Однодоменные антитела для диагностики и защиты от урогенитальной инфекции, вызванной MYCOPLASMA HOMINIS тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Бурмистрова Дарья Андреевна

• Бурмистрова Дарья Андреевна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Бурмистрова Дарья Андреевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цель работы

Поставленные задачи

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Публикации по материалам работы

Личное участие автора в получении результатов

Объем и структура работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Антигенсвязывающие фрагменты моноклональных антител

Отличительные особенности молекулярной структуры однодоменных антител23

Технология получения однодоменных антител

Продуценты однодоменных антител

Использование однодоменных антител для диагностики бактериальных инфекций

Использование однодоменных антител для терапии бактериальных инфекций

Представление о факторах вирулентности микоплазм

Патогенный потенциал Mycoplasma hominis

Лечение инфекций, вызванных Mycoplasma hominis, и поиск новых терапевтических мишеней

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Оборудование, использованное в диссертационной работе

Микроорганизмы, используемые в диссертационной работе

Линии клеток млекопитающих, использованные в диссертационной работе

Плазмидные векторы, используемые в диссертационной работе

Ферменты для молекулярно-биологических процедур

Питательные среды и вещества

Методы

Общелабораторные методы и подходы

Культивирование микроорганизмов и культур клеток млекопитающих

Выделение нуклеиновых кислот

Молекулярное клонирование фрагментов ДНК

Полимеразная цепная реакция

Электрофоретическое разделение макромолекул

Иммуноблоттинг

Биотинилирование белков

Определение нуклеотидной последовательности ДНК

Получение однодоменных антител

Выделение липид-ассоциированных мембранных белков (LAMPs) M. hominis

Иммунизация, отбор крови и выделение лимфоцитов

Выделение РНК из лимфоцитов и синтез кДНК

ПЦР-амплификация последовательностей VHH

Клонирование VHH последовательностей в фагмидный вектор pHEN4 и получение библиотеки клонов-трансформантов

Получение библиотеки бактериофагов

Определение титра бактериофагов методом подсчета трансдуцирующих единиц

Паннинг на антигене

Скрининг клонов

Получение рекомбинантных конструкций для экспрессии белков

Трансформация

Продукция и очистка рекомбинантных белков

Определение кинетических констант реакций

Получение рекомбинантных аденовирусов

Методы работы с животными

Статистическая обработка результатов исследований

Биоинформатические методы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение и характеристика однодоменных антител, специфически связывающихся с M. hominis

Получение последовательностей, кодирующих однодоменные антитела

Получение белкового препарата VHH

Характеристика специфичности aMh06

Тримеризация aMh06

Создание продуцентов препаратов на основе aMh06 с изолейциновым зиппером (aM^-^-^)

Определение термодинамических характеристик взаимодействия aMh06-ILZ с антигеном

Идентификация антигена

Изучение диагностического потенциала препаратов на основе aMh06 для детекции M. hominis

Генетическая пассивная иммунизация для защиты от урогенитальной инфекции, вызванной M. hominis

Противомикоплазменное действие aMh в условиях in vitro

Получение вектора для генетической пассивной иммунизации

Оценка эффективности подхода генетической пассивной иммунизации для защиты от урогенитальной инфекции мышей, вызванной M. hominis

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

БСА (BSA) - бычий сывороточный альбумин

ИФА (ELISA)- иммуноферментный анализ

кДНК (cDNA)- кодирующая ДНК

КОЕ (CFU) - колониеобразующая единица

ЛАМП (LAMPs) - липид-ассоциированные мембранные белки

мРНК (mRNA) - матричная РНК

ПАМП (PAMPs) - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны

ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция

тРНК (tRNA) - транспортная РНК

цАМФ (cAMP) - циклический аденозинмонофосфат

ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетрауксусная кислота

HSP - белок теплового шока

A260 (A280 и т.п.) - поглощение при длине волны 260 нм (280 нм)

AP-1 - транскрипционный фактор «activator protein-1»

BoNT - ботулинистический нейротоксин

BSA - бычий сывороточный альбумин

САР-белок - белок-активатор катаболитных генов

CDR - гипервариабельная область иммуноглобулина

CH - константный домен иммуноглобулина

CMV промотор - ранний промотор цитомегаловируса человека

DMEM - среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко

DPBS - фосфатносолевой буфер Дульбекко

EDTA (ЭДТА) - этилендиаминтетрауксусная кислота

F(ab)2 - димер Fab

Fab - антигенсвязывающий фрагмент антитела FcR - рецептор, связывающийся с Fc-фрагментом

FcRn - неонатальный FcR

FR - константные структурные участки молекулы иммуноглобулина

hcAb - антитела, состоящие только из тяжелых цепей иммуноглобулинов

hcIgG - антитела, состоящие только из тяжелых цепей иммуноглобулинов класса G

IgNAR - акульи антитела, состоящие только из тяжелых цепей иммуноглобулинов

ILZ - изолейциновый зиппер

InlB - интерналин В листерий

IPTG - изопропилтиогалактопиранозид

IRF - интерферон-регулирующий фактор

LAMPs (ЛАМП) - липид-ассоциированные белки

LB - среда Лурия Бретани

LiAc - ацетат лития

LPS - липополисахарид

MALDI - Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

MBP - мальтоза-связывающий белок

MF - единицы Мак Фарланда

MOI - множественность инфекционных единиц

NF-kB - транскрипционный фактор «ядерный фактор каппа-би»

OptiMEM - оптимизированная среда Игла

PA - протективный антиген

PAMPs - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны

PBS - фосфатносолевой буфер

PEG - полиэтиленгликоль

PhSB - буфер для хранения бактериофагов

pIII - белок III головки бактеориофага М13

PLAP - плацентарная щелочная фосфатаза

rAd - рекомбинантный репликативнодефектный аденовирусный вектор

RPMI - среда "Roswell Park Memorial Institute medium"

rSAP - рекомбинантная алкалиновая фосфатаза креветки

scFv - объединенные в одну полипептидную цепь с помощью короткого полипептидного линкера VH- и VL-участки цепей иммуноглобулинов

SD - синтетическая среда с определенным набором аминокислот

SDS - додецилсудльфат натрия

SG - синтетическая среда с глюкозой

SGal - синтетическая среда с галактозой

SOC - супер-оптимальная среда с катаболитным репрессором SPRi - поверхностный плазмонный резонанс

SpvB - АДФ-рибозилтрансфераза сальмонеллы («salmonella plasmid virulence protein В»)

STEC - шига-токсин продуцирующия кишечная палочка Stx - шига-токсин

TBS - буфер на основе трис(гидроксиметил)аминометана

TcdA - токсин А Clostridium difficile

TcdB - токсин Б Clostridium difficile

TE - трис-ЭДТА буферный раствор

TLR - толл-подобный рецептор

TMB - тетраметилбензидин

TPBS - фосфатносолевой буфер, содержащий детергент твин-20

TRIM21 - содержащий трехчастный мотив белок 21 («tripartite motif-containing protein 21»)

TSST-1 - токсин синдрома токсического шока 1 TX-114 - тритон Х-114

UreC - фосфоглюкозамин мутаза Helicobacter pylori (белок из группы уреаз) VH - вариабельный домен тяжелой цепи канонического иммуноглобулина VL - вариабельный домен легкой цепи канонического иммуноглобулина VHH - однодоменные антитела, наноантитела

У-КЛЯ - однодоменные антитела акул

УРБ - среда содержащая дрожжевой экстракт, пептон, декстрозу

УТ - одна из стандартных сред для культивирования бактерий и нитчатых бактериофагов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Mycoplasma hominis - первый вид микоплазм, изолированный от человека в

1937 году. Он был выделен впервые из абсцесса бартолиновой железы. Важную роль в изучении патогенетической роли M. hominis сыграли работы В.Д. Тимакова и Г.Я. Каган, которые были выполнены в НИИ Эпидемиологии и Микробиологии (сейчас «ФНИЦЭМ им. Гамалеи») [Тимаков В.Д., Каган Д.Я., 1973; Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович Ю.В., 1995].

Для нескольких видов микоплазм показана их патогенность для животных и человека в соответствии с постулатами Коха. В отношении патогенности M. hominis у специалистов существуют разные точки зрения, рассматривающие этот микроорганизм либо как патогенный, либо как опортунистический микроорганизм. M. hominis обнаруживается преимущественно в биообразцах из нижней части урогенитального тракта. При этом часто наблюдается бессимптомное носительство и длительная персистенция M. hominis, вызывающая хронические воспалительные процессы. Частота таких случаев варьирует в зависимости от пола, расы, возраста, сексуальной активности, гормонального статуса и может достигать нескольких десятков процентов [Стуколкина Н., 2005; Раковская И.В., Горина Л.Г., Утюшева М.Г., 2006; Балабанов Д.Н., Раковская И.В., 2007; Бархатова О.И., Балабанов Д.Н., Раковская И.В., 2008; Кузнеченкова Т., Теплова С., 2010 Arya и др., 2001; TaylorRobinson, Rosenstein, 2001]. Данные многих исследователей свидетельствуют о патогенетической роли M. hominis в ряде заболеваний. Так, показана этиологическая роль M. hominis в постабортивных и постродовых осложнениях, а также в преждевременных родах и недостаточном весе новорожденных [Agger и др., 2014; Neman-Simha и др., 1992]. Хроническая инфекция, вызванная M. hominis, приводит к развитию воспалительных заболеваний урогенитального тракта, и, как следствие, бесплодию [Jamalizadeh Bahaabadi и др., 2014; Miron и др., 2013] . Тревожные опасения при обнаружении M. hominis у беременных женщин связаны

с высоким риском инфицирования плода. Вероятность передачи её новорожденным может достигать 60% случаев [Стуколкина Н., 2005]

Особенно часто M. hominis выявляется при бактериальном вагинозе. Хотя M. hominis не является этиологическим агентом этого заболевания, её часто обнаруживают в высоком титре в вагинальных образцах у женщин с таким диагнозом [Keane и др., 2000] . В ряде исследований показано, что M. hominis активно взаимодействует с другими микроорганизмами [Миллер Г.Г., Раковская И.В., 1983]. Так, M. hominis может проникать внутрь клеток Trichomonas vaginalis и размножаться в ассоциации с этим простейшим [Dessi и др., 2006] . Синергизм M. hominis и T. vaginalis не только обеспечивает инфицирование эукариотических клеток, но и потенциирует создание необходимого для колонизации провоспалительного статуса инфицированных тканей [Dessi и др., 2005; Fiori и др., 2013; Morada и др., 2010; Rappelli и др., 1998; Rappelli и др., 2001]

В работе коллектива авторов, в том числе сотрудников НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, была показана ассоциация M. hominis с онкотрансформацией клеток, в частности со злокачественными опухолями простаты [Миллер Г.Г., Клицунова Н.В., Раковская И.В., 2005;Логунов Д.Ю. и др., 2009; Барыкова Ю.А. и др., 2010; Barykova и др., 2011; Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Раковская И.В., 2012] . Было показано, что механизм онкотрансформации связан с активацией сигнальных каскадов, обеспечивающих не только провоспалительный статус, но и снижающих активность белка p53.

С развитием представлений о патогенетической роли микоплазм, началось изучение механизмов их взаимодействия с организмом хозяина и молекулярных основ этих процессов. Несмотря на простоту организации микоплазм, их паразитический характер существования обусловил высокую степень интеграции многих систем их жизнеобеспечения и мультифункциональность различных факторов вирулентности. Ограниченный набор ферментов, осуществляющих биохимические реакции их метаболизма, свидетельствует о важной роли систем поглощения питательных веществ из окружающей среды, в том числе из тканей

эукариотического организма, оккупированных микоплазмами. Механизмы поглощения метаболитов включают в себя системы деградации макромолекул до субъединиц, доступных для связывания и транспортирования внутрь микоплазменной клетки. Главную роль в этом процессе играют белки семейства АВС транспортеров. Геномный анализ большинства видов микоплазм показал наличие большого количества оперонов генов АВС транспортеров, однако субстратная специфичность большинства этих белков до сих пор не определена [Rechnitzer и др., 2011] . Протеомные исследования некоторых видов микоплазм показали, что значительная доля всех белков приходится на различные компоненты комплексов АВС транспортеров, что также свидетельствует об их важной роли в жизнедеятельности этих бактерий [Cacciotto и др., 2013; Masukagami и др., 2013; Raherison и др., 2005; Schmidt, Browning, Markham, 2007; Tseng и др., 2013; Zhao и др., 2004] . Авторы этих исследований предполагают, что АВС транспортеры могут являться целевыми мишенями для терапевтического воздействия, тем не менее экспериментальные данные, напрямую подтверждающие это предположение, в мировой литературе отсутствуют. В качестве мишень-специфических молекул для терапии инфекций, вызванных M. hominis, могут быть использованы моноклональные антитела или их различные производные (пассивная иммунизация).

Пассивная иммунизация была первой антимикробной стратегией направленного действия. Способность сывороток, содержащих специфические антитела, защищать от бактериальных токсинов была описана в начале 1890 годов [Kantha, 1991] . Однако открытие антибиотиков в 1935-1940 годах вытеснило применение антител в качестве антимикробных агентов. Тем не менее, во второй половине 20 века с возникновением и стремительным распространением антибиотикоустойчивости среди многих патогенов, разработка препаратов на основе антител, обладающих бактерицидным и бактериостатическим действием, вновь приобрела актуальность [Manohar, Ahuja, Crane, 2015] . Прогресс в области технологии получения моноклональных антител и их производных привел к тому,

что терапевтические препараты на основе антител сейчас являются одной из самых быстроразвивающихся отраслей фармацевтической продукции.

Канонические антитела, несмотря на их широкое распространение, имеют очевидные для практического использования недостатки, связанные с их структурной организацией. Канонические антитела могут вызывать дозо-зависимую токсичность и другие побочные эффекты, а также имеют лимитированную эффективность проникновения в различные ткани [Descotes, 2009; Hansel и др., 2010; Shah, Betts, 2013; Tabrizi, Bornstein, Suria, 2010] . Эти ограничения привели к необходимости развития нового направления - получению различных антигенсвязывающих фрагментов антител, главным образом Fab (~57кДа) и scFv (~27кДа). Эти типы препаратов на основе моноклональных антител часто оказываются малорастворимыми, склонными к агрегации, с чем связаны сложности при их продукции в препаративных количествах [Holliger, Hudson, 2005]

В начале 1990 годов у представителей семейства Camelidae наряду с иммуноглобулинами канонической структуры были открыты неканонические антитела, которые состоят из димеров только тяжелых цепей иммуноглобулинов класса G [Hamers-Casterman и др., 1993] . Антигенсвязывающий домен этих антител сформирован вариабельными участками только тяжелой цепи. Таким образом, подобные неканонические антитела являются своего рода природным примером тенденции уменьшения размера иммуноглобулинов. Вскоре аналогичные антитела были также обнаружены у акул, скатов и некоторых других хрящевых рыб [Greenberg и др., 1995] . Одноцепочечная природа антигенсвязывающих фрагментов таких иммуноглобулинов позволила свести процедуру их получения к селекции только функциональных фрагментов тяжелых цепей, так называемых однодоменных антител (VHH). Дальнейшие исследования показали, что подобные структуры, сформированные в ходе эволюционного процесса и прошедшие аффинное созревание in vivo, обладают высокой стабильностью, растворимостью и другими превосходными физико-химическими

и термодинамическими характеристиками [Dumoulin и др., 2002; Linden van der и др., 1999] . Более того, гипервариабельные домены (CDR - complementarity determining regions), в среднем содержат большее число аминокислотных остатков (по сравнению с каноническими антителами), что увеличивает площадь контакта с антигеном, компенсируя отсутствие легких цепей, и приводит к высокой аффинности взаимодействия [Muyldermans и др., 1994]

Однодоменные антитела очень быстро заняли собственную нишу в области моноклональных антител и их производных. Высокий уровень интереса к VHH обусловлен не только возможностью их применения в различных целях, но и эффективной и воспроизводимой технологией получения.

Степень разработанности темы исследования

В настоящее время методы выявления M. hominis в клинических образцах

ограничены высевом на селективные питательные среды, ПИФ и ПЦР [Балабанов Д.Н., Раковская И.В., Горина Л.Г., 2006; Румянцева Т., Варламова А., Гущин А., 2014] . Несмотря на распространенность этих методов, они имеют существенные недостатки. Так, время культивирования M. hominis на селективных питательных средах составляет минимум 48 часов, а в большинстве случаев занимает от 72 часов до недели. Оценка результатов ПИФ с поликлональными сыворотками часто носит субъективный характер. Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, а результаты могут быть получены за несколько часов, тем не менее существует проблема ложноположительных результатов и чувствительностью к ингибиторам реакции. Для установления диагноза бактериальной инфекции с целью выбора этиотропного лечения необходимо применение комплексной диагностики, основанной на не менее чем двух методах выявления возбудителя. Высокотехнологичный метод на основе ИФА для прямого выявления специфических антигенов бактерий может эффективно использоваться как в качестве скринингового, так и подтверждающего теста. Однако специфичность и чувствительность ИФА в первую очередь определяются выбранными антителами.

В случае M. hominis., отсутствуют специфические моноклональные антитела, которые позволяли бы проводить такое исследование.

При выявлении у пациента M. hominis, единственным распространенным способом лечения является антибиотикотерапия. Тем не менее, у микоплазм, как и у других бактерий, существует проблема растущей антибиотикорезистентности [Romanova и др., 2015; Song и др., 2014; Wang и др., 2014] . В связи с этим актуальной задачей является разработка терапевтических средств иного механизма действия, который заключался бы не только в прямом микоплазмоцидном эффекте, но и способствовал коррекции иммунологических механизмов направленного действия. Применение специфических антител (пассивная иммунизация) может явиться перспективным подходом для терапии инфекций, вызванных M. hominis.

Таким образом, получение однодоменных антител к антигенам M. hominis, является актуальной задачей. Специфические однодоменные антитела могут быть использованы для создания диагностических тест-систем, а также могут быть использованы для пассивной иммунизации от микоплазменных инфекций.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Однодоменные антитела для диагностики и защиты от урогенитальной инфекции, вызванной MYCOPLASMA HOMINIS»

Цель работы

Целью работы явилось получить однодоменные антитела, специфически связывающиеся с M. hominis, и изучить возможность их применения для диагностики и защиты от урогенитальной инфекции, вызванной M. hominis.

Поставленные задачи

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. получить библиотеку кДНК генов иммуноглобулинов верблюда, иммунизированного липидассоциированными белками M. hominis, определить последовательности, кодирующие VHH, связывающиеся с M. hominis, и охарактеризовать специфические свойства полученных VHH;

2. идентифицировать молекулу антигена, с которым связываются полученные VHH;

3. получить про- и эукариотические продуценты однодоменных антител и отработать методы их очистки из различных систем экспрессии;

4. оценить диагностический потенциал полученных молекул на основе VHH для детекции M. hominis методом вестерн-блот гибридизации, методом иммуноцитохимического окрашивания, методом иммуноферментного анализа, методом проточной флуорометрии;

5. создать вектор для генетической пассивной иммунизации на основе рекомбинантного аденовируса 5 серотипа, экспрессирующего последовательность VHH и Fc-фрагмент иммуноглобулина G;

6. изучить возможность применения генетической пассивной иммунизации полученным вектором для защиты от экспериментальной урогенитальной инфекции у мышей, вызванной M. hominis.

Научная новизна работы

Впервые получены однодоменные антитела, связывающиеся с M. hominis, и

идентифицирована специфическая мишень - субстрат-связывающий белок АВС-транспортера M. hominis.

Получены олигомеры специфических VHH, содержащие в своем составе мотив тримеризующего изолейцинового зиппера (VHH-ILZ), что направлено на увеличение.

Впервые показано, что присоединение мотива мальтоза-связывающего белка (МВР) к VHH-ILZ позволяет нарабатывать МВР-VHH-ILZ в растворимой форме в клетках Escherichia. coli.

Впервые получены продуценты VHH-ILZ на основе бактерий Bacillus megaterium и дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Впервые показано, что молекулы на основе специфических VHH могут быть использованы для детекции M. hominis, в том числе методом проточной флуорометрии.

Впервые показано, что присоединение к VHH Fc-фрагмента иммуноглобулина G2а мыши, обеспечивает доставку химерных молекул VHH-Fc на поверхность слизистой оболочки урогенитального тракта.

Впервые показано, что генетическая пассивная иммунизация, оказывает защитный эффект на модели экспериментальной урогенитальной инфекции у мышей, вызванной M. hominis.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные VHH, специфически связывающиеся с субстрат-

связывающимся белком АВС-транспортера M. hominis, позволят изучить роль этого мембранного комплекса в жизнедеятельности, и особенно, в патогенезе M. hominis.

Полученные результаты по использованию специфических VHH для детекции M. hominis позволят приступить к созданию диагностической тест-системы для обнаружения M. hominis в различных образцах.

Полученные результаты по возможности использования генетической пассивной иммунизации для защиты от урогенитальной инфекции, вызванной M. hominis, позволят использовать этот подход при создании препаратов для профилактики и терапии инфекций, вызванных M. hominis.

По результатам работы подготовлены методические рекомендации «Методические рекомендации по разработке экспериментальных модельных систем (биосенсоров) для оценки биологических свойств наноматериалов различной структуры и химического состава», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России 05 сентября 2013 г.

Результаты работы защищены патентом на изобретение RU 0002562158 "Рекомбинантная псевдоаденовирусная частица, продуцирующая модифицированные наноантитела, узнающие микоплазму М. hominis, фармацевтическая композиция на ее основе и способ ее использования для терапии микоплазмозов", зарегистрированного в государственном реестре 10 августа 2015 года.

Методология и методы исследования

В работе использовались технология бактериофагового дисплея,

современные микробиологические методы, молекулярно-генетические методы, хроматографические методы, биохимические методы, иммунологические методы, вирусологические методы, методы работы с животными и биоинформационные методы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Получены однодоменные антитела, специфически связывающиеся с

субстрат-связывающим белком АВС-транспортера M. hominis. Охарактеризована их видовая специфичность в отношении лабораторных штаммов и клинических изолятов M. hominis.

2. Получены про- и эукариотические продуценты молекул на основе однодоменных антител.

3. Показана эффективность детекции M. hominis с использованием полученных однодоменных антител методами вестерн-блот гибридизации, твердофазного иммуноферментного анализа (в том числе в варианте «сэндвич-ИФА»), иммуноцитохимического окрашивания, проточной цитофлуорометрии.

4. Получена генетическая конструкция на основе репликативнодефектного рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего химерный белок, состоящий из полученного однодоменного антитела и Fc-фрагмента иммуноглобулина класса G (rAd5-CMV-aMh-FcG2a).

5. В экспериментах in vivo показано, что системное введение rAd5-CMV-aMh-FcG2a обеспечивает присутствие однодоменных антител как в сыворотке крови, так и в смывах из урогенитального тракта мышей в течение 2-х недель.

6. На модели урогенитальной инфекции у мышей, вызванной M. hominis., показана профилактическая и терапевтическая эффективность генетической пассивной иммунизации с использованием rAd5-CMV-aMh-FcG2a.

Степень достоверности и апробация результатов

Для решения поставленных задач в работе использовались современные

инструментальные методы. Обсуждение результатов проведено с учетом современных данных медицинской и биологической науки. Научные положения и выводы, изложенные в диссертации, обоснованы и подтверждены фактическим материалом. Материалы диссертационной работы доложены на III Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013); на конференции отдела Клеточного стресса Института рака Розвелл-парк (Roswell Park Cancer Institute) (Буффало, 2013) на I Международной молодежной биотехнологической школе-конференции «Биотехнология: от бактериофагов до вакцин» (Барнаул, 2014); на 19-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2015); на Международном конгрессе «Инновационные технологии в иммунологии и аллергологии» (Москва, 2015).

Апробация работы состоялась на научной конференции отделов иммунологии, медицинской микробиологии, генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России 03 марта 2016 года.

Публикации по материалам работы

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 7 в

журналах, рекомендованных ВАК, а также 1 патент и 1 методические указания, 5 тезисов научных конференций.

Личное участие автора в получении результатов

Все этапы диссертационной работы, оформление диссертации и

автореферата выполнены Бурмистровой Д.А. самостоятельно. Отдельные этапы были проведены в сотрудничестве с другими исследователями, о чем отмечено в тексте диссертации и автореферата.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 168 странице машинописного текста

и включает оглавление, список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (222 источников, из которых 20 отечественных и 202 иностранных). Работа содержит 4 таблицы и 41 рисунок.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Антигенсвязывающие фрагменты моноклональных антител

Развитие методов клеточной биологии, генетической инженерии и технологии фагового дисплея привели к разработке и внедрению рекомбинантных препаратов на основе антител, широко применяемых в области онкологических, аутоиммунных, сердечнососудистых и инфекционных заболеваний.

Канонические антитела, несмотря на их широкое распространение, имеют очевидные для практического использования недостатки, связанные, главным образом, с их структурной организацией. Канонические антитела представляют собой структуру, состоящую из 2-х тяжелых и 2-х легких цепей иммуноглобулинов. Подобная комплексная структура значительно затрудняет и увеличивает стоимость получения антител, поскольку поиск функциональной комбинации тяжелых и легких цепей является неотъемлемой частью технологии. Помимо этого, размер канонического антитела составляет примерно 150 кДа, что в случае введения в организм может вызывать дозозависимую токсичность и другие побочные эффекты, а также лимитирует эффективность проникновения в различные ткани [Descotes, 2009b; Hansel и др., 2010; Shah, Betts, 2013; Tabrizi, Bornstein, Suria, 2010] . Эти ограничения привели к необходимости развития нового направления - получению различных антигенсвязывающих фрагментов антител (в англоязычной научной литературе эту тенденцию называют «downsizing») (рисунок 1).

Рисунок 1. Моноклональные антитела и их различные производные.

Среди большого количества различных производных моноклональных антител пока наибольшее распространение получили Fab (~57кДа) и scFv (~27кДа) фрагменты (антигенсвязывающие фрагменты, лишенные большей части константных доменов тяжелых цепей и их производные, соединенные в единую полипептидную последовательность соответственно). Эти типы препаратов на основе моноклональных антител способны эффективно проникать в ряд тканей организма, но часто оказываются малорастворимыми, склонны к агрегации и вызывают сложности при получении в препаративных количествах [Holliger, Hudson, 2005; Jain, Kamal, Batra, 2007] .

В начале 1990 годов у представителей семейства Camelidae наряду с иммуноглобулинами канонической структуры были обнаружены неканонические антитела, состоящие из димеров только тяжелых цепей иммуноглобулинов класса G [Hamers-Casterman и др., 1993]. Антигенсвязывающий домен этих антител сформирован вариабельными участками только тяжелой цепи (рисунок 2). Таким образом, подобные неканонические антитела являются своего рода природным

примером тенденции уменьшения размера иммуноглобулинов. Вскоре аналогичные антитела были также обнаружены у акул, скатов и некоторых других хрящевых рыб [ОгеепЬе^ и др., 1995] . Одноцепочечная природа антигенсвязывающих фрагментов таких иммуноглобулинов позволила свести процедуру их получения к селекции только функциональных фрагментов легких цепей, так называемых однодоменных антител или УНЫ.

Рисунок 2. Канонические и неканонические антитела.

Дальнейшие исследования показали, что подобные структуры, сформированные в ходе эволюционного процесса и прошедшие аффинное созревание in vivo, обладают высокой стабильностью, растворимостью и другими физико-химическими и термодинамическими характеристиками, позволяющими эффективно связываться с антигенами различной природы [Dumoulin и др., 2002; Linden van der и др., 1999]. Более того, гипервариабельные домены (CDR -complementarity determining regions) в среднем содержат большее число аминокислотных остатков (по сравнению с каноническими антителами), что увеличивает площадь контакта с антигеном, компенсируя отсутствие легких цепей, и приводит к высокой аффинности взаимодействия [Muyldermans и др., 1994]. Благодаря своим малым размерам (примерно 2,5 нм на 4 нм) VHH способны эффективно проникать в различные ткани организма и, в некоторых случаях, даже способны проходить гематоэнцефалический барьер [Muruganandam и др., 2001].

VHH фрагменты очень быстро заняли собственную нишу в области моноклональных антител и их производных. Некоторые продукты на основе VHH были успешно коммерциализованы фирмами Ablynx и GenWay Biotech, и сейчас находятся на завершающих стадиях клинических испытаний. Фирмой Ablynx в 2003 году было введено новое обозначение VHH - «nanobodies», подчеркивающее размеры этих молекул и их высокую аффинность связывания с антигенами [Wolfson, 2006]. Название «nanobodies» (русскоязычный перевод -«наноантитела»), хотя и является товарным знаком, получило очень широкое распространение для обозначения VHH и зачастую используется в качества термина в научной литературе. Общее же количество публикаций, посвященных VHH, в международной базе данных Web of Science насчитывает несколько тысяч статей за последние 10 лет, опубликованных научными коллективами из более чем 300 организаций по всему миру [Vanlandschoot и др., 2011]. Такой высокий уровень интереса к VHH обусловлен не только возможностью применения в различных областях, но и эффективной и воспроизводимой технологией получения. Большая часть публикаций, предметом которых являются VHH, относятся к таким областям, как молекулярная биология, иммунология, гематология и экспериментальная медицина.

Отличительные особенности молекулярной структуры однодоменных антител

Наряду с каноническими иммуноглобулинами класса G (IgG), часть IgG2 и IgG3 в организме представителей семейства Cameliedae (верблюды, ламы, альпаки, викуньи) представлены неканоническими формами, состоящими из димеров только тяжелых цепей и лишенными CHI-регионов константных доменов антител. Такие неканонические антитела, состоящие из тяжелых цепей, называются hcAb (heavy-chain antibody). Антигенсвязывающий сайт hcAb расположен на VHH-домене, причем VHH-домен полностью сохраняет свою структуру и функции

независимо от других структурных элементов таких антител [Hamers-Casterman и др., 1993].

Выравнивания последовательностей VHH с VH-доменами канонических антител показали, что они сходны по организации аминокислотных остатков, а основные отличия локализованы в гипервариабельных петлях (CDR -complementarity determining regions) и Fr2 регионе (framework-2 region) [Muyldermans и др., 1994] (рисунок 3).

VH

11114Р

11

37 V 44G45L47W

Я АЛ

84А

Л.

FR1

CDR1

FR2

CDR2

FR3

CDR3

FR4

C22L

| С92

VHH 11S14A \\ 37F 44E45R47G 84Р *

FR1 CDR1 FR2 FR3 CDR3 FR4

гм гм СЗЗ IC92 СЮОе

Рисунок 3. Характерные отличия аминокислотных последовательностей УНЫ от УН фрагментов канононических иммуноглобулинов.

Причины возникновения ЬсЛЬ и закрепления их в ходе эволюционного процесса у верблюдовых до сих пор вызывают вопросы. Тем не менее общепризнанными являются ряд гипотетических механизмов молекулярной эволюции ЬсЛЬ [Б^шк, БеБсЬасЬ!, МиуМегтапБ, 2011]. Согласно этим предположениям, точечная мутация на 5' конце интрона последовательности СН1 привела к исчезновению консенсусного сигнала сплайсинга мРНК, что привело к потере СН1. В результате еще нескольких точечных мутаций гидрофобные аминокислоты в позициях 37, 44, 45 и 47 были заменены на гидрофильные. В результате этих изменений укороченные и более растворимые тяжелые цепи

перестали эффективно связываться с белками-шаперонами и стали выделяться из эндоплазматического ретикулума клетки в растворимой форме. Гипервариабельные домены CDR1 и CDR2 по своей структуре сходны с гомологичными доменами VH канонических антител, в тоже время, CDR3, как правило, представлен большим числом аминокислотных остатков. Увеличение числа аминокислот подразумевает большую вариабельность последовательностей, что дает VHH возможность связывать альтернативные эпитопы различных антигенов. Однако более гибкая молекулярная структура обладает большей энтропией, поэтому CDR3 в структуре VHH стабилизируется дополнительной дисульфидной связью [Flajnik, Deschacht, Muyldermans, 2011]. Этими структурными аспектами CDR3 объясняется феноменальная способность иммунной системы верблюдовых вырабатывать большое число антител, блокирующих активность ферментов за счет конкурирования с субстратами или лигандами за связывание с активными ферментативными центрами [Chavanayarn и др., 2012; Desmyter и др., 1996; Desmyter и др., 2002] . Поскольку для терапевтического использования во многих случаях необходимы антитела, обладающие как раз такого рода биологической активностью, то VHH представляют исключительный интерес для биомедицины не только как инструменты для специфической детекции антигенов, но и как терапевтические агенты.

Технология получения однодоменных антител

Технология получения VHH фрагментов заданной специфичности является воспроизводимой процедурой, не требующей дорогостоящего оборудования, а весь процесс может быть реализован в течение нескольких месяцев [Kastelic и др., 2009; Pardon и др., 2014]. Отчасти именно поэтому прогресс в области получения и использования VHH развивается весьма быстрыми темпами.

Технология получения VHH в общем виде состоит из нескольких ключевых этапов, каждый из которых может быть реализован с помощью как общепринятых

методик и подходов, так и с использованием оригинальных решений в зависимости от целей, задач и объектов исследования.

Первый этап в получении VHH фрагментов заданной специфичности - это иммунизация животного. Неканонические антитела образуются в организме всех животных семейства Cameliedae. Относительная доля таких антител варьирует в переделах нескольких десятков процентов. Выбор определенного вида животного (лама, альпака, одногорбый или двугорбый верблюд) зависит в большей степени от возможностей содержания животных. К сожалению, в России получением и исследованием VHH пока занимаются единичные группы ученых, а животные из семейства Верблюдовых содержатся, как правило, в зоопарках или у частных заводчиков.

Как и в большинстве иммунологических исследований, на этапе иммунизации решающую роль играет характер антигена, выбор адъюванта, способ его введения и схема иммунизации. Как правило, в большинстве работ эффективно применяют последовательную иммунизацию очищенными белковыми антигенами с добавлением хорошо известных в ветеринарии классических адъювантов, таких как адъювант Фройнда или соединения алюминия [Spickler, Roth, 2003]. Максимальный титр антител класса G наблюдается в таких случаях примерно на 610 неделе после иммунизации [Ferrari и др., 2012]. Тем не менее, в случаях, когда невозможно или нецелесообразно получение очищенного белкового препарата в достаточном количестве или целью исследования является получение VHH к неизвестному антигену, присутствующему в том или ином материале, используют в качестве иммуногена многокомпонентные препараты (смесь белков, целые бактерии и вирусы, лизаты клеток или даже целые клетки) [Garaicoechea и др., 2008] [Maussang, Mujic-Delic, Descamps, 2013]. Смешанные антигены

позиционируются в случае инфекционных заболеваний как «инфектомы» (видимо, присутствует аналогия с термином «веном», использующимся применительно к ядам) [Toms и др., 2011]. Получение «инфектом-специфичных» VHH было успешно реализовано для ряда мишеней [Saerens и др., 2008] . Также для

иммунизации используются различные генетические векторы, обеспечивающие продукцию целевого иммуногена in vivo [Koch-Nolte и др., 2007] . В этом случае однократное введение обеспечивает длительное присутствие иммуногена в организме и обеспечивает формирование специфического иммунного ответа.

Второй этап заключается в получении библиотеки генов, кодирующих последовательности VHH фрагментов антител. Для этого у иммунизированного животного забирают кровь и выделяют из нее мононуклеарные клетки, в том числе лимфоциты. Необходимо отметить, что в ряде работ исследователи не ограничивались периферической кровью, а отбирали селезенки или лимфоузлы [Maass и др., 2007] . Этот подход, хоть и успешен, но гораздо менее гуманен. В целом, существенным требованием на этом этапе, помимо общих требований к лабораторной практике и качеству образцов, является работа с достаточным количеством исходного материала, поскольку важно соблюсти множественность разнообразия специфических для VHH мРНК. Полученный материал используют для выделения РНК и получения кДНК, на матрице которой осуществляют амплификацию VHH-кодирующих последовательностей. Поскольку нуклеотидные последовательности канонических и неканонических антител обладают высокой степенью гомологии, то важной задачей является дифференциация VHH и VH последовательностей. Для этого различными авторами было разработано несколько стратегий ПЦР [Pardon и др., 2014] . Отсутствие CH1 региона у неканонических антител позволяет отличить соответствующие ампликоны по размеру, а затем, изолировав необходимый пул продуктов ПЦР, провести второй раунд амплификации. Помимо гнездовой ПЦР, также описаны праймеры, позволяющие напрямую амплифицировать последовательности, соответствующие только VHH [Pardon и др., 2014] . Амплифицированные последовательности, кодирующие VHH, затем клонируют в фагмидный вектор.

Фагмидные векторы, в которые клонируют последовательности VHH, разнообразны [Qi и др., 2012]. Практически всегда используются фагмиды на основе рШ белка М13 бактериофага. Основной принцип фагмид заключается в

том, что инсерцию VHH проводят в рамку считывания pIII белка бактериофага М13. Поскольку фагмиды содержат два ориджина репликации, то они могут реплицироваться как в форме двуцепочечной плазмидной ДНК, так и в виде одноцепочечной ДНК, способной упаковываться в капсид бактериофага M13. В бактериальной клетке, содержащей фагмиду с инсерцией VHH, происходит синтез белка pIII, слитого с последовательностью VHH. В тоже время в этой клетке присутствует одноцепочечная форма этой фагмиды. В случае если в этой клетке появится источник всех остальных структурных белков бактериофага, произойдет сборка вирионов, причем в головку бактериофага будет упакован химерный белок, состоящий из pIII и VHH, а в капсид будет упакована одноцепочечная ДНК, содержащая последовательность, кодирующую этот химерный белок. На этом дуализме фагмид основан принцип фагового дисплея как подхода для изоляции специфических белок-кодирующих последовательностей [Hammers, Stanley, 2014].

Как правило, помимо общих элементов, таких как ген селективного маркера антибиотикоустойчивости, фагмиды часто содержат различные тэги в рамке считывания VHH-pIII для удобства детекции экспрессии белка, а также дальнейшей очистки и использования VHH. В большинстве случаев это следующие тэги или их комбинации: His-tag, HA-tag, c-Myc-tag, Strep-tag, FLAG-tag и E-tag [Qi и др., 2012]. Также, в некоторых фагмидах предусмотрен участок кодирующий сайт трипсинолиза, располагающийся между последовательностями VHH и pIII [Baek и др., 2002]. С использованием таких конструкций становится возможным элюция связавшихся с антигеном фаговых частиц с помощью обработки трипсином. К тому же отщепление VHH от головки фага снижает риск влияния VHH на его инфекционность. Таким образом, существует большое многообразие фагмидных векторов, которые позволяют исследователям выбрать оптимальное решение для их экспериментальных задач.

Ключевым завершающим звеном этого этапа является трансформация полученной библиотеки VHH в фагмидном векторе в соответствующий штамм E.coli и получение библиотеки индивидуальных клонов-трансформантов.

До сих пор речь шла о получении библиотеки с использованием иммунизированного животного. То есть В-лимфоциты, продуцирующие антитела, проходили клональную селекцию in vivo. Современные технологии позволяют получать синтетические библиотеки антител и их фрагментов такой комплексности, чтобы из них также можно было отобрать специфические VHH, в том числе на такие антигены, иммунизация которым затруднительна или невозможна [Frigotto и др., 2015; Yan и др., 2014]. Однако работа с такими библиотеками на начальных этапах трудоемка, а также всегда существует вероятность отбора последовательностей, которые могут быть стабильны только в составе слитого белка VHH-pIII, тогда как собственно VHH не будут обладать необходимыми свойствами. Более того, наши исследования разнообразия последовательностей VHH с использованием высокопроизводительного секвенирования, показали, что широкая вариабельность аминокислотных остатков характерна не только для CDR петель, но затрагивает и константные области, что не учитывается при конструировании синтетических библиотек. Тем не менее, подобные синтетические библиотеки представляют собой в некоторой степени универсальный источник VHH [Finlay, Almagro, 2012; Ponsel и др., 2011; Sidhu, Fellouse, 2006] .

Третий этап технологии получения VHH определенной специфичности представляет собой собственно процедуру фагового дисплея. Как уже описывалось выше, фагмидные вектора обладают двумя важнейшими свойствами, на которых основан фаговый дисплей: обеспечивают экспрессию слитого белка VHH-pIII в клетках E.coli и имеют в своей структуре функциональный ориджин репликации бактериофага M13, то есть могут существовать в форме одноцепочечной ДНК, которая может быть упакована в головку бактериофага M13. Однако, для сборки частиц бактериофага необходим источник всех остальных структурных белков. В процедуре фагового дисплея в качестве такого источника используется бактериофаг-помощник. Как правило, бактериофаг-помощник представляет собой функциональный бактериофаг на основе M13, имеющий в своем составе все

необходимые детерминанты для сборки фаговых частиц. При инфицировании таким бактериофагом-помощником клетки E.coli, уже трансформированной фагмидой, создается система, в которой присутствуют все элементы для сборки частиц бактериофага. В этих условиях головка бактериофага собирается как из белков дикого типа (наличие которых обеспечено фагом-помощником), так и из слитых белков VHH-pIII (наличие которых обеспечено фагмидой). Упаковка в фаговую частицу одноцепочечной ДНК также происходит либо с фагмидной ДНК, либо с ДНК фага-помощника. Таким образом, из одной клетки E.coli, трансформированной фагмидой и инфицированной фагом-помощником выходит несколько вариантов фаговых частиц: с головкой содержащей или не содержащей VHH-pIII и с одноцепочечной ДНК фагмиды или фага-помощника. Одной из главных задач совершенствования процедуры фагового дисплея является смещение равновесия в сторону сборки фаговых частиц, содержащих ДНК фагмиды и VHH-pIII слитого белка. Основным направлением для решения этой задачи является модификация фага-помощника таким образом, чтобы его ДНК была как можно менее репликативнокомпетентной, а белок pIII с меньшей вероятностью упаковывался в головку бактериофага. Существует значительное количество работ, посвященных созданию мутантных форм фагов-помощников обладающих подобными свойствами. Проблема упаковки одноцепочечной ДНК не фагмидного происхождения достаточно эффективно решается селекцией на средах, содержащих соответствующий антибиотик. Описан ряд мутаций, снижающих уровень упаковки белка pIII. Необходимо отметить, что подобные мутанты, должны, при всех модификациях, обеспечивать возможность продукции достаточного количества фага-помощника на этапах, предшествующих инфекции клонов E.coli, трансформированных фагмидой, а также обладать достаточной инфекционностью для осуществления этого процесса. Одним из успешных вариантов таких модификаций является создание фагов-помощников, геном которых содержит делецию гена белка pIII [Rondot и др., 2001] . Такие бактериофаги требуют для продукции в препаративных количествах модифицированных штаммов E. coli, комплементирующих отсутствие pIII в геноме

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бурмистрова Дарья Андреевна, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Альтшулер Е.П., Серебряная Д.В., Картуха А.Г. Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности // Успехи биологической химии. 2010. № 50, С. 203-258.

2. Балабанов Д.Н., Раковская И.В. Сравнительная оценка методов диагностики микоплазменных инфекций урогенитального тракта // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. №4. С. 82-85.

3. Балабанов Д.Н., Раковская И.В. Микоплазмы при негонококковом уретрите // Клиническая и лабораторная диагностика. 2007. №8. С. 49-51.

4. Барыкова Ю.А., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Аляев Ю.Г., Фиев Д.Н., Винаров А.З., Винарова Н.А., Раковская И.В., Народицкий Б.С., Гудков А.В., Гинцбург А.Л. Идентификация микоплазм у больных с подозрением на рак простаты // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2010. - №4. - С.81-85.

5. Бархатова О.И., Балабанов Д.Н., Раковская И.В. Обнаружение «урогенитальных микоплазм» человека в сыворотке крови // Клиническая и лабораторная диагностика. 2008. №3. С. 49-51.

6. Герасимова Н.А., Евстигнеева Н.П., Зильберберг Н.В., Гущин А.Е. К вопросу о дискордантных результатах выявления Mycoplasma hominis и Ureaplasma spp. молекулярно-биологическими и культуральными методами у пациентов с урогенитальными заболеваниями // Медицинские науки. 2014. №10. С. 487 - 492.

7. Горина Л.Г., Шершнева Н.Н., Балабанов Д.Н., Гончарова С.А. Персистенция микоплазм при респираторных и урогенитальных микоплазменных инфекциях // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2008. №6. С. 41-44.

8. Грибова И.Ю., Тухватулин А.И., Гарас М.Н., Есмагамбетов И.Б., Бурмистрова Д.А., Должикова И.В., Каштиго Т.В., Тутыхина И.Л. Получение Е-1 комплементирующей клеточной линии для производства

рекомбинантных аденовирусов, свободных от репликативно-компетентных частиц, с помощью лентивирусной трансдукции // Естественные и технические науки, № 3(65). С. 53-62.

9. Деев С.М., Поляновский О. Л. Моноклональные антитела для диагностики и терапии // Биотехнология. 2008. № 2. С. 3-13.

10.Кузнеченкова Т., Теплова С. Анализ клинических проявлений и показателей иммунитета влагалищного секрета при генитальной микоплазменной инфекции у женщин // Вестник Южно-Уральского государственного университета. 2010. №19. С.94-97.

11.Логунов Д.Ю., Щебляков Д.В., Шмаров М.М. и др. Липид-ассоциированные мембранные белки M. arginini активируют NF-kB, взаимодействуя с TLR2/1, TLR2/6 и TLR2/CD14. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009 г. - №2. - С. - 25-28.

12.Миллер Г. Г., Клицунова Н. В., Раковская И. В., Зигангирова Н. А. Апоптоз-антиапоптоз зависимые модуляции клеточной морфологии // Ветеринарная патология. 2005. №1. С. 44 - 48.

13.Миллер Г. Г., Раковская И. В. Электронно-микроскопическое изучение ассоциации микоплазмы и бычьего лейкозного вируса в культуре ткани // Вопросы вирусологии. 1983. № 5. С. 615 - 621.

14.Прозоровский С. В., Раковская И. В., Вульфович Ю. В. Медицинская микоплазмология. М.: Медицина, 1995. - 285 с

15.Раковская И.В., Горина Л.Г., Утюшева М.Г. и др. Инфицированность микоплазмами детей, больных бронхиальной астмой// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. №4. С. 78-81.

16.Румянцева Т., Варламова А., Гущин А. Сравнение тестов для количественной оценки Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis: «Mycoplasma Duo», «Уреаплазма Микротест», «Микоплазма Микротест» и «Амплисенс-Флороценоз-Микоплазмы-FL» // Клиническая лабораторная диагностика. 2014. № 8. С. 52 - 57.

17.Стуколкина Н. Современные аспекты биологии микоплазм // Вестн. Новг. гос. ун-та. Сер.: Мед. науки. 2005. № 32, С. 58-62.

18.Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников // Acta Naturae. 2010. № 2(3). С. 100-108.

19.Тимаков В. Д. Каган Г. Я. L формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae в патологии. -М.: Медицина, 1973. -391 с.

20.Щебляков Д. В., Логунов Д. Ю., Раковская И. В., Народицкий Б. С. Возможная роль TOLL-подобных рецепторов в повышении резистентности опухолевых (лейкозных) клеток к действию химиотерапевтических препаратов в условиях in vitro и in vivo // Гематология и трансфузиология. 2012. № 3. С.28.

21.Abbady A.Q., Al-Mariri A., Zarkawi M., Al-Assad A., Muyldermans S. Evaluation of a nanobody phage display library constructed from a Brucella-immunised camel. // Vet. Immunol. Immunopathol. 2011. Т. 142. № 1-2. С. 49-56.

22.Adams H., Horrevoets W.M., Adema S.M., Carr H.E., Woerden R.E. van, Koster M., Tommassen J. Inhibition of biofilm formation by Camelid single-domain antibodies against the flagellum of Pseudomonas aeruginosa. // J. Biotechnol. 2014. Т. 186. С. 66-73.

23.Agger W.A., Siddiqui D., Lovrich S.D., Callister S.M., Borgert A.J., Merkitch K.W., Mason T.C., Baumgardner D.J., Burmester J.K., Shukla S.K., Welter J.D., Stewart K.S., Washburn M.J., Bailey H.H. Epidemiologic factors and urogenital infections associated with preterm birth in a midwestern U.S. population. // Obstet Gynecol. 2014. Т. 124. № 5. С. 969-77.

24.Alzogaray V., Danquah W., Aguirre A., Urrutia M., Berguer P., Garcia Vescovi E., Haag F., Koch-Nolte F., Goldbaum F.A. Single-domain llama antibodies as specific intracellular inhibitors of SpvB, the actin ADP-ribosylating toxin of Salmonella typhimurium. // FASEB J. 2011. Т. 25. № 2. С. 526-34.

25.Arbabi-Ghahroudi M., Tanha J., MacKenzie R. Prokaryotic expression of antibodies. // Cancer Metastasis Rev. 2005. Т. 24. № 4. С. 501-19.

26.Ardekani L.S., Gargari S.L., Rasooli I., Bazl M.R., Mohammadi M., Ebrahimizadeh W., Bakherad H., Zare H. A novel nanobody against urease activity of Helicobacter pylori. // Int. J. Infect. Dis. 2013. T. 17. № 9. C. e723-8.

27.Arya O.P., Tong C.Y., Hart C.A., Pratt B.C., Hughes S., Roberts P., Kirby P., Howel J., McCormick A., Goddard A.D. Is Mycoplasma hominis a vaginal pathogen? // Sex Transm Infect. 2001. T. 77. № 1. C. 58-62.

28.Baek H., Suk K., Kim Y., Cha S. An improved helper phage system for efficient isolation of specific antibody molecules in phage display // Nucleic Acids Research. 2002. T. 30. № 5. C. e18-e18.

29.Bakherad H., Mousavi Gargari S.L., Rasooli I., Rajabibazl M., Mohammadi M., Ebrahimizadeh W., Safaee Ardakani L., Zare H. In vivo neutralization of botulinum neurotoxins serotype E with heavy-chain camelid antibodies (VHH). // Mol. Biotechnol. 2013. T. 55. № 2. C. 159-67.

30.Baldo B.A. Chimeric fusion proteins used for therapy: indications, mechanisms, and safety. // Drug Saf. 2015. T. 38. № 5. C. 455-79.

31.Bannas P., Lenz A., Kunick V., Fumey W., Rissiek B., Schmid J., Haag F., Leingärtner A., Trepel M., Adam G., Koch-Nolte F. Validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft NIRF-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy. // J Vis Exp. 2015a. № 98. C. e52462.

32.Bannas P., Lenz A., Kunick V., Well L., Fumey W., Rissiek B., Haag F., Schmid J., Schütze K., Eichhoff A., Trepel M., Adam G., Ittrich H., Koch-Nolte F. Molecular imaging of tumors with nanobodies and antibodies: Timing and dosage are crucial factors for improved in vivo detection. // Contrast Media Mol Imaging. 2015b.

33.Baral T.N., Arbabi-Ghahroudi M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. // Methods Mol. Biol. 2012. T. 911. C. 257-75.

34.Barykova Y.A., Logunov D.Y., Shmarov M.M., Vinarov A.Z., Fiev D.N., Vinarova N.A., Rakovskaya I.V., Baker P.S., Shyshynova I., Stephenson A.J., Klein E.A., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L., Gudkov A.V. Association of

Mycoplasma hominis infection with prostate cancer. // Oncotarget. 2011. T. 2. № 4. C. 289-97.

35.Basto A.P., Leitao A. Targeting TLR2 for vaccine development. // J Immunol Res. 2014. T. 2014. C. 619410.

36.Bazl M.R., Rasaee M.J., Foruzandeh M., Rahimpour A., Kiani J., Rahbarizadeh F., Alirezapour B., Mohammadi M. Production of chimeric recombinant single domain antibody-green fluorescent fusion protein in Chinese hamster ovary cells. // Hybridoma (Larchmt). 2007. T. 26. № 1. C. 1-9.

37.Bell M.R., Engleka M.J., Malik A., Strickler J.E. To fuse or not to fuse: what is your purpose? // Protein Sci. 2013. T. 22. № 11. C. 1466-77.

38.Bitsaktsis C., Babadjanova Z., Gosselin E.J. In vivo mechanisms involved in enhanced protection utilizing an Fc receptor-targeted mucosal vaccine platform in a bacterial vaccine and challenge model. // Infect. Immun. 2015. T. 83. № 1. C. 7789.

39.Blanchard B., Saillard C., Kobisch M., Bove J.M. Analysis of putative ABC transporter genes in Mycoplasma hyopneumoniae. // Microbiology (Reading, England). 1996. T. 142 ( Pt 7). C. 1855-62.

40.Boiko E.V., Pozniak A.L., Maltsev D.S., Suetov A.A., Nuralova I.V. High Frequency of Latent Conjunctival C. trachomatis, M. hominis, and U. urealyticum Infections in Young Adults with Dry Eye Disease. // J Ophthalmol. 2014. T. 2014. C.154627.

41.Brummelhuis W.J., Joles J.A., Stam J.C., Adams H., Goldschmeding R., Detmers F.J., El Khattabi M., Maassen B.T., Verrips C.T., Braam B. Llama heavy-chain antibody fragments efficiently remove toxic shock syndrome toxin 1 from plasma in vitro but not in experimental porcine septic shock. // Shock. 2010. T. 34. № 2. C. 125-32.

42.Buck S. De, Nolf J., Meyer T. De, Virdi V., Wilde K. De, Lerberge E. Van, Droogenbroeck B. Van, Depicker A. Fusion of an Fc chain to a VHH boosts the accumulation levels in Arabidopsis seeds. // Plant Biotechnol. J. 2013. T. 11. № 8. C.1006-16.

43.Cacciotto C, Addis MF, Coradduzza E, Carcangiu L, Nuvoli AM, Tore G, Dore GM, Pagnozzi D, Uzzau S, Chessa B, Pittau M, Alberti A. Mycoplasma agalactiae MAG_5040 is a Mg2+-dependent, sugar-nonspecific SNase recognised by the host humoral response during natural infection. // PLoS ONE. 2013. T. 8. № 2. C. e57775.

44.Cacciotto C., Addis M.F., Pagnozzi D., Chessa B., Coradduzza E., Carcangiu L., Uzzau S., Alberti A., Pittau M. The liposoluble proteome of Mycoplasma agalactiae: an insight into the minimal protein complement of a bacterial membrane. // BMC Microbiol. 2010. T. 10. C. 225.

45.Cardoso F.M., Ibanez L.I., Hoecke S. Van den, Baets S. De, Smet A., Roose K., Schepens B., Descamps F.J., Fiers W., Muyldermans S., Depicker A., Saelens X. Single-domain antibodies targeting neuraminidase protect against an H5N1 influenza virus challenge. // J. Virol. 2014. T. 88. № 15. C. 8278-96.

46.Casadevall A., Scharff M.D. Serum therapy revisited: animal models of infection and development of passive antibody therapy. // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. T. 38. № 8. C. 1695-702.

47.Casadevall A., Scharff M.D. Return to the past: the case for antibody-based therapies in infectious diseases. // Clin. Infect. Dis. 1995. T. 21. № 1. C. 150-61.

48.Chasteen L., Ayriss J., Pavlik P., Bradbury A.R. Eliminating helper phage from phage display. // Nucleic Acids Res. 2006. T. 34. № 21. C. e145.

49.Chavanayarn C., Thanongsaksrikul J., Thueng-In K., Bangphoomi K., Sookrung N., Chaicumpa W. Humanized-single domain antibodies (VH/VHH) that bound specifically to Naja kaouthia phospholipase A2 and neutralized the enzymatic activity. // Toxins. 2012. T. 4. № 7. C. 554-67.

50.Chen Z.-Z.Z., Cai L., Chen M.-Y.Y., Lin Y., Pang D.-W.W., Tang H.-W.W. Indirect immunofluorescence detection of E. coli O157:H7 with fluorescent silica nanoparticles. // Biosens Bioelectron. 2015. T. 66. C. 95-102.

51.Chernov V.M., Chernova O.A., Sanchez-Vega J.T., Kolpakov A.I., Ilinskaya O.N. Mycoplasma Contamination of Cell Cultures: Vesicular Traffic in Bacteria and Control over Infectious Agents. // Acta naturae. 2014. T. 6. № 3. C. 41-51.

52.Clackson T., Wells J.A. In vitro selection from protein and peptide libraries. // Trends Biotechnol. 1994. T. 12. № 5. C. 173-84.

53.Crasson O., Rhazi N., Jacquin O., Freichels A., Jérôme C., Ruth N., Galleni M., Filée P., Vandevenne M. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. // Protein Eng. Des. Sel. 2015.

54.Cui Y., Li D., Morisseau C., Dong J.-X.X., Yang J., Wan D., Rossotti M.A.A., Gee S.J., Gonzalez-Sapienza G.G., Hammock B.D. Heavy chain single-domain antibodies to detect native human soluble epoxide hydrolase. // Anal Bioanal Chem. 2015. T. 407. № 24. C. 7275-83.

55.Czajkowsky D.M., Hu J., Shao Z., Pleass R.J. Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. // EMBO Mol Med. 2012. T. 4. № 10. C. 1015-28.

56.Darby R.A., Cartwright S.P., Dilworth M.V., Bill R.M. Which yeast species shall I choose? Saccharomyces cerevisiae versus Pichia pastoris (review). // Methods Mol. Biol. 2012. T. 866. C. 11-23.

57.Della Pia E.A., Martinez K.L. Single domain antibodies as a powerful tool for high quality surface plasmon resonance studies. // PLoS ONE. 2015. T. 10. № 3. C. e0124303.

58.Descotes J. Immunotoxicity of monoclonal antibodies // mAbs. 2009. T. 1. № 2. C.104111.

59.Desmyter A., Spinelli S., Payan F., Lauwereys M., Wyns L., Muyldermans S., Cambillau C. Three camelid VHH domains in complex with porcine pancreatic alpha-amylase. Inhibition and versatility of binding topology. // J. Biol. Chem. 2002. T. 277. № 26. C. 23645-50.

60.Desmyter, Transue, Ghahroudi, Thi, Poortmans, Hamers, Muyldermans, Wyns. Crystal structure of a camel single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme. // Nature structural biology. 1996. T. 3. № 9. C. 803-11.

61.Dessi D., Rappelli P., Diaz N., Cappuccinelli P., Fiori P.L. Mycoplasma hominis and Trichomonas vaginalis: a unique case of symbiotic relationship between two obligate human parasites. // Front. Biosci. 2006. T. 11. C. 2028-34.

62.Deyev S.M., Lebedenko E.N. Multivalency: the hallmark of antibodies used for optimization of tumor targeting by design. // Bioessays. 2008. T. 30. № 9. C. 90418.

63.Dumoulin M., Conrath K., Meirhaeghe A., Meersman F., Heremans K., Frenken L., Muyldermans S., Wyns L., Matagne A. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. // Protein science: a publication of the Protein Society. 2002. T. 11. № 3. C. 500-15.

64.Even-Desrumeaux K., Chames P. Phage display and selections on cells. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2012. T. 907. C. 225-35.

65.Feng S.H., Tsai S., Rodriguez J., Lo S.C. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells. // Mol. Cell. Biol. 1999. T. 19. № 12. C. 7995-8002.

66.Ferrari A., Weill F.S., Paz M.L., Cela E.M., González Maglio D.H., Leoni J. Activity modulation of microbial enzymes by llama (Lama glama) heavy-chain polyclonal antibodies during in vivo immune responses. // Animal. 2012. T. 6. № 3. C. 510-7.

67.Finlay W., Almagro J. Natural and man-made V-gene repertoires for antibody discovery // Frontiers in Immunology. 2012. T. 3.

68.Fiori P.L., Diaz N., Cocco A.R., Rappelli P., Dessi D. Association of Trichomonas vaginalis with its symbiont Mycoplasma hominis synergistically upregulates the in vitro proinflammatory response of human monocytes. // Sex Transm Infect. 2013. T. 89. № 6. C. 449-54.

69.Flajnik M., Deschacht N., Muyldermans S. A Case Of Convergence: Why Did a Simple Alternative to Canonical Antibodies Arise in Sharks and Camels? // PLoS Biology. 2011. T. 9. № 8.

70.Frenken L.G., Hessing J.G., Hondel C.A. Van den, Verrips C.T. Recent advances in the large-scale production of antibody fragments using lower eukaryotic microorganisms. // Res. Immunol. 1998. T. 149. № 6. C. 589-99.

71.Frenken L.G., Linden R.H. van der, Hermans P.W., Bos J.W., Ruuls R.C., Geus B. de, Verrips C.T. Isolation of antigen specific llama VHH antibody fragments and

their high level secretion by Saccharomyces cerevisiae. // J. Biotechnol. 2000. T. 78. № 1. C. 11-21.

72.Frigotto L., Smith M., Brankin C., Sedani A., Cooper S., Kanwar N., Evans D., Svobodova S., Baar C., Glanville J., Ullman C., Hine A. Codon-Precise, Synthetic, Antibody Fragment Libraries Built Using Automated Hexamer Codon Additions and Validated through Next Generation Sequencing // Antibodies. 2015. T. 4. № 2.

73.Gall F. Le, Kipriyanov S.M., Moldenhauer G., Little M. Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19: effect of valency on cell binding. // FEBS Lett. 1999. T. 453. № 1-2. C. 164-8.

74.Garaicoechea L., Olichon A., Marcoppido G., Wigdorovitz A., Mozgovoj M., Saif L., Surrey T., Parreno V. Llama-Derived Single-Chain Antibody Fragments Directed to Rotavirus VP6 Protein Possess Broad Neutralizing Activity In Vitro and Confer Protection against Diarrhea in Mice // Journal of Virology. 2008. T. 82. № 19. C. 9753-9764.

75.Gene R.W., Kumaran J., Aroche C., Faassen H. van, Hall J.C., MacKenzie C.R., Arbabi-Ghahroudi M. High affinity anti-Internalin B VHH antibody fragments isolated from naturally and artificially immunized repertoires. // J. Immunol. Methods. 2015. T. 416. C. 29-39.

76.Georgiou G., Segatori L. Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects. // Curr. Opin. Biotechnol. 2005. T. 16. № 5. C. 538-45.

77.Good R.A., Lorenz E. Historic aspects of intravenous immunoglobulin therapy. // Cancer. 1991. T. 68. № 6 Suppl. C. 1415-21.

78.Gorlani A., Haard H. de, Verrips T. Expression of VHHs in Saccharomyces cerevisiae. // Methods Mol. Biol. 2012. T. 911. C. 277-86.

79.Govaert J., Pellis M., Deschacht N., Vincke C., Conrath K., Muyldermans S., Saerens D. Dual beneficial effect of interloop disulfide bond for single domain antibody fragments. // J. Biol. Chem. 2012. T. 287. № 3. C. 1970-9.

80.Greenberg, Avila, Hughes, Hughes, McKinney, Flajnik. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. // Nature. 1995. Т. 374. № 6518. С. 168-73.

81.Gribova I.Y., Tillib S.V., Tutykhina I.L., Shmarov C.E., Logunov D.Y., Verkhovskaya L.V., Naroditskii B.S., Gintsburg A.L. Effective Genetic Expression of Nanoantibodies by Recombinant Adenoviral Vector in vitro. // Acta Naturae. 2011. Т. 3. № 3. С. 64-70.

82.Gudkov A.V., Gurova K.V., Komarova E.A. Inflammation and p53: A Tale of Two Stresses. // Genes Cancer. 2011. Т. 2. № 4. С. 503-16.

83.Gupta A., Shrivastava N., Grover P., Singh A., Mathur K., Verma V., Kaur C., Chaudhary V. A Novel Helper Phage Enabling Construction of Genome-Scale ORF-Enriched Phage Display Libraries // PLoS ONE. 2013. Т. 8. № 9.

84.Hamers-Casterman, Atarhouch, Muyldermans, Robinson, Hamers, Songa, Bendahman, Hamers. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. // Nature. 1993. Т. 363. № 6428. С. 446-8.

85.Hammers C., Stanley J. Antibody Phage Display: Technique and Applications // Journal of Investigative Dermatology. 2014. Т. 134. № 2. С. e17-.

86.Hansel T., Kropshofer H., Singer T., Mitchell J., George A. The safety and side effects of monoclonal antibodies. // Nature reviews. Drug discovery. 2010. Т. 9. № 4. С. 325-38.

87.Harmsen, Haard D. Properties, production, and applications of camelid singledomain antibody fragments // Applied Microbiology and Biotechnology. 2007. Т. 77. № 1. С. 13-22.

88.Harmsen M.M., Solt C.B. van, Zijderveld-van Bemmel A.M. van, Niewold T.A., Zijderveld F.G. van. Selection and optimization of proteolytically stable llama single-domain antibody fragments for oral immunotherapy. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. Т. 72. № 3. С. 544-51.

89.Harmsen, van Solt, Fijten H. Enhancement of toxin- and virus-neutralizing capacity of single-domain antibody fragments by N-glycosylation // Applied Microbiology and Biotechnology. 2009. Т. 84. № 6. С. 1087-1094.

90.Hisada H., Tsutsumi H., Ishida H., Hata Y. High production of llama variable heavy-chain antibody fragment (VHH) fused to various reader proteins by Aspergillus oryzae. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. T. 97. № 2. C. 761-6.

91.Holliger P., Hudson P. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. // Nature biotechnology. 2005. T. 23. № 9. C. 1126-36.

92.Holliger P., Prospero T., Winter G. «Diabodies»: small bivalent and bispecific antibody fragments. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. T. 90. № 14. C. 64448.

93.Hoseinpoor R., Mousavi Gargari S.L., Rasooli I., Rajabibazl M., Shahi B. Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2014. T. 172. № 6. C. 3079-91.

94.Huang P.-J.J., Tay L.-L.L., Tanha J., Ryan S., Chau L.-K.K. Single-domain antibody-conjugated nanoaggregate-embedded beads for targeted detection of pathogenic bacteria. // Chemistry. 2009. T. 15. № 37. C. 9330-4.

95.Hultberg A., Tremblay D.M., Haard H. de, Verrips T., Moineau S., Hammarstrom L., Marcotte H. Lactobacillli expressing llama VHH fragments neutralise Lactococcus phages. // BMC Biotechnol. 2007. T. 7. C. 58.

96.Iliades P., Kortt A.A., Hudson P.J. Triabodies: single chain Fv fragments without a linker form trivalent trimers. // FEBS Lett. 1997. T. 409. № 3. C. 437-41.

97.Inoue A., Sawata S.Y., Taira K., Wadhwa R. Loss-of-function screening by randomized intracellular antibodies: identification of hnRNP-K as a potential target for metastasis. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2007. T. 104. № 21. C. 8983-8.

98.Ivanova T.A., Gushchin A.E., Gamova N.A., Barkhatova O.I., Rakovskaia I.V. [Measurement of genital mycoplasma concentration by using a microbiological and molecular-biological methods]. // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2014. № 2. C. 25-9.

99.Jain M., Kamal N., Batra S. Engineering antibodies for clinical applications // Trends in Biotechnology. 2007. T. 25. № 7.

100. Jamalizadeh Bahaabadi S., Mohseni Moghadam N., Kheirkhah B., Farsinejad A., Habibzadeh V. Isolation and molecular identification of Mycoplasma hominis in infertile female and male reproductive system. // Nephrourol Mon. 2014. T. 6. № 6. C. e22390.

101. James L.C. Intracellular antibody immunity and the cytosolic Fc receptor TRIM21. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2014. T. 382. C. 51-66.

102. Ji X., Lu W., Zhou H., Han D., Yang L., Wu H., Li J., Liu H., Zhang J., Cao P., Zhang S. Covalently dimerized Camelidae antihuman TNFa single-domain antibodies expressed in yeast Pichia pastoris show superior neutralizing activity. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. T. 97. № 19. C. 8547-58.

103. Joosten V., Lokman C., Den Hondel C.A. Van, Punt P.J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. // Microb. Cell Fact. 2003. T. 2. № 1. C. 1.

104. Kantha S.S. A centennial review; the 1890 tetanus antitoxin paper of von Behring and Kitasato and the related developments. // Keio J Med. 1991. T. 40. № 1. C. 35-9.

105. Kastelic D., Frkovic-Grazio S., Baty D., Truan G., Komel R., Pompon D. A single-step procedure of recombinant library construction for the selection of efficiently produced llama VH binders directed against cancer markers. // Journal of immunological methods. 2009. T. 350. № 1-2. C. 54-62.

106. Keane F.E., Thomas B.J., Gilroy C.B., Renton A., Taylor-Robinson D. The association of Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma genitalium with bacterial vaginosis: observations on heterosexual women and their male partners. // Int J STD AIDS. 2000. T. 11. № 6. C. 356-60.

107. Khattabi M., Adams H., Heezius E., Hermans P., Detmers F., Maassen B., Ley P. van der, Tommassen J., Verrips T., Stam J. Llama single-chain antibody that blocks lipopolysaccharide binding and signaling: prospects for therapeutic applications. // Clin. Vaccine Immunol. 2006. T. 13. № 10. C. 1079-86.

108. Koch-Nolte F., Reyelt J., Schößow B., Schwarz N., Scheuplein F., Rothenburg S., Haag F., Alzogaray V., Cauerhff A., Goldbaum F. Single domain

antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo // The FASEB Journal. 2007. T. 21. № 13. C. 3490-3498.

109. Koh W.W., Steffensen S., Gonzalez-Pajuelo M., Hoorelbeke B., Gorlani A., Szynol A., Forsman A., Aasa-Chapman M.M.M., Haard H. de, Verrips T., Weiss R.A. Generation of a family-specific phage library of llama single chain antibody fragments that neutralize HIV-1. // The Journal of biological chemistry. 2010. T. 285. № 25. C. 19116-24.

110. Koroleva E.A., Kobets N.V., Zayakin E.S., Luyksaar S.I., Shabalina L.A., Zigangirova N.A. Small molecule inhibitor of type three secretion suppresses acute and chronic Chlamydia trachomatis infection in a novel urogenital Chlamydia model. // BioMed research international. 2015. T. 2015. C. 484853.

111. Krüger C., Hultberg A., Marcotte H., Hermans P., Bezemer S., Frenken L.G., Hammarström L. Therapeutic effect of llama derived VHH fragments against Streptococcus mutans on the development of dental caries. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. T. 72. № 4. C. 732-7.

112. Lentz E.M., Garaicoechea L., Alfano E.F., Parreno V., Wigdorovitz A., Bravo-Almonacid F.F. Translational fusion and redirection to thylakoid lumen as strategies to improve the accumulation of a camelid antibody fragment in transplastomic tobacco. // Planta. 2012. T. 236. № 2. C. 703-14.

113. Levina G.A., Barkhatova O.I., Gorina L.G., Gamova N.A., Goncharova S.A., Miller G G, Raskova T.M., Rastegaeva I.N., Seliverstova N.A., Rakovskaia I.V. [Unusual forms of persistence of Mycoplasma hominis in organism of infected humans]. // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2012. № 4. C. 104-9.

114. Li Z., Palaniyandi S., Zeng R., Tuo W., Roopenian D.C., Zhu X. Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011. T. 108. № 11. C. 4388-93.

115. Linden R.H. van der, Frenken, de Geus, Harmsen, Ruuls, Stok, de Ron, Wilson, Davis, Verrips. Comparison of physical chemical properties of llama VHH

antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. T. 1431. № 1. C. 37-46.

116. Liu Y.-C.C., Lin I.-H.H., Chung W.-J.J., Hu W.S., Ng W.V., Lu C.-Y.Y., Huang T.-Y.Y., Shu H.-W.W., Hsiao K.-J.J., Tsai S.-F.F., Chang C.-H.H., Lin C.-H.H. Proteomics characterization of cytoplasmic and lipid-associated membrane proteins of human pathogen Mycoplasma fermentans M64. // PLoS ONE. 2012. T. 7. № 4. C. e35304.

117. Lunder M., Bratkovic T., Urleb U., Kreft S., Strukelj B. Ultrasound in phage display: a new approach to nonspecific elution. // BioTechniques. 2008. T. 44. № 7. C. 893-900.

118. Maass D., Sepulveda J., Pernthaner A., Shoemaker C. Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs) // Journal of Immunological Methods. 2007. T. 324. № 1-2. C. 1325.

119. Malmborg A.C., Dueñas M., Ohlin M., Soderlind E., Borrebaeck C.A. Selection of binders from phage displayed antibody libraries using the BIAcore biosensor. // J. Immunol. Methods. 1996. T. 198. № 1. C. 51-7.

120. Manohar A., Ahuja J., Crane J.K. Immunotherapy for Infectious Diseases: Past, Present, and Future. // Immunol. Invest. 2015. T. 44. № 8. C. 731-7.

121. Masukagami Y., Tivendale K.A., Mardani K., Ben-Barak I., Markham P.F., Browning G.F. The Mycoplasma gallisepticum virulence factor lipoprotein MslA is a novel polynucleotide binding protein. // Infection and immunity. 2013. T. 81. № 9. C. 3220-6.

122. Matz J., Chames P. Phage display and selections on purified antigens. // Methods Mol. Biol. 2012. T. 907. C. 213-24.

123. Maussang, Mujic-Delic, Descamps. Llama-derived single variable domains (nanobodies) directed against chemokine receptor CXCR7 reduce head and neck cancer cell growth in vivo // 2013.

124. McConnell S.J., Dinh T., Le M.H., Spinella D.G. Biopanning phage display libraries using magnetic beads vs. polystyrene plates. // BioTechniques. 1999. T. 26. № 2. C. 208-10, 214.

125. McEwan W.A., James L.C. TRIM21-dependent intracellular antibody neutralization of virus infection. // Prog Mol Biol Transl Sci. 2015. T. 129. C. 16787.

126. McEwan W.A., Tam J.C., Watkinson R.E., Bidgood S.R., Mallery D.L., James L.C. Intracellular antibody-bound pathogens stimulate immune signaling via the Fc receptor TRIM21. // Nat. Immunol. 2013. T. 14. № 4. C. 327-36.

127. McMahon D.K., Dummer J.S., Pasculle A.W., Cassell G. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults. // Am. J. Med. 1990. T. 89. № 3. C. 27581.

128. Meehl M.A., Stadheim T.A. Biopharmaceutical discovery and production in yeast. // Curr. Opin. Biotechnol. 2014. T. 30. C. 120-7.

129. Meyer T. De, Laukens B., Nolf J., Lerberge E. Van, Rycke R. De, Beuckelaer A. De, Buck S. De, Callewaert N., Depicker A. Comparison of VHH-Fc antibody production in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and Pichia pastoris. // Plant Biotechnol. J. 2015. T. 13. № 7. C. 938-47.

130. Miranda C., Camacho E., Reina G., Turino J., Rodriguez-Granger J., Yeste R., Bautista M.F., Garcia M., Alados J.C., Rosa M. De la. Isolation of Mycoplasma hominis from extragenital cultures. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2005. T. 24. № 5. C. 334-7.

131. Miron N.D., Socolov D., Mare§ M., Anton G., Nastasa V., Moraru R.F., Virag K., Anghelache-Lupa§cu I., Deak J. Bacteriological agents which play a role in the development of infertility. // Acta Microbiol Immunol Hung. 2013. T. 60. № 1. C. 41-53.

132. Mizukami M., Tokunaga H., Onishi H., Ueno Y., Hanagata H., Miyazaki N., Kiyose N., Ito Y., Ishibashi M., Hagihara Y., Arakawa T., Miyauchi A., Tokunaga M. Highly efficient production of VHH antibody fragments in Brevibacillus choshinensis expression system. // Protein Expr. Purif. 2014. T. 105C. C. 23-32.

133. Moayeri M., Leysath C.E., Tremblay J.M., Vrentas C., Crown D., Leppla S.H., Shoemaker C.B. A heterodimer of a VHH (variable domains of camelid heavy chain-only) antibody that inhibits anthrax toxin cell binding linked to a VHH

antibody that blocks oligomer formation is highly protective in an anthrax spore challenge model. // J. Biol. Chem. 2015. T. 290. № 10. C. 6584-95.

134. Mohseni Moghadam N., Kheirkhah B., Mirshekari T.R., Fasihi Harandi M., Tafsiri E. Isolation and molecular identification of mycoplasma genitalium from the secretion of genital tract in infertile male and female. // Iran J Reprod Med. 2014. T. 12. № 9. C. 601-8.

135. Morada M, Manzur M, Lam B, Tan C, Tachezy J, Rappelli P, Dessi D, Fiori PL, Yarlett N. Arginine metabolism in Trichomonas vaginalis infected with Mycoplasma hominis. // Microbiology (Reading, Engl.). 2010. T. 156. № Pt 12. C. 3734-43.

136. Muruganandam A., Tanha J., Narang S., Stanimirovic D. Selection of phage-displayed llama single-domain antibodies that transmigrate across human blood-brain barrier endothelium // The FASEB Journal. 2001.

137. Muyldermans S., Atarhouch T., Saldanha J., Barbosa J.A., Hamers R. Sequence and structure of VH domain from naturally occurring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chains. // Protein Eng. 1994. T. 7. № 9. C. 112935.

138. Nagurskaya E.V., Zaitseva L.G., Kobets N.V., Kireeva I.V., Alimbarova L.M., Samoilenko I.I., Barinskii I.F. Functional activity of peritoneal macrophages from sensitive and resistant mouse strains during intravaginal infection with herpes simplex virus type 2 and mucosal vaccination. // Bulletin of experimental biology and medicine. 2008. T. 145. № 2. C. 235-9.

139. Neman-Simha V., Renaudin H., Barbeyrac B. de, Leng J.J., Horovitz J., Dallay D., Billeaud C., Bebear C. Isolation of genital mycoplasmas from blood of febrile obstetrical-gynecologic patients and neonates. // Scand. J. Infect. Dis. 1992. T. 24. № 3. C. 317-21.

140. Nguyen V.S., Logger L., Spinelli S., Desmyter A., Le T.T., Kellenberger C., Douzi B., Durand E., Roussel A., Cascales E., Cambillau C. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. // PLoS ONE. 2015. T. 10. № 3. C. e0122187.

141. Nian R., Kim D., Nguyen T., Tan L., Kim C.-W., Yoo I.-K., Choe W.-S. Chromatographic biopanning for the selection of peptides with high specificity to Pb2+ from phage displayed peptide library // Journal of Chromatography A. 2010. T. 1217. № 38. C. 59405949.

142. Oleksiewicz M.B., Nagy G., Nagy E. Anti-bacterial monoclonal antibodies: back to the future? // Arch. Biochem. Biophys. 2012. T. 526. № 2. C. 124-31.

143. Pardon E., Laeremans T., Triest S., Rasmussen S., Wohlkönig A., Ruf A., Muyldermans S., Hol W., Kobilka B., Steyaert J. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. // Nature protocols. 2014. T. 9. № 3. C. 674-93.

144. Parvege M.M., Rahman M., Hossain M.S. Genome-wide Analysis of Mycoplasma hominis for the Identification of Putative Therapeutic Targets. // Drug Target Insights. 2014. T. 8. C. 51-62.

145. Pham G.H., Iglesias B.V., Gosselin E.J. Fc receptor-targeting of immunogen as a strategy for enhanced antigen loading, vaccination, and protection using intranasally administered antigen-pulsed dendritic cells. // Vaccine. 2014. T. 32. № 40. C. 5212-20.

146. Pia E., Martinez K. Single domain antibodies as a powerful tool for high quality surface plasmon resonance studies. // PloS one. 2015. T. 10. № 3. C. e0124303.

147. Pollithy A., Romer T., Lang C., Müller F.D., Helma J., Leonhardt H., Rothbauer U., Schüler D. Magnetosome expression of functional camelid antibody fragments (nanobodies) in Magnetospirillum gryphiswaldense. // Appl. Environ. Microbiol. 2011. T. 77. № 17. C. 6165-71.

148. Ponsel D., Neugebauer J., Ladetzki-Baehs K., Tissot K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. // Molecules. 2011. T. 16. № 5. C. 3675-700.

149. Qi H., Lu H., Qiu H.-J., Petrenko V., Liu A. Phagemid Vectors for Phage Display: Properties, Characteristics and Construction // Journal of Molecular Biology. 2012. T. 417. № 3.

150. Raherison S, Gonzalez P, Renaudin H, Charron A, Bebear C, Bebear CM. Increased expression of two multidrug transporter-like genes is associated with ethidium bromide and ciprofloxacin resistance in Mycoplasma hominis. // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. T. 49. № 1. C. 421-4.

151. Rappelli P., Addis M.F., Carta F., Fiori P.L. Mycoplasma hominis parasitism of Trichomonas vaginalis. // Lancet. 1998. T. 352. № 9136. C. 1286.

152. Rappelli P., Carta F., Delogu G., Addis M.F., Dessl D., Cappuccinelli P., Fiori P.L. Mycoplasma hominis and Trichomonas vaginalis symbiosis: multiplicity of infection and transmissibility of M. hominis to human cells. // Arch. Microbiol. 2001. T. 175. № 1. C. 70-4.

153. Rashidian M., Keliher E.J., Bilate A.M., Duarte J.N., Wojtkiewicz G.R., Jacobsen J.T., Cragnolini J., Swee L.K., Victora G.D., Weissleder R., Ploegh H.L. Noninvasive imaging of immune responses. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2015. T. 112. № 19. C. 6146-51.

154. Ratier L., Urrutia M., Paris G., Zarebski L., Frasch A.C., Goldbaum F.A. Relevance of the diversity among members of the Trypanosoma cruzi trans-sialidase family analyzed with camelids single-domain antibodies. // PloS one. 2008. T. 3. № 10. C. e3524.

155. Rechnitzer H, Brzuszkiewicz E, Strittmatter A, Liesegang H, Lysnyansky I, Daniel R, Gottschalk G, Rottem S.Genomic features and insights into the biology of Mycoplasma fermentans. // Microbiology (Reading, Engl.). 2011. T. 157. № Pt 3. C. 760-73.

156. Reutter F., Jung G., Baier W., Treyer B., Bessler W.G., Wiesmüller K.-H.H. Immunostimulants and Toll-like receptor ligands obtained by screening combinatorial lipopeptide collections. // J. Pept. Res. 2005. T. 65. № 3. C. 375-83.

157. Riazi A., Strong P.C., Coleman R., Chen W., Hirama T., Faassen H. van, Henry M., Logan S.M., Szymanski C.M., Mackenzie R., Ghahroudi M.A. Pentavalent single-domain antibodies reduce Campylobacter jejuni motility and colonization in chickens. // PLoS ONE. 2013. T. 8. № 12. C. e83928.

158. Richard G., Meyers A.J., McLean M.D., Arbabi-Ghahroudi M., MacKenzie R., Hall J.C. In vivo neutralization of a-cobratoxin with high-affinity llama singledomain antibodies (VHHs) and a VHH-Fc antibody. // PLoS ONE. 2013. T. 8. № 7. C. e69495.

159. Romanova YM, Mulabaev NS, Tolordava ER, Seregin AV, Seregin IV, Alexeeva NV, Stepanova TV, Levina GA, Barhatova OI, Gamova NA, Goncharova SA, Didenko LV, Rakovskaya IV. Microbial communities on kidney stones. // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2015. T. 33. № 2. C. 20-5.

160. Rondot S., Koch J., Breitling F., Dübel S. A helper phage to improve single-chain antibody presentation in phage display // Nature Biotechnology. 2001. T. 19. № 1. C. 75-78.

161. Rosano G.L.L., Ceccarelli E.A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. // Front Microbiol. 2014. T. 5. C. 172.

162. Rotman M., Welling M.M., Boogaard M.L. van den, Moursel L.G., Graaf L.M. van der, Buchem M.A. van, Maarel S.M.M. van der, Weerd L. van der. Fusion of hIgG1-Fc to 111In-anti-amyloid single domain antibody fragment VHH-pa2H prolongs blood residential time in APP/PS1 mice but does not increase brain uptake. // Nucl. Med. Biol. 2015. T. 42. № 8. C. 695-702.

163. Saerens D., Stijlemans B., Baral T., Thi G., Wernery U., Magez S., Baetselier P., Muyldermans S., Conrath K. Parallel selection of multiple anti-infectome Nanobodies without access to purified antigens // Journal of Immunological Methods. 2008. T. 329. № 1-2. C. 138150.

164. Salema V., Fernández L.Á. High yield purification of nanobodies from the periplasm of E. coli as fusions with the maltose binding protein. // Protein Expr. Purif. 2013. T. 91. № 1. C. 42-8.

165. Schindler B.D., Jacinto P., Kaatz G.W. Inhibition of drug efflux pumps in Staphylococcus aureus: current status of potentiating existing antibiotics. // Future Microbiol. 2013. T. 8. № 4. C. 491-507.

166. Schmidt J.A., Browning G.F., Markham P.F. Mycoplasma hyopneumoniae mhp379 is a Ca2+-dependent, sugar-nonspecific exonuclease exposed on the cell surface. // J. Bacteriol. 2007. T. 189. № 9. C. 3414-24.

167. Shah D., Betts A. Antibody biodistribution coefficients: inferring tissue concentrations of monoclonal antibodies based on the plasma concentrations in several preclinical species and human. // mAbs. 2013. T. 5. № 2. C. 297-305.

168. Sheoran A.S., Dmitriev I.P., Kashentseva E.A., Cohen O., Mukherjee J., Debatis M., Shearer J., Tremblay J.M., Beamer G., Curiel D.T., Shoemaker C.B., Tzipori S. Adenovirus vector expressing Stx1/Stx2-neutralizing agent protects piglets infected with Escherichia coli O157:H7 against fatal systemic intoxication. // Infect. Immun. 2015. T. 83. № 1. C. 286-91.

169. Shkarupeta M.M., Lazarev V.N., Govorun V.M. Experimental Mycoplasma hominis infection of the genital tract in BALB/c mice. // Bulletin of experimental biology and medicine. 2004. T. 137. № 1. C. 53-5.

170. Shukla G.S., Krag D.N. Phage-displayed combinatorial peptide libraries in fusion to beta-lactamase as reporter for an accelerated clone screening: Potential uses of selected enzyme-linked affinity reagents in downstream applications. // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2010. T. 13. № 1. C. 75-87.

171. Sidhu S., Fellouse F. Synthetic therapeutic antibodies. // Nature chemical biology. 2006. T. 2. № 12. C. 682-8.

172. Sliepen K., Montfort T. van, Melchers M., Isik G., Sanders R.W. Immunosilencing a highly immunogenic protein trimerization domain. // J. Biol. Chem. 2015. T. 290. № 12. C. 7436-42.

173. Sobouti B., Fallah S., Mobayen M., Noorbakhsh S., Ghavami Y. Colonization of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum in pregnant women and their transmission to offspring. // Iran J Microbiol. 2014. T. 6. № 4. C. 219-24.

174. Song T, Ye A, Xie X, Huang J, Ruan Z, Kong Y, Song J, Wang Y, Chen J, Zhang J. Epidemiological investigation and antimicrobial susceptibility analysis of

ureaplasma species and Mycoplasma hominis in outpatients with genital manifestations. // J. Clin. Pathol. 2014. T. 67. № 9. C. 817-20.

175. Spickler A., Roth J. Adjuvants in Veterinary Vaccines: Modes of Action and Adverse Effects // Journal of Veterinary Internal Medicine. 2003. T. 17. № 3. C. 273-281.

176. Srivastava S.K., Ruigrok V.J., Thompson N.J., Trilling A.K., Heck A.J., Rijn C. van, Beekwilder J., Jongsma M.A. 16 kDa heat shock protein from heat-inactivated Mycobacterium tuberculosis is a homodimer - suitability for diagnostic applications with specific llama VHH monoclonals. // PLoS ONE. 2013. T. 8. № 5. C. e64040.

177. Swartz J.R. Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. // Curr. Opin. Biotechnol. 2001. T. 12. № 2. C. 195-201.

178. Sorensen M.D., Kristensen P. Selection of antibodies against a single rare cell present in a heterogeneous population using phage display. // Nature protocols. 2011. T. 6. № 4. C. 509-22.

179. Ta D.T., Steen Redeker E., Billen B., Reekmans G., Sikulu J., Noben J.-P.P., Guedens W., Adriaensens P. An efficient protocol towards site-specifically clickable nanobodies in high yield: cytoplasmic expression in Escherichia coli combined with intein-mediated protein ligation. // Protein Eng. Des. Sel. 2015.

180. Tabares-da Rosa S., Rossotti M., Carleiza C., Carrion F., Pritsch O., Ahn K.C., Last J.A., Hammock B.D., Gonzalez-Sapienza G. Competitive selection from single domain antibody libraries allows isolation of high-affinity antihapten antibodies that are not favored in the llama immune response. // Analytical chemistry. 2011. T. 83. № 18. C. 7213-20.

181. Taborda C.P., Casadevall A. Immunoglobulin M efficacy against Cryptococcus neoformans: mechanism, dose dependence, and prozone-like effects in passive protection experiments. // J. Immunol. 2001. T. 166. № 3. C. 2100-7.

182. Taborda C.P., Rivera J., Zaragoza O., Casadevall A. More is not necessarily better: prozone-like effects in passive immunization with IgG. // J. Immunol. 2003. T. 170. № 7. C. 3621-30.

183. Tabrizi M., Bornstein G., Suria H. Biodistribution mechanisms of therapeutic monoclonal antibodies in health and disease. // The AAPS journal. 2010. T. 12. № 1. C. 33-43.

184. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Models of infection due to mycoplasmas, including Mycoplasma fermentans, in the genital tract and other sites in mice. // Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 1993. T. 17 Suppl 1. C. S280-2.

185. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Observations on the antibiotic treatment of experimentally induced mycoplasmal infections in mice. // The Journal of antimicrobial chemotherapy. 2000. T. 45. № 6. C. 903-7.

186. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Further observations on the murine model of Mycoplasma hominis infection. // Journal of medical microbiology. 2010. T. 59. № Pt 8. C. 970-5.

187. Taylor-Robinson D., Furr P.M., Webster A.D. Ureaplasma urealyticum causing persistent urethritis in a patient with hypogammaglobulinaemia. // Genitourin Med. 1985. T. 61. № 6. C. 404-8.

188. Taylor-Robinson D, Purcell RH, Wong DC, Chanock RM. A colour test for the measurement of antibody to certain mycoplasma species based upon the inhibition of acid production. // J Hyg (Lond). 1966. T. 64. №1. C. 91-104.

189. Taylor-Robinson D., Rosenstein I.J. Is Mycoplasma hominis a vaginal pathogen? // Sex Transm Infect. 2001. T. 77. № 4. C. 302.

190. Teh Y.-H.A.H., Kavanagh T.A. High-level expression of Camelid nanobodies in Nicotiana benthamiana. // Transgenic Res. 2010. T. 19. № 4. C. 57586.

191. Tillib S.V., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Saakyan S.A., Gribova I.Y., Tutykhina I.L., Sedova E.S., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Formatted single-domain

antibodies can protect mice against infection with influenza virus (H5N2). // Antiviral Res. 2013. T. 97. № 3. C. 245-54.

192. Tokuhara D., Alvarez B., Mejima M., Hiroiwa T., Takahashi Y., Kurokawa S., Kuroda M., Oyama M., Kozuka-Hata H., Nochi T., Sagara H., Aladin F., Marcotte H., Frenken L.G., Iturriza-Gomara M., Kiyono H., Hammarström L., Yuki Y. Rice-based oral antibody fragment prophylaxis and therapy against rotavirus infection. // J. Clin. Invest. 2013. T. 123. № 9. C. 3829-38.

193. Toms S., Weil R., Hassanzadeh-Ghassabeh G., Saerens D., Muyldermans S. Methods in Molecular Biology // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2011.

194. Tremblay J.M., Kuo C.-L.L., Abeijon C., Sepulveda J., Oyler G., Hu X., Jin M.M., Shoemaker C.B. Camelid single domain antibodies (VHHs) as neuronal cell intrabody binding agents and inhibitors of Clostridium botulinum neurotoxin (BoNT) proteases. // Toxicon. 2010. T. 56. № 6. C. 990-8.

195. Tremblay J.M., Mukherjee J., Leysath C.E., Debatis M., Ofori K., Baldwin K., Boucher C., Peters R., Beamer G., Sheoran A., Bedenice D., Tzipori S., Shoemaker C.B. A single VHH-based toxin-neutralizing agent and an effector antibody protect mice against challenge with Shiga toxins 1 and 2. // Infect. Immun.

2013. T. 81. № 12. C. 4592-603.

196. Trilling A.K., Hesselink T., Houwelingen A. van, Cordewener J.H., Jongsma M.A., Schoffelen S., Hest J.C. van, Zuilhof H., Beekwilder J. Orientation of llama antibodies strongly increases sensitivity of biosensors. // Biosens Bioelectron.

2014. T. 60. C. 130-6.

197. Tseng CW, Kanci A, Citti C, Rosengarten R, Chiu CJ, Chen ZH, Geary SJ,Browning GF, Markham PF. MalF is essential for persistence of Mycoplasma gallisepticum in vivo. // Microbiology (Reading, Engl.). 2013. T. 159. № Pt 7. C. 1459-70.

198. Tutykhina I.L., Sedova E.S., Gribova I.Y., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Tillib S.V., Gintsburg A.L. Passive immunization with a recombinant adenovirus

expressing an HA (H5)-specific single-domain antibody protects mice from lethal influenza infection. // Antiviral Res. 2013. T. 97. № 3. C. 318-28.

199. Vancini R.G., Benchimol M. Entry and intracellular location of Mycoplasma hominis in Trichomonas vaginalis. // Arch. Microbiol. 2008. T. 189. № 1. C. 7-18.

200. Vancini R.G., Pereira-Neves A., Borojevic R., Benchimol M. Trichomonas vaginalis harboring Mycoplasma hominis increases cytopathogenicity in vitro. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2008. T. 27. № 4. C. 259-67.

201. Vanlandschoot P., Stortelers C., Beirnaert E., Ibanez L., Schepens B., Depla E., Saelens X. Nanobodies®: new ammunition to battle viruses. // Antiviral research. 2011. T. 92. № 3. C. 389-407.

202. Veggiani G., Marco A. de. Improved quantitative and qualitative production of single-domain intrabodies mediated by the co-expression of Erv1p sulfhydryl oxidase. // Protein Expr. Purif. 2011. T. 79. № 1. C. 111-4.

203. Vidarsson G., Dekkers G., Rispens T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. // Front Immunol. 2014. T. 5. C. 520.

204. Virdi V., Coddens A., Buck S. De, Millet S., Goddeeris B.M., Cox E., Greve H. De, Depicker A. Orally fed seeds producing designer IgAs protect weaned piglets against enterotoxigenic Escherichia coli infection. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013. T. 110. № 29. C. 11809-14.

205. Virdi V., Depicker A. Role of plant expression systems in antibody production for passive immunization. // Int. J. Dev. Biol. 2013. T. 57. № 6-8. C. 587-93. 208. Wang Q.-Y.Y. h gp. Prevalence and antimicrobial susceptibility of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in female outpatients, 20092013. // J Microbiol Immunol Infect. 2014a.

206. Wang QY, Li RH, Zheng LQ, Shang XH. Prevalence and antimicrobial susceptibility of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in female outpatients, 2009-2013. // J Microbiol Immunol Infect. 2014a.

207. Wang Y., Tian Z., Thirumalai D., Zhang X. Neonatal Fc receptor (FcRn): a novel target for therapeutic antibodies and antibody engineering. // J Drug Target. 2014. T. 22. № 4. C. 269-78.

208. Webster A.D., Furr P.M., Hughes-Jones N.C., Gorick B.D., TaylorRobinson D. Critical dependence on antibody for defence against mycoplasmas. // Clin. Exp. Immunol. 1988. T. 71. № 3. C. 383-7.

209. Weigt H., Muhlradt P.F., Emmendorffer A., Krug N., Braun A. Synthetic mycoplasma-derived lipopeptide MALP-2 induces maturation and function of dendritic cells. // Immunobiology. 2003. T. 207. № 3. C. 223-33.

210. Wendlandt S., Shen J., Kadlec K., Wang Y., Li B., Zhang W.-J.J., FeBler A.T., Wu C., Schwarz S. Multidrug resistance genes in staphylococci from animals that confer resistance to critically and highly important antimicrobial agents in human medicine. // Trends Microbiol. 2015. T. 23. № 1. C. 44-54.

211. Westers L., Westers H., Quax W.J. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. T. 1694. № 1-3. C. 299-310.

212. Wilkens S. Structure and mechanism of ABC transporters. // F1000Prime Rep. 2015. T. 7. C. 14.

213. Wolfson W. Ablynx Makes Nanobodies from Llama Bodies // Chemistry & Biology. 2006. T. 13. № 12. C. 12431244.

214. Wong S.L. Advances in the use of Bacillus subtilis for the expression and secretion of heterologous proteins. // Curr. Opin. Biotechnol. 1995. T. 6. № 5. C. 517-22.

215. Yan J., Li G., Hu Y., Ou W., Wan Y. Construction of a synthetic phage-displayed Nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications // Journal of Translational Medicine. 2014. T. 12. № 1. C. 343.

216. Yang Z., Schmidt D., Liu W., Li S., Shi L., Sheng J., Chen K., Yu H., Tremblay J.M., Chen X., Piepenbrink K.H., Sundberg E.J., Kelly C.P., Bai G., Shoemaker C.B., Feng H. A novel multivalent, single-domain antibody targeting TcdA and TcdB prevents fulminant Clostridium difficile infection in mice. // J. Infect. Dis. 2014. T. 210. № 6. C. 964-72.

217. Zarschler K., Witecy S., Kapplusch F., Foerster C., Stephan H. High-yield production of functional soluble single-domain antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli // Microbial Cell Factories. 2013. T. 12. № 1. C. 97.

218. Zhang Q., Zhao X., Xu X., Tang B., Zha Z., Zhang M., Yao D., Chen X., Wu X., Cao L., Guo H. Expression and purification of soluble human cystatin C in Escherichia coli with maltose-binding protein as a soluble partner. // Protein Expr. Purif. 2014. T. 104C. C. 14-19.

219. Zhang S., Lo S.-C.C. Effect of mycoplasmas on apoptosis of 32D cells is species-dependent. // Curr. Microbiol. 2007. T. 54. № 5. C. 388-95.

220. Zhang X., Dervillez X., Chentoufi A.A., Badakhshan T., Bettahi I., Benmohamed L. Targeting the genital tract mucosa with a lipopeptide/recombinant adenovirus prime/boost vaccine induces potent and long-lasting CD8+ T cell immunity against herpes: importance of MyD88. // J. Immunol. 2012. T. 189. № 9. C. 4496-509.

221. Zhao Y, Wang H, Hammond RW, Jomantiene R, Liu Q, Lin S, Roe BA, Davis RE. Predicted ATP-binding cassette systems in the phytopathogenic mollicute Spiroplasma kunkelii. // Mol. Genet. Genomics. 2004. T. 271. № 3. C. 325-38.

222. Zhu Z., Shi L., Feng H., Zhou H.S. Single domain antibody coated gold nanoparticles as enhancer for Clostridium difficile toxin detection by electrochemical impedance immunosensors. // Bioelectrochemistry. 2015. T. 101. C. 153-8.