

87,26

Кальций 76-100 88,65 89,18 5,58 2,36 2,48 2,78

86,78

88,22

92,55

148,11

140,51

Калий 125,0-188,0 142,37 143,47 8,29 2,88 3,02 2,11

142,76

145,71

141,38

3463,8

3434,6

Натрий 3048-3726 3426,8 3428,6 697,2 26,4 27,7 0,81

3420,0

3441,9

3384,4

Результаты количественного определения неорганических катионов в других растворах для инфузий представлены в таблице 22.

Таблица 22. Результаты количественного определения неорганических катионов в растворах для инфузий.

№ Наименование Масса навески Катион Норма, ммоль/л Найдено, ммоль/л

1 «Дисоль», ОАО «Биохимик», 190612 1,006 126,96 118,70±2,48

2 «Дисоль», ОАО «Биохимик», 411212 0,998 126,96 112,17±2,34

3 «Гемодез-Н», ФГУБ «Курская биофабрика -фирма «БИОК», 070413 0,994 Г 4,09-6,14 5,37±0,10

Ca2+ 2,04-2,49 2,49±0,09

№+ 78,26-117,39 96,09±2,01

4 «Гемодез-8000», ОАО «Биосинтез», 70313 0,987 K+ 4,09-6,14 5,37±0,10

Ca2+ 2,04-2,49 2,49±0,09

Na+ 78,26-117,39 86,96±1,82

5 «Гемодез-8000», ОАО «Биосинтез», 150513 0,99 K+ 4,09-6,14 5,37±0,10

Ca2+ 2,04-2,49 2,49±0,09

Na+ 78,26-117,39 85,65±1,79

6 «Раствор Хартмана», ООО «Хемофарм А.Д.», А102761 1,007 K+ 4,73-5,24 5,09±0,10

Ca2+ 1,90-2,09 2,42±0,08

Na+ 124,43-137,57 133,04±2,78

7 «Раствор Хартмана», ООО «Хемофарм А.Д.», А1900126 1,002 Г 4,73-5,24 5,12±0,10

Ca2+ 1,90-2,09 2,00±0,07

Na+ 124,43-137,57 131,74±2,75

Ca2+ 1,90-2,49 3,24±0,11

Na+ 132,52-162,00 146,52±3,06

Продолжение таблицы 23. Результаты количественного определения неорганических катионов в растворах для

инфузий.

№ Наименование Масса навески Катион Норма, ммоль/л Найдено, ммоль/л

8 «Раствор Хартмана», ООО «Хемофарм А.Д.», А202183 1,004 К+ 4,73-5,24 4,60±0,09

Са2+ 1,90-2,09 2,49±0,09

№+ 124,43-137,57 132,17±2,76

9 «Рингер», ОАО «Биохимик», 20213 1,004 К+ 3,20-4,81 4,09±0,08

Са2+ 1,90-2,49 2,49±0,09

№+ 132,52-162,00 152,61±3,19

10 «Раствор Рингера», ООО «Хемофарм А.Д.», А202036 0,996 К+ 3,20-4,81 4,09±0,08

Са2+ 1,90-2,49 2,74±0,10

№+ 132,52-162,00 139,57±2,92

11 «Рингера раствор», ОАО «Красфарма», 130413 0,997 К+ 3,20-4,81 39,90±0,77

Са2+ 1,90-2,49 2,49±0,09

№+ 132,52-162,00 134,35±2,81

12 «Рингер», ОАО «Биохимик», 160410 1,01 К+ 3,20-4,81 3,07±0,06

Са2+ 1,90-2,49 2,74±0,10

№+ 132,52-162,00 120,87±2,53

13 «Трисоль», ОАО «Мосфарм» серия 0020212 0,996 К+ 10,74-16,11 13,30±0,26

№+ 104,35-160,87 125,22±2,62

14 «Трисоль», ОАО «Биохимик», серия 220410 1,007 К+ 10,74-16,11 12,53±0,24

104,35-160,87 132,61±2,77

Продолжение таблицы 24. Результаты количественного определения неорганических катионов в растворах для инфузий.

№ Наименование Масса навески Катион Норма, ммоль/л Найдено, ммоль/л

15 «Квинтасоль», ОАО «Биосинтез», 30911 1,013 К+ 3,99-6,01 4,86±0,09

Са2+ 2,30-2,79 3,99±0,14

№+ 100,00-153,91 130,87±2,73

Ыв2+ 1,40-1,70 1,56±0,05

16 «Мафусол», ОАО «Биосинтез», 60412 1,013 К+ 3,40-4,60 4,09±0,08

№+ 252,17-307,83 279,13±5,83

Ыв2+ 1,02-1,38 1,15±0,04

17 «Мафусол», ОАО «Биосинтез», 40511 1,021 К+ 3,40-4,60 3,32±0,06

№+ 252,17-307,83 271,74±5,68

Ыв2+ 1,02-1,38 1,23±0,04

18 «Натрия хлорид», ОАО «Биохимик», 5570910 1,020 №+ 143,48 143,48±3,00

19 «Хлосоль», ОАО «Биохимик» 711212 1,003 К+ 20,20 20,46±0,40

107,83 105,22±2,20

Полученные результаты количественного определения катионов в растворах для инфузий соответствовали нормам количественного содержания указанных катионов в нормативной документации из чего можно сделать вывод о применимости разработанной методики к анализу катионов калия, натрия, кальция и магния в растворах для инфузий.

4.2 Количественное определение катионов калия, натрия, кальция, магния в лекарственных препаратах различной химической структуры.

Основными особенностями, имеющими значение для исследования таблетированных лекарственных препаратов является присутствие в их составе других действующих и вспомогательных веществ, а также необходимость перевода содержащихся в них катионов в раствор для последующего анализа. Для определения оптимальных условий экстрагирования проводилась серия испытаний на таблетированном препарате (имеющим следующий состав вспомогательных веществ: целлюлоза микрокристаллическая, повидон, лактоза, кросповидон, маннитол, магния стеарат, сахароза, рисовый крахмал, тальк, титана диоксид, кантаксантин 10% водорастворимый, парафин твердый, парафин жидкий легкий) с различными вариантами условий экстрагирования. В качестве экстрагентов использовались следующие растворители: вода, раствор хлористоводородной кислоты с концентрацией 0,5 моль/л, раствор хлористоводородной кислоты с концентрацией 0,1 моль/л, раствор муравьиной кислоты с концентрацией 1%.

Результаты исследования влияния различных условий подготовки пробы представлены на рисунках 38 и 39.

Рисунок 38. Влияние различных условий подготовки пробы на концентрацию кальция в получаемой пробе.

Рисунок 39. Влияние различных условий подготовки пробы на концентрацию кальция в получаемой пробе.

Из полученных данных можно сделать вывод, что наилучшие результаты экстракции данных катионов достигались при использовании раствора хлористоводородной кислоты с концентрацией 0,1 моль/л.

Для апробирования методики проводили определение катионов натрия, калия, кальция, магния в лекарственных препаратах, перечисленных в таблице 23. Использовалась следующая методика подготовки пробы. Навеску образца, (указанную в таблице 23 массу образца) (с точностью до 0,01 г) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли около 2 г (с точностью до 0,01 г) раствора лития ацетата с содержанием ионов лития 0,05 %, затем доводили раствором 0,1 моль/л хлористоводородной кислоты до метки, перемешивали. Масса навески подбиралась с учетом диапазона применения методики. Таблица 25. Навески образцов.

№ Наименование Масса навески, мг

1 «Аспаркам» 200

2 «Магне В6» 200

3 «Лозап» 1000

4 «Диклофенак» 526

5 «Цефазолин» 200

6 «Амоксиклав» 588

7 «Магнерот» 200

8 «Магния Сульфат», раствор для внутривенного и внутримышечного введения 250 мг/мл 200

9 «Анальгин», раствор для внутривенного и внутримышечного введения 500 мг/мл 2857

10 «Сульфацил-натрий», капли глазные 500

11 «Регидрон», порошок для приготовления раствора для приема внутрь 5000 (раствора, приготовленного согласно инструкции)

12 «Натрия хлорид», раствор для инфузий изотонический 0,9% 286

13 «Ренни» 50

Полученные электрофореграммы представлены на рисунках 40 - 48. Дополнительные пики, присутствующие на электрофореграммах помимо

пиков определяемых веществ, обусловлены детектированием катионов, входящих в состав вспомогательных веществ. Результаты количественного определения представлены в таблице 24.

Рисунок 40. Электрофореграмма пробы препарата «Амоксиклав». Состав: амоксициллин (в форме тригидрата) 250 мг; клавулановая кислота (в форме калиевой соли) 125 мг; кремния диоксид коллоидный 5,4 мг; кросповидон 27,4 мг; кроскармеллоза натрия 27,4 мг; магния стеарат 12 мг; тальк 13,4 мг; микрокристаллическая целлюлоза до 650 мг.

Рисунок 41. Электрофореграмма пробы препарата «Анальгин». Состав: метамизол натрия 500 мг/мл.

Рисунок 42. Электрофореграмма пробы препарата «Аспаркам». Состав: 1 таблетка содержит магния аспарагината 175 мг (0,175 г), калия аспарагината 175 мг (0,175 г); крахмал кукурузный, полисорбат-80, кальция стеарат, тальк.

На рисунке 40 видны пики, соответствующие катионам кальция и натрия, содержащихся во вспомогательных веществах.

Рисунок 43. Электрофореграмма пробы препарата «Цефазолин».

Рисунок 44. Электрофореграмма пробы препарата «Диклофенак». Состав (на одну таблетку): диклофенак натрий 25 мг; крахмал; кальция фосфат двузамещенный; магния стеарат; тальк очищенный; поливинилпиролидон К30; индорезин; целлюлозы ацетат; диэтилфталат; понсо 4Я лак; кармоизиновый лак; титана диоксид; оксид железа желтый; оксид железа красный

Рисунок 45. Электрофореграмма пробы препарата «Лозартан». Состав (на 1 таблетку): лозартан калия 12,5 мг; микрокристаллическая целлюлоза; маннитол; кроскармеллоза натрия; повидон 30; магния стеарат; гипромеллоза; титана диоксид; тальк; пропиленгликоль.

На электрофореграмме препарата «Лозартан» также видны пики катионов магния и натрия, содержащихся во вспомогательных веществах.

Рисунок 46. Электрофореграмма пробы препарата «Магне Б6». Состав (на одну таблетку): магния лактата дигидрат 475 мг, сахароза 115,6 мг; тяжелый каолин 40 мг; акации камедь 20 мг; карбоксиполиметилен 934 10 мг; тальк (магния гидросиликат) 42,7 мг; магния стеарат 6,7 мг

Рисунок 47. Электрофореграмма пробы препарата «Магнерот». Состав (на одну таблетку): магния оротата дигидрат 500 мг; кремния диоксид коллоидный 2,5 мг; кармеллоза натрия 10 мг; микрокристаллическая целлюлоза 67,5 мг; крахмал кукурузный 22,5 мг; повидон К30 30 мг; лактозы моногидрат 50 мг; натрия цикламат 1,5 мг; тальк 18,75 мг; магния стеарат 1,63 мг.

Рисунок 48. Электрофореграмма пробы препарата «Регидрон». Состав: натрия хлорида 3,5 г; калия хлорида 2,5г; натрия цитрата 2,9г; глюкозы 10 г.

На электрофореграмме препарата «Магнерот» виден пик катионов натрия, содержащегося в составе вспомогательных веществ.

Таблица 26. Результаты количественного определения катионов калия, натрия, кальция, магния в лекарственных препаратах.

Наименование Катион Обнаружено, % Расчетное значение, %

«Аспаркам» калий 7,98±0,4 7,24

«Амоксиклав» калий 1,9±0,1 2,11

«Анальгин» натрий 3,45±0,17 3,45

«Аспаркам» магний 2,94±0,15 2,28

«Диклофенак» натрий 1,8±0,09 2,3

«Лозап» калий 1,01±0,05 1,18

«Магне В6» магний 5,04±0,25 5,04

«Магнерот» магний 4,71±0,24 3,95

Продолжение таблицы 27. Результаты количественного определения катионов калия, натрия, кальция, магния в лекарственных препаратах.

Наименование Катион Обнаружено, % Расчетное значение, %

«Регидрон» калий 0,13±0,01 0,13

натрий 0,17±0,02 0,19

«Ренни» кальций 21,9±1,1 21,8

магний 1,81±0,09 1,81

«Сульфацил-натрий» натрий 1,61±0,13 1,62

«Цефазолин» натрий 4,24±0,21 4,24

Отклонения могут быть обусловлены присутствием исследуемых катионов в составе вспомогательных веществ, таких как тальк, магния стеарат, натрий-карбоксиметилцеллюлоза и др. На основании полученных результатов можно сделать вывод о применимости данной методики для определения катионов калия, натрия, магния, кальция в составе таблетированных лекарственных препаратов и таблетированных БАД к пище.

Выводы по главе 4.

1. Изучено влияние условий экстрагирования катионов калия, натрия, кальция, магния из проб таблетированных лекарственных средств.

2. Предложена методика подготовки проб для таблетированных препаратов и порошков.

3. Предложена методика подготовки проб для растворов для инфузий.

4. Проведено качественное и количественное определение катионов калия, кальция, натрия, магния в различных лекарственных препаратах и таблетированных БАД к пище.

1. Проведено сравнение существующих методов анализа лекарственных веществ, содержащих катионы калия, натрия, кальция и магния. Показана перспективность использования метода капиллярного электрофореза для контроля качества исследованных лекарственных препаратов и БАД.

2. Разработаны условия подготовки растворов для инфузий, таблетированных лекарственных препаратов и БАД к пище для определения в них катионов.

3. Установлены оптимальные условия электрофоретического разделения катионов для разработки методики их количественного определения в лекарственных препаратаха и БАД к пище. Оптимизирован состав буферного раствора (15-20 ммоль/л имидазола, 2 ммоль/л 18-краун-6 эфира, кислота муравьиная до рН 3,6), обоснован выбор катионов лития в качестве внутреннего стандарта.

4. Оценены электрофоретические параметры (разрешение, соотношение сигнал/шум, порядок и времена миграции) и проведена валидация разработанных методик (по параметрам специфичность, правильность, сходимость, линейность). На основании полученных результатов показано, что метод капиллярного электрофореза может быть использован для определения катионов калия, кальция, магния, натрия в лекарственных препаратах и БАД к пище.

5. Полученные результаты анализа 30 лекарственных препаратов (растворы для инфузий, таблетированные препараты и др.) и 5 биологически активных добавок к пище показали применимость данного метода для определения катионов калия, кальция, натрия и магния в различных лекарственных препаратах и БАД к пище.

1. Беликов В. Г. Учебное пособие по фармацевтической химии. М.: «Медицина», 1979, 552 с.

2. Богачук М.Н., Бессонов В.В., Передеряев О.И. Методика количественного определения водорастворимых витаминов в витаминных премиксах и пищевых продуктах с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра. // Вопросы питания. -2011. № 3. С. 67-74.

3. Богачук М.Н., Передеряев О.И., Раменская Г.В. Определение водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом капиллярного зонального электрофореза. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2011. № 9. С. 14-22.

4. Валидация аналитических методик для производителей лекарств: типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств/ под редакцией В.В. Береговых - М.: Литера, 2008. - 132 с.

5. Государственная фармакопея XI СССР. Вып. 1, 2. М.: Медицина, 1987 (выпуск 1), 1989 (выпуск 2).

6. Государственная фармакопея Российской Федерации XII. Часть 1, М.: Издательство Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008.

7. Морзунова Т.Г. Капиллярный электрофорез в фармацевтическом анализе. // Химико-фармацевтический журнал 2006, том 40, №3, С. 39-52.

8. Отто М. Современные методы аналитической химии 3-е издание. М.: Техносфера, 2008. 544с.

9. Регистр лекарственных средств России - 2012. URL: http://www.rlsnet.ru// (дата обращения 25.11.2012).

10. Руководство по капиллярному электрофорезу / Под ред. А.М. Волощука. М.: Научный совет Российской академии наук по хроматографии, 1996. 111 с.

11. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие / Под ред. проф. Н И. Калетиной. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. 1016 с.

12. Шаповалова Е.Н., Пирогов А.В. Хроматографические методы анализа: методическое пособие для специального курса МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет. М., 2007 г., с.130-142.

13. Altria, K. D., Clayton, N. G., Hart, M., et al. An inter-company cross-validation exercise on capillary electrophoresis testing of dose uniformity of paracetamol contents in formulations. Chromatographia 39, 180-184.

14. Analysis of highly saline samples by capillary zone electrophoresis: enhanced direct UV detection of inorganic anions using on-capillary preconcentration and clean-up techniques. / A.R. Timerbaev et al. // Journal of Chromatography A, 888 (2000) 309-319.

15. Beck W., Engelhardt H. Capillary electrophoresis of organic and inorganic cations with indirect UV detection. // Chromatographia 1992, 33, 313-316.

16. Breadmore M. C., Haddad P. R., Fritz J. S. Optimisation of the separation of anions by ion chromatography-capillary electrophoresis using indirect UV detection. // J. Chromatogr. A 2001, 920, 31-40.

17. Beck W., Engelhardt H. Capillary Electrophoresis of Organic and Inorganic Cations with Indirect UV Detection. // Chromatographia 1992, V.33, №7/8, 313316.

18. Beckers J.L., Bocek P. The preparation of background electrolytes in capillary zone electrophoresis: Golden rules and pitfalls. // Electrophoresis 2003, V.24, 518-535.

19. Beckers J.L. Ampholytes as background electrolytes in capillary zone electrophoresis: Sense or nonsense? Histidine as a model ampholyte. // Electrophoresis 2003, 24, 548-556.

20. Beckers J.L. UV detection in capillary zone electrophoresis. Peaks or dips -that is the question. // Journal of Chromatography A 1994, 679, 153-165.

21. Beckers J.L., Everaerts F.M. System peaks in capillary zone electrophoresis What are they and where are they coming from? // Journal of Chromatography A 1997, 787, 235-242.

22. British Pharmacopoeia 2013 (BP 2013), Crown Copyright 2012 (London).

23. Capillary electrophoresis: a new tool in forensic toxicology. Applications and prospects in hair analysis for illicit drugs. / Tagliaro F. et al. // Forensic Science Intemational 1995, 70, 93-104.

24. Capillary electrophoresis for measuring major and trace anions in thermal water and condensed-steam samples from hydrothermal springs and fumaroles. / Santoyo, E et al. // J. Chromatogr. A 2001, 920, 325-332.

25. Capillary electrophoresis for short-chain organic acids and inorganic anions in different samples. / V. Galli et al. // Electrophoresis 2003, 24, 1951-1981.

26. Capillary electrophoresis screening of poisonous anions extracted from biological samples. / R. Gillette et al. // Journal of Chromatography B, 2006, 831, 190-195.

27. Capillary electrophoresis methods for pharmaceutical analysis / Edited by S. Ahuja, M.I. Jimidar. Boston: Elsevier/Academic, 2008.

28. Contactless Conductivity Detection for Capillary Electrophoresis. / Zemann, A. J. // Anal. Chem. 1998, 70, 563-567.

29. Deng Y. Determination of major inorganic anions in rainwater by capillary electrophoresis. // Wat. Res. 1998, Vol. 32, No. 8, pp. 2249-2256.

30. Determination of alkali and alkaline earth metals in real samples by capillary ion analysis. / Yang, Q. et al. // J. Chromatogr. A 1994, 673, 275-285.

31. Determination of bromate ion in drinking water by capillary zone electrophoresis with direct photometric detection. / T. Takayanagi et al. // Journal of Chromatography A 2006, 1128, 298-302.

32. Determination of major metal cations in milk by capillary zone electrophoresis. / S. Suarez-Luque et al. // International Dairy Journal 2007, 17, 896-901.

33. Ding W., Thornton M.J., Fritz J.S. Capillary electrophoresis of anions at high salt concentrations. Electrophoresis 1998, 19, 2133-2139.

34. Effect of high concentrations of salts in samples on capillary electrophoresis of anions. / L. Song et al. // Journal of Chromatography A 1995, 696, 307-319.

35. Enantiomeric separation of antimalarial drugs by capillary electrophoresis using neutral and negatively charged cyclodextrins. / K. Nemeth et al. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2011, 54, 475-481.

36. European Pharmacopoeia 7.0, 2011 ^

37. Havel, J., Janos , P., Jandik, P. Capillary electrophoretic estimation of sulfate stability constants of metal ions and determination of alkali and alkaline earth metals in waters. // J. Chromatogr. A 1996, 745, 127-134.

38. Improved capillary electrophoresis method for measuring rare-earth elements in synthetic geochemical standards. / Verma, S. P.et al. // J. Chromatogr. A 2000, 884, 317-328.

39. Influencing of the migration time in CZE. / J. Boden et al. // Fresenius J. Anal. Chem. 1994, 348, 572-575.

40. Isoo K., Terabe S. Analysis of metal ions by sweeping via dynamic complexation and cation-selective exhaustive injection in capillary electrophoresis. // Analytical chemistry. 2003, 75, 6789-6798.

41. Kaniansky D., Zelenska V., Baluchova D. Capillary zone electrophoresis of inorganic anions with conductivity detection. // Electrophoresis 1996, 17, 18901897.

42. Kuban P., Hauser P.C. Application of an external contactless conductivity detector for the analysis of beverages by microchip capillary electrophoresis. // Electrophoresis 2005, 26, 3169-3178.

43. Kuban P., Kuban P., Kuban V. Simultaneous determination of inorganic and organic anions, alkali, alkaline earth and transition metal cations by capillary

electrophoresis with contactless conductometric detection. // Electrophoresis 2002, 23, 3725-3734.

44. Lucy C. A. Factors affecting selectivity of inorganic anions in capillary electrophoresis. // Journal of Chromatography A 1999, 850, 319-337.

45. Madajova V., Turcelovi E., Kaniansky D. Influence of poly(vinylpyrrolidone) on isotachophoretic separations of inorganic anions in aqueous electrolyte systems. // Journal of Chromatography, 1992, 589, 329-332.

46. Modification and validation of the pyromellitic acid electrolyte for the capillary electrophoretic determination of anions. / T. Ehmann et al. // Journal of Chromatography A 2003, 995, 217-226.

47. Nemutlu E., Ozaltin N. Determination of magnesium, calcium, sodium, and potassium in blood plasma samples by capillary zone electrophoresis. // Anal Bioanal Chem 2005, 383, 833-838.

48. Oehrle, S. A. Analysis of low-level anions in water extracts of hard disk drive heads by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A 1996, 745, 81-85.

49. Optimization of inorganic capillary electrophoresis for the analysis of anionic solutes in real samples. / Romano, J.et al. // J. Chromatogr. 1991, 546, 411-421.

50. Pantuckova P., Krivankova L. Fast and simple method for determination of iodide in human urine, serum, sea water, and cooking salt by capillary zone electrophoresis. // Electrophoresis 2004, 25, 1102-1111.

51. Petersen S.L., Ballou N.E. Effects of capillary temperature control and electrophoretic heterogeneity on parameters characterizing separations of particles by capillary zone electrophoresis. // Analytical Chemistry 1992, 64, 1676-1681.

52. Publication number 5990-3777 EN of Agilent Technologies Inc. High Perfomance Capillary Electrophoresis, 2009.

53. Rabiller-Baudry M., Chaufer B., Rabiller P. Capillary Electrophoretic Analysis of Anions in a Multi-Anion Background Electrolyte: Interference of System Peaks. // Chromatographia 1999 Vol. 49, No. 5/6, 309-316.

54. Rapid capillary zone electrophoresis method for the determination of metal cations in beverages. / S. Suarez-Luque et al. // Talanta 2006, 68, 1143-1147.

55. Seidel B. S., Faubel W. Determination of iron in real samples by high performance capillary electrophoresis in combination with thermal lensing. // Fresenius J Anal Chem 1998, 360, 795-797.

56. Shi, Y., Fritz, J. S. Separation of metal ions by capillary electrophoresis with a complexing electrolyte. // J. Chromatogr. 1993, 640, 473-479.

57. Soga, T., Ross G. D. Simultaneous determination of inorganic anions, organic acids and metal cations by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A 1999, 834, 65-71.

58. Stathakis C., Cassidy R.M. Control of relative migration of small inorganic and organic anions with cyclodextrins in capillary electrophoresis. // Can. J. Chem. 1998, 76, 194-198.

59. Stathakis C., Cassidy R.M. Effect of electrolyte composition in the capillary electrophoretic separation of inorganic/organic anions in the presence of cationic polymers. // Journal of Chromatography A 1995, 699, 353-361.

60. Takagai Y., Igarashi S. Simultaneous determination of Iron (II) and Iron (III) by micellar electrokinetic chromatography using an off-line selective complexing reaction. // Analytical sciences 2003, 19, 1207-1209.

61. The importance of capillary electrophoresis, capillary electrochromatography, and ion chromatography in separations of inorganic ions. / V. Pacakova et al. // Electrophoresis 2003, 24, 1883-1891.

62. Timerbaev A.R. Capillary electrophoresis of inorganic ions: an update. // Electrophoresis 2004, 25, 4008-4031.

63. Timerbaev A.R. Element speciation analysis by capillary electrophoresis. // Talanta 2000, 52, 573-606.

64. Timerbaev A.R., Hirokawa T. Recent advances of transient isotachophoresis-capillary electrophoresis in the analysis of small ions from high-conductivity matrices. Electrophoresis 2006, 27, 323-340.

65. Timerbaev A.R. Recent advances and trends in capillary electrophoresis of inorganic ions. // Electrophoresis 2002, 23, 3884-3906.

66. The Japanese Pharmacopoeia 16 (JP 16), Atomic Weights Subcommittee of the Chemical Society of Japan, 2011 (Japan).

67. United States Pharmacopeia 36 (USP 36) NF 21, The official Compendia of Standarts, 2013 (USA).

68. Wojtusik, M. J., Harrold, M. P. Factors influencing trace ion analysis with preconcentration by electrostacking. J. Chromatogr. A 1994, 671, 411-417.

Таблица 28. Информация об объектах исследования.

№ Наименование Производитель Состав

1 «Аспаркам» ОАО «Луганский химзавод», серия 520312 175 мг калия аспартата, 175 мг магния аспартата

2 «Магне В6» «Санофи Винтроп Индустрия», Франция, 2А151 магния лактата дигидрат 475 мг, сахароза 115,6 мг; тяжелый каолин 40 мг; акации камедь 20 мг; карбоксиполиметилен 934 10 мг; тальк (магния гидросиликат) 42,7 мг; магния стеарат 6,7 мг

3 «Лозап» «Зентива а.с.»Словацкая Республика, 2040212 лозартан калия 12,5 мг; микрокристаллическая целлюлоза; маннитол; кроскармеллоза натрия; повидон 30; магния стеарат; гипромеллоза; титана диоксид; тальк; пропиленгликоль

4 «Диклофенак» ООО «Хемофарм», 0261111 диклофенак натрий 25 мг; крахмал; кальция фосфат двузамещенный; магния стеарат; тальк очищенный; поливинилпиролидон К30; индорезин; целлюлозы ацетат; диэтилфталат; понсо 4Я лак; кармоизиновый лак; титана диоксид; оксид железа желтый; оксид железа красный

5 «Цефазолин» ОАО «Биохимик», 90112 цефазолин (в форме натриевой соли) 250 мг

6 «Амоксиклав» «Лек д.д.», Словения, СН8524 амоксициллин (в форме тригидрата) 250 мг; клавулановая кислота (в форме калиевой соли) 125 мг; кремния диоксид коллоидный 5,4 мг; кросповидон 27,4 мг; кроскармеллоза натрия 27,4 мг; магния стеарат 12 мг; тальк 13,4 мг; микрокристаллическая целлюлоза до 650 мг

№ Наименование Производитель Состав

7 «Магнерот» «Вёрваг Фарма Гмбх и Ко. КГ», Германия, 12В109 магния оротата дигидрат 500 мг; кремния диоксид коллоидный 2,5 мг; кармеллоза натрия 10 мг; микрокристаллическая целлюлоза 67,5 мг; крахмал кукурузный 22,5 мг; повидон К30 30 мг; лактозы моногидрат 50 мг; натрия цикламат 1,5 мг; тальк 18,75 мг; магния стеарат 1,63 мг

8 «Магния Сульфат», раствор для внутривенного и внутримышечного введения 250 мг/мл ОАО «Биохимик», 190709

9 «Анальгин», раствор для внутривенного и внутримышечного введения 500 мг/мл РУП «Борисовский завод медицинских препаратов», Республика Беларусь

10 «Сульфацил-натрий», капли глазные РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь, 391008

11 «Регидрон», порошок для приготовления раствора для приема внутрь «Орион корпорейшн», Финляндия, 175641 натрия хлорида 3,5 г; калия хлорида 2,5г; натрия цитрата 2,9г; глюкозы 10 г

12 «Натрия хлорид», раствор для инфузий изотонический 0,9% ОАО «Биохимик», 5570910

№ Наименование Производитель Состав

13 «Ренни», таблетки жевательные «Байер Консьюмер Кэр АГ», Швейцария кальция карбонат 680 мг; магния карбонат основной 80 мг; сахароза 475 мг; крахмал кукурузный прежелатинизированный 20 мг; крахмал картофельный 13 мг; тальк 33,14 мг; магния стеарат 10,66 мг; легкий жидкий парафин 5 мг; ароматизатор ментоловый 13 мг; ароматизатор лимонный 0,2 мг

14 «Трисоль» ОАО «Биохимик», серия 220410 натрия хлорида 5 г; калия хлорида 1 г; натрия гидрокарбоната 4 г (на 1 л)

15 «Рингер» ОАО «Биохимик», 160410 натрия хлорид 8,6 г; калия хлорид 300 мг; кальция хлорид дигидрат 330 мг (на 1 л)

16 «Мафусол» ОАО «Биосинтез», 40511 натрия фумарат 14 г; натрия хлорид 6 г; калия хлорид 0,3 г; магния хлорид 0,12 г (на 1 л)

17 «Квинтасоль» ОАО «Биосинтез», 30911 натрия хлорид 5,26 г; калия хлорид 0,37 г; кальция хлорид 6-водный (в пересчете на безводный) 0,28 г; магния хлорид 6-водный (в пересчете на безводный) 0,14 г; натрия ацетат 3-водный (в пересчете на безводный) 4,1 г (на 1 л)

18 «Раствор Хартмана» ООО «Хемофарм А.Д.», 1900126 кальция хлорид 0,294 г; калия хлорида 0,373 г; натрия хлорида 6,02 г; натрия лактат 3 г (на 1 л)

№ Наименование Производитель Состав

19 «Гемодез-8000» ОАО «Биосинтез», 70313 поливинилпирролидон низкомолекулярный (молекулярная масса 8000±2000) 60г, натрия хлорид 5,5 г, калия хлорид 0,42 г, кальция хлорид гексагидрат 0,5 г, магния хлорида гексагидрат 0,005г, натрия гидрокарбонат 0,23 г (на 1 л)

20 «Гемодез-8000» ОАО «Биосинтез», 150513 поливинилпирролидон низкомолекулярный (молекулярная масса 8000±2000) 60г, натрия хлорид 5,5 г, калия хлорид 0,42 г, кальция хлорид гексагидрат 0,5 г, магния хлорида гексагидрат 0,005г, натрия гидрокарбонат 0,23 г (на 1 л)

21 «Гемодез-Н» ФГУБ «Курская биофабрика -фирма БИОК» поливинилпирролидон низкомолекулярный (молекулярная масса 8000±2000) 60г, натрия хлорид 5,5 г, калия хлорид 0,42 г, кальция хлорид 0,5 г, магния хлорид безводный 0,005г, натрия гидрокарбонат 0,23 г (на 1 л)

22 «Дисоль» ОАО «Биохимик», 411212 натрия ацетата 2 г, натрия хлорида 6 г; (на 1 л)

23 «Дисоль» ОАО «Биохимик», 190612 натрия ацетата 2 г, натрия хлорида 6 г; (на 1 л)

24 «Раствор Хартмана» ООО «Хемофарм А.Д.», А102761 кальция хлорид 0,294 г; калия хлорида 0,373 г; натрия хлорида 6,02 г; натрия лактат 3 г (на 1 л)

25 «Рингер» ОАО «Биохимик», 20213 натрия хлорид 8,6 г; калия хлорид 300 мг; кальция хлорид дигидрат 330 мг (на 1 л)

26 «Хлосоль» ОАО «Биохимик» Натрия ацетата тригидрат 3,6 г, натрия хлорид 4,75 г, калия хлорид 1,5 г (на 1 л)

№ Наименование Производитель Состав

27 «Трисоль» ОАО «Мосфарм» серия 0020212 натрия хлорида 5 г; калия хлорида 1 г; натрия гидрокарбоната 4 г (на 1 л)

28 «Мафусол» ОАО «Биосинтез», 60412 натрия фумарат 14 г; натрия хлорид 6 г; калия хлорид 0,3 г; магния хлорид 0,12 г (1 л)

29 «Раствор Рингера» ООО «Хемофарм А.Д.», А202036 натрия хлорид 8,6 г; калия хлорид 300 мг; кальция хлорид дигидрат 330 мг (на 1 л)

30 «Рингера раствор» ОАО «Красфарма», 130413 натрия хлорид 8,6 г; калия хлорид 300 мг; кальция хлорид дигидрат 330 мг (на 1 л)

□ 0АЕ>1 А. 3:д=350,5 Йл^Л&.Й ¡ИЩШЖ« 3012-09-24 16-5в-55\С40-0202.[))

2_3_4_5_5_7_8 _9_йщ

Рисунок 49. Электрофореграмма смеси катионов аммония, калия, натрия, кальция, магния, лития. Состав рабочего буфера: 20 ммоль/л имидазола, кислоты муравьиной до рН 3,6.

I—I МВ1 А, 3:5=350.5 Rst21G.nl (СЛТ!0ГМ|_ЕХ1 3012-09-24 1В-56-55\040-0301.С)

2_3_ 4_5_13_7_3 _9_(тип

Рисунок 50. Электрофореграмма смеси катионов аммония, калия, натрия, кальция, магния, лития. Состав рабочего буфера: 20 ммоль/л имидазола, 0,32 ммоль/л 18-краун-6 эфира, кислоты муравьиной до рН 3,6.

О ми А, 314=250,5 НФ2КЛ0 (САТЮН'ЛЬЕХ! ЮХЫЖ* 18-5в-55\04С'-0602.й

2_3_4_§_г_7_8_ 8_гНГг

Рисунок 51. Электрофореграмма смеси катионов аммония, калия, натрия, кальция, магния, лития. Состав рабочего буфера: 20 ммоль/л имидазола, 1 ммоль/л 18-краун-6 эфира, кислоты муравьиной до рН 3,6.

I—I МВ1 А, 3!(=250.5 Rst21G.ni (СЛТ!0ГМ|_ЕХ1 2012-09-24 10,авЛ6*ОЮ-»®Т.[1)

2_3_ 4_5_13_7_Е1 _8_ййп

Рисунок 52. Электрофореграмма смеси катионов аммония, калия, натрия, кальция, магния, лития. Состав рабочего буфера: 20 ммоль/л имидазола, 1,5 ммоль/л 18-краун-6 эфира, кислоты муравьиной до рН 3,6.

□ М1 А, 318=350,5 (СйТ!СНА|.ЕХ1 2012-03-24 »ЩйЩ

2_3_4_5_г_7_3_ 8_(йГт

Рисунок 53. Электрофореграмма смеси катионов аммония, калия, натрия, кальция, магния, лития. Состав рабочего буфера: 20 ммоль/л имидазола, 2 ммоль/л 18-краун-6 эфира, кислоты муравьиной до рН 3,6.

П> А, 3:8=350,5 (САТ|0Н\Щ£Х1 2012-03-24 1в-50-55Ю4С'-0601.0)

2_3_ 4_5_0_7_3 _0_6™

Рисунок 54. Электрофореграмма смеси катионов аммония, калия, натрия, кальция, магния, лития. Состав рабочего буфера: 20 ммоль/л имидазола, 2,5 ммоль/л 18-краун-6 эфира, кислоты муравьиной до рН 3,6.

Рисунок 55. Электрофореграмма смеси катионов аммония, калия, натрия, кальция, магния, лития. Состав рабочего буфера: 20 ммоль/л имидазола, 4 ммоль/л 18-краун-6 эфира, кислоты муравьиной до рН 3,6.

Приложение 3

Проект фармакопейной статьи

Совместное определение катионов калия, натрия, кальция, магния в лекарственных препаратах различной химической структуры или в субстанциях лекарственных препаратов, содержащих эти катионы методом капиллярного зонального электрофореза.

Приведенная методика может быть использована для определения катионов калия, натрия, кальция, магния в лекарственных препаратах, а также в субстанциях, содержащих эти катионы.

Приготовление образцов

Концентрации анализируемых катионов в образце должны быть не ниже 10 мг/л.

Подготовка пробы: соответствующая навеска или соответствующий объем предварительно измельченного образца помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстрагируют 60 мл рабочего буфера или деионизированной воды. Затем интенсивно встряхивают на шейкере в течение 10 мин. Далее доводят объем раствора образца до метки водой деионизированной и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм или центрифугируют при 20000 g в течение 10 мин.

Подготовка рабочих стандартных растворов

Рабочие стандартные растворы (РСО) готовят следующим образом: навеску стандартных образцов (берут в соотношении, эквивалентном содержанию катионов в препарате) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют около 30 мл воды деионизированной, интенсивно встряхивают до полного растворения. Объем раствора доводят до метки водой деионизированной и перемешивают, затем фильтруют через

мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Рабочие стандартные растворы стабильны в течение 30 дней при температуре -18 оС. Проведение анализа КЗЭ. Условия электрофоретического анализа:

Капилляр: кварцевый капилляр HPCE stndrd cap Ьэфф/Ьобщ=56/64,5 см, ID=50 мкм или аналогичный;

Буферный раствор: 20 мМ имидазола, 2 ммоль/л 18-краун-6 эфира, рН=3,6 (доводится кислотой муравьиной);

Ввод пробы: гидродинамический при давлении 50 мбар в течение 5 с; Температура термостата: 25°С

Детектирование (диодная матрица): 210 нм (длина волны сравнения) и 350 нм (рабочая длина волны);

При исследовании катионов в выбранных условиях параметры разделения должны быть не хуже представленных в таблице 1. Таблица 1. Параметры разделения катионов.

Катионы Ожидаемое tR tRst N Asym

Калий 0,586 39344 5,99

Кальций 0,635 79804 4,05

Натрий 0,769 119899 3,06

Магний 0,802 212545 0,42

Литий - 83135 0,35

Количественное определение

Расчет содержания катионов проводят по уравнению линейности, полученному при калибровке (зависимость концентрации от получаемого соотношения площади пика к времени миграции), скорректированное

отношение площади пика к времени миграции определяют по формуле:

* $ *

к * ^

где С^ - концентрация внутреннего стандарта в пробе, мкг/мл; 8з1 -полученная площадь пика внутреннего стандарта на электрофореграмме; 8; -полученная площадь пика исследуемого катиона; ^ - полученное время миграции внутреннего стандарта, мин.; 11; - полученное время миграции исследуемого катиона, мин.

Рисунок 1. Пример электрофореграммы препарата, содержащего катионы калия, натрия, магния, кальция.