Очистка и изучение физико-химических свойств медьсодержащей аминоксидазы из кровеносных сосудов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Меграбян, Зара Борисовна

• Меграбян, Зара Борисовна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Меграбян, Зара Борисовна

ВВВДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУШ.

§ I. Биологические пути образования аминов

§ 2. Пути катаболизма аминов.

§ 3. Классификация аминоксвдаз

§ 4. Медьсодержащие аминоксидазы из микроорганизмов

§ 5. Медьсодержащие аминоксидазы в растениях.

§ 6. Аминоксидазы из почек.

§ 7. Медьсодержащие аминоксидазы из других органов животных.

§ 8. Медьсодержащие аминоксидазы из крови и других жидкостей организма.

§ 9. Лизилоксидаза - специфическая медьсодержащая аминоксидаза.

§ 10. Медьсодержащие аминоксидазы из сосудистой ткани

ГЛАВА П. МЕТОДЫ ИССЛБЩОВАНИЯ.

§ I. Использованные реактивы.

§ 2. Аппаратура.

§ 3. Биологический материал.

§ 4. Определение аминоксидазной активности

§ 5. Определение СОД-активности

§ 6. Определение белка, липидов и углеводов и тиоловых групп.

§ 7. Определение металлов.

§ 8. Электрофорез, гель-фильтрация, хроматография

ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

§ I. Очистка бензиламиноксидазы из аорты.

§ 2. Очистка бензиламиноксидазы из капилляров мозга

§ 3. Макромолекулярные свойства БАО из аорты капилляров .*.

§ 4. Кинетические характеристики фермента и его ингибирование.

§ 5. Оптические и магнитные свойства БАО из сосудов

§ 6. ]^ругие медьсодержащие ферменты сосудистой ткани

§ 7. Аминоксидаза из плаценты.

ГЛАВА 1У. 0БСУ1ЩШЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОда.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Очистка и изучение физико-химических свойств медьсодержащей аминоксидазы из кровеносных сосудов»

Медьсодержащие аминоксидазы обнаружены в некоторых животных тканях, а также в растениях и микроорганизмах. В отличие от мо-ноаминоксидаз, являющихся флавиновыми ферментами, медьсодержащие аминоксидазы катализируют главным образом окисление алифатических ди- и полиаминов.

Абсолютная необходимость этих соединений в процессах роста, дифференциации и специализации клеток стала очевидной в результате работ, выполненных в последнее двадцатилетие, которые установили также, что алифатические ди- и полиамины в избыточных концентрациях являются токсическими соединениями. Деградация этих полиаминов осуществляется главным образом путем окислительного дезаминирования, катализируемого медьсодержащими аминокси-дазами. Отсюда очевидно, что эти ферменты выполняют функцию защиты клеток и тканей от токсических концентраций ди- и полиаминов.

В последние годы придается большое значение изучению кровеносных сосудов как биохимически активной системы, ответственной за процессы транспорта веществ через гемато-тканевые барьеры, а также детоксификацию тканей. В связи с этим становится актуальным изучение ферментов, регулирующих уровень поступающих в ткани полиаминов, и в частности, медьсодержащих ферментов сосудистой системы, участвующих в метаболизме полиаминов.

Однако к настоящему времени единственной изученной медьсодержащей аминоксидазой сосудистой системы является лизилоксида-за, физиологическое значение которой состоит в образовании поперечных сшивок в полипептидных цепях структурных белков соединительной ткани: коллагена и эластина. Благодаря этому лизилоксидаза является ферментом, активность которого в значительной мере определяет эластические свойства сосудов.

Имеются указания, что сосуды обладают также полиаминокси-дазной активностью. В 70-ых годах была предпринята попытка очистить этот фермент из аорты, однако полученный препарат обладал низкой активностью и был гетерогенен. Это было практически единственным сообщением о свойствах этого фермента, поскольку в дальнейшем новых данных о нем не было опубликовало. В связи с этим основная задача настоящей работы состояла в разработке метода получения в высокоочищенном состоянии полиаминоксидазы из аорты и других сосудов и изучении ее свойств.

В результате проведенной работы впервые удалось получить высокоочшценные и гомогенные препараты полиаминоксидазы из аорты и капилляров мозга, изучить содержание фермента и его активность в крупных и мелких сосудах, определить физико-химические характеристики фермента, изучить особенности окружения меди в активном центре полиаминоксидазы, выявить ее ингибиторы. Удалось также обнаружить природный белковый ингибитор аминоксидазы. На основании проведенной работы предложен тезис о связи уровня полиаминов с уровнем меди в организме.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Меграбян, Зара Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод получения в высокоочизценном состоянии медьсодержащей бензиламиноксидазы из аорты и капилляров мозга. Определение содержания фермента в сосудах этих двух типов показало, что капилляры мозга примерно в 15 раз более обогащены этим ферментом по сравнению с аортой. Метод позволяет также получать из сосудов медьсодержащую лизилоксидазу. Установлено, что бензиламиноксидаза сосудов принадлежит к классу "несиних" медьсодержащих оксидаз, катализирующих восстановление кислорода до перекиси водорода.

2. Изучены физико-химические свойства бензиламиноксидазы из сосудов. Показана способность фермента к образованию олигоме-ров, определены молекулярная масса, содержание меди и тиоловых групп, а также каталитическая активность субъединицы фермента. Изучены влияние температуры и рН на активность фермента, стационарная кинетика ферментативной реакции. Установлено ингибирова-ние фермента высокими концентрациями субстрата. Изучены оптические и люминесцентные свойства бензиламиноксидазы из сосудов. Показано, что спектр поглощения фермента значительно отличается от спектров большинства белков и отражает низкое содержание ароматических аминокислот в ферменте.

3. Установлено, что фермент ингибируется не только высокими концентрациями субстрата, но также продуктами реакции - бен-зальдегидом, а также тиоловыми реагентами и восстановителями. Ингибиторами фермента являются также хелаторы меди и анионы с высоким сродством к меди. Помимо бензиламина,медьсодержащая аминоксидаза из аорты и капилляров способна эффективно окислять также полиамины: спермин и спермидин, которые могут рассматри

- 123 ваться как физиологические субстраты этого фермента.

4. Методом ЭПР изучены магнитные свойства фермента. Обнаружены изменения в окружении меди, входящей в состав активного центра фермента под влиянием рН, ингибиторов и субстратов. Показано, что эти изменения в окружении коррелируют с изменением активности. Необратимые изменения в окружении меди сопровождаются также необратимыми изменениями в активности. Обнаружен новый парамагнитный центр в ферменте, возникающий под влиянием субстрата и ингибитора (j^-аминопропионитрил), принадлежащий органической группе фермента, либо супероксидному радикалу.

5. Из плаценты выделена медь- и марганецсодержащая аминоксидаза, способная окислять гистамин и кадаверин и неактивная в отношении бензиламина. Изучены физико-химические свойства этого фермента (молекулярная масса, субъединичный состав, оптические и магнитный свойства) и показаны различия в свойствах этого фермента и аминоксидазы из сосудов.

6. Результаты изучения медьсодержащих аминоксидаз сосудов, способных окислять ди- и полиамины, позволили предложить тезис о регулирующей роли уровня меди в организме на содержание алифатических ди- и полиаминов в тканях.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Меграбян, Зара Борисовна, 1984 год

1. Methods in Enzymology (eds Tabor H.,Tabor C.W.) Acad.Press,New-York, I983,v.94,-544p.

2. Cohen S.S. Introduction to the polyamines. Inc.Englewood Cliffs, New Jersey,Prentice Hall,1971,-179p.

3. Janne J.,Poso H.,Raina A. Polyamines in rapid growth and cancer. Biochim.Biophys.Acta,1973,v.473,N3/4,p.241-293.

4. Bachrach U. Function of naturally occurring polyamines. Acad. Press,New York,1973,-21lp.

5. Seiler N.,Kn6dgen B. Die Umwandlung von Glutaminsaure,Putrescin una Ornitin in die^-Aminobuttersaure in Gehirn.iioppe-Scylers.-Z.Physiol.Chem.,1971,v.352,Ni,p.97-105.

6. Oxygen radicals in chemistry and biology (eds.Bors W.,Saran M., Tait D.) Walter de Gruyter & Co.Berlin-New-York,1984,-?34p.

7. Dykstra W.G.,Herbst E.J.Spermidine in regenerating liveriregula-tion to rapid synthesis of ribonucleic acid.-Science,1965,v.149, N3682,p.428-429.

8. Russel D.H.,Durie B.G.M. Polyamines as biochemical markers of normal and malignant growth. Raven Press,New-York,1978,-178p.

9. Bachrach U.,Don S.,Wiener H. Polyamines.Tumor cells.Effect of- 125 transfomation of chick embryo fibroblasts by Rous sarcoma virus on polyamine levels.-Biochem.Biophys.Res.Commun., 1973,v.55» N3,p. Ю35-Ю43.

10. Tabor C.W.,Tabor H. 1,4-Diaminobutane (putrescine),spermidine and spermine.In: Annu.Rev.Biochem. (eds.Snell E.E.,Boyer P.D., Meister A.,Richardson Ch.C.) 1976,v.45,p.285-306.

11. Ham R.G.Putrescine and related amines as growth factors for a mammalian cell line.-Biochem.Biophys.Res.Commun., 1964,v. 14,Hi, p.44-48.

12. Robinson R. The structural relations of natural products.Oxford Univ.Press,London,1955,-12Sp.17*Bowman M.B.,Levas M.S. The copper hypothesis of schizophrenia. A review.-Heuroscience and Biobehavioural Reviews,1982,v.6.,H3, p.321-328.

13. Hare M.L.C. Tyramine oxidase I.A new enzyme in liver.-Biochem. J.,1928,v.22,N5,p.968-979.

14. Best C.H. The disappearance of histamine from autolysing lung tissue.-J.Physiol.,1929,v.67,N2,p.256-263.

15. Blascnko H.,Friedman P.J.,Hawes R.,Nilsson К. The amine oxidase of mammalian plasma.-J.Physiol.,1959,v.145,N3,p.384-404.

16. Akopyan Z.I.,Stesina L.N.,Gorkin V.Z. Hew properties of highly purified bovine liver mitochondrial monoamine oxidase.-J.Biol. Chem.,1971,v.246,N14,p.4610-4618.

17. Stessina L.N.,Akopyan Zh.I.,Gorkin V. Z. Modification of catalytic properties of amine oxidases.-FEBS-Lett.,1971,v.16,N4,p.349-351.

18. Горкин B.3., Акопян Ж.И., Веревкина И.В., Гриднева Л.И., Стеси-на Л.И. О дезамннировании некоторых биогенных аминов и других азотистых соединений митохондриями печени. Биохимия, 1970, т.35, № I, с.140-151.

19. Bieganski Т.,Kusche J.,Lorenz W.,Hesterberg R.,Stahlknecht C.-D.,J?eussner K.D. Distribution and properties of human intestinal diamine oxidase and its relevance for histamine catabolism.

20. Biochim.Biophys.Acta,1983,v.756,N2,p.196-203.

21. Vogel W.H., Gentile N.T. ,Ivlenduke H. ,Boehme D.H. Inter-and intra-individual differences in monoamine oxidase A and В activities in human central and peripheral tissues.- Biochem.Medicine,1983, v.29,p.392-397.- 127

22. Gomes B.,Igane I.,Kloepfer H.G.,Yasunobu K.T. Amine oxidase.XIV. Isolation and characterization of the multiple beef liver amine oxidase components.-Arcn.Biocliem.BiopJays. , 1969,v. 132,N1,p. 1627.

23. Hc51tta E. Oxidation of spermidine and spermine in rat liver:pu-rification and properties of polyamine oxidase.-Biochemistry, I977,v.16,N1,p.91-100.

24. Van Dijken J.P.,Bos P. Utilization of amine by yeasts.-Arch. Microbiol. ,1981,v. 128,1*4,p.320-324.

25. Галаев Ю.В. Патогенные ферменты бактерий. М. Медицина, 1968,115 с.

26. Kximagai Н. ,Kishimoto N.,Yamada Ы. Subunit structure of amine oxidase from Aspergillus niger.-Agric.Biol.Chem., 1978,v«42,2T4, p.693-894.

27. Haywood G.W.,Large P.J. Microbial oxidation of amines.Distribution, purification and properties of two primary-amine oxidase from yeast Candida boidinii grown on amines as a sole nitrogen source.-Biochem.J.,1981,v.199,N1,p.187-201•

28. Srivastava S.K. ,Prakash V. Purification and properties of pea cotyledons and embryo diamine oxidase.-Phytochemistry,1977,v. 16,N1,p.189-190.

29. Mondovi B.,Rotilio G. jPinazzi-Agro' A.,Antonini E. Amine oxi-dases:a new class of copper oxidases.In: Magnetic resonanes in biological research (ed.Franconi C.) Gordon & Breach Sci.Publ. New-York,1971,p.233-246.- 129

30. Kleutz M.D.,Schmidt P.G. Proton relaxation study of the hog kidney diamine oxidase active center.-Biochemistry,1977,v.16, N24,p.5191-3196.

31. Goryachenkova E.V.,Ershova E.A. In: Chemical and biological aspects of pyridoxal catalysis (eds.Snell E.E. ,i*asella P.M.,Braun-stein A.,Rossi-Fanelli A.) Pergamon Press,Oxford,1963,p.44?•

32. Kappler-Adler R. ,Mac i?arlane H. Purification and identification of hog kidney nistaminase.-Biochim.Biopnys.Acta,1963,v.67,N4, p.542-565.

33. Bieganski T.,Kurcne J.,Lorentz W. ,Hesterberg R,Stanlknecht C-D. i?eusner K.-D. Distribution and properties of human intestinal- 130 diamine oxidase and its relevance for tlie histamine catabolism. Biochim.Biophys.Acta,1983,v.756,N2,p.196-203.

34. Bunce K.T.,Parsous M.E. Investigation of the role of histamine H^ receptors in the control of gastric acid secretion.-J.Pnarm.

35. Pharmacol.,1978,v.30,p.247-249.

36. Kusche J.,Lorenz W., Stahlkne'cht C-D.,Richter H.,Hesterberg R., Schmal A.,Hinterland E.,Weber D.,0nman C. Intestinal diamine oxidase and histamine release in rabbit mesenteric ischemia.-Gastroenterology,1981,v.80,N6,p.980-987»

37. Wollin A.,Havert H. Release of intestinal diamine oxidase by histamine in rats.-Can.J.Physiol.Pharmacol.,1983,v.61,N4,p.349-355

38. Cuffroy Ch.,Fowler Ch.J.,Benedetti M.S. The aeamination of n-pentylamine by monoamine oxidase and a semicarbazide-sensitive amine oxidase of rat heart.-J.Pharm.Pharmacol.,1983,v.35,p.416-420.

39. Bhansali E.G.,Hayes B.E.,Clarice D.E. Benzylamine oxidase in rabbit lung.-Fed.Proc.,1982,v.41,N4,p.1056.

40. Шароян С.Г., Налбандян P.M. Растворимые металлопротеины мозга. У. Медьсодержащие белки из белого вещества головного мозга. Нейрохимия, 1983, т.2, В 4, с.389-397.

41. Carper W.R.,Stoddard B.'D.,Martin D.F. Pig liver monoamine oxidase I.Isolation and characterization.-Biochim.Biophys.Acta, 1974, v. 334,113, p. 287-296.

42. Salach J.I. Monoamine oxidase from beef liver mitochondria: simplified isolation procedure,properties and determination of the cysteinyl flavin content.-Arch.Biochem.Biophys.,1979,v#192, N1,p.128-137.

43. Hirsh J.G. Spermine oxidase: an amine oxidase with specificity for spermine and spermidine.-J.Exp.Med.,1953,v.97,N2,p.345-355»

44. Buffoni F. ,Banchelli G.,Ignesti G.,Pirisino R.,Raimondi L.The presence of an inhibitor of benzylamine oxidase in human blood plasma.-Biochem.J.,1983,v.211,N3,p.767-769.

45. Becker R.E. Endogeneous inhibitor of MAO present in human cerebrospinal fluid.-Science,1983,v.221,N4609,p.476-477»

46. Murphy D.L.,Weiss R. Reduced monoamine oxidase activity inblood platelets from bipolar depressed patients.-Amer.J.Psych., 1972,v.128,Nl,p.35- 133

47. H61tta E.,Pulkkinen P.,Efving K.,J£nne J. Oxidation of polyami-nes by diamine oxidase from human seminal plasma.-Biochem.J., 1975,v.145,N2,p.373-378.

48. Siegel R.C.,Page R.C.,Martin G.R. The relative activity of connective tissue lysyl oxidase and plasma amine oxidase on collagen and elastin substrates.-Biochim.Biophys.Acta,1970,v.222,N2, p.552-555.

49. Rucker R.B.,0'Dell B.L. Connective tissue amine oxidase.I.Purification of bovine aorta amine oxidase and its comparison with plasma amine oxidase.-Biochim.Biopnys.Acta,1971,v.235,Ш,p.32-43.

50. Harris E.D.,Blout J.E.,Leach R.M. Localization of lysyl oxidase in hen oviduct.-Science,1980,v.208,p.55-56.

51. Harris E.D.,Gonnerman W.A.,Savage J.E^O'Dell B.L. Connective tissue amine oxidase.II.Purification and partial characterization of lysyl oxidase from chick aorta.-Biochim.Biophys.Acta,1974, v.341,N2,p.332-344.

52. Kagan H.M.,Hewitt N.A.,Salcedo L.L.,Franzblau C. Catalytic activity of aortic lysyl oxidase in an insoluble enzyme-substrate complex.-Biochim.Biophys.Acta,1974,v.365,N1,p. 223-234.

53. Siegel R.C.,Fu J.C.C. Collagen cross-linking.Purification and substrate specificity of lysyl oxidaseJ.Biol.Chem.,1976,v.251, N18,p.5779-5785.

54. Harris E.D.,0'Dell B.L. Copper and amine oxidases in connective tissue metabolism.-Adv.Exp.Biol.Med.,1974,v.48,p.267-284.- 135 109.0*Dell В.L.Roles of iron and copper in connective tissue biosynthesis.- Phil.Trans.R.Soc.bond.,1981,B,294,p.91-104.

55. Benditt E.P. The origin of atherosclerosis.-Sci.Amer.,1977,v. 236,p.74-84.

56. Benditt E.P. ,Govm A.M. Atheroma:the artery wall and the environment. -Int.Rev.Exp.Pathol.,1980,v.21,p.55-118.

57. Dobbing J.,Hawkins R.A. The blood-brain barrier.-The Lancet, 1981,v.II,N8246,p.584.

58. Mans A.M.,Biebnyck J.P.,Shelly K.,Hawkins R.A. Regional blood-brain barrier permeability to amino acids after portacaval anastomosis.-J.Neurochem.,1982,v.38,N3,p.705-717.

59. Lewinsohn R. Amine oxidase in human blood vessels and nonvascular smooth muscles.-J.Pharm.Pharmacol.,1981,v33,N8,p.569-575*

60. Hayes B.E.,0strow P.Т.,Clarke D.E. Benzylamine oxidase in normal and atherosclerotic human aortae.-Exp.Mol.Pathol.,1983,v. 38,N3,p.243-254.

61. Brendell K.,Meezan E.,Carlson E.C. Isolated brain microvessels:- 136 a purified,metabоlieally active preparation from bovine cerebral cortex.-Science,1974,v.185,N4155,p.953-955*

62. Jarrott B.,Hjelle J.T.,Spector S. Assosiation of histamine with cerebral microvessels in regions of bovine brain.-Brain Res.,1979,v.168,Hi,p.323-330.

63. Tabor C.W.,Tabor H.,Rosenthal S.Ivl. Purification of amine oxidase from beef plasma.-J.Biol.Chem.,1954,v.208,N1,p.645-660.

64. Nishikimi M#,Rao N.,Yagi K. The occurence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine inethasulfate and molecular oxyde.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,1972,v.46,N2,p.849-854.

65. Lowry 0. ,Rosebrough N. ,J?arr A.,Randall R. Protein measurment with the Folin phenol reagent.-J.Biol.Chem.,1951,v.193,N1,p. 265-275»125«Piske C.H.,Subbarow J. The colorimetric determination of phosphorus.-J.Biol.Chem. , 1925, v. 66,N2,p.375»

66. Levine C.,Chargaff E. Procedures for the microestimation of nitrogenous phosphatide constitutients.-J.Biol.Chem.,1951,v. 192,N2,p.465-479»

67. Кейтс M. Техника липидологии. M. Мир, 1975, - с.81.

68. Zacharius R.,Zell Т. Glycoprotein staining following electrophoresis on acrylamiae gels.-Anal.Biochem.,1969,v.30,N1,p.148-152.

69. Sedlak J.,Lindsay II. Estimation of total,protein-bound and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent.-Anal.Biocnem.,1968,v.25,N1,p.192-205.

70. Matsuba Y.,Takahashi Y. Spectrophotometry determination of copper with N,N,N^N-tetraethylthiuram disulfide and application of this method for studies on subcellular distribution of copper in rat brain.-Anal.Biochem.,1970,v.36,N1,p.182-192.

71. Cameron B.F. Determination of iron in heme compounds.II.Hemo- 137 globin and myoglobin.-Anal.Biochem.,1965,N2,p.164-169.

72. Davis B. Disc electrophoresis.II.Method and application to human serum proteins.-Ann.N.Y.Acaa.Sci.,1964,v.121,p.404-427.

73. Weber K.,0sborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. -J.Biol.Chem.,1969,v.244,N16,p.4460-4412.

74. Yamada H.,Kumagai H.,Kawasaki H.,Marsui H.,Ogata K. Crystallization and properties of diamine oxidase from pig kidney.-Biochem.Biophys.Re s.Commun.,19 67,v.29,N5,p.723-729.- 138

75. Losty Т.S.,О'Dell B.L. Evidence for lysyl oxidase substrate specificity.-Fed. Pro с «Fed.Am.Soc.Exp.Biol., 1980,v.39,N5,P« 974-978.

76. Камалян М.Г., Налбандян P.M. Оптические,магнитные свойстваазурина из PseaoWn^ й^.гБиохимия, 1977, т.42, J 2, с.223-229.

77. Kamin К. Flavins and flavoproteins. Univ.Park.Press,Baltimore, 1970,-560p.

78. Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М., Наука, 1981, - 168 с.

79. Friedman J.,Cerutti P. The induction of ornitine decarboxylase by piaorbol 12-myristate-13-acetate or by serum in inhibited by antioxidants.-Carcinogenesis,1983,v.4,Hll,p.1425-1428.