Определение антигенных детерминант белков вируса гепатита С методом фагового дисплея тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Перебоева, Лариса Александровна

• Перебоева, Лариса Александровна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Перебоева, Лариса Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирусный гепатит С. Характеристика возбудителя и вызываемой им инфекции.

1.1.1 .Строение вириона и организация генома ВГС.

1.1.2. Вариабельность генома ВГС.

1.1.3. Эпидемиология ВГС инфекции.

1.1.4. Иммунитет при ВГС инфекции.

1.1.4.1. Гуморальный иммунный ответ при ВГС инфекции.

1.1.4.2. Клеточный иммунный ответ при ВГС инфекции.

1.1.5. Диагностика ВГС инфекции.

1.1.6. Картирование и поиск антигенных детерминант ВГС.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение антигенных детерминант белков вируса гепатита С методом фагового дисплея»

Актуальность проблемы.

Вирус гепатита С является этиологическим фактором острого и хронического гепатитов, цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (Seeff, 1995). В настоящее время заболевания, вызываемые вирусом гепатита С, широко распространены в различных странах мира, в том числе и в России. В мировом масштабе общее количество инфицированных вирусом гепатита С достигает 500 миллионов человек. Этот факт подтверждает, что инфекция представляет значительную угрозу здоровью человечества, выдвигая необходимость эффективной диагностики и вакцинопрофилактики заболевания.

Основные пути распространения ВГС связаны с использованием продуктов инфицированной крови, медицинскими манипуляциями, наркоманией и половыми контактами (Alter, 1997). Учитывая факт, что парентеральный способ заражения является доминирующим в процессе передачи ВГС, ключевым моментом для установления контроля над этим инфекционным заболеванием является своевременная и эффективная диагностика, разработка чувствительных методов скрининга крови и ее продуктов для детекции инфицированных носителей ВГС и предотвращения передачи вируса.

При многих инфекциях выделение патогена из культуры ткани или клеток остается основным методом для постановки или подтверждения диагноза. Однако, размножение ВГС в культуре клеток или тканей является весьма трудной задачей. Более того, содержание вируса в клинических образцах настолько низко, что не позволяет регистрировать вирусные частицы известными методами.

Современная диагностика ВГС основывается на иммуноферментных тестах, которые позволяют определить анти-ВГС антитела, а также молекулярных методах детекции и количественного определения РНК ВГС.

Применение диагностических методов скринирования крови первого поколения значительно снизило риск посттрансфузионных гепатитов С. В то же время эти методы создали проблему ложноположительных реакций. В популяции клинически здоровых доноров крови уровень ложнопозитивных реакций превышал (иногда значительно) истинный уровень позитивных случаев. Несмотря на то, что диагностические тесты последнего поколения в значительной мере повысили специфичность и чувствительность выявления анти-ВГС антител (Barrera et al., 1995; Као et al., 1995), проблема улучшения качества серологических тестов до сих пор остается актуальной. Необходимость оптимизации существующих серологических методов диагностики, тесно связанная с созданием новых улучшенных антигенов, выдвигает задачу изучения антигенной структуры вируса и отдельных его белков.

Насущной проблемой также является поиск антивирусных препаратов и создание анти-ВГС вакцин. Однако, основываясь на высокой степени изменчивости вируса и характере взаимодействия его с иммунной системой, можно предположить, что эта задача потребует от исследователей значительных усилий и времени (Farci et al., 1997). Следует подчеркнуть, что эффективной вакцины против ВГС инфекции до сих пор нет, несмотря на интенсивные работы в этом направлении. Дальнейшее углубление знаний о биологии вируса и взаимодействии его с иммунной системой человека будет способствовать прогрессу в данном направлении.

Очевидно, что для успешного решения вышеуказанных задач необходимо выявление и изучение вирусных антигенных детерминант. Такие исследования не только позволяют создать улучшенные реагенты для профилактики и диагностики ВГС инфекции, но и имеют фундаментальное значение. Это прежде всего возможность выявления особенностей белок-белкового взаимодействия на примере связывания антигена с антителом, и, кроме того, возможность изучения ряда аспектов взаимодействия инфекционного агента с организмом хозяина.

Подавляющее большинство исследований антигенной структуры ВГС проведено с помощью коротких синтетических пептидов или путем клонирования делеционных фрагментов вирусного генома с последующей их экспрессией и изучением антигенной реактивности продуктов экспрессии (Goeser et al., 1994; Khudyakov Yu et al., 1995). Несмотря на то, что такие работы могут дать представление в основном только о существовании линейных эпитопов, они внесли значительный вклад в изучение антигенности различных белков ВГС.

В последнее время методы эпитопного картирования были дополнены бурно развивающимся методом фагового дисплея, который, благодаря способности выявлять значимые компоненты на границе белок-белкового взаимодействия, приобрел особое значение для картирования антигенных детерминант.

Очевидное преимущество использования частиц нитевидных бактериофагов для дисплея пептидных библиотек состоит в том, что огромное количество вариантов может быть быстро и довольно легко создано. Данная система позволяет также отбирать с помощью аффинной селекции лиганды, имеющие сродство к используемому антителу, проводить амплификацию отобранных пептидов в составе фаговых частиц с последующим секвенированием ДНК фагов, соответствующей пептидным вставкам. Все это обеспечивает относительно быстрый, не требующий трудоемких методов, анализ полученных последовательностей (Сеэагеш, 1992).

Хотя метод фагового дисплея, имеющий явные достоинства, широко используется для картирования и выявления эпитопов многих вирусов, он не нашел должного применения в отношениии ВГС. Применение метода фагового дисплея в контексте поиска антигенных детерминант может также представлять значительную ценность, позволяя находить последовательности, являющиеся имитаторами реальных эпитопов, в том числе конформационных.

Несмотря на очевидные успехи в картировании антигенных детерминант ВГС, в этой карте до настоящего времени много «белых пятен». Изучение детальной антигенной структуры вируса и его белков представляется первостепенной задачей на пути создания новых диагностических и терапевтических средств.

Вышесказанное показывает, что актуальность, своевременность и практическая значимость данной работы связана с более тщательным и подробным изучением уже известных антигенных детерминант белков вируса и поиском новых для создания новых диагностических средств и эффективных вакциных препаратов.

Цель работы.

Целью настоящей работы являлся поиск и идентификация новых антигенных детерминант структурных и неструктурных белков вируса гепатита С с использованием методов фагового дисплея.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

- Клонирование участков генома ВГС, кодирующих основные антигенные районы корового, N83, N84 и N85 вирусных белков.

Прокариотическая экспрессия клонированных генов, препаративная наработка и очистка корового, N83, N84 и N85 рекомбинантных белков ВГС.

- Исследование иммунологическими методами специфичности полученных рекомбинантных белков.

- Поиск пептидов-миметиков, моделирующих антигенные детерминанты белков ВГС и специфически взаимодействующих с анти-ВГС антителами сывороток крови с использованием фаговых библиотек случайных пептидов. Анализ выявленных последовательностей для установления их сходства с первичной аминокислотной последовательностью белков ВГС.

Поиск и картирование антигенных детерминант неструктурных белков N83, N84, N85 ВГС с применением фагового дисплея библиотек генных фрагментов

Создание химерного антигена с повышенной специфичностью комбинированием двух антигенных районов белка N84: района, полученного прямым клонированием и района, выявленного методом фагового дисплея.

Научная новизна и практическая ценность.

В результате проделанной работы клонированы 5 фрагментов кодирующих регионов генома ВГС, соответствующие кор, N83, N84 (2 фрагмента) и N85. Источником ВГС РНК служили образцы сывороток пациентов с гепатитом С.

Определены полные нуклеотидные последовательности всех клонированных фрагментов. Проведено сравнение с имеющимися в базе данных последовательностями кДНК штаммов ВГС. Установлено, что все последовательности имеют наибольшее сходство с штаммом ВГС 16.

Клонированные фрагменты генома ВГС в дальнейшем служили основой для создания фаговых библиотек генных фрагментов.

Получены штаммы-продуценты рекомбинантных белков кор, N83 и N85 с использованием вектора рЕТ21 и белка NS4N с использованием вектора рЕТ32. Подтверждена специфичность всех рекомбинантных белков в Вестерн блоте с ВГС-положительными и отрицательными сыворотками. Полученные и очищенные препараты рекомбинантных белков ВГС использовали для определения анти-ВГС антител в сыворотке крови и для аффинного фракционирования антител, специфичных к отдельным белкам ВГС.

При использовании метода фагового дисплея случайных пептидов получено 7 пептидных последовательностей, соответствующих антигенным детерминантам структурных (кор) и неструктурных (N84, N85) белков ВГС. Антигенные детерминанты соответствовали а.о. 19-26, 34-52, и 73-83 на кор белке; а.о. 1712-1718 на N84 белке и а.о. 2251-2260 на N85 белке. В системе биопаннинга на анти- N85 антителах, получены последовательности пяти пептидов, специфически взаимодействующих с анти-ВГС положительными сыворотками, но не имеющих гомологии с последовательностью белка N85. Высказано предположение, что данные последовательности имитируют конформационную детерминанту, представленную на белке N85.

Впервые в контексте поиска антигенных детерминант ВГС созданы и примененены фаговые библиотеки генных фрагментов. С помощью библиотек генных фрагментов неструктурных белков ВГС (N83, N84, N85) были локализованы три антигенные детерминанты на каждом исследуемом фрагменте:

1. а.о. 1381-1415 на белке N83,

2. а.о. 1929-1938 на белке N84,

3. а.о. 2088-2101 на белке N85.

Антигенные детерминанты, обнаруженные на белке N85, были описаны впервые.

При помощи комбинирования двух антигенных районов белка N84: одного, полученного прямым клонированием (ТМ84ЭД, и другого, выявленного методом фагового дисплея (N84?), создан химерный антиген №4РЛМ84К

Показано, что добавление антигенной детерминанты, выявленной при помощи библиотеки генных фрагментов к антигену повысило специфичность выявления анти-ВГС антител в сыворотках. Предложен метод создания химерных антигенов из антигенных детерминант, полученных аффинной селекцией с использованием фаговых библиотек генных фрагментов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клонирование пяти фрагментов кДНК генома ВГС, соответствующих кор, N83, N84 (2 фрагмента), N85 регионам. Сравнение полной нуклеотидной последовательности всех фрагментов с нуклеотидными последовательностями штаммов ВГС (1а и 16), хранящимися в базе данных.

2. Получение в препаративных количествах очищенных рекомбинантных белков кор, N83, N84^ N85 с использованием прокариотических экспрессионных систем. Подтверждение специфичности реакции полученных рекомбинантных белков в иммуноблоттинге с ВГС-положительными сыворотками.

3. Выявление пептидов-миметиков 7-ми антигенных детерминант ВГС, соответствующих а.о. 19-26, 34-52, и 73-83 на кор белке; а.о. 1712-1718 на N84 белке и а.о. 2251-2260 на N85 белке методом фагового дисплея случайных пептидов в системе аффинной селекции с использованием анти-ВГС положительных сывороток и аффинноочищенных анти-ВГС антител.

4. Выявление пяти пептидных последовательностей в системе биопаннинга на анти- N85 антителах, специфически взаимодействующих с анти-ВГС положительными сыворотками, но не имеющих сходства с первичной последовательностью N85. Высказано предположение, что данные последовательности имитируют конформационную детерминанту, представленную на белке N85.

5. Картирование антигенных детерминант на неструктурных белках ВГС (N83, N84, N85) с использованием библиотек генных фрагментов: а.о. 1381-1415 на белке N83, а.о. 1929-1938 на белке N84, а.о. 2088-2101 на белке N85.

6. Создание комбинированного NS4p/NS4N антигена с повышенной специфичностью в реакции с ВГС-положительными сыворотками. Предложен метод создания химерных антигенов из антигенных детерминант, полученных аффинной селекцией с использованием фаговых библиотек генных фрагментов.

Апробация и публикации.

Результаты работы были представлены на Международном семинаре "Progress in Clinical Virology" (Prague - 1995), на Международном симпозиуме "Phage display technology" (Cardiff University - 1998), на юбилейной конференции посвященной тридцатилетию журнала Молекулярная биология (Москва - 1998). Результаты обсуждались на семинарах в NEWI, Wrexham, UK и Gene Therapy Programm, UAB, Birmingham, USA.

По материалам работы опубликованы 2 статьи и тезисы 4 докладов. По материалам диссертационной работы опубликованы следующие научные работы:

1. Kanev A.N., Vorobjeva N.M.S., Shalunova N.V., Kiselev N.N., Pereboeva L.A., Lomanova G.A., Shalaev E.Yu., Bocharova N.G. The development of the reference sera panels with low titer antibody. // Progress in clinical virology. Abstr. Book. -Prague. -1995. P.284.

2. Pereboeva L., Pereboev A., Morris G.E. Identification of HCV epitopes by screening different phage-displayed peptide libraries with human polyclonal antibodies. // Phage display technology symposium. Cardiff University, June 42th-26th, 1998. Кардиф -1998.

3. Перебоева JI.A., Перебоев Г.Е., Моррис Г.Е. Изучение антигенных районов вируса гепатита С методом фагового дисплея. // Мол. биол. -1998. Т.32. С.375.

4. Pereboeva LA, Pereboev AV, Morris G.E. Identification of antigenic sites on three hepatitis С virus proteins using phage-displayed peptide libraries. // J. Med. Virol. -. 1998. V.56. №.2. P.105-11.

5. Pereboeva L. Recombinant Antigens from Hepatitis С Virus. North East Wales Institute of Higher Education. University of Wales. M.Phil. Thesis. (1998).

6. Pereboeva LA, Pereboev AV, Morris G.E. (1999). Hepatitis С epitope mapping by phage display and improved diagnosis using chimeric antigens. J Med Virol (в печати).

Благодарности

Автор приносит благодарность Перебоеву A.B. за практическую помощь критические замечания в процессе диссертационной работы; Красных В.Н. обсуждение работы.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Перебоева, Лариса Александровна

выводы.

Клонированы и секвенированы пять фрагментов кДНК генома ВГС, соответствующие N83, N84 (2 фрагмента), N85 и кор районам генома. Путем сравнения полной нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов с последовательностями штаммов ВГС, хранящимися в базе данных показано, что клонированные фрагменты имеют наибольшую гомологию (более 90%) с последовательностью генома штамма 16. Созданы бактериальные штаммы-продуценты белков ВГС (кор, N83, N84^ N85), позволяющие нарабатывать рекомбинантные белки в препаративных количествах. Показана специфичность взаимодействия всех четырех рекомбинантных белков с анти-ВГС антителами сыворотки крови. Методом фагового дисплея случайных пептидов в системе аффинной селекции с использованием анти-ВГС положительных сывороток и аффинноочищенных анти-ВГС антител выявлены пептидные последовательности 7 антигенных детерминант ВГС соответствующие а. о 19-26, 34-52 и 73-83 на кор белке; а.о. 1681-1692, 1712-1718 и 1726-1736 на N84 белке и а.о. 2251-2260 на N85 белке.

В системе биопаннинга на анти-^5 антителах, выявлены сходные между собой последовательности пяти пептидов специфически взаимодействующие с анти-ВГС положительными сыворотками, но- не имеющими сходства с первичной последовательностью N85. Высказано предположение что, данные последовательности имитируют конформационную детерминанту, представленную на белке N85. Впервые для локализации антигенных детерминант ВГС сконструированы фаговые библиотеки генных фрагментов неструктурных белков вируса N83, N84, N85. С использованием полученных библиотек локализованы антигенные детерминанты ВГС, которые представлены аминокислотными остатками: 1381-1415 на белке N83; 1929-1938 на белке N84 и 2088-2101 на белке N85.

При помощи комбинирования двух антигенных районов белка N84: одного, полученного прямым клонированием (Ы84М), и другого, выявленного методом фагового дисплея (Ы84Р), создан комбинированный антиген NS4P/NS4N с повышенной специфичностью выявления ВГС-положительных сывороток.

Заключение

Работы, появившиеся в большом количестве за последние годы, убедительно свидетельствуют о том, что метод фагового дисплея становится инструментом для множества исследований, начиная от картирования антигенных эпитопов до конструирования белков и генной терапии. Протоколы селекции, разработанные в различных лабораториях довольно просты, не требуют сложного оборудования и манипуляций, что способствует дальнейшему широкому распространению метода в различных областях.

Хотя техника фагового дисплея широко используется для картирования и выявления белковых эпитопов многих вирусов она не нашла должного применения в отношении ВГС. Следует отметить, что применение метода фагового дисплея, в контексте поиска антигенных детерминант, может также представлять значительную ценность, позволяя находить последовательности, являющиеся имитаторами реальных эпитопов, в том числе конформационных. Таким образом, анализ антигенных детерминант ВГС с помощью техники фагового дисплея может существенно расширить наши представления об антигенной структуре вируса, механизмах его взаимодействия с иммунной системой, а также создает основу для создания новых диагностических реагентов и вакцинных препаратов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

Сыворотки. В работе использовали донорские сыворотки с выявленными антителами к вирусу гепатита С. Сыворотки тестировали на наличие антител к ВГС с использованием диагностического набора "РекомбиБест ВГС" (производства Вектор-Бест, Россия) и теста для определения анти-ВГС антител (производства"Abbott", США). Лиофилизированные сыворотки хранились при 4°С. После разведения сыворотки хранили при -70°С. Аликвоты сывороток, используемых для иммунологических реакций инактивировали у-облучением в дозе 2 МРад (процедура была любезно выполнена г-ном Б. Ходсоном , Манчестер, Великобритания).

Плазмидные векторы. Вектор рТ7 использовали для клонирования продуктов ПЦР. Векторы рЕТ21, рЕТ32 и pMAL использовали для продукции рекомбинантных белков ВГС. Все плазмиды были получены от Novagen. Манипуляции с векторами проводили согласно инструкциям производителя (Novagen, 1997). Вектор fUSE2 был любезно предоставлен проф. Г. Смитом, университет штата Миссури-Колумбия (Smith and Scott, 1993). Данный вектор использовали для создания библиотек генных фрагментов.

Бактериальные штаммы. В работе использовали следующие штаммы E.colv.

NovaBlue end Al hsdR17(ru2 %+J supE44 thi-1 recAl gyr96 relAl lac[ F' proA+B+ lacfZAM15:: Tnl 0(Tcr)]

BL21(DE3) F" ompThsdSb (n mb~) gal dem (DE3) K91Kan F' thi lacZkan

MC1061 araD139 A(ara-leu)7696 galEIS galKló A(lac)X75 rpsL(Strr) hsdR2 (r¿ mC) mcrA mcrBIF'

TG1 supE A?(hsdM-mcrB)5(rk' mk'McrB')thi A(la-proAB)[FtraD36,LacP A(lacZ)M15]

NovaBlue - для хранения и препаративной наработки клонирующих и экспрессионных плазмид, несущих фрагменты генома ВГС;

BL21(DE) - для экспрессии фрагментов генома ВГС и препаративной наработки рекомбинантных белков ВГС с использованием векторов серии рЕТ; TG1 - для экспрессии фрагментов генома ВГС с использованием вектора pMAL;

К91Кап - для амплификации фага в фаговом дисплее и титрования фаговых частиц;

MC 1061 - для создания фаговых пептидных библиотек.

Библиотеки случайных пептидов.

В работе использовали 2 вида библиотек случайных 15-мерных пептидных последовательностей, экспонированных на поверхности бактериофага fd-tet. Данные библиотеки были любезно предоставлены проф. Г. Смитом из Университета штата Миссури Колумбия. В библиотеке Б15-3 случайные пептидные последовательности представлены на N-конце белка pill бактериофага fd. В библиотеке Б15-8 пептиды представлены на главном поверхностном белке pVIII бактериофага fd-tet (Smith, 1992).

Реактивы. Химреактивы приобретали у компаний Sigma, Merk. Ферменты для молекулярно-биологических экспериментов: Taq-полимеразу, рестриктазы, Т4-полинуклеотид-киназу, Т4 ДНК-лигазу, Т4 ДНК-полимеразу, обратную транскриптазу M-MLV RT приобретали у компаний Promega, Boehringer-Mannheim, Pharmacia, New England Biolabs. Секвенирование ДНК проводили, используя Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit, а также 358-дАТФ, поставляемые Amersham. Выделение и очистку ДНК и РНК проводили с использованием специализированных наборов, выпускаемых QIAGEN. Для иммуноферментного анализа и иммуноблотгинга использовали биотинилированные антитела козы к IgG человека и систему ABC, содержащую авидин и биотинилированную пероксидазу из корня хрена (система VectoStain, Vector Biolabs). Концентрацию белка определяли с помощью набора Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad) с использованием БСА и человеческого у-глобулина в качестве стандартов.

Праймеры для секвенирования и ПЦР рассчитывали, используя компьютерную программу Gene Works 2.2 (Intelligenetics Inc., USA). При расчете праймеров для амплификации участков генома ВГС за основу принимали 2 варианта генотипа ВГС: la (Choo et al., 1989) и 16 (Kato et al.,

1990). Синтез праймеров заказывали у разных компаний (Alta Bioscience,

University of Birmingham, UK; Cruachem, Glasgow; Human Genome Map Project,

Cambridge). Последовательность праймеров для ПЦР приведена в таблице 2.1. В качестве маркеров молекулярного веса фрагментов ДНК использовались маркеры фирмы Boehringer (UK)

MVI (154,220,234,298, 394,453, 517, 653, 1033, 1230, 1766,2176 н.п.), MVII (81, 359,492, 710, 718, 992,1164, 1482, 1515, 1882, 1953,2799, 3639, 4899, 6106, 7427, 8576 н.п.)

В качестве маркера молекулярного веса белков для электрофореза в ПААГ использовался маркер SeeBlue фирмы R&D System (UK) (16, 30, 36, 50, 64, 98, 250 кД)

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Перебоева, Лариса Александровна, 1999 год

1. Abrignani S (1997). Immune responses throughout hepatitis C virus (HCV) infection: HCV from the immune system point of view. Springer Seminars in Immunopathology. 19: 47-55.

2. Ahmad N, Schiff GM and Baroudy BM (1993). Detection of viremia by a one step polymerase chain reaction method in hepatitis C virus infection. Virus Research. 30: 303-15.

3. Alter MJ (1997). Epidemiology of hepatitis C. Hepatology. 26: 62S-65S.

4. Alter MJ, Mast EE, Moyer LA and Margolis HS (1998). Hepatitis C. Infectious Disease Clinics of North America. 12: 13-26.

5. Bach N, Thung SN and Schaffner F (1992). The histological features of chronic hepatitis C and autoimmune chronic hepatitis: a comparative analysis. Hepatology. 15: 572-7.

6. Barrera JM, Francis B, Ercilla G, Nelles M, Achord D, Darner J and Lee SR (1995). Improved detection of anti-HCV in post-transfusion hepatitis by a third-generation ELIS A. Vox Sanguinis. 68: 15-8.

7. Barrett RW, Cwirla SE, Ackerman MS, Olson AM, Peters EA and Dower WJ (1992). Selective enrichment and characterization of high affinity ligands from collections of random peptides on filamentous phage. Analytical Biochemistry. 204: 357-64.

8. Barry MA, Dower WJ and Johnston SA (1996). Toward cell-targeting gene therapy vectors: selection of cell-binding peptides from random peptide-presenting phage libraries. Nature Medicine. 2: 299-305.

9. Botarelli P, Brunetto MR, Minutello MA, Calvo P, Unutmaz D, Weiner AJ, Choo QL, Shuster JR, Kuo G and Bonino F (1993). T-lymphocyte response to hepatitis C virus in different clinical courses of infection. Gastroenterology. 104: 5807.

10. Bresters D, Cuypers HT, Reesink HW, Schaasberg WP, van der Poel CL, Mauser-Bunschoten EP, Houghton M, Choo QL, Kuo G and Lesniewski R (1992). Enhanced sensitivity of a second generation ELISA for antibody to hepatitis C virus. Vox Sanguinis. 62: 213-7.

11. Bukh J, Miller RH and Purcell RH (1995). Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. Seminars in Liver Disease. 15: 41-63.

12. Bukh J, Miller RH and Purcell RH (1995). Genetic heterogeneity of the hepatitis C virus. Princess Takamatsu Symposia. 25: 75-91.

13. Burritt JB, Bond CW, Doss KW and Jesaitis AJ (1996). Filamentous phage display of oligopeptide libraries. Analytical Biochemistry. 238: 1-13.

14. Carrick RJ, Schlauder GG, Peterson DA and Mushahwar IK (1992). Examination of the buoyant density of hepatitis C virus by the polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods. 39: 279-89.

15. Cerny A and Chisari FV (1994). Immunological aspects of HCV infection. Intervirology. 37: 119-25.

16. Cesareni G (1992). Peptide display on filamentous phage capsids. A new powerful tool to study protein-ligand interaction. FEBS Letters. 307: 66-70.

17. Cheng C, Chenghua S, Ping L, Yizheng T and Qingjun M (1996). Diagnosis of hepatitis C Virus (HCV) infection by antigen-capturing ELISA. Clinical and Diagnostic Virology. 6: 137-145.

18. Chien DY, Choo QL, Ralston R, Spaete R, Tong M, Houghton M and Kuo G (1993). Persistence of HCV despite antibodies to both putative envelope glycoproteins letter. Lancet. 342: 933.

19. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW and Houghton M (1989). Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244: 359-62.

20. Choo QL, Weiner AJ, Overby LR, Kuo G, Houghton M and Bradley DW (1990). Hepatitis C virus: the major causative agent of viral non-A, non-B hepatitis. British Medical Bulletin. 46: 423-41.

21. Clackson T and Wells JA (1994). In vitro selection from protein and peptide libraries. Trends In Biotechnology. 12: 173-84.

22. Claeys H, Volckaerts A, Mertens W, Liang Z, Fiten P and Opdenakker G (1995). Localization and reactivity of an immunodominant domain in the NS3 region of hepatitis C virus. Journal of Medical Virology. 45: 273-81.

23. Cortese I, Capone S, Tafi R, Grimaldi LM, Nicosia A and Cortese R (1998). Identification of peptides binding to IgG in the CSF of multiple sclerosis patients. Multiple Sclerosis. 4: 31-6.

24. Cwirla SE, Peters EA, Barrett RW and Dower WJ (1990). Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87: 6378-82.

25. Daniels DA and Lane DP (1996). Phage peptide libraries. Methods in Enzvmology. 9: 494-507.

26. Di Bisceglie AM, Goodman ZD, Ishak KG, Hoofnagle JH, Melpolder J J and Alter HJ (1991). Long-term clinical and histopathological follow-up of chronic posttransfusion hepatitis. Hepatology. 14: 969-74.

27. Doorbar J and Winter G (1994). Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display. Journal of Molecular Biology. 244: 361-9.

28. Du Plessis DH, Romito M and Jordaan F (1995). Identification of an antigenic peptide specific for bluetongue virus using phage display expression of NS1 sequences. Immunotechnology. 1: 221-30.

29. Fack F, Hugle-Dorr B, Song D, Queitsch I, Petersen G and Bautz EK (1997). Epitope mapping by phage display: random versus gene-fragment libraries. Journal of Immunological Methods. 206: 43-52.

30. Farci P, Alter HJ, Govindarajan S, Wong DC, Engle R, Lesniewski RR, Mushahwar IK, Desai SM, Miller RH and Ogata N (1992). Lack of protective immunity against reinfection with hepatitis C virus. Science. 258: 135-40.

31. Farci P, Alter HJ, Wong D, Miller RH, Shih JW, Jett B and Purcell RH (1991). A long-term study of hepatitis C virus replication in non-A, non-B hepatitis see comments. New England Journal of Medicine. 325: 98-104.

32. Farci P, Bukh J and Purcell RH (1997). The quasispeeies of hepatitis C virus and the host immune response. Springer Seminars in Immunopathologv. 19: 5-26.

33. Farci P, Orgiana G and Purcell RH (1995). Immunity elicited by hepatitis C virus. Clinical & Experimental Rheumatology. 13 Suppl 13: S9-12.

34. Felici F, Galfre G, Luzzago A, Monaci P, Nicosia A and Cortese R (1996). Phage-displayed peptides as tools for characterization of human sera. Methods in Enzvmology. 267: 116-29.

35. Ferroni P, Mascolo G, Zaninetti M, Colzani D, Pregliasco F, Pirisi M, Barbone F and Gasparini V (1993). Identification of four epitopes in hepatitis C virus core protein. Journal of Clinical Microbiology. 31: 1586-91.

36. Feucht HH, Zollner B, Polywka S and Laufs R (1995). Study on reliability of commercially available hepatitis C virus antibody tests. Journal of Clinical Microbiology. 33: 620-4.

37. Folgori A, Luzzago A, Monaci P, Nicosia A, Cortese R and Felici F (1998). Identification of disease-specific epitopes. Methods in Molecular Biology. 87: 195208.

38. Folgori A, Tafi R, Meola A, Felici F, Galfre G, Cortese R, Monaci P and Nicosia A (1994). A general strategy to identify mimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries and human sera. EMBO Journal. 13: 2236-43.

39. Fong S, Doyle LV, Devlin JJ and M.V. D (1994). Scanning whole cells with phage-display libraries: identification of peptide ligands that modulate cell function. Drug Development Research. 33: 64-70.

40. Galfre G, Monaci P, Nicosia A, Luzzago A, Felici F and Cortese R (1996). Immunization with phage-displayed mimotopes. Methods in Enzvmology. 267: 10915.

41. Geysen HM, Rodda SJ and Mason TJ (1986). The delineation of peptides able to mimic assembled epitopes. Ciba Foundation Symposium. 119: 130-49.

42. Goeser T, Muller HM, Ye J, Pfaff E and Theilmann L (1994). Characterization of antigenic determinants in the core antigen of the hepatitis C virus. Virology. 205: 462-9.

43. Greenwood J, Willis AE and Perham RN (1991). Multiple display of foreign peptides on a filamentous bacteriophage. Peptides from Plasmodium falciparum circumsporozoite protein as antigens. Journal of Molecular Biology. 220: 821-7.

44. Gretch DR (1997). Diagnostic tests for hepatitis C. Hepatologv. 26: 43S-47S.

45. Hawkins RE, Russell SJ and Winter G (1992). Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. Journal of Molecular Biology. 226: 889-96.

46. Hijikata M, Kato N, Ootsuyama Y, Nakagawa M, Ohkoshi S and Shimotohno K (1991). Hypervariable regions in the putative glycoprotein of hepatitis C virus. Biochemical & Biophysical Research Communications. 175: 220-8.

47. Hijikata M, Shimizu YK, Kato H, Iwamoto A, Shih JW, Alter HJ, Purcell RH and Yoshikura H (1993). Equilibrium centrifugation studies of hepatitis C virus: evidence for circulating immune complexes. Journal of Virology. 67: 1953-8.

48. Hoofnagle JH, Gerety RJ and Barker LF (1973). Antibody to hepatitis-B-virus core in man. Lancet. 2: 869-73.

49. Hsuih TC, Park YN, Zaretsky C, Wu F, Tyagi S, Kramer FR, Sperling R and Zhang DY (1996). Novel, ligation-dependent PCR assay for detection of hepatitis C in serum. Journal of Clinical Microbiology. 34: 501-7.

50. Hussy P, Langen H, Mous J and Jacobsen H (1996). Hepatitis C virus core protein: carboxy-terminal boundaries of two processed species suggest cleavage by a signal peptide peptidase. Virology. 224: 93-104.

51. Inchauspe G, Abe K, Zebedee S, Nasoff M and Prince AM (1991). Use of conserved sequences from hepatitis C virus for the detection of viral RNA in infected sera by polymerase chain reaction. Hepatology. 14: 595-600.

52. Ivanisenko VA and Eroshkin AM (1997). Poisk saitov, soderzhashchikh funktsional'no vazhnye zameny v naborakhrodstvennykh ili mutantnykh belkov. Molekuliarnaia Biologiia. 31: 880-7.

53. Kao JH, Yang PM, Lai MY, Chen PJ, Wang TH and Chen DS (1995). Evaluation of third-generation hepatitis C antibody assay in chronic hepatitis C and chronic non-B, non-C hepatitis. Viral Immunology. 8: 135-9.

54. Kato N, Ootsuyama Y, Ohkoshi S, Nakazawa T, Sekiya H, Hijikata M and Shimotohno K (1992). Characterization of hypervariable regions in the putativeenvelope protein of hepatitis C virus. Biochemical & Biophysical Research Communications. 189: 119-27.

55. Khanna A, Poduri CD, Murugan P, Kumar S, Sugunan VS, Shenoy KT and Das MR (1998). Analysis of human immune response to potential hepatitis C viral epitopes. Acta Virologica. 42: 141-5.

56. Khanna A and Ray R (1995). Hepatitis C virus core protein: synthesis, affinity purification and immunoreactivity with infected human sera. Gene. 153: 185-9.

57. Khudyakov YE, Fields HA, Favorov MO, Khudyakova NS, Bonafonte MT and Holloway B (1993). Synthetic gene for the hepatitis C virus nucleocapsid protein. Nucleic Acids Research. 21: 2747-54.

58. Khudyakov Yu E, Khudyakova NS, Jue DL, Lambert SB, Fang S and Fields HA1995). Linear B-cell epitopes of the NS3-NS4-NS5 proteins of the hepatitis C virus as modeled with synthetic peptides. Virology. 206: 666-72.

59. Kleinman S, Alter H, Busch M, Holland P, Tegtmeier G, Nelles M, Lee S, Page E, Wilber J and Polito A (1992). Increased detection of hepatitis C virus (HCV)-infected blood donors by a multiple-antigen HCV enzyme immunoassay. Transfusion. 32: 805-13.

60. Koivunen E, Wang B and Ruoslahti E (1995). Phage libraries displaying cyclic peptides with different ring sizes: ligand specificities of the RGD-directed integrins. Bio/Technology. 13: 265-70.

61. Koziel MJ (1997). The role of immune responses in the pathogenesis of hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 4 SuppI 2: 31-41.

62. Krajden M (1995). Molecular detection of hepatitis C virus: impact of detection methodology on clinical and laboratory correlations. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 32: 41-66.

63. Laemmli UK (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-5.

64. Leon P, Lopez JA, Domingo C and Echevarria JM (1993). Evaluation of laboratory assays for screening antibody to hepatitis C virus. Transfusion. 33: 268-70.

65. Lesniewski RR, Watanabe S and Devare SG (1995). Expression of HCV envelope proteins and the serological utility of the anti-E2 immune response. Princess Takamatsu Symposia. 25: 129-37.

66. Li B, Tom JY, Oare D, Yen R, Fairbrother WJ, Wells JA and Cunningham BC (1995). Minimization of a polypeptide hormone. Science. 270: 1657-60.

67. Lowman HB and Wells JA (1993). Affinity maturation of human growth hormone by monovalent phage display. Journal of Molecular Biology. 234: 564-78.

68. Luzzago A and Felici F (1998). Construction of disulfide-constrained random peptide libraries displayed on phage coat protein VIII. Methods in Molecular Biology. 87: 155-64.

69. McGregor D (1996). Selection of proteins and peptides from libraries displayed on filamentous bacteriophage. Molecular Biotechnology. 6: 155-62.

70. Mennuni C, Santini C, Dotta F, Farilla L, Di Mario U, Fierabracci A, Bottazzo G, Cortese R and Luzzago A (1996). Selection of phage-displayed peptides mimicking type 1 diabetes-specific epitopes. Journal of Autoimmunity. 9: 431-6.

71. Milton ID, Watson JP, Guo K, Carter MJ, Bassendine MF and Toms GL (1995). Prokaryotic expression and analysis of the antibody response to a Newcastle isolate of the core gene of hepatitis C. Journal of Medical Virology. 45: 253-8.

72. Minenkova OO, Ilyichev AA, Kishchenko GP and Petrenko VA (1993). Design of specific immunogens using filamentous phage as the carrier. Gene. 128: 85-8.

73. Model P and Russel M (1988). Filamentous bacteriophage. The bacteriophages. Calendar R. New York, Plenum Press: 375-456.

74. Mondelli MU (1996). Is there a role for immune responses in the pathogenesis of hepatitis C? see comments. Journal of Hepatology. 25: 232-8.

75. Mondelli MU, Cividini A and Cerino A (1995). Role of humoral immune responses in hepatitis B and C virus infections. European Journal of Clinical Investigation. 25: 543-7.

76. Moradpour D, Englert C, Wakita T and Wands JR (1996). Characterization of cell lines allowing tightly regulated expression of hepatitis C virus core protein. Virology. 222: 51-63.

77. Nagesha HS, Yu M and Wang LF (1996). Application of linker-ligation-PCR for construction of phage display epitope libraries. Journal of Virological Methods. 60: 147-54.

78. Nasoff MS, Zebedee SL, Inchauspe G and Prince AM (1991). Identification of an immunodominant epitope within the capsid protein of hepatitis C virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88: 5462-6.

79. Neddermann P, Tomei L, Steinkuhler C, Gallinari P, Tramontano A and De Francesco R (1997). The nonstructural proteins of the hepatitis C virus: structure and functions. Biological Chemistry. 378: 469-76.

80. Novagen (1997). pET System Manual, Novagen Inc.: 67.

81. Okamoto M, Baba M, Kodama E, Sekine K, Takagi T, Kasukawa R and Shigeta S (1993). Detection of hepatitis C virus genome in human serum by multi-targeted polymerase chain reaction. Journal of Medical Virology. 41: 6-10.

82. Palmer DB, George AJ and Ritter MA (1997). Selection of antibodies to cell surface determinants on mouse thymic epithelial cells using a phage display library. Immunology. 91: 473-8.

83. Park HJ, Byun SM, Ha YJ, Ahn JS and Moon HM (1995). Identification of immunodominant epitopes in the core and non-structural region of hepatitis C virus by enzyme immunoassay using synthetic peptides. Journal of Immunoassay. 16: 16781.

84. Parmley SF and Smith GP (1988). Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene. 73: 305-18.

85. Parmley SF and Smith GP (1989). Filamentous fusion phage cloning vectors for the study of epitopes and design of vaccines. Advances in Experimental Medicine & Biology. 251: 215-8.

86. Pasqualini R, Koivunen E and Ruoslahti E (1995). A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an RGD-binding site on integrins. Journal of Cell Biology. 130: 1189-96.

87. Pasqualini R and Ruoslahti E (1996). Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380: 364-6.

88. Pereboeva LA, Pereboev AV and Morris GE (1998). Identification of antigenic sites on three hepatitis C virus proteins using phage-displayed peptide libraries. Journal of Medical Virology. 56: 105-11.

89. Pereboeva LA, Pereboev AV and Morris GE (1999). Hepatitis C epitope mapping by phage display and improved diagnosis using chimeric antigens. Journal of Medical Virology (in press).

90. Pereira S, Maruyama H, Siegel D, Van Belle P, Elder D, Curtis P and Herlyn D1997). A model system for detection and isolation of a tumor cell surface antigen using antibody phage display. Journal of Immunological Methods. 203: 11-24.

91. Prezzi C, Nuzzo M, Meola A, Delmastro P, Galfre G, Cortese R, Nicosia A and Monaci P (1996). Selection of antigenic and immunogenic mimics of hepatitis C virus using sera from patients. Journal of Immunology. 156: 4504-13.

92. Prohaska W, Wolff C, Lechler E and Kleesiek K (1991). High rate of false positives in blood donor screening for antibodies to hepatitis C virus. Cause of underestimation of virus transmission rate? Klinische Wochenschrift. 69: 294-6.

93. Rajotte D, Arap W, Hagedorn M, Koivunen E, Pasqualini R and Ruoslahti E1998). Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. Journal of Clinical Investigation. 102: 430-7.

94. Rasched I and Obeber E (1986). Ff coliphages: structural and functional relationships. Microbiological Review. 50: 401-427.

95. Ravaggi A, Natoli G, Primi D, Albertini A, Levrero M and Cariani E (1994). Intracellular localization of full-length and truncated hepatitis C virus core protein expressed in mammalian cells. Journal of Hepatology. 20: 833-6.

96. Roggendorf M, Lu M, Meisel H, Riffelmann M, Schreier E and Viazov S (1996). Rational use of diagnostic tools in hepatitis C. Journal of Hepatology. 24: 2634.

97. Russel M (1991). Filamentous phage assembly. Molecular Microbiology. 5: 1607-13.

98. Russel M (1995). Moving through the membrane with filamentous phages. Trends in Microbiology. 3: 223-8.

99. Russel M, Linderoth NA and Sali A (1997). Filamentous phage assembly: variation on a protein export theme. Gene. 192: 23-32.

100. Sallberg M, Pumpen P, Zhang ZX, Lundholm P, Gusars I, Ruden U, Wahren B and Magnius LO (1994). Locations of antibody binding sites within conserved regions of the hepatitis C virus core protein. Journal of Medical Virology. 43: 62-8.

101. Sallberg M, Ruden U, Wahren B and Magnius LO (1992). Immune response to a single peptide containing an immunodominant region of hepatitis C virus core protein: the isotypes and the recognition site. Immunology Letters. 33: 27-33.

102. Sallberg M, Ruden U, Wahren B and Magnius LO (1992). Immunodominant regions within the hepatitis C virus core and putative matrix proteins. Journal of Clinical Microbiology. 30: 1989-94.

103. Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989). Molecular cloning: a laboratory maniual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

104. Scott JK and Smith GP (1990). Searching for peptide ligands with an epitope library. Science. 249: 386-90.

105. Seeff LB (1995). Natural history of viral hepatitis, type C. Seminars in Gastrointestinal Disease. 6: 20-7.

106. Seki M, Honda Y, Kondo J, Fukuda K, Ohta K, Sugimoto J and Yamada E (1995). Effective production of the hepatitis C virus core antigen having high purity in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 38: 229-41.

107. Shimizu YK, Feinstone SM, Kohara M, Purcell RH and Yoshikura H (1996). Hepatitis C virus: detection of intracellular virus particles by electron microscopy see comments. Hepatology. 23: 205-9.

108. Simmonds P (1995). Variability of hepatitis C virus. Hepatology. 21: 570-83.

109. Simmonds P (1996). Virology of hepatitis C virus. Clinical Therapeutics. 18 Suppl B: 9-36.

110. Smith GP (1988). Filamentous phage assembly: morphogenetically defective mutants that do not kill the host. Virology. 167: 156-65.

111. Smith GP (1988). Filamentous phages as cloning vectors. Biotechnology. 10: 61-83.

112. Smith GP (1991). Surface presentation of protein epitopes using bacteriophage expression systems. Current Opinion in Biotechnology. 2: 668-73.

113. Smith GP (1992). Cloning in fUSE vectors.

114. Smith GP and Scott JK (1993). Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. Methods in Enzymology. 217: 228-57.

115. Spengler U, Lechmann M, Irrgang B, Dumoulin FL and Sauerbruch T (1996). Immune responses in hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology. 24: 20-5.

116. Szardenings M, Tornroth S, Mutulis F, Muceniece R, Keinanen K, Kuusinen A and Wikberg JE (1997). Phage display selection on whole cells yields a peptide specific for melanocortin receptor 1. Journal of Biological Chemistry. 272: 27943-8.

117. Tan DM, Hu GL, Arima T, Zhang Z, Nanba T and Hatanaka T (1993). Molecular cloning, sequencing and expression of core and NS3 fragments of HCV from patients with HCV infection. Chinese Medical Journal. 106: 522-6.

118. Thomssen R, Bonk S, Propfe C, Heermann KH, Kochel HG and Uy A (1992). Association of hepatitis C virus in human sera with beta-lipoprotein. Medical Microbiology & Immunology. 181: 293-300.

119. Tilston P and Corbitt G (1995). A single tube nested PCR for the detection of hepatitis C virus RNA. Journal of Virological Methods. 53:121-9.

120. Tong MJ, el-Farra NS, Reikes AR and Co RL (1995). Clinical outcomes after transfusion-associated hepatitis C see comments. New England Journal of Medicine. 332: 1463-6.

121. Tsukiyama-Kohara K, Iizuka N, Kohara M and Nomoto A (1992). Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA. Journal of Virology. 66: 1476-83.

122. Ulrich PP, Romeo JM, Daniel LJ and Vyas GN (1993). An improved method for the detection of hepatitis C virus RNA in plasma utilizing heminested primers and internal control RNA. Genome Research. 2: 241-9.

123. Vallari DS, Jett BW, Alter HJ, Mimms LT, Holzman R and Shih JW (1992). Serological markers of posttransfusion hepatitis C viral infection. Journal of Clinical Microbiology. 30: 552-6.

124. Verslype C, Suwandhi W, Clarysse C and Yap SH (1997). Hepatitis C: seven years after the discovery of the causative agent. Acta Clinica Bélgica. 52: 36-48.

125. Wang YF, Brotman B, Andrus L and Prince AM (1996). Immune response to epitopes of hepatitis C virus (HCV) structural proteins in HCV-infected humans and chimpanzees. Journal of Infectious Diseases. 173: 808-21.

126. Willis AE, Perham RN and Wraith D (1993). Immunological properties of foreign peptides in multiple display on a filamentous bacteriophage. Gene. 128: 7983.

127. Wilson DR and Finlay BB (1998). Phage display: applications, innovations, and issues in phage and host biology. Canadian Journal of Microbiology. 44: 313-29.

128. Wrighton NC, Farrell FX, Chang R, Kashyap AK, Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barrett RW, Jolliffe LK and Dower WJ (1996). Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin see comments. Science. 273: 45864.

129. Yamada M, Kakumu S, Yoshioka K, Higashi Y, Tanaka K, Ishikawa T and Takayanagi M (1994). Hepatitis C virus genotypes are not responsible for development of serious liver disease. Digestive Diseases & Sciences. 39: 234-9.

130. Yatsuhashi H, Inokuchi K, Inoue O, Matsumura N, Koga M, Kosakai Y and Yano M (1993). The clinical significance of reactivity to individual epitopes of the hepatitis C viral genome. Gastroenterologia Japónica. 28 Suppl 5: 6-11.

131. Yatsuhashi H, Inoue O, Koga M, Nagataki S, Mizuno K, Kolberg J, Beall E, Cha TA, Irvine B and Kuo G (1992). Comparison of hepatitis C virus markers in patients with NANB hepatitis. Journal of Virological Methods. 37: 13-21.

132. Zaaijer HL, Cuypers HT, Reesink HW, Winkel IN, Gerken G and Lelie PN (1993). Reliability of polymerase chain reaction for detection of hepatitis C virus. Lancet. 341: 722-4.

133. Zaaijer HL, Vallari DS, Cunningham M, Lesniewski R, Reesink HW, van der Poel CL and Lelie PN (1994). E2 and NS5: new antigens for detection of hepatitis C virus antibodies. Journal of Medical Virology. 44: 395-7.

134. Zhang ZX, Sonnerborg A and Sallberg M (1994). Antigenic structure of the hepatitis C virus envelope 2 protein. Clinical & Experimental Immunology. 98: 382