Определение и анализ пространственной структуры рибосомного белка L1 из бактерии Thermus thermophilus в комплексе с фрагментом матричной РНК при разрешении 2,6Å тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Волчков, Сергей Александрович

• Волчков, Сергей Александрович
• кандидат физико-математических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Волчков, Сергей Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ.-2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНА ЧЕНИЙ.

Введение.

Глава 1. Обзор литературных данных.

1.1.Основные методы рентгеноструктурного анализа макромолекул.

1.2. Молекулярное замещение.

1.2.1. Метод максимального правдоподобия и его применение в задачах молекулярного замещения.

1.2.1.1. Правдоподобие функции вращения.

1.2.1.2. Функция правдоподобия для трансляции.

1.2.1.3. Усиленные функции правдоподобия.

1.2.1.4. Phaser - программа для решения задач молекулярного замещения методом максимизации правдоподобия.

1.3 Уточнение структуры макромолекул.

1.3.1. Проблема переопределенности задачи кристаллографического уточнения.

1.3.2. Уточнение с ограничениями ("constraints" и "restraints").

1.3.3. Достоверность кристаллографического уточнения.

1.3.4. Критерии оценки качества атомной модели.

1.3.4.1. Стандартный кристаллографический R-фактор.

1.3.4.2. Rfee как критерий оценки качества модели в процессе уточнения.

1.3.5. Улучшение фаз методом модификации плотности с использованием"сошрЫе cross-validation".

1.3.6 Уточнение максимизацией правдоподобия.

1.3.7. Схемы и программы уточнения. t 1.3.7.1. Программа CNS.

Глава 2.Эксперименталъная часть.

2.1. Общая характеристика комплекса рибосомного белка L1 с фрагментом мРНК.

2.2. Получение и кристаллизация комплекса TthLl-мРИК.

2.3. Сбор и анализ дифракционных данных.

2.4. Решение фазовой проблемы и построение модели.

2.4.1. Построение стартовой поисковой модели.

2.4.2. Позиционирование модели в независимой части элементарной ячейки и расчет фаз.

2.4.3. Построение и уточнение модели.

Глава 3. Результаты и обсуждение.-573.1. Общая характеристика кристаллической структуры комплекса TthLl-мРНК.-573.1.1. Структура рибосомного белка TthLl в комплексе TthLl-мРНК.

3.1.2. Структура 38-нуклеотидного фрагмента мРНК в комплексе TthLl-мРНК.

3.1.3. РНК-белковые взаимодействия в составе комплекса TthLl-мРНК.

3.2. Сравнительный анализ структуры комплекса TthLl-мРНК и известных структур белка L1 в РНК-связанном и свободном состояниях.

3.2.1. Сравнение структур белка TthLl в связанном с мРНК и свободном состоянии.

3.2.2. Сравнение структуры белка L1 из комплекса TthLl-мРНК с известными структурами белка L1 из различных организмов.

3.2.3. Две конформации белка TthLl. Белок TthLl должен принять открытую конформацию, чтобы связаться с РНК.

3.2.4. Сравнение регуляторных и рибосомного комплексов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение и анализ пространственной структуры рибосомного белка L1 из бактерии Thermus thermophilus в комплексе с фрагментом матричной РНК при разрешении 2,6Å»

Проблема регуляции экспрессии генов является одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии. Экспрессия многих генов регулируется на уровне трансляции. Сбалансированный синтез рибосомных белков в бактериях и археях осуществляется именно этим способом [1, 2, 3, 4]. Гены рибосомных белков объединены в опероны и продукт одного из генов может репрессировать свой собственный синтез и синтез белков того же оперона. Белок-регулятор преимущественно встраивается в рибосомную РНК, но при избыточном синтезе он связывается со специфическим участком в молекуле своей мРНК и мешает ее трансляции в рибосоме. Полагают, что для ряда рибосомных белков этот регуляторный связывающий участок на мРНК структурно подобен соответствующему участку связывания белка-репрессора на рРНК. Сродство белка к рРНК больше, чем к мРНК, что позволяет использовать механизм конкурентного связывания для регуляции синтеза белков данного оперона.

Исследования, посвященные выявлению деталей механизмов регуляции синтеза на уровне трансляции, интенсивно ведутся в течение достаточно длительного времени. Несмотря на то, что накоплен большой объем информации, полученной, в основном, биохимическими и генетическими методами, структурные детали этого механизма пока изучены плохо. Ранее были получены только структуры некоторых рибосомных белков-регуляторов в комплексе с фрагментами рибосомной РНК [9, 10, 11, 16] и в составе структуры рибосомы. Но поскольку конкурентный механизм регуляции синтеза основан на различии в сродстве белка-репрессора к рРНК и мРНК, для выяснения структурных основ регуляции необходимо также получение структуры комплекса этих белков с фрагментами мРНК.

Целью данной работы было получение кристаллической структуры комплекса рибосомного белка L1 из экстремально-термофильной бактерии Thermus thermophilus со специфически связывающимся 38-нуклеотидным фрагментом мРНК из археи Methanococcus vannielii, анализ взаимодействия компонентов комплекса и выявление структурных основ механизма регуляции синтеза этого белка.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Обзор литературы посвящен современным методам кристаллографии макромолекул. Подробно описаны метод молекулярного замещения, который использовался для определения структуры данного комплекса, последние достижения в усовершенствовании этого метода, а также вычислительные методы, алгоритмы и программы, использующиеся для уточнения структуры макромолекул.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Волчков, Сергей Александрович

Основные результаты и выводы.

1. Определена и уточнена с разрешением 2.6 А структура гибридного регуляторного комплекса рибосомного белка L1 из бактерии Thermus thermophilus с 38-нуклеотидным фрагментом мРНК из археи Methanococcus vannielii. Показано, что плотный контакт с мРНК образует только домен I белка L1, домен II в связывании мРНК практически не участвует.

2. Показано, что в комплексе взаимное положение доменов соответствует открытой конформации, найденной в архейных белках L1, тогда как в свободном белке домены находятся в закрытой конформации.

3. Проведен сравнительный анализ структуры белка L1 из комплекса TthLl-мРНК с известными структурами белков L1 из разных организмов, в связанном с РНК и свободном состоянии. Показано, что в области РНК-белкового контакта имеется структурно инвариантный участок, образованный строго консервативными остатками. Выдвинуто предположение, что этот участок может быть ответственным за узнавание РНК белком L1.

4. Показано, что более высокое сродство белка L1 к рРНК по сравнению с мРНК, необходимое для регуляции синтеза этого белка с использованием механизма конкуренции вызвано дополнительными связями домена II этого белка с петлей В 23 S рРНК, которая отсутствует в мРНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Волчков, Сергей Александрович, 2006 год

1. Kraft A., Lutz С., Lingenhel A., Grobner P. and Piendl W. Control of ribosomal protein LI synthesis in mesophilic and thermophilic archaea. Genetics, 1999, 152, 1363-1372.

2. Gourse R., Sharrock R. & Nomura M. Regulation of the synthesis of ribosomal components. Springer, New York, 1986, 766-788.

3. Kohrer C., Mayer C., Neumayr 0., Grobner P., & Piendl W. Interaction of ribosomal LI proteins from mesophilic archaea and bacteria with specific LI-binding sites on 23S rRNA and тША.Еиг. J. Biochem, 1998, 256, 97-105.

4. Nomura M., Yates J.L., Dean D., Post L.E. Feedback regulation of ribosomal protein gene expression in Escherichia colt structural homology of ribosomal RNA and ribosomal protein mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 7084-7088.

5. Nevskaya N., Tishchenko S, Fedorov R., Al-Karadaghi S., Liljas A., Kraft A., Piendl W., Garber M., Nikonov S. Archael ribosomal protein LI: the structure provides new insights into RNA binding of the LI protein family. Structure, 2000, 8,363-371.

6. Unge J., Al-Karadaghi S., Liljas A., Jonsson B.-H., Eliseikina I., Ossina N., Nevskaya N., Fomenkova N., Garber M., Nikonov S. A mutant form of the ribosomal protein LI reveals conformation flexibility. FEBS Letters, 1997, 411, 53-59.

7. Nikulin A., Eliseikina I., Tishchenko S., Nevskaya N., Davydova N., Platonova 0., Piendl W., Selmer M., Liljas A., Drygin D., Zimmermann R., Garber M., Nikonov S. Structure of the LI protuberance in the ribosome. Nature Str. Biol., 2003, 10,104-108.

8. Perederina A., Nevskaya N., Nikonov 0., Nikulin A., Dumas P., Yao M., Tanaka I., Garber M., Gongadze G. and Nikonov S. Detailed analysis of RNA-protein interactions within the bacterial ribosomal protein L5/5S rRNA complex. RNA, 2002, 8, 1-10.

9. Невская H., Никонов О., Ревтович С., Гарбер М. и Никонов С. Идентификация РНК-узнающих модулей на поверхностях рибосомных белков. Мол. Биол., 2004, 38, 789-798.

10. Merianos H.J., Wang J. & Moore P.B. The structure of a ribosomal protein S%/spc operon mRNA complex. RNA, 2004,10, 954-964.

11. Tishchenko S.V., Nikulin A., Fomenkova N.P., Nevskaya N., Nikonov 0., Dumas P., Moine H., Ehresmann В., Ehresmann C., Piendl W., Lamzin V., Garber M., and

12. Nikonov S. Detailed analysis of RNA-protein interactions within the ribosomal protein S8-rRNA complex from the archaeon Methanococcus jannaschii. J. Mol. Biol., 2001, 311,311-324.

13. Green D., Ingram V. & Perutz M.F. The structure of haemoglobin. IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proc. R. Soc., 1954, A225, 287-307.

14. Blow D.M. & Crick F.H.C. The Treatment of Errors in the Isomorphous Replacement Method. Acta Cryst., 1959,12, 1195-1202.

15. Hendrickson W.A. Determination of macromolecular structures from anomalous diffraction of synchrotron radiation. Science, 1991, 254, 51-58.

16. Perutz M.E. Isomorphous Replacement and Phase Determination in oncentrosymmetric Space Groups. Acta Cryst., 1956, 9, 867-873.

17. Rossmann, M.G. The Molecular Replacement Method. // Gordon &Breach, 1972, New York, London, Paris.

18. Patterson A.L. (1934), Phys. Rev., 46, 372.

19. Brunger A.T. Patterson Correlation Searches and Refinement. // Methods in Enzymology, Academic Press, 1997, 276, 558-580.

20. Navaza J. & Saludjian P. AMoRe: An Automated Molecular Replacement Program Package. // Methods in Enzymology, Academic Press, 1997, 276, 581-594.

21. Navaza J. Implementation of molecular replacement in AMoRe. Acta. Cryst., 2001, D57, 1367-1372.

22. Vagin A., Teplyakov. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst, 1997, 30, 1022-1025.

23. Pannu N.S. & Read R.J. Improved structure refinement through maximum likelihood. Acta Cryst., 1996, A52,659-668.

24. McCoy A.J., Storoni L.C. and Read R.J. Simple algorithm for a maximum-likelihood SAD function. Acta Cryst., 2004, D60, 1220-1228.

25. R.J. Read. Pushing the boundaries of molecular replacement with maximum likelihood. A eta Cryst., 2001, D57, 1373-1382.

26. L.C. Storoni, A.J. McCoy & R.J. Read. Likelihood-enhanced fast rotation functions. Acta Cryst., 2004, D60,432-438.

27. McCoy A.J., Grosse-Kunstleve R.W., Storoni L.C. & Read R.J. Likelihood-enhanced fast translation functions. Acta Cryst., 2004, D61,458-464.

28. McCoy A. J. Liking Likelihood. Acta Cryst., 2004, D60, 2169-2183.

29. Bricogne, G. (1992). Proceedings of the CCP4 Study Weekend. Molecular replacement, edited by W. Wolf, E.J. Dodson & S Gover, 62-75.

30. G. Bricogne. Bayesian Statistical Viewpoint on Structure Determination : Basic Concepts and Examples. Methods in Enzymology, 1997, 276, Chapter 23, pp. 361-423, Academic Press.

31. Rossmann M.G. & Blow D.M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Cryst., 1962,15,24-31

32. Drenth J. Principles of Protein X-ray Crystallography. Springer-Verlag New-York, 1994.

33. Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol, 1968, 33, 491-497.

34. Kantardjieff K.A. and Rupp B. Matthews coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science, 2003,12: 1865-1871.

35. Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst., 1994, D50, 760-763.

36. Konnert J.H. A restrained-parameter structure-factor least-squares refinement procedure for large asymmetric units. Acta Cryst., 1976, A32,614-617.

37. Hendrickson W.A., Konnert J.H. Incorporation of stereochemical information into ciystallographic refinement. Intern.Winter School on Ciyst.Computing, Bangalore, India, 1980.

38. Sussman J.L., Holbrook S.R., Church G.M., Kim S.-H. A structure-factor least-square refinement procedure for macromolecular structures using constrained and restrained parameters. Acta Cryst., 1977, A33, 800-804.

39. Sussman J.L. Constrained-resntained least-squares (CORELS) refinement of proteins and nucleic acids. Methods in Enzymology, Academic Press, 1985,115,271-303.

40. G.Jack A., Levitt M. Refinement of large structures by simultaneous minimization of energy and R factor. Acta Cryst., 1978, A34,931-935.

41. Agarwal R.C. A new least-square refinement technique based on the fast Fourier transforn algorithm. Acta Cryst., 197?, A34,791-809.

42. Brunger A.T., Kuriyn J., Karplus M. Crystallographic R factor refinement by molecular dynamics. Science, 1987, 235,458-460.

43. Brunger A.T., Karplus M., Petsko G.A. Crystallographic refinement' by simulated annealing: application to crambin. Acta Cryst., 1989, A45,51-61.

44. Kuriyn J., Brunger A.T., Karplus M. X-ray refinement of protein structures by simulated annealing: test of method on myohemerythrin. Acta Cryst., 1989, A45, 396409.

45. Brunger A.T., Krukovski A., Erickson J.W. Slow-cooling protocol for crystallographic refinement by simulated annealing. Acta Cryst., 1990, A46,585-593.

46. Jones T.A., Zou J.Y., Cowan S.W., Kjeldgaard M. Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst., 1991, A47,110-119.

47. Dodson E. Report of workshop on validation of macromolecular structures solved by X-ray analysis. Joint CCP4 and ESF-EACBM newsletter on protein crystallography, 1995, 31,51-57.

48. Ramachandran G.N., Ramakrishnan C., Sasisekharan V. Stereochemistry of polypeptide chain configurations. J.Mol. Biol., 1963, 7, 95-99.

49. Briinden СЛ., Jones T.A. Between objectivity and subjectivity. Nature, 1990, 343, 687-689.

50. Kleywegt G.J., Jones T.A. Braille for pugilists. Proceedings of the CCP4 Study Weekend, 1995, 6-7 January, p. 11-23.

51. Laskowski R.A., MacArthur M.W., Moss D.S., Thornton, J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J.Appl.Cryst., 1993, 26,283-291.

52. Watkin D. The control of difficult refinements. Acta Cryst, 1994, D50,411-437.

53. Brunger A.T. X-PLOR, Version 3.1. A system for X-ray Crystallography and NMR. New Haven, CT, Yale University Press, 1992.

54. Brunger A.T. Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures. Nature, 1992, 355,472-475.

55. Brunger A.T. Assessment of phase accuracy by cross validation: the free R value. Methods and applications. Acta Cryst., 1993, D49,24-36.

56. Rossmann M.G., Blow D.M. Determination of phases by the conditions of non-crystallographic symmetry. Acta Cryst., 1963,16,39-45.

57. Zhang K.Y.J., Main P. Histogram matching as a new density modification technique for phase refinement and extension of protein molecules. Acta Cryst., 1990, A46, 4146.

58. Lunin V.Yu., Urzhumtsev A.G., Skovoroda T.P. Direct low-resolution phasing from electron-density histograms in protein crystallography. Acta Cryst., 1990, A46, 540544.

59. Lunin V.Yu. Electron density histograms and the phase problem. Acta Cryst., 1993, D49, 90-99.

60. Lunin V.Yu., Skovoroda T.P. Frequencies-restrained structure factor refinement. I. Histogram simulation. Acta Cryst., 1991, A47,45-52.

61. Lunin V.Yu., Vernoslova E.A. Frequencies-restrained structure factor refinement. II. Comparison of methods. Acta Cryst., 1991, A47,238-243.

62. Cowtan K.D., Main P. Improvement of macromolecular electron-density maps by the simultaneous application of real and reciprocal space constraints. Acta Cryst., 1993, D49, 148-157.

63. Xiang S., Carter C.W.Jr, Bricogne G., Gilmore C.J. Entropy maximization constrained by solvent flatness: a new method for macromolecular phase extension and map improvement. Acta Cryst., 1993, D49, 193-212.

64. Schevitz R.W., Podjarny A.D., Zwick M., Hugkes J.J., Sigler P.B. Improving and extending the phases of medium- and low- resolution macromolecular structure factors by density modification. Acta Cryst., 1981, A37, 669-677.

65. Jiang J.-S., Brunger A.T. Protein hydration observed by X-ray diffraction. J. Mol. Biol., 1994, 243, 100-115.

66. Roberts A.L.U., Brunger A.T. Phase improvement by cross-validation density modification. Acta Cryst., 1995, D51,990-1002.

67. Brunger A.T. Free R Value: Cross-Validation in Crystallography. In Methods in Enzymology, 1997, 277,366-396, Academic Press.

68. Cowtan,K.D. DM: An automated procedure for phase improvement by density modification. Joint CCP4 and ESF-EACBM newsletter on protein crystallography, 1994, 31, 34-38.

69. Lunin V.Yu., Skovoroda T.P. R-free likelihood-based estimates of errors for phases calculated from atomic models. Acta Cryst., 1995, A51, 880-887.

70. Lunin V.Yu., Urzhumtsev A.G. Improvement of protein phases by coarse model modification. Acta Cryst., 1984, A40,269-277.

71. Box G.E.P. & Tiao G.C. Bayesian inference in statistical analisis. Addison-Wesley, 1973.

72. Waser, J. Least-squares refinement with subsidiary conditions. Acta Cryst., 1963, 16, 1091-1094.

73. Levitt M. Energy Refinement of Hen Egg-White Lysozyme. J. Mol. Biol., 1974, 82, 393-420.

74. Konnert J. H. A restrained-parameter structure-factor least-squares refinement procedure for large asymmetric units. Acta Cryst., 1976, A32, 614-617.

75. Lunin V. Yu. & Urzhumtsev A. G. Program construction for macromolecule atomic model refinement based on fast Fourier transform and fast differentiation algorithms. Acta Cryst., 1985, A41, 327-333.

76. Tronrud D. E., Ten Eyck L. F. & Matthews B. W. An efficient general-purpose least squares refinement program for macromolecular structures. Acta Cryst., 1987, A43, 489-501.4

77. Driessen H., Haneef M. I. J., Harris G. W., Howlin В., Khan G. & Moss D. S. J. Appl. Cryst., 1989,22,510-516.

78. Sheldrick G. M. SHELXL93, a Program for the Refinement of Crystal Structures from Diffraction Data. 1995, Institut for Anorganishe Chemie, G6ttingen, Germany.

79. Jack, A. & Levitt, M. Refinement of Large Structures by Simultaneous Minimization of Energy and R Factor. Acta Cryst., 1978, A34, 931-935.

80. Sim G. A. The distribution of phase angles for structures containing heavy atoms. Acta Cryst., 1959, 12, 813-815.

81. Read R.J. Structure factor probabilities for related structures. Acta Cryst., 1990, A46, 900-912.

82. Diamond R. A real-space refinement procedure for proteins. Acta Cryst., 1971, A27, 436-452.

83. Isaacs N.W., Agarwal R.C. Experience with fast Fourier least-squares in the refinement of the crystal structure of rhombohedral 2-zinc insulin at 1.5A resolution. Acta Cryst., 1978, A34,782-791.

84. Yusupov M. M., Yusupova G. Zh., Baucom A., Lieberman K., Earnest T. N., Cate J. H. D. & Noller H. F. Science, 2001,292, 883-896.

85. Harms J. et al. High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell, 2001,107, 679-688.

86. Wower J. et al. Transit of tRNA through the Escherichia coli ribosome. J. Biol. Chem., 2000, 275, 37887-37894.

87. Baier G. et al. Structural and functional equivalence between ribosomal proteins of E. coli LI and Methanococcus vannielii L6. Syst. Appl. Microbiol., 1989, 12, 119-126.

88. Hanner M. et al Autogenous translational regulation of the ribosomal MvaLl operon in the archaebacterium Methanococcus vannielii. J. Bacteriol., 1994,176,409-418.

89. Kabsch, W. Integration, scaling, space-group assignment and post refinement. XDS. International Tables for Crystallography, 2001, Vol. F., Dordrecht, Kluwer Academic Publishers.

90. Rao S., Rossman M. Comparison of super-secondary structures in proteins. J. Mol. Biol., 1973,76:241-256.

91. DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. DeLano Scientific, 2002, San Carlos, CA, USA. http://www.pymol.org.

92. N.B. Leontis, J. Stombaugh, E. Westhof. The non-Watson-Crick base pairs and their associated isostericity matrices. Nucleic Acids Research, 2002,30(16): 3497-3531.

93. E. Ennifar, A. Nikulin, S. Tishchenko, A. Serganov, N. Nevskaya, M. Garber, B. Ehresmann, C. Ehresmann, S. Nikonov and P. Dumas. The Crystal Structure of UUCG Tetraloop. Journal ofMol. Biol., 2000, 304,35-42.

94. Argos P. An investigation of protein subunit and domain interfaces. Prot. Engng, 1988, 2, 101-113.

95. Katsamba P.S., Park S. & Laird-Offiinga I. Kinetic studies of RNA-protein « interactions using surface plasmon resonance. Methods, 2002, 26,95-104.

96. Conn G., Gittis A., Lattman E., Misra V. & Draper D. A compact RNA tertiary structure contains a buried backbone-K+ complex. J. Mol. Biol, 2002, 318: 963-973.

97. Klein D., Moore P. & Steiz T. The contribution of metal ions to the structural stability of the large ribosomal subunit. RNA, 2004,10, 1366-1379.