Определение изомерных аминокислотных остатков треонина в последовательностях пептидов в задачах протеогеномных исследований тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.17, кандидат наук Соловьева Елизавета Михайловна

• Соловьева Елизавета Михайловна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Соловьева Елизавета Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ПРЕДМЕТА ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Масс-спектрометрия

1.1.1 Электростатическая орбитальная ионная ловушка

1.1.2 Методы ионизации высокомолекулярных соединений, белков и пептидов

1.1.3 Ионизация электрораспылением

1.2 Тандемная масс-спектрометрия

1.2.1 Диссоциация, активированная соударениями

1.2.2 Модель «мобильного протона» и «кислотный эффект»

1.2.3 Фотодиссоциация ультрафиолетовым излучением

1.2.3 Предсказание скоростей реакцией фрагментации

1.3 Исследование структуры белков, пептидов и аминокислотных остатков

1.3.1 Анализ структуры белков и пептидов

1.3.2 Фотодиссоционная спектроскопия ионов при ультрахолодных температурах

1.3.3 Анализ изомерных аминокислотных остатков

1.4 Протеомика

1.4.1 Подход «снизу-вверх». Подготовка образца

1.4.2 Подход «снизу-вверх». Схема эксперимента и анализ данных

1.4.3 Протеогеномика

1.4.4 Проблемы современной протеогеномики

1.4.5 Влияние химической модификации метионина на результаты протеогеномных исследований раковых заболеваний

Глава 2. СПЕКТРОСКОПИЯ И ФОТОДИССОЦИАЦИЯ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ МОДЕЛЬНЫХ ПАР ПЕПТИДОВ С ИЗОМЕРНЫМИ АМИНОКИСЛОТНЫМИ ОСТАТКАМИ ТРЕОНИНА

2.1. Фотодиссоционная спектроскопия биомолекул в газовой фазе при криогенных температурах

2.2. Фотодиссоционные спектры поглощения пептидов с изомерными аминокислотными остатками треонина

2.3 Оптимизация параметров записи спектров фотодиссоциации пептидов в ультрафиолетовом диапазоне

2.4 Спектры фотодиссоциации ультрафиолетовым излучением пептидов с изомерными аминокислотными остатками треонина

2.5 Спектры фотодиссоциации ультрафиолетовым излучением двадцати пар модельных пептидов. «Эффект соседа»

Глава 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОМЕРОВ ОСТАТКА ТРЕОНИНА В ПЕПТИДАХ ПРОИЗВОЛЬНОГО АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА МАСС-

СПЕКТРОВ ФОТОДИССОЦИАЦИИ

3.1. Синтетические пептиды белков человека. Нормализация интенсивностей фрагментов модельных пептидов

3.2. Контроль качества спектров фрагментации пептидов

3.3. Диссоциация, активированная соударениями, синтетических пептидов белков человека

Глава 4. МЕХАНИЗМ ФОТОДИССОЦИАЦИЯ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ ИОНОВ ПЕПТИДОВ

4.1. Общие принципы процесса фотодиссоциации пептидов

4.2. Общие принципы процесса диссоциации, активированной соударениями. Теория «мобильного протона»

4.3. Фотодиссоциация ультрафиолетовым излучением натриевых аддуктов модельного пептида. Теория «мобильного протона»

4.4. Теория «мобильного протона» в применении к фотодиссоциации пептидов и белков. Сравнение результатов

4.5. Объяснение эффекта зависимости скорости реакции фотодиссоциации от структуры остатка треонина в рамках теории «мобильного протона»

Глава 5. ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ОСТАТКОВ ИЗОТРЕОНИНА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОТЕОГЕНОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

5.1. Реакция алкилирования свободных тиольных групп в белках. Модификация остатков метионина

5.2. Реакция превращение остатков метионина в остатки изотреонина под действием йодацетамида в пептидах белка бычьего сывороточного альбумина

5.3. Тепловой эффект и влияние буферного раствора на кинетику реакции превращения остатков метионина в остатки изотреонина

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение изомерных аминокислотных остатков треонина в последовательностях пептидов в задачах протеогеномных исследований»

Актуальность темы исследования

Протеогеномика представляет собой область науки, занимающуюся анализом изменений, произошедших на геномном уровне, и их влиянием на соответствующие белковые продукты генов. Особенно большой интерес представляет изучение изменений, в результате которых происходит замена аминокислот в белках, поскольку их идентификация позволяет устанавливать причины многих патологий, разрабатывать белковые маркеры и эффективную терапию заболеваний.

Одна из важных проблем современной протеогеномики заключается в возникновении в процессе подготовки анализируемых смесей химических модификаций белков [1]. Такие артефакты могут быть ошибочно приняты за результат геномных мутаций [2-4]. В частности, недавно было обнаружено, что природные аминокислотные остатки метионина могут превращаться в изотреонин (гомосерин) в процессе стандартной подготовки белковых проб [5]. В то же время, геномные мутации, в частности замена тимина на цитозин в триплете, кодирующем метионин, приводят к реальной замене метионина на треонин в тех же белковых последовательностях. Невозможность отличить остатки треонина от его изомера изотреонина ведет к тому, что химические модификации метионина, возникающие in vitro, могут быть перепутаны с генетическими мутациями in vivo, проявляющимися на белковом уровне. В связи с этим все найденные замены метионина на треонин и треонина на метионин должны априорно исключаться из результатов протеогеномных анализов, что неизбежно ведет к потере биологически важной информации. Таким образом, определение изомеров остатка треонина в аминокислотных последовательностях белков является актуальной и крайне востребованной задачей.

Основным методом, используемым для анализа смесей белков, является масс-спектрометрия (МС). Высокая производительность и разрешающая способность современных масс-анализаторов позволяют решать такие сложные задачи, как качественный и количественный анализ белков живых организмов. Несмотря на широкое использование МС во многих областях науки, на сегодняшний день существует ряд нерешенных проблем. В первую очередь, МС обладает ограниченными возможностями при анализе структурных особенностей белков и пептидов, в частности, их изомерных форм. Так, классические методы МС не позволяют отличить аминокислотные остатки треонина от изотреонина в составе пептидов.

Изменение структуры аминокислотного остатка в полипептидной цепи может оказывать влияние на эффективность реакции разрыва соседних пептидных связей. Однако высокая

тепловая энергия может существенным образом нивелировать эту разницу. Понижение температуры молекул позволит преодолеть это препятствие и повысить чувствительность анализа структурных особенностей пептидов. Недавно было показано, что фотодиссоционная спектроскопия ионов пептидов, находящихся в газовой фазе при криогенных температурах, может быть использована для исследования изомерных форм биомакромолекул [6]. Однако данный метод позволяет работать только с индивидуальными веществами, а время сканирования в широком диапазоне длин составляет десятки минут. Поэтому классическая фотодиссоционная спектроскопия, включающая в себя сканирование по многим длинам волн, не может быть использована для идентификации большого числа изомерных соединений в сложных смесях протеолитических пептидов. Решение этой задачи видится в использовании низкотемпературной фотодиссоциации, индуцированной лазерным излучением на одной длине волны, в качестве способа диссоциации пептидных связей в рамках метода тандемной масс-спектрометрии. При этом, поскольку пептидная связь поглощает в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне, использование такого лазерного излучения позволит создать универсальный метод анализа изомерных форм пептидов: измеряя массы и интенсивности фрагментов ионов пептидов при их фотодиссоциации в результате воздействия УФ излучения, можно определить даже незначительные структурные различия отдельных аминокислотных остатков.

Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в разработке нового метода анализа изомеров остатка треонина в последовательностях пептидов, а также в изучении фундаментальных механизмов фотодиссоциации ионов пептидов с изомерными аминокислотными остатками треонина под воздействием УФ излучения. Конкретные задачи исследования были следующие:

1. Создание библиотеки характеристических фрагментов, возникающих при низкотемпературной фотодиссоциации ионов пептидов с изомерными остатками треонина, инициируемой лазерным излучением в УФ диапазоне. Определение величины эффекта влияния соседних аминокислот на диссоциацию изомерного остатка.

2. Экспериментальная проверка возможностей метода, основанного на использовании созданной библиотеки характеристических фрагментов, для идентификации изомеров остатка треонина в природных пептидах с произвольной аминокислотной последовательностью, оценка его чувствительности и специфичности.

3. Создание методики оценки качества масс-спектров фрагментации пептидов в ионных ловушках гибридных масс-спектрометров. Тестирование методики на спектрах фотодиссоциации пептидов, инициируемой УФ излучением в диапазоне длин волн 192-250 нм.

4. Выяснение механизма реакции диссоциации пептидов под воздействием УФ излучения и роли ионизирующего протона. Изучение факторов, влияющих на скорость реакции фотодиссоциации пептидной связи при замене остатка треонина на его изомер.

5. Исследование влияния температуры и состава буферных растворов на химическую реакцию, приводящую к модификации остатка метионина и его превращению в изотреонин в процессе подготовки белков для масс-спектрометрического анализа. Оценка уровня модификации в сравнении с частотой встречаемости имитирующей ее природной мутации.

Научная новизна работы

1. Впервые продемонстрирована возможность использования масс-спектрометрии высокого разрешения в сочетании с фотодиссоциацией УФ излучением для идентификации изомерных форм треонина в последовательностях пептидов. Предложен метод для определения структурных изомеров остатков треонина в последовательностях пептидов произвольного состава. Экспериментально получены необходимые характеристические параметры предлагаемого метода для всех природных аминокислот, соседствующих с изучаемым остатком треонина.

2. Впервые экспериментально показана применимость модели «мобильного протона» для объяснения процесса фотодиссоциации пептидов под действием УФ излучения. В рамках данной модели предложено описание особенностей масс-спектров фотодиссоциации пептидов с изомерными остатками треонина, инициируемой УФ излучением.

3. Впервые рассмотрены факторы, влияющие на появление аминокислотных остатков изотреонина в последовательностях пептидов как результата химической модификации остатков метионина. Получены данные по температурным зависимостям реакции модификации в буферных растворах различного состава и предложена методика оптимизации условий подготовки белков для хроматомасс-спектрометрического анализа.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в получении фундаментальных знаний о механизмах фотодиссоциации пептидов под воздействием УФ

излучения и разработке на основе этих знаний методики, позволяющей определять изомерную форму аминокислотного остатка треонина в последовательностях пептидов. Предложенная методика может быть использована специалистами в области анализа высокомолекулярных соединений, а также исследователями в области биологии и персонализированной медицины для поиска и идентификации методами хромато-масс-спектрометрии пептидов и белков, ассоциированных с патологическими геномными мутациями в клетках. Предложенная в работе модель влияния ионизирующего протона на процесс фотодиссоциации может быть полезна для специалистов в области химической физики при изучении кинетики фрагментации природных и синтетических биополимеров.

Методы исследования

В работе использовались следующие физико-химические методы исследования:

• масс-спектрометрия высокого разрешения на основе электростатической орбитальной ионной ловушки;

• масс-спектрометрия на основе квадрупольной ионной ловушки;

• ультрафиолетовая спектроскопия ионов с использование оптического параметрического осциллятора;

• фотодиссоциация ионов УФ излучением в криогенной ионной ловушке на основе радиочастотного мультиполя;

• высокоэффективная обращённо-фазовая жидкостная хроматография;

Подготовка смесей биомакромолекул проводилась с использованием стандартных биохимических методов. Обработка экспериментальных данных и теоретические расчеты проводились с использованием математического программного обеспечения Origin и программных ресурсов, разработанных автором на языке программирования высокого уровня с динамической типизацией Python.

Положения, выносимые на защиту

1. Новый метод идентификации изомеров треонина в последовательностях пептидов, основанный на комбинации фотодиссоциации пептидов под воздействием УФ излучения с масс-спектрометрией высокого разрешения.

2. Экспериментальное обоснование применимости модели «мобильного протона» для описания механизма фотодиссоциации изомеров под воздействием УФ излучения. Теоретическое обоснование зависимости скорости реакции разрыва пептидных связей под действием ультрафиолетового излучения от структуры остатка треонина в последовательности пептидов.

3. Оптимальные условия подготовки пробы белков для хромато-масс-спектрометрического анализа, позволяющие уменьшить степень химической модификации остатков метионина в последовательностях белков и повысить достоверность их идентификации.

Степень достоверности полученных результатов

Достоверность полученных результатов подтверждена совокупностью экспериментальных данных, полученных лично автором с использованием современных аналитических и математических методов и подходов.

Апробация результатов

Основные результаты диссертации были доложены на следующих конференциях: 18th Human Proteome Organisation World Congress (Adelaide, Australia, 2019); 13 th Annual Congress of the European Proteomics Association: From Genes via Proteins and their Interactions to Functions (Potsdam, Germany, 2019); Annual conference of Swiss Proteome society (Montreux, Switzerland, 2018); 8-я Всероссийская конференции «Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы», (г. Москва, Россия, 2017); 16th Human Proteome Organisation World Congress (Dublin, Ireland, 2017); 2-я международная конференция "Инновации в масс-спектрометрии: инструменты и методы (г. Москва, Россия, 2016); 64th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics (San-Antonio, USA, 2016)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них работ, опубликованных в рецензируемых научных изданиях, включённых в библиографические базы Scopus и Web of Science - 6.

Личный вклад автора

Автором обоснована актуальность проблемы определения изомерных структур аминокислотных остатков треонина в последовательностях пептидов, предложен и обоснован подход к решению проблемы, основанный на комбинации низкотемпературной фотодиссоциации и масс спектрометрии. Лично автором получены экспериментальные данные на модельных и природных пептидах, доказывающие применимость метода, а также разработаны программные ресурсы для обработки результатов, включая программы открытого доступа для контроля качества получаемых результатов. Кроме того, экспериментально продемонстрирована применимость модели «мобильного протона» для описания процессов фотодиссоциации пептидов, и в рамках данной модели описаны физико -химические механизмы, влияющие на разрыв пептидной связи, соседствующей с остатком треонина и его изомером. Также автором получены масс-спектрометрические данные по температурным зависимостям реакции модификации остатков метионина в буферных растворах различного состава. Для всех данных, полученных в рамках работы, автором была проведена соответствующая биоинформатическая обработка, а также статистический анализ полученных результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, формулировки основных результатов и выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 132 страницах и содержит 57 рисунков, 8 таблиц и библиографию из 287 наименований.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫМ ОБЗОР ПРЕДМЕТА ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Масс-спектрометрия.

Масс-спектрометрия (МС) является высокочувствительным аналитическим методом, способным предоставлять качественные и количественные данные о различных веществах, входящих в состав сложных смесей. Данный метод успешно применяется для решения широкого круга задач в различных областях науки, таких как физика, химия, биология, медицина, а также в смежных дисциплинах. В то время как первая работа по измерению отношения заряда электрона к его массе была сделана более ста лет назад в работах Томпсона, лишь в последние несколько десятков лет МС стала доступным и широко используемым методом анализа. Одним из основных толчков к применению МС для анализа сложных смесей высокомолекулярных соединений явилось создание высокопроизводительных масс-анализаторов высокого разрешения на основе орбитальной ионной ловушкой.

1.1.1 Электростатическая орбитальная ионная ловушка.

В 1999 году Александр Макаров презентовал новый тип масс-анализатора с использованием электростатического поля и преобразования Фурье - орбитальная ловушка, позже названная Орбитрэп (Orbitrap) [7]. Высокое разрешение (до 106 на 200 ш/£) и большой динамический диапазон (до 4 порядков) позволяют использовать такие приборы для анализа образцов высокой гетерогенности, таких как смеси белков. Отсутствие магнитного поля сделало электростатические орбитальные ловушки удобными в использовании и относительно недорогими в обслуживании.

Орбитальная ионная ловушка представляет собой центральный электрод специальной формы и опоясывающий внешний электрод, которые расположены на одной оси (Рис. 1.1).

г

Рисунок 1.1.Схематичное изображение электростатической орбитальной ловушки. Черной линией со стрелками показана траектория движения иона внутри ловушки.

РНРШНИЙ ЧЛРКТППЛ

внутренний электрод

г

Постоянное напряжение прикладывается к внутреннему электроду, что приводит к распределению электростатического потенциала, который может быть рассмотрен как сумма квадрупольного поля классической ионной ловушки и логарифмического поля цилиндрического конденсатора (1.1) [8].

В таком поле движение ионов складывается из двух независимых компонент -орбитального движение вокруг центрального электрода и одновременные колебания вдоль центральной оси электродов.

где 2 и г- цилиндрические координаты, ^-характеристический радиус,^- кривизна поля, а С -константа.

Аксиальная частота ионов(1.2)используется для измерения отношения массы к заряду, поскольку она не зависит от начальной скорости и траектории иона, в отличие от орбитального движения. Именно эта независимость позволяет получать высокое разрешение и точность измеряемых масс в орбитальной электростатической ловушке [9].

где ци ^представляют собой заряд и массу иона, соответственно.

Первый коммерческий прибор на основе орбитальной ионной ловушке был выпущен в 2005 году, что стало прорывом в панорамном протеомном анализе [10]. За последние 15 лет масс-спектрометры на основе орбитальной ионной ловушки развивались как в направлении улучшения разрешающей способности, так и скорости снятия масс-спектров [11]. Так, в настоящее время они позволяют измерять масс-спектры пептидов со скоростью до 40 спектров в секунду при разрешении 7500 и максимальным разрешением, достигающим в опытных образцах 106, что позволяет эффективно использовать их для анализа таких сложных биологических смесей, как протеолитические пептиды белковых экстрактов клеток [12]. В свою очередь, новые возможности анализа биологических объектов с использованием масс -спектрометров на основе орбитальной ионной ловушки привели к быстрому росту соответствующих публикаций (Рис. 1.2).

(11)

(12)

Рисунок 1.2. Ежегодное количество публикаций, содержащих слово "Orbitrap", в базе данных биомедицинских исследований (PubMed [13]). Абсолютные значения, вероятно, являются лишь небольшой частью публикаций, в которых используются инструменты на основе орбитальной ионной ловушки, поскольку часто указывается лишь конкретная модель инструмента.

Однако развитие МС в этой области связано не только с усовершенствованием масс-анализаторов, но и во многом с появлением методов «мягкой» ионизации высокомолекулярных биоорганических соединений.

1.1.2 Методы ионизации высокомолекулярных соединений, белков и пептидов.

Масс-спектрометрия является эффективным методом анализа, однако позволяет исследовать только с соединениями в ионизированном состоянии. Если говорить об анализе таких сложных нелетучих соединений, как, например, белки или пептиды, то одной из основных проблем является их ионизация и перевод газовую фазу без разрушения, так называемая «мягкая» ионизация.

Один из первых методов мягкой ионизации был основан на дериватизации различных групп в молекулах, однако подготовка пробы была очень трудоемкой и во многом зависела от образца, хотя несколько модифицированных методов инкорпорирования в молекулу химических групп с высоким сродством к протону продолжают использоваться для анализа некоторых специфических соединений [14-19]. В 1969 году Ганс Беккей предложил метод полевой ионизации, который заключается в использовании сильно неоднородного электрического поля и эмиттера специальной формы с нанесенным образцом [20,21]. Данный метод позволил исследовать различные высокомолекулярные соединения, такие как простые сахара, пептиды и различные углеводороды [22].

Растущий запрос со стороны биологических задач привел к появлению различных методов ионизации, таких как метод вторичных ионов [23], метод бомбардировки быстрыми атомами [24], ионизация в индуктивно-связанной плазме [25,26] и другие. Несмотря на то, что многие из этих методов используются и по сей день, настоящая революция в ионизации сложных биомакромолекул произошла в середине 80-хгодов прошлого века с изобретением методов ионизации электрораспылением (ИЭР) и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) [27,28]. Важность этих открытий была высоко оценена научным сообществом, и в 2002 г. Джон Фенн из Йельского университета и сотрудник фирмы Шимадзу Коичи Танака разделили Нобелевскую премию в области химии.

1.1.3 Ионизация электрораспылением.

Ионизация электрораспылением на сегодняшний день является одним из наиболее популярных методов, используемых для масс-спектрометрического анализа высокомолекулярных соединений [29], в первую очередь, белков и пептидов. Данный метод в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием был впервые продемонстрированв 1984 году группой из Йельского университета [30] и, параллельно, научным коллективом Института аналитического приборостроения АН СССР [31,32].

Помимо высокой эффективности и возможности прямого соединения с жидкостной хроматографией (см. раздел 1.4.2), одной из особенностей ИЭР является получение многозарядных ионов анализируемых веществ в случае белков и пептидов. При этом, так как максимальный заряд молекулы зависит от количества химических групп с высоким сродством к протону, то с повышением массы увеличивается и вероятность наблюдения более высоких зарядовых состояний соответствующего иона [33,34]. Несмотря на повышение сложности масс-спектров, связанное с появлением дополнительных пиков от распределения белков по зарядовым состояниям, эта особенность является, одновременно, и серьезным положительным фактором. Поскольку масс-анализатор детектирует величину отношения массы иона к его заряду, m/z, то повышение зарядового состояния позволяет измерять масс-спектры высокомолекулярных соединений в диапазоне сравнительно небольших значений m/z. В свою очередь масс-спектральные характеристики, такие как разрешающая способность и чувствительность растут при уменьшении m/z и такая особенность ИЭР существенно увеличивает диапазон доступных для анализа масс высокомолекулярных соединений. Так, например, 1995 году научному коллективу Ричарда Смита из Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории Министерства энергетики США удалось получить масс-спектры молекулярных ионов ДНК бактериофага Т4, молекулярная масса которой составляет более107Да, в зарядовом состоянии 35000 [35].

Общий принцип работы ИЭР и общепринятый в настоящее время механизм ионизации изображены на Рис.1.3. Поток жидкости с растворенным в ней анализируемым веществом прокачивается через вытянутый металлический или стеклянный капилляр диаметром порядка нескольких микрометров, находящийся под высоким напряжением порядка нескольких киловольт [29].

мкм

* ^—

раствор аналита * - + * + + -* * +* + ^__ Конус Тейлора

*

капилляр

+кВ

поток горячего газа

Кулоновский взрыв

J

"П

МС

Рисунок 1.3.Общая схема работы источника ионизации электрораспылением.

Раствор с анализируемым веществом на выходе из капилляра искривляется в так называемый конус Тейлора [36], который приводит к образованию заряженных капель размером несколько микрометров [37]. Каждая капля заряжена положительно благодаря наличию избыточных ионов (чаще всего протонов), которые могут как содержаться в растворе, так и появляться в результате электрохимических реакций. Заряженные капли поступают во входной капилляр системы транспорта масс-спектрометра, по мере движения в котором происходит испарение растворителя и уменьшение размера капель [38]. При этом, плотность заряда на каплях увеличивается до тех пор, пока кулоновское отталкиванием не превысит поверхностное натяжение (так называемый, Релеевский предел [39]). При дальнейшем уменьшении капли происходит так называемый кулоновский разрыв, который приводит к образованию капель меньшего размера. Процесс уменьшения и разрыва капель повторяется до полного испарения растворителя с образованием протонированных молекул анализируемого вещества.

1.2 Тандемная масс-спектрометрия.

Информация о точной массе молекулы может быть не всегда достаточно для её однозначной идентификации. Поэтому в случае высокомолекулярных соединений требуется дополнительные знания о составе изучаемой молекулы. Такая информация может быть получена методами тандемной масс-спектрометрии, при которой молекулярные ионы соединения сначала изолируются, затем фрагментируются, и после чего измеряются масс-

спектры фрагментов на второй стадии анализа [40]. Здесь и ниже мы будем называть масс-спектры молекулярных ионов (ионов-предшественников) спектрами первого уровня (МС1), а соответствующие им масс-спектры фрагментов - спектрами второго уровня (МС/МС). В общем случае, для получения МС/МС-спектров исходный ион анализируемого соединения выделяется, транспортируется в камеру, где происходит диссоциации с помощью того или ионного метода, а затем все продукты реакции транспортируются в масс-анализатор, где и записывается спектр фрагментов (Рис. 1.4). При этом, измерение спектров может происходит как последовательно в одном масс-анализаторе при использовании ионных ловушек (тандемная масс-спектрометрия «во времени»), так и в разных, помещенных внутрь одного инструмента (тандемная масс-спектрометрия «в пространстве») [41]. Спектры фрагментации специфичны по отношению к структуре анализируемых веществ, что дает возможность для их однозначной идентификации (см. ниже раздел 1.4.2).

m/z m/z

Рисунок 1.4.Схема тандемного масс-спектрометрического эксперимента с использованием орбитальной ионной ловушки. Запись спектров фрагментов может происходить в том же масс-анализаторе, что и запись спектров молекулярных ионов, или в другом (например, в ионной ловушке).

Тандемная масс-спектрометрия оказывается особенно эффективной при анализе высокомолекулярных гетерополимерных соединений, состоящих из небольшого числа известных мономеров как, например, белковых и пептидных молекул, состоящих из набора двадцати природных аминокислот соединенных пептидной связью [42,43]. Существует несколько возможных методов разрыва пептидной цепи в газовой фазе, приводящих к образованию ионов фрагментов [44]. Согласно общепринятой терминологии фрагменты называется в зависимости от того, какая из связей разорвалась и где остался заряд (Рис. 1.5) [45,46].

Рисунок 1.5.Номенклатура фрагментов, получающихся при разрыве полипептидной цепи. Если после разрыва связи заряд локализован наК-концевой (левой) части молекулы, то соответствующие фрагменты называются а-, Ь- и с-типа. В противном случае - х-, у- и г-типа.

Наиболее распространенным методом является диссоциация, активированная соударением (ДАС), которая происходит при столкновении ионов с молекулами буферного газа (аргона, гелия или азота) [47]. Помимо ДАС часто используется диссоциация, протекающая при переносе или захвате электрона (ДПЭ или ДЗЭ), при которой происходит экзотермическая реакция рекомбинации электрона и положительно заряженного иона (чаще всего протона) с последующим разрывом пептидной связи [48,49]. В качестве переносчика электронов используются полициклические ароматические углеводороды такие как флюоронтен или антрацен [50]. Также стоит отметить диссоциацию, индуцируемую поверхностью [51]. В этом методе часть кинетической энергии ионов при столкновении с твердой поверхностью мишени преобразуется во внутреннюю, что приводит к фрагментации [52]. Как правило, эффективность преобразования энергии составляет от 10 до 30%, причем более эффективным оказывается использовании поверхностей с фторированным монослоем [53]. В последнее время активно развиваются методы на основе фотодиссоциации, в которых энергия поглощенного фотона приводит к возбуждению молекулы и её последующей фрагментации [54]. Выделяют два основных метода в зависимости от длины волны используемого излучения - фотодиссоциация ультрафиолетовым излучением (ФДУФ) [55] и инфракрасная мультифотонная диссоциация (ИКМФД) [56].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Соловьева Елизавета Михайловна, 2021 год

• |

800

900

1000

Рисунок 3.10. (А) Экспериментальный и (Б) предсказанный спектр фрагментации, активированной соударениями, двухзарядного пептида с аминокислотной последовательностью DNIQGITKPAIR. Интенсивности ионов указаны в процентах от наиболее интенсивного пика фрагмента Ь2 (230.08m/z).

Предсказанная относительная интенсивность фрагментов хорошо согласуется с экспериментально измеренными величинами. Однако в реальном масс-спектре присутствует больше пиков, чем в рассчитанном с помощью программы М82Р1Р. Данный факт связан в первую очередь с двухзарядными фрагментами, которые не учитываются при теоретическом предсказании спектра фрагментации. Поскольку для определения изомерной структуры остатков треонина используется соотношение интенсивностей четырех фрагментов, то для оценки точности предсказания вычислялась разница отношений характеристических фрагментов для теоретически предсказанного и экспериментально измеренного спектра ДАС:

О =

\КМБ2Р1Р-К Эксп\ КМБ2Р1Р

ДАС

(3.13)

где КмБ2Р1Ррассчитывается по формуле (3.7), а Я ДаСП по формуле (3.4) для спектров фрагментации ДАС.

На рисунке 3.11 показаны соответствующие отклонения предсказанных характеристических отношений от экспериментально измеренных для пептидов белков человека (таблица 3.1), содержащих аминокислотный остаток треонина.

Рисунок 3.11. Теоретически предсказанные характеристические отношения (ИМ52Р1Р , формула 3.7)и экспериментально измеренные (й , формула 3.4) в спектрах ДАС для пептидов белков человека (таблица 3.1), содержащих аминокислотный остаток треонина. Ошибка предсказания о была рассчитана по формуле (3.13) и указана в процентах.

Для всех пептидов за исключением одного отклонение не превышает 20%, в то время как теоретическое отношение для пептида №5 отклоняется от экспериментального более чем в два раза. Такое расхождение может быть связано с аминокислотной последовательностью данного пептида - TGHSLLHTLYGR, а именно с близостью аминокислотного остатка гистидина к изучаемой пептидной связи. Известно, что данный остаток значительно влияет на механизм и скорость реакции фрагментации при ДАС [276,277], что затрудняет предсказание интенсивностей фрагментов. Более того, поскольку гистидин одна из наиболее редких аминокислот в составе белков человека [278], то вероятно в данных, на которых тренировалась модель машинного обучения программы MS2PIP, было недостаточно пептидов, содержащих данный остаток.

Таким образом, использование теоретически предсказанных спектров для определения газофазной основности для данного пептида может приводить к некорректным результатам, с чем, вероятно, связано неправильное определение изомеров остатка треонина (рисунок 3.4).

со о

I-

5 4

пз

а. 3

-а

О)

I

<и 3

0

1

н О

• /• ЯэкслТ/изоТ */* Я^Т/ИЗОТ ▲

А/А Й-теор т/изот •

* • *•

*• • •

* • • * * * •

* * • • •

] 1 2 3 4 5 6

Название пары пептидов

Рисунок 3.12. Нормализованные теоретические (й , К ДЛрр) и экспериментальные (й ДЛр,) соотношения суммы фрагментов, соответствующих разрывам связей до и после остатка треонина/изотреонина, в изомерных парах пептидов белков человека (таблица 3.1). Для расчета

,ДЛР Теор

величины ЯДЛр вместо предсказанной величины ЙМ52Р/Р используется величина й

ДЛР

Теор,

полученная на основе экспериментально измеренного спектра ДАС пептида №5 с аминокислотным остатком треонина.

Однако некорректно рассчитанная величина Ям52Р1Р может быть заменена на

оДАС

характеристическое отношение к ^ксп, рассчитанное на основе экспериментального спектра ДАС этого пептида (шаг 3 на рисунке 3.3). Далее, подставляя это выражение в формулы (3.6) и (3.5), может быть рассчитана величина ИДА^, которая по смыслу совпадает с Я . Предсказанные таким образом величины оказываются близки к экспериментально измеренным отношениям в обоих пептидах пары №5(рисунок 3.12).

Таким образом, разработанный метод позволяет достоверно определить изомеры остатков треонина в пептидах произвольной аминокислотной последовательности на основе их спектров ФДУФ. Кроме того, созданный метод контроля качества спектров фрагментации позволяет оценивать надежность полученных результатов. При этом для повышения точности метода в случае заметного отклонения теоретических отношений характеристических фрагментов от экспериментальных данных может быть использован масс-спектр ДАС соответствующего пептида.

Представленные экспериментальные данные демонстрируют однозначную зависимость скорости реакции фотофрагментации от структуры остатка треонина в последовательностях пептидов. Однако, для определения причин этой зависимости необходимо выяснение фундаментальных механизмов реакции ФДУФ пептидов.

Глава 4. МЕХАНИЗМ ФОТОДИССОЦИАЦИЯ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ ИОНОВ ПЕПТИДОВ

Фотодиссоциация пептидов под воздействием ультрафиолетового излучения является сложным физико-химическим процессом, однако качественное описание влияния ионизирующего протона на процесс разрыва пептидной связи позволяет объяснить наблюдаемые различия в скорости реакции фотодиссоциации пептидов с изомерными остатками треонина [279].

4.1. Общие принципы процесса фотодиссоциации пептидов.

Реакция разрыва связей в ионах пептидов под воздействием излучения ультрафиолетового диапазона является специфичной по отношению к строению аминокислотных остатков, образующих полипептидную цепь. В частности, как было показано в предыдущих главах, при замене остатка треонина в последовательности пептида на изомерный остаток наблюдается повышении скорости реакции образования фрагментов Ь- и ^-типа, отвечающих разрыву С-концевой относительно остатка связи. Данный эффект не зависит от аминокислотной последовательности пептида и величина эффекта может быть предсказана на основе данных по фотофрагментации модельных пептидов. Следовательно, изменение скорости реакции является результатом непосредственного влияния положения гидроксильной группы в остатке треонина на процесс разрыва соседней пептидной связи. Для объяснения наблюдаемого эффекта необходимо понимание фундаментального механизма ФДУФ.

Несмотря на достаточно широкое практическое применение, достоверный механизм ФДУФ молекул пептидов на сегодняшний день не установлен. В общем случае поглощение фотона приводит к возбуждению молекулы и ее переход на более высокое электронное состояние (см. раздел 1.2.3). Из-за резонансного взаимодействие неподеленной электронной пары атома азота с ^-орбиталями карбонильной группы, пептидная связь обладает двумя молекулярными п-орбиталями (рисунок 4.1), которые могут возбуждаться при взаимодействие с излучением ультрафиолетового диапазона. При этом наблюдается п-п*переход. Далее, как правило, рассматриваются два возможных механизма диссоциации — быстрый, т. е. прямое пересечение возбужденного терма с диссоциативным, и медленный, протекающий с передачей энергии из возбужденного электронного состояния на колебательные уровни основного электронного состояния с последующим разрывом связи за счет избытка энергии.

Для реализации медленного механизма также существуют два варианта — после релаксации системы в основное электронное состояние энергия может перераспределиться

статистически по многим колебательным модам или же остаться в большей степени в колебательных модах возбужденных связей.

Рисунок 4.1.(А) Электронная конфигурация атомных орбиталей атомов углерода, кислорода и азота, участвующих в пептидной связи. Серым цветом показаны электроны, не участвующие в образовании пептидной связи. (Б) Схема связывающих и разрыхляющих молекулярных орбиталей пептидной связи.

Альтернативно, ряд авторов выступают в поддержку второго механизма, демонстрируя, что реакция разрыва полипептидной цепи между Са атомом и карбонильной группой является гомолитической [43]. Одним из подтверждений такой теории является нарушение изотопного распределения в группах ионов фрагментов а-типа, что подтверждает теорию радикального разрыва. Стоит отметить, что такие эксперименты проводились только с использованием F2 лазера с длиной волны 157 нм. Однако схожий эффект наблюдается и при фотодиссоциации ультрафиолетовым излучением с длинной волны 193 нм, которое используется в настоящей работе. На рисунке 4.2 приведен спектр фотофрагментации двухзарядного иона пептида DNIQGIKPAIR под действием лазерного излучения с длиной волны 193 нм, а также изотопное распределение одного из фрагментов а-типа (ац). В состав данного фрагмента входит 50 атомов углерода, и, зная среднюю частоту встречаемости изотопа углерода 13С в природе, можно

рассчитать вероятность для случайно выбранной молекулы иметь хотя бы один тяжелый атом углерода. Такая статистическая модель соответствует биномиальному распределению, и

вероятность Р™ того, что в п независимых испытаниях некоторое случайное событие наступит

ровно т, может быть рассчитана по формуле:

Рп = C™pmqn-m, (4.1)

ц = (42)

^т = п! (4.3)

п (п-т)\т\'

где р - вероятность наступления случайного события в каждом испытание.

Подставляя в формулы (4.1 - 4.3) значения п=50 и р = 1.07% можно рассчитать теоретическое отношение интенсивности моноизотопного пика к первому (т= 1), второму (т= 2) и третьему (т= 3) изотопным пикам (рисунок 4.2б и в). Как и в литературных данных, в исследуемом спектре фотофрагментации наблюдается значительное отклонение экспериментально наблюдаемого изотопного распределения от теоретического. В частности, интенсивность первого изотопного пика превышает интенсивность пика моноизотопного иона, в то время как согласно теории отношение вероятностей наблюдения молекулы с нулем и одним атомом 13С составляет 0.63. Такое расхождение может быть связано с гомолитической природой разрыва связи и образованием радикального фрагмента, отличающегося от классического фрагмента а-типа на один атомом водорода. Интересно, что соотношение обсуждаемых изотопов отличается для пептида с аминокислотным остатком треонина и изотреонина (рисунок 4.2б и в), однако, поскольку разрыв связи происходит на расстоянии четырех аминокислотных остатков от Т/изоТ, то наблюдаемый эффект является скорее результатом изменения пространственной структуры и не несёт в себе аналитического потенциала для определения изомеров остатков треонина.

Основными пиками в изучаемых спектрах фотофрагментации пептидов являются, однако, не высокоэнергетические фрагменты а-типа, которые, вероятно, являются продуктами прямого разрыва связи без перераспределения энергия, а фрагменты Ь- и ^-типов (рисунок 4.2а), которые наблюдаются в спектрах диссоциации при низких энергиях. Разрыв пептидной связи наиболее вероятно происходит после внутренний релаксации энергии по колебательным степеням свободы и поэтому, возможно, аналогичен процессам, наблюдаемым при диссоциации, активированной соударениями.

Рисунок 4.2.(А) Нормализованный на интенсивность иона-предшественника спектр фотофрагментации двухзарядного иона пептида DNIQGIKPAIR лазерным излучением с длиной волны 193 нм. Серым и красным цветом показаны двухзарядные ионы и фрагментыа-типа, соответственно. (Б) Экспериментальное и теоретическое изотопное распределение фрагмента ац пептида, содержащего аминокислотный остаток треонина и (В) изотреонина. Спектры нормализованы на максимальный пик в представленной области.

4.2. Общие принципы процесса диссоциации, активированной соударениями. Теория «мобильного протона».

Диссоциация, активированная соударениями, происходит при столкновении ускоренных ионов с молекулами газа (см. раздел 1.2.1). В этом методе разрыв связи происходит преимущественно между карбонильной и амидной группами пептидной цепи с образованием фрагментов Ъ-и ^-типов. Для объяснения механизма ДАС была предложена концепция «мобильного протона», которая заключается в непрерывной миграции протона, участвующего в ионизации молекулы, по цепи пептидных связей. Наличие такого протона значительно понижает энергетический барьер разрыва связи за счет образования переходного комплекса с

протонированным атомом азота амидной группы пептидной цепи (более подробно см. раздел 1.2.2).

Модель «мобильного протона» имеет множество как экспериментальных, так и теоретических подтверждений. Одним из наиболее ярких и показательных примеров является изменение масс-спектров фрагментации пептидов при замене ионизирующего протона на катионы щелочных металлов (Li+, Na+, и K+). Поскольку такие катионы обладает большей массой и радиусом по сравнению с протоном, то вероятность изменения их локализации в цепи аминокислотной последовательности заметно ниже, что приводит к значительным различиям спектров фрагментации аддуктов пептидов и их протонированных версий. Ранее такое сравнение проводилось для масс-спектров фрагментации натриевых и литиевых аддуктов пептидов различной длины и аминокислотного состава[280,281]. Было показано, что замена протона на ион металла приводит к существенному преобладанию специфического фрагмента [bn-i+OH+Cat]+ в спектрах, где Cat - катион соответствующего металла, а n — количество аминокислотных остатков в пептиде. Данные ионы формируются через переходное состояние, в котором катион металла взаимодействует с кислородом ближайшей карбонильной группы пептидной связи и инициирует нуклеофильную атаку, приводящую к отрыву С-концевого остатка в виде СО и имина (рисунок 4.3). При этом в получаемых спектрах отсутствуют классические фрагменты b- и ^-типов. Таким образом, кардинальное отличие продуктов реакции фрагментации протонированных пептидов и их аддуктов с катионами щелочных металлов, является прямым подтверждением теории «мобильного протона».

Рисунок 4.3. Схема образования фрагмента [Ь1+ОИ+Ы]+ дипептида ШЯ^ с катионом лития в процессе диссоциации, активированной соударениями. Ион лития стабилизируется карбонильной группой пептидной связи и С-концевой гидроксильной группой, активируя последнюю для нуклеофильной атаки пептидной связи. Адаптация рисунка из [280].

Помимо согласования теоретических расчетов с получаемыми экспериментальными данными, модель «мобильного протона» позволяет качественно объяснять зависимости

интенсивностей фрагментов от аминокислотной последовательности пептидов. Более того, в рамках данной модели удается объяснить влияния групп с высоким сродством к протону на скорость реакции диссоциации близлежащих связей.

Таким образом, использование данной концепции может помочь объяснить изменение скорости реакции разрыва пептидной связи под действием ультрафиолетового излучения при изменение положения гидроксильной группы в аминокислотном остатке треонина. Однако на сегодняшний день остается невыясненным вопрос о том, проходит ли реакция фотофрагментации через состояние промежуточного комплекса с переходом ионизирующего протона на атомы пептидной цепи (как это предполагается в модели «мобильного протона») или же поглощенной энергии достаточно для разрыва связи без реорганизации молекулы.

4.3. Фотодиссоциация ультрафиолетовым излучением натриевых аддуктов модельного пептида. Теория «мобильного протона».

Для определения роли мобильного протона в процессе ФДУФ ионов пептидов было проведено сравнение масс-спектров фрагментации протонированного модельного пептида PAATAAGSLGSLK и его комплексов с катионами натрия, в которых ион натрия замещает протон в качестве носителя заряда. Для получения комплексов в раствор пептида вместо муравьиной кислоты добавлялся иодид натрия. Поскольку в последовательности изучаемого пептида представлено две группы с высокой вероятностью протонирования (аминогруппа остатка лизина и №конца пептида), то основным пиком в масс-спектре является ион пептида с двумя протонами. При добавлении иодида натрия, появляется ион соответствующий комплексу пептида с протоном и катионом натрия, а также с двумя катиона натрия. Один из катионов натрия, вероятно, стабилизируется карбонильной группой пептидной связи и С-концевой гидроксильной группой, а другой гидроксильной группой остатка серина и карбонильной группой соседней пептидной связи (рисунок 4.4).

Рисунок 4.4. Фрагмент схемы структуры комплекса модельного пептида PAATAAGSLGSLK с двумя катионами натрия. На рисунке показаны три концевых аминокислотных остатка (^КК).

При этом интенсивность иона пептида с двумя катиона натрия оказывается практически на порядок ниже, чем протонированного пептида (рисунок 4.5). Такая разница может быть связана с напряжением связей и, следовательно, меньшей стабильностью натриевого комплекса, однако даже в этом случае сигнала иона-предшественника достаточно для получения спектров фотофрагментации высокого качества.

Рисунок 4.5. Нормализованные на интенсивность моноизотопного пика масс-спектры иона модельного пептида РААТАЛОБЬСЗЬК, несущего (А) два протона, (Б) один протон и один катион натрия и (В) два катиона натрия. Буквой I показана интенсивность моноизотопного пика.

Наличие катиона натрия может изменять пространственную конфигурацию пептида, однако происходит это локально вблизи С-конца пептида. Таким образом, благодаря относительно большому размеру (13 аминокислотных остатков) структура пептидных связей, удаленных от С-конца, должна оставаться практически неизменной. Таким образом, механизм процесса прямого разрыва пептидной связи (без участия заряда) под действием УФ излучения с длиной волны 193 нм должен оставаться неизменным.

На рисунке 4.6 показаны спектры фотофрагментации двухзарядного модельного пептида и двух его аддуктов с катионами натрием. Как отмечалось ранее, спектры ФДУФ протонированных пептидов обычно содержат множество фрагментов разных типов: помимо полных серий фрагментов b- и ^-типа также наблюдается значительное количество a-/x- и некоторое количество с-/г-фрагментов (рисунок 4.6а). Кроме того, присутствуют фрагменты с потерями воды (обозначены индексом «#») и внутренние фрагменты b-типа (обозначены индексом «int»), являющиеся результатом вторичной фрагментации.

Рисунок 4.6.Масс-спектры ФДУФ модельного двухзарядного пептида PAATAAGSLGSLK (M) с (А) двумя протонами,(Б) протоном и катионом натрия, и (В) двумя катионами натрия. Интенсивность нормирована на интенсивность максимального пика в масс-спектре. Фрагменты с потерями воды обозначены решеткой (#), внутренние фрагменты ¿-типа — индексом «int», двухзарядные ионы, несущие ион натрия и протон, показаны красным цветом, специфический фрагмент [bi2+OH+Na]2+ и фрагменты ^-типа, полученные из него в процессе вторичной фрагментации, обозначены синим цветом.

При замене одного протона на катион натрия спектр фрагментации значительно упрощается (рисунок 4.6б). Заметно возрастает интенсивность двухзарядных С-концевых фрагментов, таких как уп/пи Х11/12, которые практически отсутствовали в случае дважды протонированного пептида (красным цветом обозначены двухзарядные ионы с натрием и протоном). Данный эффект связан с напряжением С-концевых связей из-за присутствия катиона металла и, как следствие, с понижением барьера реакции разрыва соответствующей пептидной связи.

Помимо классических фрагментов также наблюдается интенсивный пик характерного двухзарядного иона [Ьп+ОИ+Ма]2+, который в значительной степени подвергается последующей фрагментации с образованием внутренних фрагментов у-типа (отмечены синим цветом на рисунке 4.6б). Поскольку ионизирующий протон изначально находится на №конце аминокислотной последовательности пептида, в спектрах фрагментации наблюдаются только легкие ^-концевые) фрагменты ¿-типа, интенсивность которых в среднем в три раза ниже, чем в случае дважды протонированного пептида. В спектре полностью отсутствуют Ь-/у-фрагменты, отвечающие разрыву связей в середине последовательности, однако есть несколько фрагментов а-типа, которые, как отмечалось выше, вероятно являются радикальными фрагментами, появляющимися в результате прямой диссоциации из возбужденного состояния. Таким образом, замена одного из мобильных протонов на менее подвижный катион натрия оказывает значительное влияние на спектр ФДУФ, особенно на формирование фрагментов Ь- и у-типа, которые, по всей видимости, являются продуктами реакции диссоциации с наименьшим энергетическим барьером, и, как следствие, протекающей с наибольшей скоростью.

В случае замены обоих мобильных протонов на катионы натрия в спектре фрагментации присутствуют только два характерных иона фрагментов, [Ь12+ОИ+2Ыа]2+ и [Ьц+ОИ+2Ма]2+ (рисунок 4.6в). Согласно литературным данным, такие фрагменты получаются вследствие реакций нуклеофильного замещения через переходные комплексы оксазолидина (вероятно в форме цвиттер-иона) и металлизированного ангидрида.

Поскольку все остальные каналы фрагментации являются энергетически недоступными из-за отсутствия мобильных протонов, интенсивность полученных фрагментов более чем на порядок превышает интенсивности фрагментов, соответствующих разрывам тех же связей (Ьц/у2 и Ь12/У1) в случае дважды протонированного пептида. Таким образом, наличие ионизирующего протона необходимо для эффективной ФДУФ пептидов. Данный факт согласуется с моделью «мобильного протона», предложенной для ДАС, и доказывает, что ФДУФ также протекает через переходный комплекс, образованный с участием протона. Кроме

того, получение характеристических фрагментов с ионами натрия и отсутствие разрывов всех остальных связей свидетельствуют в пользу медленного механизма протекания реакции ФДУФ. Стоит отметить, однако, что такой вывод расходится с некоторыми результатами, представленными в литературе. Так, в работе по ФДУФ белков утверждается, что теория «мобильного протона» не может быть использована для описания процесса разрыва связей в изучаемых молекулах [282]. Однако полученные авторами экспериментальные данные могут быть объяснены особенностями использованных методов, при учёте которых наблюдаемые зависимости не противоречат участию «мобильного протона» в процессе фотодиссоциации.

4.4. Теория «мобильного протона» в применении к фотодиссоциации пептидов и белков. Сравнение результатов.

В недавней работе [282] авторы изучали влияние основности первичных аминов на спектры ФДУФ и ДАС для шести различных белков (убиквитин, цитохром ^ миоглобин, супероксиддисмутаза, лизоцим и карбоангидраза). Поскольку группами с наибольшим сродством к протону в белках являются первичные амины, входящие в состав остатков аргинина и лизина, их наличие повышает энергию, необходимую для инициирования миграции ионизирующего протона по цепи пептидных связей. Другими словами, протон оказывается «запертым» на этих остатках, что приводит к возрастанию пороговой энергии фрагментации. Понижение основности первичных аминов приводит к уменьшению энергии их связи с протоном, а, следовательно, к повышению мобильности ионизирующего протона. Таким образом, с помощью химической модификации остатков лизина (например, карбамилирования) можно изучать влияние мобильности протона на спектры фрагментации. Данный подход и был продемонстрирован в работе [282], основной вывод которой заключается в незначительной роли мобильного протона в процессе ФДУФ, что расходится с экспериментальными данными, представленными в настоящей работе. Стоит отметить, что хотя экспериментальные условия в работах схожи (такие как длина волны и мощность УФ излучения, концентрация изучаемых молекул и растворителя, метод ионизации и тип масс-анализатора), объекты исследования значительно различаются по массам. Однако, поскольку число поглощенных фотонов пропорционально количеству абсорбирующих центров (т. е. количеству пептидных связей), то энергии, приходящиеся на одну связь, остаются сравнимыми, и увеличение размера полипептидной цепи практически не влияет на механизм фотофрагментации.

Основное же различие в выводах связано с различными подходами к изменению мобильности ионизирующего протона. Замена протона на ион натрия позволяет исключить из системы мобильный протон как таковой, в то время как химическая модификация

аминокислотных остатков лишь частично увеличивает мобильность протона. Кроме того, сродство к протонуу аргинина значительно выше, чем у лизина, что приводит к заметным различиям во влиянии этих аминокислотных остатков на спектры фотодиссоциации. В частности, наличие аргинина в последовательности пептида приводит к тому, что ионизирующий протон оказывается «запертым» на этом остатке, и наблюдается так называемый «кислотный эффект» (см. раздел 1.2.2). В свою очередь наличие остатков лизина в последовательности пептида никак не влияет на интенсивность фрагментов после остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот. Таким образом, стадия инициации миграции мобильного протона, локализованного на остатке лизина, не является лимитирующей в реакции разрыва пептидной связи. Другими словами химическая модификация лизина, приводящая к понижению его основности, может не иметь выраженного влияния на спектры фрагментации пептидов.

Кроме того, в обсуждаемой работе изучалось влияние карбамилирования белков на спектры ДАС. Основное отличие спектров фрагментов белков до химической модификации и после заключаются в уменьшении количества наблюдаемых фрагментов. Однако, согласно теории мобильного протона, при уменьшении энергии связи ионизирующего протона с молекулой и, как следствие, при повышении вероятности формирования переходного комплекса с переносом протона на пептидную связь, выход реакции диссоциации должен возрастать. Данное противоречие объясняется авторами работы повышением вероятности вторичной фрагментации, поскольку из-за возрастания мобильности ионизирующего протона реакция диссоциации происходит быстрее. После разрыва пептидной связи у фрагментов есть возможность получения дополнительной энергии в столкновениях, что приводит к последующей фрагментации. В случае ДАС время нахождения молекул в столкновительной камере обычно составляет 10-50 мс, в то время как длительность импульса лазера составляет 5 нс. Таким образом, при ФДУФ у фрагментов нет возможности получения дополнительной энергии (т. е. поглощения еще одного фотона) для дальнейшей диссоциации, а вероятность поглощения нескольких фотонов единовременно достаточно мала. Исходя из этого, вторичная фрагментация маловероятна вне зависимости от скорости реакции диссоциации, что может объяснить отсутствие изменения спектров ФДУФ при понижении основности белков.

Рассмотренные выше объяснения наблюдаемых в работе [282] зависимостей не противоречат модели «мобильного протона», а вместе с представленными в настоящей работе данными подтверждают тот факт, что фотодиссоциация ионов пептидов под воздействием УФ излучения происходит с участием мобильного протона. Таким образом, несмотря на высокую энергию фотона с длиной волны 193 нм, которая превышает среднюю энергию пептидной

связи, прямая диссоциация из электронно-возбужденного состояния является маловероятным процессом, а разрыв связи происходит из колебательно-возбужденного состояния основного электронного уровня молекулы через образование переходного комплекса с участием ионизирующего протона.

4.5. Объяснение эффекта зависимости скорости реакции фотодиссоциации от структуры остатка треонина в рамках теории «мобильного протона».

Основным отличием в процессах фотодиссоциации пептидов, содержащих аминокислотный остаток треонина и изотреонина, является значительно изменение эффективность фрагментации С-концевой относительно остатка пептидной связи. Поскольку данный эффект не зависит от состава пептида, то он, вероятно, обусловлен расположением гидроксильной группы на боковой цепи остатка треонина, которая в случае изотреонина находится дальше от пептидной связи. При этом, поскольку азот пептидной связи смещает электронную плотность с атома водорода, то последний может образовывать водородные связи с атомом кислорода гидроксильной группы боковой цепи остатка (рисунок 4.7а). При этом в случае треонина такая связь будет более вероятна. Данный вывод также согласуется с результатами расчёта структур, обладающих наименьшей внутренней энергий, для частного случая трипептида ATN и его изомера с остатком изотреонина [5]. Альтернативно, поскольку атом азота также обладает неподеленной электронной парой, возможно возникновение водородной связи между атомом водорода гидроксильной группы боковой цепи остатка треонина и атомом азота амидной группы пептидной связи (рисунок 4.7б).

Рисунок 4.7.Структура аминокислотного остатка треонина в последовательности пептида. Красным, синим, серым и светло серым показаны атомы кислорода, азота, углерода и водорода, соответственно. Голубой пунктир соответствует водородным связям между (А) кислородом гидроксильной группы боковой цепи треонина и водородом пептидной связи, и (Б) водородом гидроксильной группы боковой цепи треонина и атомом азота пептидной связи.

Как было показано выше, для процесса фотодиссоциации пептидной связи необходим перенос ионизирующего протона. В соответствии с моделью «мобильного протона» процесс фрагментации пептида начинается с протонирования амидной группы в пептидной связи (см. раздел 1.2.2).Участие амидного азота в водородной связи снижает вероятность образования такого переходного комплекса за счет делокализации электронной плотности. Более того, как известно, водородные связи способствуют транспорту протонов в белковых молекулах[283], таким образом, даже в случае образования протонированного атома азота вероятность переноса протона на атомы боковой цепи треонина будет выше, чем в случае изотреонина.

Поскольку образование конкретных водородных связей во многом зависит от пространственной структуры всей молекулы, а наблюдаемый эффект не зависит от аминокислотного состава изученных пептидов, то возможна более простая альтернативная модель влияния изомеров остатка треонина на процесс фотодиссоциации. Наличие дополнительной электроотрицательной группы рядом с пептидной связью (гидроксильной группы боковой цепи треонина) может понижать вероятность локализации ионизирующего протона вблизи атома азота для инициирования фрагментации (рисунок 4.8).

Рисунок 4.8. Схематическое изображение возможных локализаций мобильного протона в пептидах с остатками треонина и изотреонина.

При этом, как и в случае образования водородных связей, понижается вероятность образования переходного комплекса с протонированной амидной группой, что приводит к понижению эффективности диссоциации пептидной связи, которая и наблюдается в эксперименте. Таким образом, представленная в этой главе качественная модель механизма фотодиссоциации пептидов на основе концепции «мобильного протона», позволяет теоретически обосновать наблюдаемые экспериментально различия в масс-спектрах ФДУФ пептидов с изомерными остатками изотреонина.

Глава 5. ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ОСТАТКОВ ИЗОТРЕОНИНА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОТЕОГЕНОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Возникновение структурного изомера треонина в аминокислотных последовательностях природных белков является результатом побочной химической реакции в процессе подготовки пробы к масс-спектрометрическому анализу. В частности, стадия алкилирования свободных тиольных групп в белках приводит к множеству различных модификаций, в том числе, вероятно, к превращению остатка метионина в остаток изотреонина [284]. Такая химическая модификация является особенно не желательной при совместных геномных и протеомных исследованиях, направленных на обнаружение однонуклеотидных полиморфизмов, которые изменяют белковый продукт гена [260]. Изучение механизма этой реакции, а также зависимости уровня модификации от условий проведения реакции алкилирования, позволит оптимизировать процесс подготовки белковой пробы для протеогеномных исследований.

5.1. Реакция алкилирования свободных тиольных групп в белках. Модификация остатков метионина.

Треонин является одной из девяти незаменимых для человека аминокислот и входит в состав большинства белков всех живых организмов. Данная аминокислота имеет два хиральных центра и может существовать в виде 4 стереоизомеров, однако только два из них распространены в природе. При этом ее структурный изомер (изотреонин/гомосерин), отличающийся положением гидроксильной группы, хотя и является важным соединением для различных биохимических процессов, не входит в состав белков живых организмов. Однако изотреонин может наблюдаться при анализе белков методами протеомики «снизу - вверх» (см.раздел 1.4). Появление остатков изотреонина в последовательности природных белков связано с процессом подготовки пробы для хромато-масс-спектрометрического анализа. В частности, одним из основных этапов получения пептидной смеси является стадия дериватизации свободных тиольных групп для предотвращения замыкания S-S связей в белковых молекулах (см.раздел 1.4.1).

Наиболее распространенным реагентом, используемым на данном этапе подготовки пробы, является йодацетамид (ИАА), алкилирующий атомы серы в боковых цепях остатков цистеина. Однако, поскольку атом серы входит в состав ещё одной природной аминокислоты, возможны реакция ИАА с аминокислотным остатком метионина. Стоит отметить, что скорость такой реакции будет ниже, чем основной, так как в случае метионина необходимо заместить метильную группу, а не водород (рисунок 5.1).

Рисунок 5.1. Химическая формула серосодержащих аминокислот (А) цистеина и (Б) метионина.

В процессе нуклеофильной атаки атомом серы возможно образование нестабильной сульфониевой соли остатка метионина (рисунок 5.2) с последующим превращением в более стабильные соединения. Например, известна реакция образования карбоксиметилсульфониевой соли метионина при добавлении йодацетата, с последующим превращением в S-карбоксиметил-гомоцистеин и изотреонин [257].

Рисунок 5.2. Общая химическая формула сульфониевого катиона остатка метионина.

Поскольку йодацетамид представляет собой йодацетат с замененной гидроксильной группой на амидную группу, то вероятно подобная двухстадийная реакция может происходить и при взаимодействии ИАА с остатками метионина при проведении реакции алкилирвоания свободных тиольных групп остатков цистеина (рисунок 5.3). Данное предположение было высказано в более ранних работах, где была продемонстрирована возможность химической модификации остатков метионина с последующим превращением в остатки изотреонина в процессе подготовки пробы для классического хромато-масс-спектрометрического анализа [5]. Однако для подтверждения обсуждаемого механизма реакции необходимо исследовать зависимость количества получаемых продуктов (остатков изотреонина) от концентрации ИАА и условий проведения реакции.

Модельная система для изучения механизма реакции получения остатков изотереонина в пробе природных белков должна быть достаточно простой и стандартизированной, чтобы можно было однозначно интерпретировать результаты и следить за уровнем продукта, но в то же время достаточно близкой к реальным пробам. Таким объектом может служить, например, гидролизат очищенного белка, полученный при проведении всех классических стадий подготовки проб - восстановления дисульфидных связей, алкилирования свободных тиольных групп и последующего ферментативного гидролиза (см.раздел 1.4.1). При этом хотя бы несколько полученных пептидов должны содержать остатки метионина, быть хорошо ионизуемыми и иметь удобную для детектирования длину из 7 - 20 аминокислотных остатков. Всем указанным требованиям соответствует белок бычьего сывороточного альбумина (БСА), который и был выбран в качестве модельной системы.

Рисунок 5.3.Схема двухстадийной реакции превращения остатка метионина в остаток изотреонина под действием йодацетамид через промежуточное соединение карбоамидометилсульфониевую соль метионина.

5.2. Реакция превращение остатков метионина в остатки изотреонина под действием йодацетамида в пептидах белка бычьего сывороточного альбумина.

Белок БСА представляет собой глобулярный белок плазмы крови, состоящий из 607 аминокислотных остатков, пять из которых являются метионинами. Согласно одной из наиболее обширных баз тандемных масс-спектрометрических данных peptideAtlas [285] только

три из пяти остатков метионина наблюдаются в классических протеомных экспериментах. Последовательность и массы соответствующих триптических пептидов, а также общее число экспериментов в базе данных, в которых эти пептиды были идентифицированы, представлены таблице 5.1. Поскольку белок БСА является хорошо изученным модельным объектом в биохимических исследованиях и имеет три хорошо детектируемых пептида, содержащих остаток метионина, то его триптический гидролизат был выбран для изучения реакции химического превращения остатков метионина в остатки изотеронина в процессе подготовки пробы.

Классический процесс подготовки белковой пробы для хромато-масс-спектрометрического анализа состоит из трех стадий - восстановления дисульфидных связей дитиотреитолом (ДТТ), затем алкилирование свободных тиольных групп с использованием ИАА, и непосредственно ферментативный гидролиз с использованием трипсина (более подробно см. раздел 1.4.1).

Таблица 5.1. Экспериментально наблюдаемые согласно базе данных PeptideAtlas [285] триптичсекие пептиды белка БСА, содержащие остаток метионина. Название пептида представляет собой порядковый номер остатка метионина в последовательности белка.

Название Последовательность # наблюдений, PeptideAtlas Масса, Да

MШ ETYGDMADCCEK 21 1363.47

M571 TVMENFVAFVDK 23 1398.69

M469 MPCTEDYLSLILNR 23 1666.81

Как обсуждалось выше, модификация метионина может происходить на стадии алкилирования пробы, поэтому необходимо исследовать зависимость степени превращения остатков метионина в остатки изотреонина от концентрации ИАА. Однако, помимо трех исследуемых пептидов, белок БСА имеет более 30 других триптических пептидов, поэтому для достоверного детектирования малых концентраций продуктов необходимо, во-первых, использовать хроматографическое разделение, а во-вторых, таргетный метод масс-спектрометрического анализа (см. раздел 1.4.2). Основным преимуществом таргетного метода является то, что прибору заранее задаётся список масс ионов, которые нужно изолировать и фрагментировать, с помощью чего удаётся избежать детектирования ионов, не являющихся целью анализа. Таким образом, проводя гидролиз белка БСА при разных условиях и анализируя

получившуюся смесь пептидов таргетным хромато-масс-спектрометрическим методом, можно измерять кинетические характеристики реакции модификации метионина. Общая схема анализа, соответствующие этапы и экспериментальные условия приведены на рисунке 5.4.

Сухой очищенный белок БСА разводился в буферном растворе 50 мМ гидрокарбоната аммония до концентрации 1 мкг/мкл. Далее в смесь добавлялся восстанавливающий агент ДТТ до концентрации 10 мМ, после чего образец нагревался до 60°С в течение 30 минут. Реакция алкилирования проводилась в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут при пяти различных концентрациях ИАА от 10мМ до 50 мМ. Затем в смесь добавлялся фермент трипсин в соотношении 1:100 к исходному белку. После 15 часов гидролиза при температуре 37°С, реакция останавливалась добавлением муравьиной кислоты, смесь пептидов очищалась и высушивалась. Непосредственно перед анализом пептиды разводились в 2% смеси ацетонитрила и воды и разделялись в течение часа с использованием обращено-фазовой хроматографии на нанопотоковой хроматографической системе высокого давления (Thermo Easy-nLC, Thermo Scientific). Детектирование пептидов осуществлялось с помощью масс-спектрометра с орбитальной ионной ловушкой (Orbitrap Velos Pro, Thermo Scientific).

Рисунок 5.4.Общая схема анализа реакции модификации остатков метионина в пептидах белка бычьего сывороточного альбумина методами таргетной хроматомасс-спектрометрии.

На рисунке 5.5а приведена хроматограмма полного ионного тока гидролиза белка БСА. Видно, что смесь состоит из достаточно большого количества высокоинтенсивных пептидов, большинство из которых не содержат остатки метионина. Более того, интересующие нас пептиды имеют достаточно низкую относительную интенсивность, так, например, хроматограмма ионного тока на выделенной массе пептида М571 (таблица 5.1) на три порядка ниже, чем хроматограмма полного ионного тока (рисунок 5б). Однако таргетный метод детектирования позволяет достоверно идентифицировать и квантифицировать даже вещества с относительно низкими концентрациями.

Рисунок 5.5. (А) Хроматограмма полного ионного тока гидролиза белка БСА. (Б) Хроматограмма ионного тока на выделенной массе двухзарядного пептида, содержащего метионин (М571, таблица 5.1). (В) Хроматограмма ионного тока на выделенной массе двухзарядного модифицированного пептида (isoT571, таблица 5.2).

Под действием алкилирующего реагента остатки метионина в изучаемых пептидах могут превращаться в остатки изотреонина, при этом масса таких пептидов будет изменяться

соответственно на разницу масс данных аминокислотных остатков (таблица 5.2.). Поскольку гидрофобность метионина и изотеронина отличаются, то время элюирования модифицированного пептида также будет изменяться. Например, максимум хроматограммы ионного тока на выделенной массе пептида М571 приходится на 53 минуту анализа, в то время как максимум элюирования его модифицированной версии isoT571 составляет 44 минуты (рисунок 5.5в).

Для однозначной идентификации пептида в сложных смесях точной массы молекулярного иона может быть недостаточно. Более того, для подтверждения протекания реакции модификации метионина необходимо установление наличия остатка изотреонина в конкретном месте изучаемого пептида. Поэтому для определения аминокислотной последовательности пептидов на заранее определенных массах (таблица 5.1 и 5.2) снимались спектры фрагментации, активированной соударениями.

Таблица 5.2. Аминокислотная последовательность и масса модифицированных пептидов белка БСА. Отношение массы к заряду (m/z) экспериментально наблюдаемых молекулярных ионов модифицированных пептидов. Все остатки цистеина карбамидометилированы.

Название Последовательность Масса, Да m/z

isoT111 ETYGDisoTADCCEK 1333.48 724.77

isoT571 TVisoTENFVAFVDK 1368.69 685.35

isoT469 isoTPCTEDYLSLILNR 1636.81 847.92

На рисунке 5.6 приведены примеры спектров фрагментации пептидов М571 и isoT571, полученные в таргетном анализе гидролизата белка БСА. В случае обоих пептидов покрытие последовательности составляет практически 100%, при этом ионы обоих b- и ^-типов подтверждают наличие остатков метионина в исходном пептиде и остатка изотреонина в модифицированном пептиде. Для двух других изучаемых пептидов аналогичны образом были идентифицированы остатки метионина и изотреонина в природных и модифицированных версиях пептидов, соответственно.

# 100-jT t

§ 80-

m

s

и

60 -

X

s к

га 40л ш

5 20-

0

1 О

£ 100-.о"

? 80-m

U

f 60т

л ионы b-ИОНЫ y- типа А

t 1 F А J V „ F < N

м

1 1 1 II 1 Iii 1 1 Ii 1 1 1 1 1 1 Ii 1 II 1 1 1 Ii I i 1 i II 1 1 hll

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

m/z

40

g 20 о

6 0

ионы Ь-типа Б

, T E V F , N ионы у-типа E T

V ,

(

II Uli ll 1 1 Hill 1 1 i! и I Ii il! i 1 Ii 1 1 И 1 II 1 1 Hill 1 1 i

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 m/z

Рисунок 5.6. Масс-спектр фрагментации, активированной соударениями, пептидов M571 и isoT571 (таблица 5.1 и 5.2). Цветом показаны ионы фрагменты и соответствующие расстоянию между ними аминокислоты.

Количество пептида было рассчитано как площадь под соответствующим хроматографическим пиком на основе масс-спектров первого уровня (степень ионизации при этом полагалась одинаковой). Предполагая, равенство стехиометрических коэффициентов метионина и изотреонина в реакции модификации пептида (рисунок 5.3), а также пренебрегая побочными реакции, количество продуктов определяется следующим образом:

NIsoT = UM>0 - NM, (51)

гдеЫщ,о и Ыщ количество пептида с метионином в начале и конце реакции, соответственно. Степень превращения пептида метионина в такой реакции будет равно:

^ _ nM,Q-nM (5.2)

ЛМ = ~ ,

NM,o

Далее, исходя из формул (5.1) и (5.2), а также предполагая, что исходное количества пептида с остатком метионина представляет собой сумму количества соответствующего пептида с

изотреонином и оставшегося после реакции пептида с метионином, степень превращения может быть рассчитана следующим образом:

—

(5.3)

где количество вещества N заменено на площадь S под хроматографическим пиком соответствующего пептидного кластера в масс-спектре первого уровня.

Для пяти образцов, которые соответствуют проведению реакции алкилирования при разных концентрациях ИАА, были рассчитаны степени превращения (формула 5.3) трех пептидов, содержащих остатки метионина (таблица 5.1). Зависимость степени превращения остатков метионина в пептидах от концентрации алкилирующего реагента представлена на рисунке 5.7. При концентрациях ниже 20 мМ не наблюдается значительной модификации остатков метионина за время проведения реакции, однако, при небольшом увеличении концентрации ИАА до 30 мМ, от 23 до 45 процентов метионин содержащих пептидов подвержены химической модификации.

сг

о; ^

х

ш

н

го о.

т си о. с

.0 I

ш

с ф

н

и

100 80 60 40 20 0

10

1 • М469 • М111

• М571

т

20 30 40

Концентрация ИАМ, мМ

50

Рисунок 5.7. Степень превращения аминокислотных остатков метионина в изотреонин (формула 5.3) для трех пептидов белка БСА (таблица 5.1) в зависимости от концентрации йодоацетамида, используемой на стадии алкилирования образца (рисунок 5.4). Реакция алкилирования проводилась в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре.

Таким образом, остатки метионина в природных белках действительно могут подвергаться химической модификации в процессе подготовки пробы с последующим превращением в остатки изотреонина. Более того, данная реакция происходит на стадии алкилирования смеси и зависит от концентрации йодоацетамида. Начиная с некоторого значения концентрации ИАА (20 мМ) данная зависимость близка к линейной, однако величина степени превращения различна для различных пептидов, что может быть связано как с пространственной структурой, так и с активностью фермента трипсина по отношению к различным сайтам гидролиза.

5.3. Тепловой эффект и влияние буферного раствора на кинетику реакции превращения остатков метионина в остатки изотреонина.

Реакции алкилирования смеси белков всегда проводится после стадия восстановления дисульфидных связей, которая обычно происходит при повышенных температурах. Таким образом, несмотря на то, что сама реакция алкилирования не требует повышенной температуры, реакционная смесь может оставаться нагретой. Кроме того, для уменьшения время подготовки пробы к анализу, реакция алкилирования может проводиться вместе с реакций восстановления S-S связей при повышенных температурах [286]. Для установления характера влияния температуры на скорость превращения остатков метионина в остатки изотреонина были проведены эксперименты при повышенной температуре алкилирования (95 °С). Аналогично экспериментам, представленным в пункте 5.2, концентрация ИАА варьировалась в пределах от 10 мМ до 50 мМ, и для каждого анализа рассчитывалась степень превращения остатков метионина в трех пептидах (рисунок 5.8).

При повышении температуры реакции наблюдается увеличение концентрации продукта реакции (пептидов с изотреонином). Более того, изменяется характер зависимости степени превращения остатков метионина от концентрации ИАА - наблюдается резкое увеличение, с последующим насыщением. Стоит отметить, что при концентрации ИАА 10 мМ количество продукта реакции (пептидов с изотреонином) ниже предела обнаружения даже при повышенных температурах. Таким образом, максимально допустимая концентрация ИАА не вызывающая значительного превращения остатков метионина в остатки изотреонина уменьшается в два раза по сравнению с реакции алкилирования, проводимой при комнатной температуре.

£

о; ^

т.

си

та

а.

со

си

о.

с

.а I

си с

си I-

и

100 80 60 40 20 0

• М469 • М111 т = 95°С ^---------

• М571

10 20 30 40

Концентрация ИАМ, мМ

50

Рисунок 5.8. Степень превращения аминокислотных остатков метионина в изотреонин (формула 5.3) для трех пептидов белка БСА (таблица 5.1) в зависимости от концентрации йодоацетамида, используемой на стадии алкилирования образца. Реакция алкилирования проводилась в темноте в течение 30 минут при температуре 95 °С.

Помимо температуры также может варьироваться буферный раствор, используемый при проведении реакции алкилирования. Поскольку для последующего ферментативного гидролиза с использованием трипсина необходим основный рН (максимум активности наблюдается при pH = 8 [287]), гидрокарбонатные буферы являются наиболее часто используемыми, в частности гидрокарбонат аммония и гидрокарбонат триэтиламмония (ТЕАВ). На рисунке 5.9 представлена зависимость степени превращения остатков метионина от концентрации ИАА при комнатной и повышенной температурах при проведении всех стадий подготовки пробы в буферном растворе ТЕАВ.

Использование буферного раствора ТЕАВ снижает уровень модификации остатков метионина по сравнению с гидрокарбонатом аммония. Тем не менее, при концентрациях ИАА выше 20 мМ в обоих случаях наблюдается значительное количество пептидов с изотреонином. Таким образом, использование ТЕАВ в качестве буферного раствора, а также проведение реакции алкилирования при низких температурах является предпочтительным и помогает снизить скорость побочной реакции модификации метионина. Однако даже при таких условиях небольшая часть остатков метионина подвергается воздействию и превращается в изотреонин.

10 20 30 40 50 10 20 30 40 50

Концентрация ИАМ, мМ Концентрация ИАМ, мМ

Рисунок 5.9. Степень превращения аминокислотных остатков метионина в изотреонин (формула 5.3) для трех пептидов белка БСА (таблица 5.1) в зависимости от концентрации йодоацетамида. Реакция алкилирования проводилась в буферном растворе гидрокарбоната триэтиламмония в течение 30 минут при (А) комнатной температуре и (Б) 95 °С.

Низкий процент модификаций может быть незначителен для панорамных исследований совокупности всех белков клетки, но оказывается критически важным в протеогеномных исследованиях при изучении отдельных событий генетически обусловленной замены аминокислотных остатков в белках при различных заболеваниях, в частности онкологических (см.раздел 1.4.4. и 1.4.5).

Таким образом, изучаемая проблема химической модификации остатка метионина и его превращение в остаток изотреонина на стадии подготовки пробы играет важную роль во многих областях биологии и медицины, где применяется масс-спектрометрическая идентификация белков. Предложенные в настоящей работе способы идентификации изоформы остатка треонина в последовательности пептида могут позволить не только получать дополнительную структурную информацию, но и отличить химическую модификацию от генетической мутации остатков метионина и треонина.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Продемонстрирована возможность использование метода фотодиссоциации ультрафиолетовым излучением в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения для установления структуры аминокислотных остатков треонина в последовательностях пептидов. Найдены специфические фрагменты b- и y-типа, соответствующие разрыву пептидных связей по обе стороны от остатка треонина/изотреонина в последовательностях, и экспериментально получены величины отношений этих фрагментов для всех природных аминокислотных остатков.

2. Предложен и протестирован метод, позволяющий определять структуру остатков треонина в последовательностях пептидов, а также оценивать качество получаемых спектров фотодиссоциации, и, как следствие, уровня достоверности результатов. Применимость метода показана на наборе пептидов, аминокислотная последовательность которых соответствуют природным белкам человека.

3. Показана применимость модели «мобильного протона» для описания влияния ионизирующего протона на процесс фотодиссоциации пептидов. Получены экспериментальные данные по фотодиссоциации комплексов пептидов с катионами щелочного металла (натрия), подтверждающие предложенную модель, в рамках которой было объяснено отличие скоростей реакций разрыва пептидных связей под действием ультрафиолетового излучения для пептидов с различными изомерами остатков треонина.

4. Установлена причина возникновения остатков изотреонина при проведении хроматомасс-спектрометрического анализа белков клеток живых организмов. На примере белка бычьего сывороточного альбумина показано, что широко используемая реакция алкилирования тиольных групп может приводить к химической модификации остатков метионина с их последующим превращением в остатки изотреонина. Исследованы температурные зависимости данной реакции в различных буферных растворах, и рассчитаны предельно допустимых концентрации реагентов, не приводящие к возникновению остатков изотреонина.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МС -Масс-спектрометрия

ИЭР - Метод ионизации электрораспылением

МС-спектр - Масс-спектр первого уровня (ионов предшественников)

МС/МС-спектр - Масс-спектр второго уровня (ионов фрагментов)

ДАС - Диссоциация, активированная соударением

ДПЭ - Диссоциация, протекающая при переносе электрона

ДЗЭ - Диссоциация, протекающая при захвате электрона

УФ - Излучение в ультрафиолетовом диапазоне

ФДУФ - Фотодиссоциация ультрафиолетовым излучением

ИКМФД - Инфракрасная мультифотонная диссоциация

Теория РРКМ - Теория Райса - Рамспергера - Касселя - Маркуса

Спектроскопия ЯМР - Спектроскопия ядерно-магнитного резонанса

ВЭЖХ - Высокоэффективная жидкостная хроматография

ППМ -Поисковая протеомная машина

ОАЗ - Одноаминокислотная замена

ОПО - Оптический параметрический осциллятор

ИАА - Йодацетамид

ДТТ -Дитиотреитол

Белок БСА - Белок бычьего сывороточного альбумина ТЕАВ -Гидрокарбонаттриэтиламмония

CnHCOK^HTEPATYPM

1. Nesvizhskii A.I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies // Nature Methods. — 2014. — V.11. — N.11. — P. 1114-1125.

2. Karpova M.A., Karpov D.S., Ivanov M. V., Pyatnitskiy M.A., Chernobrovkin A.L., Lobas A.A., Lisitsa A. V., Archakov A.I., Gorshkov M. V., Moshkovskii S.A. Exome-driven characterization of the cancer cell lines at the proteome level: The NCI-60 case study // Journal Of Proteome Research. — 2014. — V.13. — N.12. — P. 5551-5560.

3. Ivanov M. V., Lobas A.A., Karpov D.S., Moshkovskii S.A., Gorshkov M. V. Comparison of False Discovery Rate Control Strategies for Variant Peptide Identifications in Shotgun Proteogenomics // Journal Of Proteome Research. — 2017. — V.16. — N.5. — P. 1936-1943.

4. Moshkovskii S.A., Ivanov M. V., Kuznetsova K.G., Gorshkov M. V. Identification of Single Amino Acid Substitutions in Proteogenomics // Biochemistry (Moscow). — 2018. — V.83. — N.3. — P. 250-258.

5. Chernobrovkin A.L., Kopylov A.T., Zgoda V.G., Moysa A.A., Pyatnitskiy M.A., Kuznetsova K G., Ilina I.Y., Karpova M.A., Karpov D.S., Veselovsky A. V., Ivanov M. V., Gorshkov M. V., Archakov A.I., Moshkovskii S.A. Methionine to isothreonine conversion as a source of false discovery identifications of genetically encoded variants in proteogenomics // Journal Of Proteomics. — 2015. — V.120. — P. 169-178.

6. Kopysov V., Makarov A., Boyarkin O. V. Colors for Molecular Masses: Fusion of Spectroscopy and Mass Spectrometry for Identification of Biomolecules // Analytical Chemistry. — 2015. — V.87. — N.9. — P. 4607-4611.

7. Makarov A. Electrostatic Axially Harmonic Orbital Trapping : A High-Performance Technique of Mass Analysis // Anal. Chem. — 2000. — V.72. — N.6. — P. 1156-1162.

8. Gillig K.J., Bluhm B.K., Russell D.H. Ion motion in a Fourier transform ion cyclotron resonance wire ion guide cell // International Journal Of Mass Spectrometry And Ion Processes. — 1996. — V.157-158. — N.4. — P. 129-147.

9. Perry R.H., Cooks R.G., Noll R.J. Orbitrap mass spectrometry: Instrumentation, ion motion and applications // Mass Spectrometry Reviews. — 2008. — V.27. — N.6. — P. 661-699.

10. EDITORIAL. The path of biomolecular mass spectrometry into open research // Nature Communications. — 2019. — V.10. — N.1. — P. 4029.

11. Makarov A. Orbitrap journey: taming the ion rings // Nature Communications. — 2019. — V.10. — N.1. — P. 3743.

12. Hecht E.S., Scigelova M., Eliuk S., Makarov A. Fundamentals and Advances of Orbitrap Mass Spectrometry // Encyclopedia of Analytical Chemistry. — 2019. — P. 1-40.

13. Agarwala R., Barrett T., Beck J., Benson D.A., Bollin C., Bolton E., Bourexis D., Zbicz K., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information // Nucleic Acids Research. — 2018. — V.46. — N.D1. — P. D8-D13.

14. Kiryushkin A.A., Gorlenko V.A., Agadzhanyan T.E., Rosinov B. V., Ovchinnikov Y.A., Shemyakin M.M. Mass spectrometric determination of the amino acid sequence in cystine- and cysteine-containing peptides // Experientia. — 1968. — V.24. — N.9. — P. 883-885.

15. Zaikin V.G., Halket J.M. Derivatization in Mass Spectrometry—8. Soft Ionization Mass

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

Spectrometry of Small Molecules // European Journal Of Mass Spectrometry. — 2006. — V. 12.

— N.2. — P. 79-115.

Van Berkel G.J., Quirke J.M.E., Tigani R.A., Dilley A.S., Covey T.R. Derivatization for Electrospray Ionization Mass Spectrometry. 3. Electrochemically Ionizable Derivatives // Analytical Chemistry. — 1998. — V.70. — N.8. — P. 1544-1554.

Wang D.X., Fang S.A., Wohlhueter R.M. N-Terminal Derivatization of Peptides with Isothiocyanate Analogues Promoting Edman-Type Cleavage and Enhancing Sensitivity in Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry Analysis // Analytical Chemistry. — 2009.

— V.81. — N.5. — P. 1893-1900.

Perez-Riverol Y., Sanchez A., Noda J., Borges D., Carvalho P.C., Wang R., Vizcaino J.A., Betancourt L., Ramos Y., Duarte G., Nogueira F.C., Gonzalez L.J., Padron G., Tabb D.L., Hermjakob H., Domont G.B., Besada V. HI-bone: a scoring system for identifying phenylisothiocyanate-derivatized peptides based on precursor mass and high intensity fragment ions // Analytical Chemistry. — 2013. — V.85. — N.7. — P. 3515-3520.

Halket J.M., Waterman D., Przyborowska A.M., Patel R.K.P., Fraser P.D., Bramley P.M. Chemical derivatization and mass spectral libraries in metabolic profiling by GC/MS and LC/MS/MS // Journal Of Experimental Botany. — 2005. — V.56. — N.410. — P. 219-243.

Beckey H.D. Field desorption mass spectrometry: A technique for the study of thermally unstable substances of low volatility // International Journal Of Mass Spectrometry And Ion Physics. — 1969. — V.2. — N.6. — P. 500-502.

Röllgen F.W. Principles of Field Desorption Mass Spectrometry (Review). — 1983. 2-13 p.

Winkler H.U., Beckey H.D. Field desorption mass spectrometry of peptides // Biochemical And Biophysical Research Communications. — 1972. — V.46. — N.2. — P. 391-398.

Benninghoven A., Sichtermann W.K. Detection, identification, and structural investigation of biologically important compounds by secondary ion mass spectrometry // Analytical Chemistry.

— 1978. — V.50. — N.8. — P. 1180-1184.

Танцырев Г.Д., Николаев Е.Н. Образование кластеров при ионной бомбардировке пленок замороженных полярных веществ. // Письма В ЖЭТФ. — 1971. — V.13. — P. 473-477.

Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry: Introduction to Analytical Aspects // Clinical Biochemist Reviews. — 2019. — V.40. — N.3. — P. 115-133.

Gray A.L., Date A.R. Plasma source mass spectrometry of inorganic samples - recent developments of the technique // International Journal Of Mass Spectrometry And Ion Physics.

— 1983. — V.46. — P. 7-10.

Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T., Matsuo T. Protein and polymer analyses up tom/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry // Rapid Communications In Mass Spectrometry. — 1988. — V.2. — N.8. — P. 151-153.

Karas M., Bachmann D., Bahr U., Hillenkamp F. MATRIX-ASSISTED ULTRAVIOLET LASER DESORPTION OF NON-VOLATILE COMPOUNDS // International Journal Of Mass Spectrometry And Ion Processes. — 1987. — V.78. — P. 53-68.

Wilm M. Principles of Electrospray Ionization // Molecular & Cellular Proteomics. — 2011. — V.10. — N.7. — P. M111.009407.

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

Yamashita M., Fenn J.B. Electrospray ion source. Another variation on the free-jet theme // The Journal Of Physical Chemistry. — 1984. — V.88. — N.20. — P. 4451-4459.

Александров М.Л., Галль Л.Н., Краснов Н.В., Николаев В.И., Шкуров В.А. Электрогидродинамический ввод жидких веществ в масс-спектрометр // ЖТФ. — 1984.

— V.54. — N.8. — P. 1559-1571.

Александров М.Л., Галль Л.Н., Краснов Н.В., Николаев В.И., Шкуро В.А. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении - новый метод масс-спектрометрического анализа // ДАН СССР. — 1984. — V.277. — N.2. — P. 379-383.

Schnier P.D., Gross D.S., Williams E.R. On the maximum charge state and proton transfer reactivity of peptide and protein ions formed by electrospray ionization // Journal Of The American Society For Mass Spectrometry. — 1995. — V.6. — N.11. — P. 1086-1097.

Iavarone A.T., Jurchen J.C., Williams E.R. Effects of solvent on the maximum charge state and charge state distribution of protein ions produced by electrospray ionization // Journal Of The American Society For Mass Spectrometry. — 2000. — V.11. — N.11. — P. 976-985.

Chen R., Cheng X., Mitchell D.W., Hofstadler S.A., Wu Q., Rockwood A.L., Sherman M.G., Smith R.D. Trapping, Detection, and Mass Determination of Coliphage T4 DNA Ions by Electrospray Ionization Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry // Analytical Chemistry. — 1995. — V.67. — N.7. — P. 1159-1163.

Taylor G.I. Disintegration of water drops in an electric field // Proceedings Of The Royal Society Of London. Series A. Mathematical And Physical Sciences. — 1964. — V.280. — N.1382. — P. 383-397.

Konermann L., Ahadi E., Rodriguez A.D., Vahidi S. Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization // Analytical Chemistry. — 2013. — V.85. — N.1. — P. 2-9.

Banerjee S., Mazumdar S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte // International Journal Of Analytical Chemistry. — 2012. — V.2012. — P. 1-40.

Rayleigh, Lord. On the equilibrium of liquid conducting masses charged with electricity // The London, Edinburgh, And Dublin Philosophical Magazine And Journal Of Science. — 1882. — V.14. — N.87. — P. 184-186.

Lin L., Lin H., Zhang M., Dong X., Yin X., Qu C., Ni J. Types, principle, and characteristics of tandem high-resolution mass spectrometry and its applications // RSC Advances. — 2015. — V.5. — N.130. — P. 107623-107636.

Amorim Madeira P.J., Helena M. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies // Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles.

— 2012. 794 p.

Aebersold R., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics // Nature. — 2003. — V.422. — N.6928. — P. 198-207.

Coon J.J., Syka J.E.P., Shabanowitz J., Hunt D.F. Tandem Mass Spectrometry for Peptide and Protein Sequence Analysis // BioTechniques. — 2005. — V.38. — N.4. — P. 519-523.

Sleno L., Volmer D.A. Ion activation methods for tandem mass spectrometry // Journal Of Mass Spectrometry. — 2004. — V.39. — N.10. — P. 1091-1112.

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

Roepstorff P., Fohlman J. Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides // Biological Mass Spectrometry. — 1984. — V.11. — N.11. — P. 601-601.

Chu I.K., Siu C.-K., Lau J.K.-C., Tang W.K., Mu X., Lai C.K., Guo X., Wang X., Li N., Xia Y., Kong X., Oh H. Bin, Ryzhov V., Turecek F., Hopkinson A.C., Siu K.W.M. Proposed nomenclature for peptide ion fragmentation // International Journal Of Mass Spectrometry. — 2015. — V.390. — P. 24-27.

Olsen J. V., Macek B., Lange O., Makarov A., Horning S., Mann M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis // Nature Methods. — 2007. — V.4. — N.9. — P. 709-712.

Zubarev R.A., Horn D.M., Fridriksson E.K., Kelleher N.L., Kruger N.A., Lewis M.A., Carpenter B.K., McLafferty F.W. Electron Capture Dissociation for Structural Characterization of Multiply Charged Protein Cations // Analytical Chemistry. — 2000. — V.72. — N.3. — P. 563-573.

Zubarev R. Protein primary structure using orthogonal fragmentation techniques in Fourier transform mass spectrometry. — 2006. — P. 251-261.

Kim M.-S., Pandey A. Electron transfer dissociation mass spectrometry in proteomics // PROTEOMICS. — 2012. — V.12. — N.4-5. — P. 530-542.

Cooks R.G., Ast T., Mabud M.A. Collisions of polyatomic ions with surfaces // International Journal Of Mass Spectrometry And Ion Processes. — 1990. — V.100. — P. 209-265.

Dongre A.R., Somogyi A., Wysocki V.H. Surface-induced Dissociation: An Effective Tool to Probe Structure, Energetics and Fragmentation Mechanisms of Protonated Peptides // Journal Of Mass Spectrometry. — 1996. — V.31. — N.4. — P. 339-350.

Danell R.M., Glish G.L. A new approach for effecting surface-induced dissociation in an ion cyclotron resonance mass spectrometer: A modeling study // Journal Of The American Society For Mass Spectrometry. — 2000. — V.11. — N.12. — P. 1107-1117.

Brodbelt J.S. Photodissociation mass spectrometry: new tools for characterization of biological molecules // Chem. Soc. Rev. — 2014. — V.43. — N.8. — P. 2757-2783.

Ly T., Julian R.R. Ultraviolet Photodissociation: Developments towards Applications for Mass-Spectrometry-Based Proteomics // Angewandte Chemie International Edition. — 2009. — V.48.

— N.39. — P. 7130-7137.

Little D P., Speir J.P., Senko M.W., O'Connor P.B., McLafferty F.W. Infrared Multiphoton Dissociation of Large Multiply Charged Ions for Biomolecule Sequencing // Analytical Chemistry. — 1994. — V.66. — N.18. — P. 2809-2815.

Nielsen M.L., Savitski M.M., Zubarev R.A. Improving Protein Identification Using Complementary Fragmentation Techniques in Fourier Transform Mass Spectrometry // Molecular & Cellular Proteomics. — 2005. — V.4. — N.6. — P. 835-845.

Coon J.J. Collisions or Electrons? Protein Sequence Analysis in the 21st Century // Analytical Chemistry. — 2009. — V.81. — N.9. — P. 3208-3215.

March R.E. Ion Trap Mass Spectrometers // Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry.

— 1999. — P. 1000-1009.

Marzluff E.M., Beauchamp J.L. Large Ions: Their Vaporization, Detection and Structural

Analysis. — 1996. 200 p.

61. McCormack A.L., Dongre A.R., Wysocki V.H., Somogyi A. Fragmentation of Protonated Peptides: Surface-Induced Dissociation in Conjunction with a Quantum Mechanical Approach // Analytical Chemistry. — 1993. — V.65. — N.20. — P. 2859-2872.

62. Somogyi A., Wysocki V.H., Mayer I. The effect of protonation site on bond strengths in simple peptides: Application of Ab initio and modified neglect of differential overlap bond orders and modified neglect of differential overlap energy partitioning // Journal Of The American Society For Mass Spectrometry. — 1994. — V.5. — N.8. — P. 704-717.