Окислительное расщепление ДНК аренами и их олигонуклеотидными конъюгатами в присутствии ионов Cu(II) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат биологических наук Коваль, Ольга Александровна

• Коваль, Ольга Александровна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коваль, Ольга Александровна

Список сокращений

Введение

1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСОВ МЕДИ С Ю

НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ (Обзор литературы)

1.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИОНОВ МЕДИ С НУКЛЕИНОВЫМИ 11 КИСЛОТАМИ

1.1.1. Связывание ионов меди с нуклеиновыми кислотами

1.1.2. Механизм реакции Фентона

1.1.3. Взаимодействие активных форм кислорода с нуклеиновыми ^ кислотами

1.1.4. Реакция Фентона in vivo

1.1.4.1. Мутации в ДНК, возникающие под действием кислородных радикалов

1.1.4.2. Воспаление и окислительный стресс

1.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 26 КОМПЛЕКСАМИ МЕДИ И МЕДЬ-ЗАВИСИМЫМИ СИСТЕМАМИ

1.2.1. Комплексы меди, осуществляющие окислительную деструкцию нуклеиновых кислот

1.2.1.1. Комплексы меди и медь-зависимые системы. осуществляющиеокислительн уюдеструкцию нуклеиновых кислот в присутствии тиолов или Н2О2.

1.2.1.2 .Окислительная деструкция нуклеиновых кислот комплексами меди. действующими без активации экзогенными окислителями или восстановителями

1.2.2. Комплексы меди, осуществляющие гидролитическую деструкцию нуклеиновых кислот

1.3. САЙТ-НАПРАВЛЕННОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ 57 КИСЛОТ КОНЪЮГАТАМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С КОМПЛЕКСАМИ МЕДИ

1.3.1. Расщепление ДНК и РНК конъюгатами олигонуклеотидов с 58 комплексами меди в двуцепочечном комплексе

1.3.2. Расщепление ДНК и РНК конъюгатами олигонуклеотидов с 62 комплексами меди в триплексе

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Окислительное расщепление ДНК аренами и их олигонуклеотидными конъюгатами в присутствии ионов Cu(II)»

Создание химических соединений, способных расщеплять ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, необходимо для развития ряда областей молекулярной биологии и для разработки терапевтических препаратов регулирующих экспрессию генов [1, 2]. Такие соединения могут быть получены путем присоединения реакционноспособных групп к олигонуклеотидам, взаимодействующим с определенными нуклеотидными последовательностям ДНК [3, 4]. Важным, не решенным вопросом конструирования таких соединений, является разработка реакционноспособных групп, которые могли бы высокоэффективно расщеплять или химически модифицировать ДНК в физиологических условиях. На сегодняшний день создан широкий спектр производных олигонуклеотидов, несущих алкилирующие, фотоактивируемые группы, комплексы переходных металлов, катализирующие окислительную деструкцию нуклеиновых кислот (EDTA-железо, порфирин-железо, 1,10-фенантролин-медь блеомицин-железо) [5-12]. Реагенты последнего типа способны расщеплять или модифицировать ДНК и РНК в аэробных условиях в присутствии восстановителей или доноров активного кислорода. Однако направленная модификация ДНК ни одним из описанных реагентов не достигает в физиологических условиях биологически значимых уровней.

В настоящее время не вполне выясненным является вопрос о формировании комплексов олигонуклеотидов с клеточной ДНК. ДНК клетки упакована в регулярно повторяющиеся нуклеопротеиновые структуры - нуклеосомы, и расплетение её цепей является редким событием [13,14]. Уотсон-Криковское связывание олигонуклеотидов может происходить только по расплетенным одноцепочечным участкам ДНК, появляющимся в составе активного хроматина [15]. С нерасплетенной двуцепочечной ДНК олигонуклеотиды могут образовывать комплексы путем формирования трехтяжевых структур, в районах с гомопуриновыми-гомопиримидиновыми последовательностями. Большая бороздка ДНК, упакованной в нуклеосому, периодически обращена к поверхности гистонового октамера [16], и в этом случае экранирована коровыми пистонами, что должно препятствовать образованию комплекса с олигонуклеотидом. Поэтому, исследование влияния упаковки ДНК в нуклеосому на ззаимодействие с олигонуклеотидами является актуальной задачей. Локализация гистоновых октамеров на ДНК и экранированность белками последовательностей-мишеней ДНК могут быть определены методами футпринтинга: с помощью ферментов, ДНКазы I, микрококковой нуклеазы и химических реагентов [17, 18] В качестве реагентов для такого футпринтинга могут быть использованы и металлокомплексы [19,20].

В настоящей работе исследовали возможность создания на основе галоген-замещенных производных бензойной кислоты реакционноспособных производных олигонуклеотидов как для направленного расщепления ДНК так и для изучения структуры ДНК-белковых комплексов. В отличие от органических растворителей, в водных растворах медные комплексы бензойных кислот обладают пониженной стабильностью, что позволит добиться снижения степени неселективной деградации ДНК [21,22].

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось создание новых реагентов для расщепления ДНК на основе замещенных производных бензойной кислоты и исследование закономерностей их действия в присутствии ионов меди (II). В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Расщепление ДНК аренами в присутствии ионов Cu(II) и установление закономерностей этой реакции.

2. Исследование свойств реакционноспособного производного олигонуклеотида на основе о-бромбензойной кислоты как реагента для сайт-направленного расщепления ДНК в двуспиральном и трехспиральном комплексе. Сравнительное исследование расщепления ДНК под действием этого производного олигонуклеотида и производных олигонуклеотидов, несущих в качестве реакционноспособных групп фталоцианин кобальта (II) и блеомицин А5.

Возможность применения системы Си(П)/о-бромбензойная кислота для определения положения нуклеосомного кора на ДНК в составе реконструированной нуклеосомы и исследование доступности ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи для модификации производными олигонуклеотидов.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Коваль, Ольга Александровна

выводы

1. Исследовано Си(П)-зависимое расщепление ДНК аренами различной структуры.

• показано, что арены, в структуре которых имеется бензольное кольцо с присоединенной к нему карбоксильной группой, статистически расщепляют ДНК в присутствии ионов Си(П) без добавления восстановителей или перекиси водорода за счет присутствующего в растворе молекулярного кислорода, вызывая как прямые разрывы ДНК, так и образование пиперидин-лабильных модифицированных оснований.

• обнаружено, что арены вызывают окислительную деструкцию ДНК через Си(И)/Си(1)-индуцированное образование кислородных радикалов, зарегистрированных методом ЭПР с использованием спиновых ловушек и ингибиторов кислородных радикалов.

• показано, что хотя для генерации короткоживущих кислородных радикалов достаточно образования комплекса Си(П)*о-бромбензойная кислота в растворе, для эффективного расщепления ДНК необходимо образование комплекса ДНК-Си(И)-о-бромбензойная кислота.

• показана возможность применения системы Си(П)-обромбензойная кислота в качестве реагента для футпринтинга ДНК-белковых контактов в составе реконструированного хроматина для определения местоположения последовательности-мишени на нуклеосоме.

2. Изучено расщепление одноцепочечной и двуцепочечной ДНК конъюгатом олигонуклеотида с 5-(4/-амино-пропил-сульфамоил)-2-бромбензойной кислотой.

• показано, что в присутствии свободной о-бромбензойной кислоты этот конъюгат способен вызывать сайт-направленное расщепление ДНК при образовании комплементарных комплексов с одноцепочечной ДНК и двуцепочечной ДНК.

• сравнение расщепления ДНК в дуплексе и триплексе олигонуклеотидными конъюгатами, содержащими в качестве реакционноспособной группы о-бромбензойную кислоту, фталоцианин кобальта (П), и блеомицин А5 показало, что расщепление под действием конъюгата олигонуклеотида с 5-(4 -амино-пропилсульфамоил)-2-бромбензойной кислотой происходит с меньшей эффективностью, однако более специфично; приводит к образованию прямых разрывов и не требует присутствия в реакционной смеси восстановителя или перекиси водорода. 3. Исследована сайт-направленная модификация двуцепочечной ДНК в составе реконструированной нуклеосомы.

• футпринтинг ДНК с помощью системы Си(П)/о-бромбензойная кислота и микрококковой нуклеазы показывает, что при реконструкции нуклеосом на фрагменте промотора протоонкогена c-fos длиной 352 п.о. (-348/+3) последовательность (-97/-84), выбранная для образования трехцепочечного комплекса с производным олигонуклеотида, расположена в области нуклеосомного кора.

• впервые проведена сайт-направленная модификация двуцепочечной ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи алкилирующим производным гомопиримидинового олигонуклеотида. Показано, что наличие гистонового октамера не препятствует образованию триплекса олигонуклеотид-двуцепочечная ДНК и эффективному направленному алкилированию ДНК в составе такого комплекса (степень модификации до 48%).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коваль, Ольга Александровна, 2003 год

1. Helene С. The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming-oligonucleotides И Anticancer Drug Des. 1991. V. 6. P. 569-584.

2. Maher L.J III. DNA triple-helix formation: an approach to artificial gene repressors? II BioEssays. 1992. V.14. P. 807-815.

3. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives // Boca Raton, FL: CRC Press. 1994.

4. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues II Tetrahedron Lett. 1967. N. 37. P. 3557-3562.

5. Boutorin A.S., Vlassov V.V., Kazakov S.A., Kutiavin I.V., Podyminogin M.A. Complementary addressed reagents carrying EDTA-Fe(II) groups for directed cleavage of single-stranded nucleic acids IIFEBS Lett. 1984. V. 172. P. 43-46.

6. Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A., Vlassov V.V. Sensitized photomodification of single-stranded DNA by a binary system of oligonucleotide conjugates // Antisense Res. Dev. 1997. V. 4. P. 309-317.

7. Zarytova V.F., Sergeyev D.S., Godovikova T.S. Synthesis of bleomycin A5 oligonucleotide derivatives and site-specific cleavage of the DNA target II Bioconjug. Chem. 1993. V. 3. P. 189-193.

8. Chen C.B., Milne L., Landgraf R., Perrin D.M., Sigman D.S. Artificial nucleases II Chembiochem. 2001. V. 2. P. 735-740.

9. Francois J.-C., Helene C. Recognition and cleavage of single-stranded DNA containing hairpin structures by oligonucleotides forming both Watson-Crick and Hoogsteen hydrogen bonds II Biochemistry. 1995. V. 34. P. 65-72.

10. Frolova E.I., Fedorova O.S., Knorre D.G. Kinetic study of the addressed modification by hemin derivatives of oligonucleotides II Biochimie. 1993. V. 75. P. 5-11.

11. Strobel S.A., Dervan P.B. Site-specific cleavage of a yeast chromosome by oligonucleotide-directed triple-helix formation II Science. 1990. V. 249. P. 73-75.

12. Bigey P., Pratviel G., Meunier B. Cleavage of double-stranded DNA by 'metalloporphyrin-linker-oligonucleotide' molecules: influence of the linker II Nuc leic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3894-3900.

13. Kornberg R.D. Structure of chromatin II Annu. Rev. Biochem. 1977. V. 46. P. 931 -954.

14. Laskey R.A., Earnshaw W.C. Nucleosome assembly II Nature. 1980. V. 286. P. 763-767.

15. Drew H.R., Calladine C.R. Sequence-specific positioning of core histones on an 860 base-pair DNA. Experiment and theory. II J. Mol. Biol. 1986. V. 189. P. 179-188.

16. Zhang L., Gralla J.D. Micrococcal nuclease as a probe for bound and distorted DNA in lac transcription and repression complexes II Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 50175028.

17. Suzuki Т., Kuwahara J., Sugiura Y. Nucleotide sequence cleavage of guanine-modified DNA with alfatoxin Bl, dimethyl sulfate, and mitomycin С by bleomycin and deoxyribonuclease I //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. V. 117. P. 916-922.

18. Sigman D.S. Chemical nucleases II Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9097-105.

19. Basak M., Nagaraja V. A versatile in vivo footprinting technique using 1,10-phenanthroline-copper complex to study important cellular processes II Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 105-119.

20. Lindley J. Copper assisted nucleophilic substitution of aryl halogen II Tetrahedron. 1984. V. 40. P. 1433-1456.

21. Сергеев Д.С., Зарытова В.Ф. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами II Успехи химии. 1996. Т. 65. С. 377-401.

22. Cowan J.A. Metal activation of enzymes in nucleic acid biochemistry H Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1067-1088.

23. Trawick B.N., Osiek T.A., Bashkin J.K. Enhancing sequence-specific cleavage of RNA within a duplex region: incorporation of 1,3-propanediol linkers into oligonucleotide conjugates of serinol-terpyridine II Bioconjug. Chem. 2001. V. 12. P. 900-905.

24. Brigelius-Flohe R., Kelly F.J., Salonen J.T., Neuzil J., Zingg J.M., Azzi A. The European perspective on vitamin E: current knowledge and future research II Am. J. Clin. Nutr. 2002. V. 4. P. 703-711.

25. Bryan S.E., Vizard D.L., Beary D.A., LaBiche R.A., Hardy K.J. Partitioning of zinc and copper within subnuclear nucleoprotein particles II Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 5811-5823.