Образование и использование АТФ в гепатоцитах круглоротых и амфибий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Гампер, Никита Львович

• Гампер, Никита Львович
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гампер, Никита Львович

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Принципы организации энергетического метаболизма в клетках

позвоночных животных

1.1.1. Структура клеточного энергетического метаболизма. Потребление кислорода клетками

1.1.2. Межвидовые различия скорости энергетического метаболизма в клетках позвоночных животных

1.2 Регуляция энергетического метаболизма в клетках позвоночных

животных

1.3. Метаболическая депрессия

1.3.1. Что является сигналом к снижению метаболической скорости?

1.3.2. Баланс процессов синтеза и гидролиза АТФ при метаболической депрессии

1.3.3. Поддержание ионного гомеостаза

1.3.4. Молекулярные механизмы развития метаболической

депрессии

2. Материалы и методы

3. Результаты и обсуждение

3.1. Структура энергетического метаболизма в гепатоцитах

круглоротых и амфибий в активные периоды жизненных циклов

3.1.1. Размеры и масса гепатоцитов эктотермных и эндотермных позвоночных

3.1.2. Эндогенное потребление кислорода гепатоцитами. Митохондриальное и немитохондриальное дыхание. Распределение митохондриального дыхания

3.1.3. Содержание адениновых нуклеотидов в гепатоцитах и ткани печени миног и лягушек в периоды активного метаболизма

3.1.4. Взаимосвязь скорости потребления кислорода гепатоцитами и массы тела у эктотермных позвоночных. Сравнение с млекопитающими

3.2. Энергетический метаболизм в гепатоцитах миноги в период преднерестовой миграции

3.2.1. Жизненный цикл миног. Краткое описание

3.2.2. Дыхание и адениновые нуклеотиды в гепатоцитах мигрирующих миног. Феномен обратимой метаболической депрессии

3.2.3. Регуляция окислительного метаболизма в гепатоцитах

миноги

3.3. Влияние замедления энергетического метаболизма на жизнеспособность изолированных гепатоцитов

3.4. Влияние замедления энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги на ионный гомеостаз

4. Заключение

5. Выводы

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

адф аденозин-5' -дифосфат

АМФ ад енозин-5 '-фосфат

АТФ аденозин-5 '-трифосфат

АФК активные формы кислорода

БСА бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

гдф гуанозин-5'-дифосфат

ГМФ гуанозин-5' -фосфат

ГТФ гуанозин-5' -трифосфат

дк дыхательный контроль

жкт желудочно-кишечный тракт

Фн неорганический фосфат

ФП фосфатный потенциал ([АТФ]/[АДФ][Фн])

УДФ уридин-5'-дифосфат

УМФ уридин-5' -фосфат

УТФ уридин-5' -трифосфат

цАМФ аденозин-3' ,5' -циклофосфат

ЦДФ цитидин-5 '-дифосфат

ЦМФ цитидин-5' -фосфат

ЦТФ цитидин-5' -трифосфат

эпо эритропоэтин

ANOVA дисперсионный анализ (analysis of variances)

СССР карбонилцианид-м-хлорофенилгидразон

СоА кофермент А

CiJ коэффициент контроля фермента Ej над потоком J

АОф потенциал фосфорилирования (десятичный логарифм ФП)

ДцН электрохимический градиент протонов

A|iNa электрохимический градиент ионов Na+

АрН градиент рН

Др протонодвижущая сила

Ау мембранный потенциал

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

ФАД флавинадениндинуклеотид

FCCP карбонилцианид-р(трифлуорометокси)-фенилгидразон

HEPES (N-[гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этилсульфоновая кислота])

HIF фактор, индуцируемый гипоксией (hypoxia induced factor)

MES 2(Ы-морфолино) этилсульфоновая кислота

НАД никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ никотинамидадениндинуклеотидфосфат

Р/О Отношение количества синтезированного АТФ к количеству

потребленного кислорода

pCQ2 парциальное давление СОг

SEM Ошибка среднего (standard error of mean)

tR время удерживания соединения на сорбенте в хроматографической системе

Qio коэффициент увеличения скорости химической реакции при

увеличении температуры на 10°С

рНе рН внеклеточной среды

pHi рН внутриклеточной среды

Vo2 скорость потребления кислорода

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Образование и использование АТФ в гепатоцитах круглоротых и амфибий»

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Одна из аксиом молекулярной логики живого, сформулированная Альбертом Ленинжером, гласит: "Живые организмы создают и поддерживают присущую им упорядоченность за счет внешней среды, степень упорядоченности которой в результате этого уменьшается." (Ленинджер, 1974). Высокий уровень молекулярной организации живых систем поддерживается путем извлечения из окружающей среды свободной энергии, которая затем возвращается организмом обратно в виде тепла и других форм, дальнейшее использование которых организмом затруднено. Таким образом, превращение между собой различных форм энергии в организме является основой существования жизни. Неудивительно, что исследованиями энергетического метаболизма занимается огромное количество биологов различных специальностей, успехи этих исследований можно проследить по Нобелевским премиям, неоднократно присуждавшимся ученым в этой области знаний (последняя - в 1997 за открытие принципа функционирования АТФ-синтетазного комплекса и за исследования Na+/K+АТФазы).

С момента открытия окислительного фосфорилирования В.А. Энгельгардтом (Энгельгардт, 1931) прошло уже почти 70 лет; многие проблемы мембранной биоэнергетики за это время уже решены, однако, несмотря на быстрый прогресс в понимании принципов превращения энергии в клетках, существует ряд вопросов, до сих пор требующих разрешения. Так, нет единой теории регуляции окислительного фосфорилирования в клетке ш vivo-, неясно, как поддерживается баланс скоростей синтеза и гидролиза АТФ при изменениях скорости метаболизма; мы очень мало знаем об эволюции "энергетической машины" клетки. Последнее обстоятельство особенно показательно: основные работы по изучению энергетического метаболизма ведутся на клетках и митохондриях млекопитающих, относительно большое внимание привлечено также к изучению биоэнергетики микроорганизмов и растений, однако энергетический метаболизм клеток эктотермных позвоночных до сих пор еще мало изучен. Мы в той или иной степени представляем себе, как происходит

трансформация энергии в клетках млекопитающих, однако, мало знаем о том, что происходило с "энергетической машиной" клетки в процессе эволюции животного мира.

Логично было бы предположить, что за миллионы лет эволюции биоэнергетические мембраны достигли наивысшей степени эффективности, то есть наивысшей степени сопряженности потребления кислорода с окислительным фосфорилированием. Однако, в начале 90х годов стало окончательно ясно, что это не так: существенная часть (20-30%) кислорода, потребляемого клеткой млекопитающего, расходуется в результате пассивной утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий и не сопряжена с синтезом АТФ (Murphy, 1989; Brand, 1990а; Brand, 1990b; Brown and Brand, 1991; Brown, 1992; Brand et al., 1994a). Более того, было показано (Brand et al., 1991, Brookes et al., 1998), что скорость утечки протонов в митохондриях эктотермных позвоночных ниже, чем у млекопитающих и птиц.

Другой интригующий вопрос эволюции энергетического метаболизма связан с различиями удельной скорости энергетического метаболизма у экто- и эндотермных животных. Известно, что удельная скорость метаболизма эктотермных позвоночных в 5-10 раз ниже, чем у эндотермных (при одинаковой массе и температуре тела). Различия того же порядка сохраняются и при сравнении удельных скоростей метаболизма изолированных клеток экто- и эндотермных животных. При этом, митохондрии, изолированные из клеток эктотермных позвоночных, способны in vitro функционировать со скоростями, присущими митохондриям теплокровных животных (Cassuto, 1971; Smith, 1973; Савина, 1985; Hulbert and Else, 1989; Савина, 1992). Таким образом, здесь мы сталкиваемся с явным нарушением принципа симморфоза, который гласит, что биологические структуры организованы таким образом, чтобы соответствовать максимальным потребностям организма, но не превышать их (Tailor and Weibel, 1981; Шмидт-Нильсен, 1987; Tailor et al., 1996).

Исследование энергетического метаболизма эктотермных позвоночных интересно еще с одной точки зрения. Спектр экологических адаптаций этих животных необычайно широк, и многие состояния, такие как переохлаждение, голодание, обезвоживание, существование в условиях крайне скудного снабжения кислородом, которые для большинства млекопитающих являются

стрессорными, патологическими или вообще несовместимыми с жизнью, оказываются приемлемыми для холоднокровных животных в определенные фазы их жизненного цикла. Многие эктотермные животные обладают способностью снижать скорость базального метаболизма в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды (феномен метаболической депрессии) до крайне низких значений, - вплоть до 5% от нормального уровня (Storey and Storey, 1990), что позволяет экономить энергетические ресурсы и переживать неблагоприятные условия в течение длительного времени. Поэтому изучение окислительного метаболизма эктотермных животных может быть полезным при формировании новых терапевтических подходов для защиты клеток от последствий гипоксии (ишемии), нарушений водно-солевого обмена, неправильного питания или голодания.

Для изучения энергетического метаболизма клеток эктотермных позвоночных в данной работе были выбраны миноги (Lampetra fluviatilis) и лягушки (Rana temporaria). Миноги являются интересным объектом сравнительных исследований клеточного энергетического метаболизма по нескольким причинам. Во-первых, эти животные - представители самого древнего из ныне живущих класса позвоночных животных - Круглоротых. Кроме того, миноги обладают своеобразным жизненным циклом, в котором, в контексте настоящей работы, наиболее интересным является период преднерестовой миграции, на протяжении которого животные не питаются в течение 8 месяцев, у них практически полностью атрофируется желудочно-кишечный тракт и дренажная система печени. Развитие гонад и такой весьма активный с точки зрения энергетического метаболизма процесс как нерест протекают исключительно за счет эндогенных субстратов, накопленных в период активного питания. Будучи моноцикличными, миноги умирают после нереста. Известно также, что в зимние месяцы миграции в печени миног наблюдается феномен обратимой метаболической депрессии (Савина, 1985, 1992; Savina and Gamper, 1998).

Выбор второго экспериментального животного, лягушки, которое является представителем другого класса эктотермных позвоночных - Амфибий, обусловлен тем, что эти животные доступны для эксперимента в периоды активного питания (в отличие от миног).

Гепатоциты были выбраны в качестве объекта исследования по нескольким соображениям: 1) использование живых клеток позволяет исследовать "энергетическую машину" клетки в естественном окружении, что невозможно при работе с изолированными митохондриями; 2) печень вносит существенный вклад в энергетический метаболизм организма; 3) гепатоциты относительно легко выделить и они долго сохраняют жизнеспособность в изолированном состоянии; 4) в литературе имеется большое количество данных по энергетическому метаболизму гепатоцитов млекопитающих, что облегчает сопоставление полученных результатов.

Цели и задачи исследования можно сформулировать следующим образом.

ЦЕЛИ РАБОТЫ:

1) изучение структуры энергетического метаболизма (соотношения между основными процессами, сопряженными с потреблением кислорода, производством и потреблением АТФ) клеток эктотермных позвоночных на примере гепатоцитов миноги Lampetra fluviatilis и лягушки Rana temporaria', сравнение полученных результатов с литературными данными для гепатоцитов млекопитающих; 2) Изучение феномена обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах миноги в зимние месяцы преднерестовой миграции.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) Определить скорость потребления кислорода гепатоцитами миног и лягушек. Оценить вклад в потребление кислорода клетками митохондриального и немитохондриального дыхания, потребления кислорода в процессе окислительного фосфорилирования и в результате утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий; определить вклад активного транспорта натрия и калия в скорость производства и потребления АТФ в клетке.

2) Сравнить скорости потребления кислорода гепатоцитами миноги и лягушки со скоростями потребления кислорода клетками печени других эктотермных позвоночных разной массы тела и млекопитающих. На основании полученных данных построить зависимость скорости потребления кислорода гепатоцитами

от массы тела для эктотермных позвоночных.

3) Подтвердить наличие депрессии энергетического метаболизма в клетках печени миног в период преднерестовой миграции; исследовать механизмы регуляции окислительного метаболизма в гипометаболическом состоянии; изучить влияние замедления скорости метаболизма на жизнеспособность изолированных клеток и поддержание в них ионного гомеостаза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ.

В результате проведенных исследований впервые было продемонстрировано, что несмотря на 3-5 кратные различия в скорости клеточного дыхания, структура энергетического метаболизма в гепатоцитах круглоротых и амфибий сходна с описанной для млекопитающих: удельный вклад в потребление кислорода клетками таких процессов как митохондриальное и немитохондриальное дыхание, потребление кислорода, обусловленное окислительным фосфорилированием и утечкой протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, а также потребление кислорода в результате функционирования Na+/K+ATOa3bi одинаково в исследованных гепатоцитах и в гепатоцитах крысы. Доступные литературные данные по этому в отношении эктотермных позвоночных вопросу касаются только рептилий (Brand et al., 1991).

Впервые было получено уравнение зависимости скорости потребления кислорода гепатоцитами от массы тела у эктотермных позвоночных. Подобные уравнения для клеток млекопитающих были опубликованы в 1995 году (Porter and Brand, 1995а, 1995b), однако для эктотермных позвоночных таких данных до сих пор представлено не было.

На изолированных гепатоцитах миноги были подтверждены более ранние данные, полученные на тканевых гомогенатах и изолированных митохондриях печени (Савина 1985, 1992), о наличии в этих клетках в зимние месяцы преднерестовой миграции обратимой метаболической депрессии, которая выражается в 2-Зх кратном снижении скорости потребления кислорода клетками, снижении интенсивности окислительного фосфорилирования, существенном уменьшении концентрации АТФ.

Впервые были исследованы принципы регуляции энергетического метаболизма при обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах мигрирующих на нерест миног. Было показано, что скорость потребления кислорода клетками, а также скорость окислительного фосфорилирования в гепатоцитах миноги регулируется доступностью для окисления жирных кислот - основного энергетического субстрата в этих клетках. Также была получена ценная информация об активности Na+/K+ATOa3bi в клетках, находящихся в гипометаболическом состоянии.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений о принципах функционирования и регуляции энергетического метаболизма у эктотермных позвоночных, выявлении черт сходства и различия биоэнергетики клеток экто- и эндотермных позвоночных. Была обнаружена зависимость скорости потребления кислорода гепатоцитами холоднокровных позвоночных от массы тела, сходная с известной для млекопитающих, а также сходное соотношение процессов потребления кислорода, синтеза и гидролиза АТФ в клетках этих животных. Эти закономерности позволяют по-новому взглянуть на проблему многократных различий в скоростях метаболизма между экто- и эндотермными позвоночными.

Результаты исследования регуляции энергетического метаболизма при обратимой метаболической депрессии позволяют глубже понять феномен в целом, сформировать представления о принципах выживания клеток при низких скоростях дыхания и производства АТФ, что может найти применение в медицине.

В процессе работы усовершенствована методика выделения гепатоцитов (Lappova and Leibush, 1995), что сделало ее пригодной для выделения жизнеспособных гепатоцитов, находящихся в гипометаболическом состоянии Также, была разработана новая методика определения нуклеотидов в биологических образцах методом высокоэффективной анионообменной жидкостной хроматографии, которая нашла практическое применение в лабораториях Научно-исследовательского центра Медицинской Академии

последипломного образования (НИЦ МАПО), где ее используют для определения нарушений энергетического метаболизма в лимфоцитах больных с хронической почечной недостаточностью, а также в Клинике нервных болезней Военно-Медицинской Академии, где методику применяют для определения адениновых нуклеотидов в цереброспинальной жидкости больных с черепно-мозговыми травмами для оценки степени повреждения.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты исследования докладывались на Втором съезде Биохимического общества РАН в Москве 19-23 мая 1997; XXXIII Международном Конгрессе физиологических наук в Санкт-Петербурге 30 июня -5 июля 1997; XIX Конгрессе Европейского общества сравнительной физиологии и биохимии в Турку, Финляндия, 23-26 августа 1998; в течение 2ой Финско - Русской школы "Рост и развитие. От молекул к организму", проходившей с 6 по 13 февраля 1998 на базе Хельсинского Университета в Финляндии. Методика определения адениновых нуклеотидов методом ВЭЖХ была представлена на Десятом Международном Симпозиуме по капиллярному электрофорезу и изотахофорезу в Праге, Чехия, 17-20 сентября 1996; Международном Конгрессе по аналитической химии в Москве 15-21 июня 1997 и на 22ом Международном Симпозиуме по хроматографии в Риме, Италия, 1318 сентября 1998. В декабре 1997 г работа получила вторую премию на конкурсе научных работ молодых сотрудников Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано три статьи, одна статья направлена в редакцию журнала Journal of Experimental Biology, кроме того опубликовано семь тезисов докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Работа занимает 138 страниц, содержит 17 рисунков и 16 таблиц и состоит из следующих глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Список литературы содержит 272 источника, 8 на русском и 264 на английском языке.

1.3, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Настоящее исследование посвящено изучению структуры энергетического метаболизма в гепатоцитах круглоротых и амфибий, выявлению черт сходства и различия принципов организации энергетического метаболизма в клетках экто-и эндотермных позвоночных, изучению феномена метаболической депрессии в гепатоцитах миног, а также вопросу регуляции окислительного фосфорилирования при метаболической депрессии. В связи с этим обзор литературы будет состоять из 3 частей: в первой (1.1.) мы обсудим принципы организации энергетического метаболизма в клетках позвоночных животных, и имеющиеся в литературе данные о сходстве и различиях биоэнергетики клеток экто- и эндотермных позвоночных; вторая часть (1.2.) будет содержать краткую историю и современное состояние вопроса о регуляции энергетического метаболизма в клетках позвоночных; третья часть (1.3.) будет посвящена рассмотрению феномена метаболической депрессии.

Перед тем как перейти к обсуждению перечисленных вопросов, необходимо дать несколько определений используемых ниже терминов. Под энергетическим метаболизмом в настоящей работе подразумевается совокупность процессов преобразования различных форм энергии в клетке (органе, организме), в частности, образование и использование АТФ. Скорость энергетического метаболизма или метаболическая скорость - интенсивность обменных процессов, измеренная по скорости потребления кислорода клеткой (органом, организмом). Удельная метаболическая скорость - потребление кислорода, отнесенное к массе клетки (органа, организма). Структура энергетического метаболизма - вклад в потребление кислорода клеткой (органом, организмом), различных процессов трансформации энергии. Базалъный метаболизм, или метаболизм покоя - энергетический метаболизм бодрствующего животного, не совершающего работы, сытого, но не переваривающего пищу, находящегося при температуре, оптимальной для данного вида. Состояние покоя изолированных клеток и тканевых препаратов -состояние, при котором отсутствует какое-либо стимулирование или ингибирование обменных процессов in vitro.

1.1. ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА В КЛЕТКАХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ.

Процессы производства (синтеза) и потребления (гидролиза) АТФ лежат в основе метаболизма всех типов клеток. Синтез АТФ происходит, главным образом, в митохондриях и сопряжен с потреблением (восстановлением) кислорода. Митохондриальное дыхание представляет собой окисление НАД-Н (ФАД-Нг) кислородом, которое посредством электрон-транспортной цепи сопряжено с транспортировкой протонов через внутреннюю мембрану митохондрий. Функционирование электрон-транспортной цепи создает электрохимический градиент протонов (ДцН) на внутримитохондриальной мембране, который, в свою очередь, состоит из мембранного потенциала (Д\|/) и градиента рН (ДрН). Перенесенные протоны возвращаются обратно по градиенту либо свободно (утечка протонов), либо через АТФ-синтетазный комплекс. АТФ-синтетаза сопрягает транспорт протонов через мембрану с синтезом АТФ из АДФ и Фн в митохондриальном матриксе. Неорганический фосфат для фосфорилирования переносится из цитозоля в митохондрии с помощью специфического фосфатного переносчика; АДФ доставляется в митохондрии (в обмен на АТФ в стехиометрическом соотношении 1:1) транслоказой адениновых нуклеотидов. Основной окисляемый дыхательной цепью субстрат - НАД-Н - образуется в результате восстановления НАД* при окисления углеводов, жирных кислот и аминокислот. Произведенная в результате описанных выше событий АТФ используется клеткой для выполнения ее функций. Основными потребителями АТФ в клетках позвоночных являются биосинтезы, №+/К+АТФаза и актомиозиновая АТФаза (в мышцах). Упрощенная схема образования и использования АТФ в клетке представлена на рис. 1.

Энергетический метаболизм часто концептуально подразделяют на две группы реакций: 1) процессы, ведущие к производству энергии (АТФ) -катаболизм и 2) процессы, потребляющие энергию (АТФ) - анаболизм. Такое подразделение в некоторых случаях удобно, но, по существу, не является верным так как, во-первых, производство АТФ не является производством

немитохондриальное дыхание

утечка протонов

-X-

ЫАйН

дыхательная цепь

С02, Н20

Окисление субстратов

а>

г

о. сг

Рисунок 1. Упрощенная схема энергетического метаболизма животной клетки. Пунктиром указаны процессы, ведущие к портеблению кислорода, но не сопряженные с синтезом АТФ.

энергии (согласно первому и второму законам термодинамики), а скорее является способом распределения свободной энергии; во-вторых, эндергонические процессы в клетке часто снабжаются энергией через другие чем АТФ интермедиаты (ГТФ, НАД-Н, НАДФ-Н, ДцН, ApNa); и в-третьих, реакции, протекающие с использованием АТФ, не являются единственными источниками производства тепла и рассеивания свободной энергии в клетке (Rolfe and Brown, 1997). Поэтому иногда кажется более целесообразным рассматривать метаболизм как совокупность сопряженных и разобщающих реакций (Rolfe and Brown, 1997). Так окисление субстратов сопряжено с восстановлением НАД-Н, окисление НАД-Н - с генерацией ЛцН, транспорт протонов по электрохимическому градиенту сопряжен с синтезом АТФ, синтез макромолекул, поддержание ионного гомеостаза, мышечное сокращение и пр., сопряжены с гидролизом АТФ. В свою очередь, деградация макромолекул, пассивная ионная проводимость мембран, мышечная релаксация, холостые циклы являются разобщающими процессами.

Ранее считалось, что энергетический метаболизм полностью сопряжен с синтезом АТФ, однако это не так. В настоящее время известно, что не весь кислород, потребляемый клеткой, расходуется в митохондриях (Siems et al., 1984; Dora et al., 1992; Brand et al., 1994a; Rolfe and Brand, 1996a; Rolfe and Brand, 1996b). Более того, значительная часть (в некоторых тканях до 50%) потребляемого митохондриями кислорода не сопряжена с синтезом АТФ (Nichols, 1974; Brand, 1990а; Brand, 1990b; Brown and Brand, 1991). Наличие в клетках разобщающих процессов, а также немитохондриального дыхания является причиной базального метаболизма - наличия определенной скорости обменных процессов в организме в состоянии покоя.

Ниже в этой части обзора литературы мы рассмотрим структуру клеточного энергетического метаболизма покоя а также некоторые закономерности межвидовых различий метаболической скорости в клетках позвоночных.

1.1.1. Структура клеточного энергетического метаболизма. Потребление кислорода клетками.

Интенсивность энергетического метаболизма (в аэробных условиях) может быть адекватно измерена по скорости потребления кислорода (Shutz, 1995). Часто понятия скорость энергетического метаболизма и скорость потребления кислорода используют как синонимы (Schmidt-Nielsen, 1997), поэтому в дальнейшем, при обсуждении структуры энергетического метаболизма в клетках мы будем использовать, главным образом, данные, полученные с помощью измерения скорости клеточного дыхания. Структура клеточного энергетического метаболизма различна в разных тканях, поэтому, для того, чтобы дать более полную картину принципов образования и потребления АТФ в клетках мы будем рассматривать не только гепатоциты, но и клетки других тканей позвоночных животных. Печень, тем не менее, в контексте данной работы является наиболее интересным органом, поскольку интенсивность энергетического метаболизма в нем очень высока (табл.1.)

1.1.1.1. Вклад в потребление кислорода клетками процессов, несопряженных с производством и потреблением АТФ.

Немитохондриальное дыхание. Как уже отмечалось выше, не весь кислород, потребляемый клеткой, расходуется в митохондриях. Существует большое количество реакций, потребляющих кислород вне этих органелл. К ним относится окисление жирных кислот в пероксисомах, оксигеназы эндоплазматического ретикулума и пр. Немитохондриальное дыхание составляет 14 - 23% от кислорода, потребляемого изолированными гепатоцитами крысы (Brand et al., 1991, 1994), 20% в перфузированной печени (Sholz and Bucher, 1965), 14% в скелетных мышцах крысы (Dora et al, 1992, Rolfe and Brand, 1996a), 20% в ретикулоцитах кролика (Siems et al, 1982), 15.7% в гепатоцитах ящерицы Amphybolurus vitticeps (Brand et al, 1991) и только 2% в изолированных тимоцитах (Lakin-Tomas and Brand, 1988).

Таблица 1. Вклад различных органов в суммарное потребление кислорода организмом у млекопитающих. (Rolfe and Brown, 1997).

Орган Масса тела, % Потребление Ог организмом, %

человек крыса человек крыса

печень 2 5 17 20

желудочно-кишечный

тракт 2 5 10 5

почка 0.5 0.9 6 7

легкие 0.9 0.6 4 1

сердце 0.4 0.5 11 3

мозг 2 1.5 20 3

скелетные мышцы 42 42 20 30

всего 49.8 55.5 88 69

Утечка протонов через внутреннюю мембрану митохондрий. В недавних работах группы Бранда показано, что утечка протонов обуславливает 19 - 26% потребления кислорода гепатоцитами млекопитающих (Nobes et al, 1990; Brown et al., 1990b; Brand, 1990a; Brand et al., 1991,1993, 1994; Harper and Brand, 1993), 52% в мышцах в состоянии покоя (Rolfe and Brand, 1996a; Rolfe and Brand, 1996b), 39% в тимоцитах (Buttgereit and Brand, 1995) и несущественна в клетках карциномы Эрлиха (Boguchka et al., 1990). Гораздо меньше данных о пассивной протонной проводимости митохондрий в клетках эктотермных позвоночных, однако известно, что в гепатоцитах ящерицы Amphybolurus Vitticeps утечка протонов обуславливает 30% потребления кислорода в состоянии покоя (Brand et al., 1991). Исходя из опубликованных данных об утечке протонов в клетках печени, сердца и скелетных мышц млекопитающих, Ральфи и Браун рассчитали, что утечка протонов обуславливает примерно 20% базального метаболизма млекопитающих (Rolfe and Brown, 1997).

Пассивная проводимость внутренней мембраны митохондрий для протонов, считавшаяся до недавнего времени артефактом выделения митохондрий (Duszynski and Woitczak, 1985; Brown and Brand, 1986), вносит

существенный вклад в потребление кислорода клетками в состоянии покоя, по этому мы уделим некоторое дополнительное внимание природе этого явления. Схема возможных процессов, объясняющих феномен "мягкого" (термин В.П. Скулачева), или физиологического разобщения, представлена на рисунке 2. Утечка протонов (proton leak) представляет собой возврат Н+ по электрохимическому градиенту. Не опосредованный протонными насосами и не сопряженный с синтезом АТФ, "проскок" электронов (redox slip) представляет собой прохождение электрона по соответствующему участку электрон-транспортной цепи, не сопряженный с переносом Н+ против электрохимического градиента. "Проскок" протонов (proton slip) представляет собой возврат Н+ через протонный насос, или АТФ-синтетазу, по электрохимическому градиенту, не сопряженный с синтезом АТФ или транспортом электронов (Brown, 1992). В настоящее время нет единой точки зрения на то, какой из перечисленных механизмов разобщения преобладает in

+

Hf -

протонный насос

-it

АТФ-синтетаза

Рисунок 2. Возможные механизмы физиологического разобщения (по Brown, 1992). 1 - проскок электронов; 2 - утечка протонов; 3 - проскок протонов.

vivo. Часть исследователей считают, что "проскоки" электронов или протонов могут вносить существенный вклад в разобщение, т.е. стехиометрия соотношений Н+/е и Н+/0 может существенно меняться в зависимости от Ар (Zoratti et al., 1986: Pietrobon et al., 1981, 1983; Murphy and Brand, 1987, 1988a, 1988b); другие, - что эта стехиометрия стабильна и основным механизмом разобщения является утечка протонов (Brown, 1989, Zolkiewska et al., 1989, Hafner and Brand, 1991). Данные по этому вопросу достаточно противоречивы, достаточно сказать, что в начале 90х годов Бранд с соавторами провели серию работ, доказывающих несущественность "проскока" электронов в физиологическом разобщении (Brand et al., 1994а, 1994b) однако, в 1995 г появляется работа той же группы, подвергающая сомнению категоричность предыдущих работ (Porter and Brand, 1995с). В целом, кажется наиболее вероятным, что физиологическое разобщение имеет смешанное происхождение, хотя его преобладающим компонентом является утечка протонов (Murphy, 1989; Brown, 1992; Luvisetto et al., 1992).

Механизм пассивной проницаемости внутримитохондриальной мембраны для протонов также вызывает много споров. М. Бранд и другие считают, что протонная проводимость - свойство липидного бислоя, и не связана с белками (Brown and Brand, 1991; Brown, 1992; Porter et al., 1996). С другой стороны, во второй половине 90-х годов стало появляться все больше доказательств того, что во многих тканях позвоночных существуют специфические разобщающие белки, аналогичные термогенину бурой жировой ткани (Fleury et al., 1997; Harper, 1997; Everback et al., 1997; Faggioni, 1998), хотя их способность проводить протоны дискутируется (Bienengraber, 1998; Brookes et al., 1998).

Для краткости и по сложившейся традиции мы будем применять термин "утечка протонов" для обозначения процесса физиологического разобщения, однако, принимая во внимание приведенные выше рассуждения, не будем забывать, что истинные причины разобщения могут иметь более сложную природу.

Утечка протонов не является "дефектом" энергетического метаболизма и, по-видимому, выполняет ряд функций, среди которых - поддержание клетки в состоянии готовности к совершению работы. Например, высокая скорость потребления кислорода покоящимися мышцами, поддерживающаяся за счет

сильной утечки протонов, позволяет быстро увеличить скорость выработки АТФ при нагрузке, не меняя при этом сильно скорости потребления кислорода; Rolfe and Brand, 1996а; Rolfe and Brand, 1996b). Другая возможная роль утечки протонов - предотвращение образования активных форм кислорода (АФК). Известно, что дыхательная цепь является источником образования супероксида О2', причем скорость образования последнего сильно возрастает при снижении скорости потребления кислорода митохондриями (Скулачев, 1995). Таким образом, потребление кислорода клетками в состоянии покоя за счет утечки протонов, или, в терминологии В.П. Скулачева "мягкого" разобщения, снижает "кислородную опасность" (Скулачев, 1995; Rolfe and Brand, 1997; Skulachev, 1998).

1.1.1.2. Вклад в потребление кислорода процессов, являющихся основными потребителями АТФ в клетке.

Определение удельного вклада того или иного процесса в общее потребление произведенной клеткой АТФ производится двумя основными способами: 1) непосредственное измерение скорости данного процесса в клетке (ткани). 2) измерение уменьшения скорости потребления кислорода при действии на клеточный или тканевый препарат специфическим ингибитором изучаемого процесса. Недостаток первого метода - сложности прямых измерений в живых клетках, второго - возможные побочные эффекты ингибиторов на энергетический метаболизм. Оба эти недостатка имеют следствием большой разброс доступных в литературе данных о вкладах тех или иных процессов в общее потребление кислорода клетками. Мы, тем не менее, кратко изложим сложившиеся к настоящему моменту взгляды по этому вопросу.

1.1.1.2.1. Na+/К*АТФаза. Поддержание высокой внутриклеточной концентрации К+ и низкой Na+ вносит наибольший вклад в потребление АТФ в мозгу и почках млекопитающих, где доля этого фермента в потреблении кислорода клеткой составляет 50-60% (Astrup et al., 1981; Harris et ah, 1981; Soltof, 1986; Erecinska and Silver, 1989). В печени Na /К АТФаза гораздо менее активна и ее вклад в клеточное дыхание составляет около 10% (Nobes et ah, 1989; Brand et al, 1991; Clausen et al, 1991). В гепатоцитах рептилий (А. vitticeps) вклад Ыа+/К+АТФазы в клеточное дыхание также составляет примерно

10% (Brand et al, 1991). Таков же порядок величин для активности Na /К АТФазы в скелетных мышцах и сердце млекопитающих (Clausen et al, 1991). Данные о большем вкладе фермента в потребление кислорода этими органами, полученные ранее (Whitman, 1974; Else and Hulbert, 1987), объясняются, по-видимому, вторичными эффектами уабаина (широко применяемого ингибитора Na+/K+АТФазы) на энергетический метаболизм (Nobes et al., 1989).

1.1.1.2.2. Ca АТФаза. На обеспечение "работы" этого фермента расходуется 6% кислорода, потребляемого скелетными мышцами (в состоянии покоя), 24-58% в сокращающихся скелетных мышцах, < 1% в покоящейся сердечной мышце, 18-36% в работающей сердечной мышце, 2% в печени (данные для млекопитающих). Также предполагается, что этот фермент активен в мозгу (Clausen et al, 1991; Rolfe and Brown, 1997).

1.1.1.2.3. Метаболизм белков. Расход энергии на синтез белка составляет примерно 20% базального метаболизма у млекопитающих (Waterlow, 1984; Rolfe and Brown, 1997) и может варьировать в разных тканях. В дифференцирующихся клетках примерно 40% от производимой АТФ идет на синтез белка (Land et al, 1993). Подобные цифры были получены и для тканей эктотермных позвоночных. Так в гепатоцитах черепахи в норме 36% производимой АТФ (или 24% потребляемого кислорода) тратится на синтез белка (Land et al, 1993; Buck and Hochachka, 1993; Land and Hochachka, 1994). Данные об энергетических затратах на распад белков трудно интерпретировать, так как они получены, главным образом, при действии на клеточное дыхание эмитина (ингибитора синтеза белка и протеолиза), который, по-видимому, обладает побочными эффектами на метаболизм. Тем не менее, было показано, что на АТФ-зависимый протеолиз расходуется 11-15% кислорода, потребляемого ретикулоцитами кролика (Siems et al, 1982, 1984), 5-8% -клетками карциномы Эрлиха (Muller et al, 1986; Schmidt et al, 1989), 7% -лимфоцитами млекопитающих (Buttgereit et al, 1991).

1.1.1.2.4. Холостые циклы. Рабкин и Блюм (Rabkin and Blum, 1985) исследовали активность пяти субстратных циклов: глюкоза / глюкоза-6-фосфат, гликоген / глюкоза-6-фосфат, фруктоза-6-фосфат / фруктоза-1,6-дифосфат, фосфоенолпируват / пируват / оксалоацетат и ацетат / ацетилСоА в

изолированных гепатоцитах крысы и нашли, что активность исследованных циклов обеспечивается 26% кислорода, потребляемого гепатоцитами. В других органах активность холостых циклов может быть ниже (Rolfe and Brown, 1997).

1.1.1.2.5. Метаболизм нуклеиновых кислот. Вклад метаболизма нуклеиновых кислот в метаболизм покоя в различных типах клеток был оценен в нескольких работах с использованием ингибиторов синтеза ДНК и РНК актиномицина и а-аманитина. Было показано, что синтез нуклеиновых кислот обеспечивается 12% кислорода, потребляемого лимфоцитами (Buttgereit et al., 1991) и клетками карциномы Эрлиха (Schmidt et al., 1989), 15% - конкановалин А-стимулированными тимоцитами (Buttgereit and Brand, 1995), но несущественен в тимоцитах в состоянии покоя (Buttgereit et al., 1992).

1.1.1.2.6. Другие потребляющие АТФ процессы. Среди других потребителей АТФ можно назвать мышечное сокращение, глюконеогенез, который эффективен в печени (15-40% от потребления кислорода этим органом; Kusaka and Ui, 1977; Berry et al., 1991), утилизацию продуктов азотистого обмена, фосфорилирование белков и внутриклеточную сигнализацию, внутриклеточный транспорт, механическую работу элементов цитоскелета и пр. Основные обсуждавшиеся выше данные сведены в таблице 2. Таблица объединяет данные разных лабораторий, поэтому суммарное потребление кислорода некоторыми тканями может превышать 100%. Существенный вклад в потребление кислорода клетками вносят также немитохондриальное дыхание и утечка протонов.

1.1.2. Межвидовые различия в скоростях энергетического метаболизма в клетках позвоночных животных.

Интенсивность энергетического метаболизма в клетках различных видов позвоночных животных неодинакова и зависит от массы тела (клетки маленьких животных имеют более интенсивный метаболизм, чем клетки больших; Porter and Brand, 1995а; Porter and Brand, 1995b; Porter etal, 1996) и

Таблица 2. Вклад различных процессов, протекающих с использованием АТФ, в потребление кислорода различными тканями крысы (Rolfe and Brown, 1997).

Ткань Синтез бежа NaVÄTOcßa Са2+АТФаза Другие процессы

Печень 24 5-10 5 глюконеогенез (1540%), синтез мочевины (12%) холостые циклы (26%), синтез

ЖКТ 74 60 нуклеиновых кислот (5%)

Почка 6 40-70 глюконеогенез (5%)

Сердце 3 1-5 15-30 акгомиозиновая АТФаза

Мозг Скелетные 5 17 50-60 5-10 существенный 5 (40-50%)

мышцы

от филогенетического положения вида (клетки эктотермных позвоночных имеют менее интенсивный метаболизм, чем клетки эндотермных; Brand et al., 1991). В этом разделе мы кратко рассмотрим современное состояние вопроса о причинах подобных различий.

1.1.2.1 Интенсивность энергетического метаболизма и масса тела.

Связь метаболизма покоя с массой тела известна уже давно (Kleiber, 1932; Шмидт-Ниельсен, 1987). Показано, что для млекопитающих зависимость скорости базального метаболизма (измеренная по потреблению кислорода) от массы тела, может быть описана уравнением Vo2 = 14.6М0 75, где Vo2 - скорость потребления кислорода животным, л/сутки; М - масса тела, кг (Kleiber, 1932). Соответственно, скорость базального метаболизма мыши весом в 20 г примерно в 1000 раз ниже, чем у лошади, весом 250 кг. С другой стороны, удельная скорость метаболизма (скорость потребления кислорода, отнесенная к массе

тела животного) пропорциональна М"025. Таким образом, удельная скорость метаболизма мыши в 10 раз выше, чем у лошади.

Уравнения, сходные с приведенным для млекопитающих, были получены и для эктотермных позвоночных. Так, для рептилий зависимость скорости потребления кислорода от массы тела описывается уравнением Vo2 = 1.6М0 83 (Шмидт-Ниельсен, 1987). Уменьшение удельной скорости метаболизма с увеличением массы тела частично объясняется уменьшением удельного веса метаболически активных органов. Например, печень составляет 6% от массы тела мыши и только 1.8% от массы тела лошади (Blaxter, 1989; Porter and Brand, 1995b). Остальная разница объясняется различиями метаболической активности самих тканей.

Рассмотрим печень. Вклад этого органа в потребление кислорода организмом у млекопитающих составляет примерно 20% (Rolfe and Brown, 1997), при этом, скорость потребления кислорода срезами печени мыши примерно в 7.5 раз выше, чем у аналогичных препаратов печени лошади (Krebs, 1950; Couture and Hulbert, 1995). Подобные различия сохраняются и в удельной скорости дыхания изолированных гепатоцитов млекопитающих, которая пропорциональна массе тела животного с показателем степени -0.18 (Porter and Brand, 1995а) или -0.20 (Porter and Brand, 1995b). Таким образом, снижение удельной скорости метаболизма печени объясняется снижением метаболической активности составляющих ее клеток.

В исследованиях причин различия скорости метаболизма в тканях животных разной массы, проводившихся в 60х - 80х годах основные усилия были сосредоточены на обнаружение количественных различий в "энергетической машине" у маленьких и больших животных. Так, для млекопитающих было показано, что следующие параметры имеют зависимость от массы тела: удельное содержание митохондрий в печени пропорционально М"028 (Smith,1956; Шмидт-Ниельсен, 1987); общая площадь поверхности внутренней мембраны митохондрий на единицу массы тела в печени, сердце, мозге и скелетных мышцах пропорциональна М"024 (Else and Hulbert, 1985b); удельная активность цитохромоксидазы в печени и мышцах пропорциональна М"0 30 - М"0 25 (Kunkel, 1956; Jansky, 1961); удельное содержание цитохрома с в организме пропорционально

м-о.зо _ м-о.24 (Drabkin; 1950; Шмидт-Ниельсен,

1987). Таким образом, в этих работах предполагалось, что уменьшение удельной скорости метаболизма с увеличением массы тела связано с уменьшением удельного содержания митохондрий (Шмидт-Ниельсен, 1987) или площади поверхности внутренней мембраны митохондрий в клетке (Else and Hulbert, 1985а; Else and Hulbert, 1985b). Однако, цитированные работы обычно проводились на небольшом числе животных и поэтому не имеют достаточных оснований для распространения найденных в них закономерностей на весь животный мир. Существуют работы, показывающие, что общее содержание цитохромов и митохондрий в тканях многих экто- и эндотермных животных не зависит от массы тела (Савина, 1985; Савина 1992). Также достаточно убедительными кажутся результаты, полученные в группе М. Бранда (Brookes et al., 1998): площадь внутренней мембраны митохондрий не имеет выраженной зависимости от массы тела как у теплокровных, так и у холоднокровных животных.

По-видимому, различия в скорости метаболизма связаны все же не с количественными различиями в "энергетической машине", а с особенностями функционирования митохондрий in vivo в клетках животных различной массы. При этом, интересен факт, что скорость потребления кислорода митохондриями, изолированными из печени, не зависит от массы тела (Porter et al., 1996), тогда как изолированные гепатоциты такую зависимость проявляют (Porter and Brand, 1995а; Porter and Brand, 1995b).

Снижение скорости потребления кислорода клетками при увеличении массы тела животного связано с пропорциональным снижением активности всех клеточных функций (Rolfe and Brown, 1997). Показано, что удельная скорость метаболизма нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих пропорциональна M"026 (Schoch et al., 1991); удельная скорость метаболизма белков пропорциональна М"028 (Reeds and Harris, 1981); активность Na+/K+ATOa3bi на единицу массы в сердце, печени и почке млекопитающих пропорционально М'014 (Couture and Hulbert, 1995). Кроме того, было показано, что в клетках печени соотношение между митохондриальным и немитохондриальным дыханием, а также между потреблением кислорода в процессе окислительного фосфорилирования и при утечке протонов, не меняется с массой тела (Porter and Brand, 1995b). Обсуждение вопроса о

зависимости скорости метаболизма от массы тела мы продолжим в главе "Результаты и обсуждение".

1.1.2.2. Интенсивность энергетического метаболизма в клетках экто- и эндотермных позвоночных.

Скорость метаболизма покоя различается также у экто- и эндотермных позвоночных (Bennet, 1978). Приведенные выше уравнения для зависимости метаболической скорости от массы тела для млекопитающих (Vo2 = 14.6М075) и

о 83

рептилий (Vo2 = 1.6М ) показывают, что скорость метаболизма последних в 9 раз ниже, чем первых. Элс и Хьюлберт (Else and Hulbert, 1981; Hulbert and Else, 1981) а также Бранд и соавторы (Brand et al., 1991), показали, что примерно 5-кратная разница в скорости потребления кислорода между млекопитающими (крыса и мышь) и рептилиями (ящерицы Amphybolurus vitticeps и A. nuchalis) сохраняется и на тканевом и на клеточном уровне; в этих работах были учтены и масса и температура тела животных.

Как и в случае с различиями в скоростях метаболизма, связанными с массой тела, было показано, что основные пропорции клеточного (гепатоциты) метаболизма, а именно, соотношение между митохондриальным и немитохондриальным дыханием, между фосфорилирующим дыханием и потреблением кислорода в результате утечки протонов и вклад Иа+/К+АТФазы в скорость клеточного метаболизма, примерно одинаков у млекопитающих и рептилий (Else and Hulbert, 1987; Brand et al, 1991). В отношении Ыа+/К+АТФазы также было показано, что плотность распределения этого фермента в клетках низших позвоночных такая же, как и у млекопитающих, однако активность фермента в 5 раз ниже (Else et al, 1996).

Различия в метаболических скоростях между тепло- и холоднокровными животными также пытались объяснить разницей в общей площади внутримитохондриальной мембраны (Else and Hulbert, 1981; Else and Hulbert, 1985a; Else and Hulbert, 1985b). Однако и в этом случае есть убедительные контраргументы: клетки эктотермных позвоночных часто оснащены митохондриями даже лучше, чем клетки млекопитающих и птиц (Савина, 1985; Савина, 1992). Митохондрии печени рептилий, амфибий и рыб не имеют выраженных отличий по площади внутренней мембраны от митохондрий

млекопитающих (Brand et al, 1991; Brookes et al, 1998), при этом, изолированные митохондрии эктотермных позвоночных потребляют кислород с теми же скоростями, что и митохондрии млекопитающих (Cassuto, 1971; Smith, 1973; Hulbert and Else, 1989; Савина и соавт. 1989; Савина, 1985, Савина, 1992). Обсуждение этого вопроса также будет продолжено в экспериментальных главах.

1.2. РЕГУЛЯЦИЯ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА В КЛЕТКАХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ.

В этой части обзора литературы мы рассмотрим кратко современные взгляды на регуляцию энергетического метаболизма в клетках, уделив также внимание истории вопроса. Необходимость эта связана с тем, что при исследовании регуляции энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги мы пришли к ряду выводов, несоответствующих традиционным представлениям о ведущей роли системы синтеза и утилизации АТФ в регуляции скорости клеточного дыхания.

Контролируемое использование энергии для поддержания гомеостаза и выполнения работы является неотъемлемым свойством всех типов клеток. Основным цитоплазматическим интермедиатом энергетического метаболизма в клетке является АТФ (Boyer et al, 1977). Таким образом, скорость образования АТФ и скорость ее гидролиза должны быть сбалансированы. Это означает, что в клетках должны существовать четкие механизмы регуляции энергетического метаболизма, обеспечивающие поддержание устойчивого стационарного состояния заключающегося в балансе скоростей производства и потребления АТФ.

В течение последних 4-5 десятилетий взгляды на принципы регуляции митохондриального дыхания претерпели ряд существенных изменений. У истоков современных представлений стоят исследования Ларди и Вельмана (Lardy and Wellman, 1952), а также Чанса и Уильямса (Chance and Williams, 1956). В этих работах, выполненных на изолированных митохондриях, была впервые продемонстрирована роль внемитохондриальной концентрации АДФ в контроле митохондриального дыхания и, таким образом, сформулирована

концепция о регуляции скорости окислительного фосфорилирования потребностью клетки в АТФ. Механизм контроля предполагался простой -субстратное (АДФ в качестве субстрата) лимитирование. Окислительное фосфорилирование ограничивается [АДФ] и увеличение скорости гидролиза АТФ в клетке приводит к усилению дыхания. Следующая по времени была "равновесная" гипотеза, развитая в работах Клингенберга (Klingenberg, 1963) и группы Уильсона и Эрецинской (Wilson et al, 1973; Holian et al., 1977; Erecinska et al, 1978). Согласно этой концепции, все стадии окислительного фосфорилирования от НАД-Н до цитоплазматической АТФ находятся вблизи термодинамического равновесия. Единственное звено, удаленное от равновесия - цитохромоксидаза. Таким образом, окислительное фосфорилирование контролируется, с одной стороны, митохондриальным отношением НАД^/НАД-Н, с другой - фосфатным потенциалом цитоплазмы (ФП -[АТФ]/[АДФ][Фн]) или потенциалом фосфорилирования (AG<j, - логарифм ФП); кроме того, регуляторами митохондриального дыхания могут выступать любые эффекторы цитохромоксидазы, такие как Ог или pH.

Других взглядов придерживались в группах Дэвиса (Davis et al., 1974; Davis and Lumeng, 1975 Davis and Davis-Van Thienen, 1978) и Кунца (Küster et al, 1976; Kunz et al, 1981, Tager et al, 1983). В работах этих авторов было показано, что транслоказа адениновых нуклеотидов находится в условиях, далеких от равновесия и, таким образом именно она является скорость-лимитирующей ("транслоказная" теория). В этой связи, контроль окислительного фосфорилирования принадлежит отношению [АТФ]/[АДФ], а не ФП или AG,},.

Так или иначе, в работах того времени предполагалось, что контроль над окислительным фосфорилированием принадлежит какому-либо одному звену в системе окислительного фосфорилирования, находящемуся вне термодинамического равновесия. Кроме того, поскольку опыты на изолированных митохондриях проводились в условиях насыщающих концентраций субстратов цикла Кребса, то основное внимание уделялось контролю дыхания со стороны аденилатного статуса цитоплазмы. В этом смысле близки к уже описанным взгляды Аткинсона (Atkinson, 1977), который предположил (на основании исследований свойств изолированных ферментов),

что энергетический метаболизм находится под контролем так называемого аденилатного энергетического заряда или заряда Аткинсона {([АТФ]+0.5[АДФ])/([АТФ]+[АДФ]+[АМФ])}. АТФ, АДФ, и АМФ выступают как аллостерические эффекторы ферментов гликолиза, дегидрогеназ цикла Кребса и ферментов, потребляющих АТФ.

В начале 8 Ох годов представления о контроле окислительного фосфорилирования вновь начали меняться. Большим шагом вперед явилось применение теории метаболического контроля (Kacser and Burns, 1973; Heinrich and Rappoport, 1974; Heinrich et al, 1977; Холоденко, 1988) к энергетическому метаболизму (Duszynski et al, 1982; Tager et al, 1983; Groen, 1982; Brand et al, 1988; Brown et al, 1990a; Hafner et al, 1990; Brand, 1997). Эти теоретические и экспериментальные исследования показали, что, во-первых, окислительное фосфорилирование находится под контролем более чем одной реакции, и во-вторых, даже если какая-либо реакция находится вблизи термодинамического равновесия, она тем не менее может иметь определенный контроль над всей системой. Согласно теории метаболического контроля вклад фермента Ej в метаболический поток J можно оценить, сравнивая относительное изменение потока AJ/J с вызвавшим его изменением активности фермента АЕ;/Е; при неизменных активностях остальных ферментов. Количественно это соотношение выражается коэффициентом контроля фермента Е; над потоком J (CiJ):

С/ = lim (AJ/J)/( AEj/Ej)

ДЕ~~* 0

Сумма всех коэффициентов контроля над системой всегда равна 1.

Многочисленные измерения коэффициентов контроля тех или иных участков окислительного метаболизма над скоростью дыхания и окислительного фосфорилирования, выполненные в последние 15 лет, свидетельствуют о том, что в клетке контроль над окислительным фосфорилированием разделен между большим числом реакций, а не принадлежит какому-либо одному звену. Так было показано, что снабжение митохондрий НАД-Н имеет коэффициент контроля над скоростью потребления кислорода гепатоцитами крысы, равный 0.15 - 0.30 (Brown et al, 1990b; Harper and Brand, 1993). Коэффициенты контроля равные 0.15 для электрон-

транспортной цепи, 0.22 для утечки протонов и 0.49 для системы синтеза, транспорта и утилизации АТФ были определены в гепатоцитах Брауном и соавторами с помощью алгоритма "top-down" теории метаболического контроля (Brown et al, 1990а, 1990b). Также в гепатоцитах Душинский и соавторы определили, что транспорт адениновых нуклеотидов в митохондриях обладает коэффициентом контроля 0.3 над скоростью потребления кислорода клетками (Duszynski et al, 1982). Синтез и утилизация АТФ имеют коэффициент контроля над скоростью дыхания порядка 0.2 (Sobol, 1995). Ральфи и Браун обобщили имеющиеся в литературе данные и пришли к выводу, что в печени "система окисления субстратов" имеет 29-35% контроля над скоростью потребления кислорода клетками, утечка протонов - 22-25% и синтез и гидролиз АТФ - 41-49%. В мышцах те же процессы имеют 44 ± 28%, 38 ± 21% и 21 ± 9% контроля, соответственно (Rolfe and Brown, 1997).

Другим аргументом против "равновесной" теории регуляции энергетического метаболизма стали результаты скрупулезных кинетических исследований процессов синтеза и гидролиза АТФ в различных тканях. Так в работе Кингсли-Хайкмена и соавторов (Kingsly-Hickman et al, 1987), проведенных на сердце с помощью неинвазивного метода ядерно-магнитного резонанса, было продемонстрировано, что фундаментальная догма "равновесной" теории о том, что АТФ-синтетазный комплекс находится вблизи равновесия, неверна. Далее, в группе Ла Ной (La Noue et al, 1986) показали, что в изолированных митохондриях печени и сердца крыс окислительное фосфорилирование не находится в состоянии равновесия (за исключением состояния 4). Основываясь на приведенных фактах, Фром и соавторы (From et al, 1990) провели масштабные исследования контроля над энергетическим метаболизмом в изолированном, перфузированном сердце крысы. Благодаря продуманной постановке эксперимент позволял сочетать непрерывный мониторинг скорости потребления кислорода, концентраций адениновых нуклеотидов и Фн в работающем сердце с изменением механической нагрузки, а также манипулировать степенью доступности восстановительных эквивалентов для дыхательной цепи. Результатом исследования явилось заключение о том, что in vivo окислительное фосфорилирование не находится в состоянии равновесия и, таким образом, неверно считать, что скорость потребления

кислорода клетками находится под термодинамическим контролем редокс потенциала митохондрий и потенциала фосфорилирования цитоплазмы. Скорее имеет место кинетический контроль скорости дыхания (и окислительного фосфорилирования). Согласно этой концепции окислительное фосфорилирование находится под сочетанным контролем основных своих субстратов: НАД-Н, АДФ, Фн и О2, причем наибольшую роль в этом контроле будет иметь тот субстрат, снабжение которым в данный момент наиболее лимитировано. Данная концепция наиболее удачно вмещает все предыдущие данные, полученные на изолированных митохондриях и клетках, так как подразумевает возможность in vivo как прямых зависимостей скорости потребления кислорода от [АДФ], [Фн], [НАД-Н] или [О2] (при условии, что меняется только один параметр), так и отсутствие оных (если меняется более чем один параметр). Эта концепция примиряет также аргументы сторонников "равновесной" и "транслоказной" теорий в полемике друг с другом (а именно сложность зависимостей между скоростью потребления кислорода и [АТФ]/[АДФ], ФП или АОф - см. выше). Рассмотрим вкратце потенциальную роль вышеперечисленных субстратов окислительного фосфорилирования в контроле над последним.

Кислород. В настоящее время в литературе нет согласия по поводу того, имеет ли доступность кислорода, хотя бы частично, контроль над окислительным фосфорилированием in vivo в условиях нормоксии. Кажущаяся Km окислительного фосфорилирования для кислорода в изолированных митохондриях менее 1 мкМ (Balaban, 1990), поэтому концентрация последнего в клетке должна быть очень сильно уменьшена (по сравнению с уровнем в крови), для того чтобы оказать лимитирующее воздействие на окислительное фосфорилирование. Так было показано, что скорость потребления кислорода клетками не меняется вплоть до концентрации кислорода в среде 20 мкМ, при кажущейся Km митохондрий « 1 мкМ (Longmuir, 1957; Wilson et al., 1979). Однако некоторые исследователи считают, что сродство дыхательной цепи к кислороду in vivo может быть гораздо ниже, чем in vitro, (Rosenthal et al., 1976; Jobis et al., 1977; Gnaiger et al., 1995). Кроме того, в клетке существует градиент концентрации кислорода (от стенки капилляра до митохондрии) и реальная концентрация О2 вблизи митохондрий много меньше, чем в крови (Gnaiger et

al., 1995). Таким образом, даже при нормоксии кислород может играть какую-то роль в контроле окислительного фосфорилирования. При снижении напряжения кислорода в крови (гипоксия) контроль окислительного фосфорилирования со стороны доступности кислорода возрастает (Wilson and Erecinska, 1986).

АТФ, АДФ и Фн. По сравнению с кислородом контроль окислительного фосфорилирования со стороны аденилатного статуса клетки изучен хорошо, хотя и здесь, как мы уже говорили, нет единого мнения. Согласно теории кинетического контроля дыхания (From et al., 1990) скорость потребления кислорода будет зависеть от [АДФ] и/или [Фн] в условиях постоянного снабжения митохондрий НАД-Н, или, при условии, что [НАД-Н] значительно выше своей Km. Применимость таких показателей, как ФП, AG<j,, [АТФ]/[АДФ] или заряд Аткинсона не имеет, по-видимому, универсального значения (From et al., 1990; Kobayashi et al., 1990).

Снабжение восстановительными эквивалентами. Роль снабжения дыхательной цепи НАД-Н (и вообще снабжения субстратами окисления) в регуляции окислительного фосфорилирования традиционно недооценивалась, однако в последнее десятилетие появилось много работ, показывающих, что при определенных условиях этому звену может принадлежать существенная часть контроля над процессом (Koretsky and Balaban, 1987; Balaban and Mandel, 1988; Balaban, 1990; From et al., 1990; Boschmann et al., 1996). Согласно Фрому, скорость потребления кислорода будет линейно зависеть от снабжения дыхательной цепи НАД-Н в условиях, когда его концентрация близка к Km и при условии, что [АДФ], [Фн] и [СЬ] значительно выше своих Km.

Разумеется in vivo окислительное фосфорилирование находится под контролем не только своих субстратов, но и таких параметров как температура, pH (Brown, 1992), размер суммарного пула адениновых нуклеотидов в митохондриях (Asimakis and Aprille, 1980; Aprille, 1988; Савина, 1992), клеточного пула гуаниновых нуклеотидов, интермедиатов цикла Кребса, уровня клеточного карнитина, СоА и пр. (Brown, 1992).

Еще одним примером ограниченности традиционного представления о том, что скорость клеточного дыхания регулируется, главным образом, через систему оборота АТФ служат скелетные мышцы. Известно, что при

А

Потребность в энергии

Сигнал -к работе

Метаболиты (АДФ, Фн)

Снабжение энергией

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гампер, Никита Львович

5. ВЫВОДЫ

1. Структура энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги и лягушки близка к таковой гепатоцитов млекопитающих и рептилий : примерно 20% общей скорости потребления кислорода клетками составляет немитохондриальное дыхание (у лягушек 30%), 15-20% - потребление кислорода, сопряженное с утечкой протонов, 55-65% - потребление кислорода в процессе производства АТФ; примерно 10% потребляемого гепатоцитами кислорода расходуется в результате потребления АТФ Ма+/К+АТФазой.

2. Скорость потребления кислорода гепатоцитами эктотермных позвоночных

0 17 зависит от массы тела животного согласно уравнению Уо2 = 1.60М" Показатель степени (-0.17) в полученном уравнении близок к таковым в уравнениях, полученных для млекопитающих (-0.18 - -0.20). Таким образом, как и для млекопитающих, для эктотермных позвоночных зависимость скорости метаболизма от массы тела справедлива и на клеточном уровне. Гепатоциты миног и лягушек потребляют кислород в 3 - 5 раз медленнее чем гепатоциты млекопитающих соответствующей массы.

3. В гепатоцитах миног в зимние месяцы преднерестовой миграции наблюдается обратимая депрессия энергетического метаболизма. Она выражается в 2-3 кратном снижении скорости потребления кислорода клетками, уменьшении интенсивности окислительного фосфорилирования, снижении клеточного содержания АТФ. Регуляция скорости энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги в этот период осуществляется, главным образом, через доступность для окисления жирных кислот - основного окисляемого субстрата в этих клетках.

4. Снижение интенсивности энергетического метаболизма в гепатоцитах сопровождается падением жизнеспособности изолированных клеток. Закисление сред выделения и инкубации до рН 6.6 способно полностью предотвратить гибель клеток.

5. Баланс скоростей активного входа и пассивного выхода калия в гепатоцитах миноги поддерживается в широком физиологическом диапазоне внутриклеточного содержания АТФ. Сильное снижение скорости активного транспорта этого иона наблюдается лишь при падении содержания АТФ в клетке ниже 0.5 нмоль/106 клеток. При метаболической депрессии поддержание внутриклеточного гомеостаза концентраций Ыа+ и К+ требует большей доли производимой клеткой АТФ, чем в активном состоянии.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Особенности энергетического метаболизма гепатоцитов круглоротых и амфибий в активные периоды жизненных циклов. Исследования энергетического метаболизма гепатоцитов круглоротых и амфибий в периоды активного метаболизма позволяют сделать вывод о том, что скорость потребления кислорода гепатоцитами миног и лягушек в 2.5 - 4 раза меньше, чем гепатоцитами крыс. В расчете на мг сухого веса клеток, гепатоциты миноги потребляют кислород в 1.8 - 3.3, а гепатоциты лягушки - в 3.9 раза медленнее, чем гепатоциты крысы, причем эта разница многократно возрастает, если скорость дыхания рассчитывать на клетку, поскольку гепатоциты млекопитающих имеют в несколько раз большую массу, чем гепатоциты холоднокровных позвоночных (табл. 6). Однако, несмотря на столь сильные различия в скоростях эндогенного дыхания гепатоцитов, соотношения между основными процессами, сопряженными с потреблением кислорода, производством и потреблением АТФ в этих клетках примерно одинаковы. Так, в клетках крысы (Rattus norvegicus), лягушки (Rana Temporaria) и миноги (Lampetra fluviatilis) потребление кислорода за счет немитохондриальных процессов составляет примерно 15-20% от скорости эндогенного дыхания (у лягушки несколько выше), остальные 80-85% составляет потребление кислорода митохондриями (табл. 8, Brand et al., 1991); потребление кислорода в процессе окислительного фосфорилирования составляет 50-60% от эндогенного дыхания и 70-80% от митохондриального потребления кислорода, соответственно дыхание, сопряженное с утечкой протонов через внутреннюю мембрану митохондрий составляет примерно 15-20% от эндогенного дыхания и 25-30% от митохондриального. Поддержание гомеостаза внутриклеточных концентраций Na+ и К+ требует гидролиза АТФ. Для обеспечения этого процесса тратится примерно 10% эндогенного дыхания или 15-20% от производимой клеткой АТФ (табл. 8, Brand et al., 1991). Подобные соотношения найдены также в гепатоцитах ящерицы Amphybolurus vitticeps (Brand et al., 1991). Приведенные результаты позволяют предположить, что структура энергетического метаболизма в гепатоцитах позвоночных животных достаточно консервативна и не зависит от филогенетического положения вида.

Взаимосвязь скорости потребления кислорода гепатоцитами и массы тела у экто- и эндотермных позвоночных. Другой общей для экто- и эндотермных позвоночных закономерностью оказалась взаимосвязь скорости потребления кислорода гепатоцитами и массы тела животного (Рис. 6). Корреляция между метаболизмом покоя и массой тела известна давно, более того, для млекопитающих показано, что эта взаимосвязь сохраняется и на уровне отдельных органов, тканевых срезов и клеток (Else and Hulbert, 1985; Шмидт-Нилльсен, 1987; Couture and Hulbert, 1995; Porter and Brand, 1995). Так, Портер и Бранд (Porter and Brand, 1995a; Porter and Brand, 1995b) показали, что зависимость удельной скорости потребления кислорода гепатоцитами от массы тела млекопитающего может быть описана уравнениями Vo2 = 7.09М"0'20 или V02 = 6.83М"018. В настоящей работе показано, что скорость потребления кислорода гепатоцитами эктотермных позвоночных зависит от массы тела согласно уравнению Vo2 = 1.60М"017. Сравнение приведенных выше уравнений для гепатоцитов млекопитающих с полученным нами уравнением для эктотермных позвоночных позволяет заключить, что показатели степени во всех трех уравнениях примерно равны и приближаются к показателю степени в уравнении для зависимости удельной скорости потребления кислорода животным от массы тела для млекопитающих: VO2 ~ М" (Kleiber, 1932) и рептилий VO2 ~ М"017 (Шмидт-Ниельсен, 1987).

Данные, полученные в группе Бранда и Портера (Porter and Brand, 1993; Porter and Brand, 1995; Porter et al, 1996), свидетельствуют о том, что в гепатоцитах млекопитающих различной массы структура энергетического метаболизма сохраняется неизменной, т.е. скорости митохондриального и немитохондриального дыхания, скорости потребления кислорода при окислительном фосфорилировании и в результате утечки протонов имеют зависимости от массы тела животного, сходные с таковой для общей скорости эндогенного дыхания (Porter and Brand, 1995). То же можно сказать и об активности

Na /К АТФазы (Couture and Hulbert, 1995). Это значит, что при многократных различиях в скорости энергетического метаболизма, связанных с массой тела (гепатоциты мелких животных имеют в несколько раз большую скорость потребления кислорода, чем гепатоциты крупных) или филогенетическим положением вида (гепатоциты эктотермных позвоночных имеют примерно в 5 раз меньшую скорость потребления кислорода, чем гепатоциты млекопитающих той же массы и температуры тела) структура энергетического метаболизма в гепатоцитах не меняется. Следовательно, можно предположить, что межвидовые различия в скорости энергетического метаболизма в гепатоцитах связаны с пропорциональными изменениями всех перечисленных параметров.

Энергетический метаболизм в гепатоцитах миноги в период преднерестовой миграции. Рассмотренные выше параметры энергетического метаболизма круглоротых и амфибий относятся к периодам активного метаболизма животных. Между тем, одной из существенных особенностей большинства холоднокровных позвоночных является способность к обратимой метаболической депрессии. Поэтому, существенная часть работы была посвящена исследованию особенностей энергетического метаболизма гепатоцитов миноги в период преднерестовой миграции, когда в этих клетках наблюдается снижение интенсивности обменных процессов. В это время животные полностью перестают питаться. Жизненная активность в течении 8 месяцев миграции, развитие гонад, а также весенняя поведенческая активация, связанная с нерестом, обеспечиваются энергией исключительно за счет утилизации липидов и белков (главным образом, мышечной ткани), накопленных в период активного метаболизма. Будучи моноцикличными, миноги погибают после нереста (в мае). Важно отметить, что прекращение питания в данном случае не является следствием недоступности пищи, "голодание" (синхония) миноги является генетически "запрограммированным" и регулируемым поведенческим феноменом.

Явление обратимой супрессии энергетического метаболизма в печени миноги в зимние месяцы анадромной миграции впервые было описано Савиной на изолированных митохондриях и препаратах ткани печени (Савина, 1985; Савина, 1992). Однако опыты с изолированными митохондриями или замороженной в жидком азоте тканью печени не позволяют исследовать энергетический метаболизм как субъект внутриклеточной регуляции. Поэтому для более глубокого изучения феномена нами был проведен ряд исследований на изолированных гепатоцитах.

Мониторинг скорости эндогенного дыхания гепатоцитов, проведенный нами в течение двух сезонов преднерестовой миграции миног, показал, что в зимние месяцы миграции наблюдается существенное (в 2-3 раза) замедление скорости эндогенного дыхания этих клеток (рис. 8). Скорость потребления кислорода гепатоцитами достоверно (р < 0.05) снижалось от осени к зиме, достигая минимума в феврале, однако весной, с приближением нереста, дыхание клеток вновь возрастало, приближаясь к уровню осенних значений. Так, в сезон миграции 1996-1997 гг., скорость потребления кислорода гепатоцитами (в нмоль Ог/мин/мг влажной массы клеток) составляла: 1.19 ± 0.08 в ноябре, 0.53 ± 0.06 в феврале и 0.88 ± 0.03 - в апреле. Подобные изменения наблюдались также и в сезон 1997-1998 гг.

Падение скорости эндогенного потребления кислорода гепатоцитами сопровождались аналогичными изменениями скорости фосфорилирующего дыхания (окислительного фосфорилирования; рис. 9,10). Скорости потребления кислорода в результате немитохондриального окисления и утечки протонов менялись в значительно меньшей степени, поэтому вклад утечки протонов в потребление кислорода митохондриями гепатоцитов увеличивался с 25% в ноябре до 47% в феврале, а вклад окислительного фосфорилирования в этот период падал с 75% до 53% (рис. 10). Весной status quo восстанавливался. Таким образом, в гепатоцитах миноги в исследуемый период наиболее подвержена супрессии именно система окислительного фосфорилирования. Снижение скорости производства АТФ в гепатоцитах сопровождалось также значительным снижением содержания АТФ в клетках.

Регуляция окислительного метаболизма в гепатоцитах миноги.

Исследуемый нами феномен обратимой супрессии энергетического метаболизма в гепатоцитах мигрирующих миног интересен еще тем, что изменения метаболической скорости в клетках печени в этом случае, по-видимому, не связаны напрямую с изменениями условий окружающей среды: животные в период миграции не испытывают ни недостатка кислорода, ни сильного переохлаждения, они перестают питаться, но это, как мы уже отмечали выше, не связано с недостатком пищи в окружающей среде. Более того, метаболическая депрессия, по-видимому, не затрагивает в равной мере все ткани организма миноги. По крайней мере в мышцах миног в зимние месяцы преднерестовой миграции не наблюдается снижения содержания АТФ (Савина, 1985; Савина, 1992). Таким образом, должны существовать соответствующие внутренние, тканеспецифические механизмы контролируемого снижения метаболической скорости, позволяющие животному экономить энергию для нереста в условиях длительного отсутствия экзогенных источников пищи.

Впервые на мысль о том, что скорость энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги регулируется через доступность субстратов для окисления нас натолкнул ряд косвенных данных, полученных в сезон миграции 19961997гг. Было показано, что скорость дыхания гепатоцитов в присутствии разобщителя (БССР) подвержена сезонным изменениям, очень близким к обнаруженным для эндогенного дыхания (см рис.8 и 15; г = 0.69, р < 0.01). Вещества, подобные БССР увеличивают проницаемость митохондриальной мембраны для протонов. В этой ситуации расход ДрН увеличивается и скорость потребления кислорода, соответственно, возрастает, вплоть до тех пор, когда ее уже начинает лимитировать скорость окисления дыхательных субстратов, всякая регуляция скорости потребления кислорода клетками со стороны системы синтеза и гидролиза АТФ при этом отсутствует. Таким образом, снижение разобщенного дыхания в зимние месяцы миграции указывало на снижение скорости окисления субстратов в этот период. Было сделано предположение, что снижение скорости окисления субстратов, или снижение доступности субстратов для окисления регулирует скорость окислительного фосфорилирования в гепатоцитах миноги.

К аналогичному выводу приводили данные об изменении содержания адениновых нуклеотидов в клетках (рис. 11, табл.12). Оказалось, что снижение скорости потребления кислорода в гепатоцитах миноги не связано с падением содержания АДФ в клетке, увеличением АТФ/АДФ или увеличением энергетического заряда Аткинсона, более того, два последних показателя наоборот уменьшались зимой. Следовательно, классические представления о ведущей роли АТФ-потребляющих процессов в регуляции клеточного дыхания неприменимы в данном случае. Считая, что доступность кислорода в этой системе не лимитирована, можно было предположить, что основная регуляция скорости дыхания осуществляется через доступность субстратов для окисления.

Для проверки этого предположения мы провели ряд исследований окисления субстратов в гепатоцитах миноги в период анадромной миграции, в результате которых было выяснено, что ни гликолиз, ни окисление аминокислот не играют существенной роли в энергетическом метаболизме гепатоцитов миноги в исследуемый период, основным дыхательным субстратом в этих клетках являются жирные кислоты.

Опыты по инкубации гепатоцитов в средах, содержащих в качестве субстрата лауриновую кислоту (2 мМ) подтвердили предположение о том, что именно доступность субстратов для окисления лимитирует скорость эндогенного дыхания и окислительного фосфорилирования в гепатоцитах миноги в исследуемый период (рис. 14). Добавление лауриновой кислоты в среду инкубации гепатоцитов вызывало увеличение скорости потребления кислорода клетками, причем эффект добавления жирной кислоты по усилению клеточного дыхания оказался идентичным добавлению в среду инкубации пирувата вместе с манатом. В отличие от эндогенного дыхания, дыхание гепатоцитов в присутствии субстрата не подвержено выраженным сезонным изменениям, таким образом, именно доступность жирных кислот для окисления является основным фактором регуляции окислительного фосфорилирования в гепатоцитах миноги в период преднерестовой миграции. Снабжение жирными кислотами, по-видимому, находится здесь под жестким, генетически запрограммированным, гормональным контролем и ограничивается зимой в целях экономии ресурсов для обеспечения нереста. Интересно отметить, в частности, что сезонная динамика скорости эндогенного дыхания гепатоцитов, обнаруженная в данной работе, оказалась очень близка к опубликованной ранее динамике содержания инсулина в плазме крови мигрирующих на нерест миног: было показано, что концентрация этого гормона уменьшается от осени к зиме (минимум в феврале) и вновь увеличивается весной, с приближением нереста (Plisetskaya, 1985). Возможно, транспорт жирных кислот в гепатоциты находится под контролем инсулина, как это было показано для аминокислот (Graf and Haussinger, 1996).

Некоторые метаболические последствия снижения скорости окислительного фосфорилирования и содержания АТФ в гепатоцитах миноги. Замедление энергетического метаболизма в гепатоцитах миноги в зимние месяцы миграции отрицательно влияет на жизнеспособность изолированных гепатоцитов. При выделении и инкубации клеток, находящихся в гипометаболическом состоянии, в средах с обычным для данной процедуры рН - 7.4 - 7.6, наблюдалось снижение выхода клеток при выделении, снижение дыхательных контролей; при дальнейшей инкубации таких гепатоцитов наблюдалось образование пузырьков на поверхности цитоплазматической мембраны (blebbing), слипание клеток, и, в итоге, их гибель. Закисление сред выделения и инкубации гепатоцитов восстанавливает их жизнеспособность.

Полученные нами и литературные данные о влиянии закисления на выживание клеток с блокированным энергетическим метаболизмом (Harrison et al. 1991; Nazaki et al. 1989; Gores etal. 1988; Bonventre and Cheung, 1985; Sakaida et al. 1992; Neiminen et al. 1990) позволяют сделать вывод, что понижение рН является универсальным стабилизирующим механизмом при метаболической депрессии. Причем этот механизм реализуется не только при гипоксии (накопление лактата), но и при других видах замедления метаболизма, за счет изменения Рсо2 в тканях, изменения буферной емкости физиологических жидкостей (Donnohoe et al. 1998) и пр. Одно из возможных объяснений положительного влияния закисления на жизнеспособность клеток стабилизация мембран за счет подавления мембранных фосфолипаз (в частности, фосфолипазы Аг, рН оптимум которой находиться в щелочной области (Chang et al. 1987; Sakaida et al. 1992; Harrison et al. 1991; Nieminen et al. 1994).

В работе также было проведено исследование влияния снижения метаболической скорости и содержания АТФ в гепатоцитах миноги на поддержание ионного гомеостаза в этих клетках. Поддержание высокой внутриклеточной концентрации калия и низкой - натрия за счет "работы" Ма+/К+АТФазы критически важно для жизнедеятельности клетки. Кроме того, этот процесс является одним из самых крупных потребителей АТФ в клетке. Как уже обсуждалось в главе "Обзор литературы", вклад Na+/K+ATOa3bi в оборот АТФ в клетках при метаболической депрессии, связанной с гипоксией, существенно возрастает (НосИасЫса et а1, 1996; НосИасЬка et а!., 1997), поэтому, в контексте настоящей работы, представлялось целесообразным изучить влияние другого вида метаболической депрессии на активность этого фермента.

Вклад № /К АТФазы в использование произведенной в клетке АТФ можно оценить по отношению уабаин-чувствительного дыхания к фосфорилирующему. Было показано, что скорость уабаин-чувствительного дыхания гепатоцитов миноги оставалась относительно постоянной в течение всего обследованного периода и составляла величину порядка 0.15 нмоль Ог/мин/Ю6 клеток, тогда как его доля в олигомицин-чувствительном дыхании значительно увеличивалась в зимние месяцы. Так, в ноябре скорость уабаин-чувствительного дыхания составляла 16.3% от скорости олигомицин-чувствительного дыхания, в феврале - 54.2% (р < 0.05), а в апреле - 28.3% (табл. 16). Таким образом, в зимние месяцы более 50% от всей производимой клеткой АТФ идет на поддержание ионного гомеостаза. При этом, не наблюдалось явления "блокады каналов" - уменьшения пассивной проницаемости цитоплазматической мембраны для ионов, описанного в гепатоцитах черепахи при гипоксии (НойгасИка et а\„ 1996; НосИасЬка et а!., 1997). Опыты по определению однонаправленных потоков К+ в гепатоцитах миноги показали, что скорость пассивного выхода этого иона из клеток не зависит от содержания АТФ в клетке (рис. 17). Скорость активного транспорта в гепатоцитах также мало зависит от клеточного содержания АТФ пока оно находится выше определенного "критического" значения (около 0.5 нмоль АТФ/106 клеток). Анализируя данные по сезонной динамике уабаин-чувствительного дыхания (табл. 16) и данные о зависимости потоков К+ от содержания АТФ в гепатоцитах (рис. 17), можно сделать вывод, что активность Ыа+/К+АТФазы в гепатоцитах, находящихся в гипометаболическом состоянии сохраняется на прежнем уровне, что позволяет избежать снижения пассивной ионной проницаемости цитоплазматической мембраны, и, таким образом, снижения ее восприимчивости к внешним сигналам, которое происходит во многих тканях при метаболической депрессии, вызванной гипоксией (СЫс1г а1, 1989; ЫИэзоп а1, 1993; ЬШ:г апё МЬвоп, 1997). С другой стороны, увеличение вклада №+/К+АТФазы в оборот АТФ в клетке должно сопровождаться снижением интенсивности прочих АТФ-потребляющих процессов. Это предположение хорошо сочетается с ранее полученными данными о том, что скорость глюконеогенеза в печени миноги в зимние месяцы миграции снижается более чем в 10 раз (Савина 1985; Савина, 1992).

В заключение изложения и обсуждения результатов исследования следует подчеркнуть, что настоящая работа посвящена изучению структуры и регуляции клеточного энергетического метаболизма эктотермных позвоночных. Полученные результаты углубляют представления об эволюции энергетического метаболизма позвоночных животных, в частности, сравнение структурных соотношений процессов производства и потребления АТФ в гепатоцитах млекопитающих, рептилий, амфибий и круглоротых позволяют выдвинуть принцип эволюционной консервативности структуры энергетического метаболизма в этих клетках. Изучение феномена обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах миног позволило выявить механизм регуляции окислительного метаболизма через доступность субстратов окисления, а также ряд защитных механизмов, позволяющих клеткам в течение длительного времени существовать в гипометаболическом состоянии. Эти данные позволяют глубже понять принципы адаптации организма к неблагоприятным условиям окружающей среды. Завершить работу хочется словами известного физиолога Кнута Шмидт-Нильсена: "By comparing different animals and examining how each has solved its problem of living within the constraints of the available environment, we gain insight into general principles that otherwise might remain obscure." (Schmidt-Nielsen, 1997).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гампер, Никита Львович, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ленинджер А. Биохимия. - М.: Мир, 1974.- 957 с.

2. Савина. М.В. Особенности структуры и функции тканевых энергетических систем круглоротых (LAMPETRA FLUVIATILIS L.). Дисс. д. б. н., Л., 1985.

3. Савина М.В. Механизмы адаптации тканевого дыхания в эволюции позвоночных. СПб.: Наука, 1992. - 200 с.

4. Савина М.В., Скульский И.А., Глазунов В.В., Иванова Т.И., Коротков С.М. Особенности функционирования митохондрий печени миноги LAMPETRA FLUVIATILIS // Ж. эвол. биохим. физиол. 1989. Т XXV. С.710-717.

5. Скулачев В.П. Нефосфорилирующее дыхание как механизм, предотвращающий образование активных форм кислорода // Мол. биол. 1995. Т. 29. С. 1199-1209.

6. Холоденко Б.Н. Управление молекулярными превращениями в полиферментных системах: количественная теория регуляции метаболизма // Мол. биол. 1988. Т. 22, С. 1238-1256

7. Шмидт-Нильсен К. Размеры животных: почему они так важны? М.: Мир, 1987.-259 с.

8. Энгельгардт В.А. Анаэробный распад и аэробный ресинтез пирофосфата в красных кровяных клетках птиц // Казан, мед. журн. 1931. Т. 27. С. 496-504.

9. Alston Т.A. Suicide substrates for mitochondrial enzymes // Pharm. Ther. 1981. Vol. 12. P. 1-41.

10.Anundi I. and de Groot H. Hypoxia liver cell death: critical PO2 and dependence of viability from glycolysis // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 257. P. G58-G64.

11.Anundi I., King J., Owen D.A., Schneider H. and Lemasters J.J. Fructose prevents cell death in liver // Am. J. Physiol. 1987. Vol. 253. P. G390-G397.

12.Aprille J. R. Regulation of the adenine nucleotide pool size in liver: mechanism and metabolic role // FASEB J. 1988. Vol. 2. P. 2547-2556.

13.Asimakis G.K. and Aprille J.R. In vitro alterations of the size of the liver mitochondria adenine nucleotide pool: correlation with respiratory functions // Arch. Biochem. Biophys. 1980. Vol. 203. P.307-316.

14.Astrup J., Sorensen P.M. and Sorensen M.P. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain // Stroke. 1981. Vol. 12. P. 726-730.

15.Atkinson D.E. Cellular energy metabolism and its regulation. New York etc.: Academic Press. 1977,-293p.

16.Aurochordogny T.J., Hofmann G.E. and Hand S.C. Extension of enzyme half-life during quiescence in Artemia embryos // Am. J. Physiol. 1993. vol. 256. R85-R-89.

17.Autori P. and Bertolini B. A study of some acid hydrolases in the liver of larval and adult lamprey // Z. Zellforsch. Microsk. Anat. 1965. Vol. 68. P.818-829.

18.Aw, T.W. and Jones D.P. Cyanide toxicity in hepatocytes under aerobic and anaerobic conditions // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 257. P. C435-C441.

19.Balaban R.S. Regulation of oxidative phosphorylation in the mammalian cell // Am. J. Physiol. Vol. 1990. 258. P. C373-C389.

20.Balaban R.S. and Mandel L.J. Metabolic substrate utilization by rabbit proximal tubule. An NADH fluorescent study // Am. J. Physiol. 1988. Vol. 254. P. F407-F416.

21.Barnhart M.C. and McMahon B.R. Discontinuous CO2 release and metabolic depression in dormant land snails // J. Exp. Biol. 1987. Vol. 128. P. 123-138.

22.Barnhart M.C. and McMahon B.R. Depression of aerobic metabolism and intracellular pH by hypercapnia in land snails, Otala lactea II J. Exp. Biol. 1988. Vol. 138. P. 289-299.

23.Beamish F.W.H. Migration and spawning energetics of the anadromous sea lamprey Petromyzon marinus II Environ. Biol. Fish. 1979. Vol. 4. P. 3-7.

24.Bennett A.F. Activity metabolism of lower vertebrates 11 Ann. Rev. Physiol. 1978. Vol.40. P.447-469.

25.Berry M.N., Edwards A.M. and Barritt G.J. Isolated hepatocytes: preparation, properties and applications. Amsterdam.: Elsevier, 1991. P. 121-178.

26.Bienengraber M. Echtay K.S. and Klingenberg M. ^-transport by uncoupling protein (UCP-1) is dependent on a histidine pair absent in UCP-2 and UCP-3 // Biochemistry. 1998. Vol. 37. P. 3-8.

27.Blaxter K. Energy metabolism in animals and man. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1989.-258 p.

28.Bodola F. and Benedict C.R. Measurement of the release of adenine nucleotides during platelet aggregation by small-bore isocratic high-performance liquid chromatography//J. Chrom. 1988. Vol. 459. P. 281-289.

29.Boguchka K. Wronisszewska A. Bednarek M. Duszynsky J. and Woitczak L. Energetics of Ehrlich ascites mitochondria: membrane potential of isolated mitochondria and mitochondria within digitonine permeabilized cells // Biochim. Biophys Acta. 1990. Vol. 1015. P. 503-509.

30.Bonventre J.V. and Cheung J.Y. Effects of metabolic acidosis on viability of cells exposed to anoxia // Am. J. Physiol. 1985. Vol. 249. P. C149-C159.

31.Boschmann M., Halangk W. and Bohnensack R. Interrelation between mitochondrial respiration, substrate supply and redox ratio in perifused permeabilized rat hepatocytes // Biochim Biophys Acta. 1996. Vol. 1273. P. 223230.

32.Boutilier R.G., Donohoe P.H., Tattersall G.J. and West, T.G. Hypometabolic homeostasis in overwintering aquatic amphibians // J. Exp. Biol. 1997. Vol. 200. P. 387-400.

33.Boutilier R.G., Ferguson R.A., Henry R.P. and Tufts B.L. Exhaustive exercise in the sea lamprey (Petromyzon marinus): relationship between anaerobic metabolism and acid-base balance // J. Exp. Biol. 1993. Vol. 178. P. 71-88.

34.Boyer P.D., Chance B., Ernster L., Mitchell P., Racker E. and Slater E.C. Oxidative phosphorylation and photophosphorylation // Annu. Rev. Biochem. 1977. Vol. 46. P. 955-1026.

35.Brand M.D. The contribution of the leak of protons across the mitochondrial inner membrane to standard metabolic rate // J. Theor. Biol. 1990a. Vol. 145. P. 267-286.

36.Brand M.D. The proton leak across the mitochondrial inner membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1990b. Vol. 1018. P. 128-133.

37.Brand M.D. Regulation analysis of energy metabolism // J. Exp. Biol. 1997. Vol. P. 193-202.

38.Brand M.D., Chien L.-F., Ainscow E.K., Rolfe D.F.S and Porter R.K. The causes and function of mitochondrial proton leak // Biochim. Biophys. Acta. 1994a. Vol. 1187. P. 132-139.

39.Brand M.D., Chien L.-F. and Diolez P. Experimental discrimination between proton leak and redox slip during mitochondrial electron transport // Biochem. J. 1994b. Vol. 297. P. 27-29.

40.Brand M.D. Chien L.-F. and Rolfe D.F.S. Control of oxidative phosphorylation in liver mitochondria and hepatocytes // Biochem. Soc. Trans. 1993. Vol. 21 P. 757762.

41.Brand M.D., Couture P., Else P.L., Whiters K.W. and Hulbert A.J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in reptile // Biochem. J. 1991. Vol. 275. P. 81-86.

42.Brand M.D., Hafner R.P. and Brown G.C. Control of respiration in non-phosphorylating mitochondria is shared between the proton leak and the respiratory chain // Biochem. J. 1988. Vol. 255. P. 535-539.

43 .Brand M.D. and Murphy M.P. Control of electron fluxes through the respiratory chain in mitochondria and cells // Biol. Rev. 1987. Vol. 62. P. 141-193.

44.Brookes P.S., Buckingham J.A., Tenreiro A.M. Hulbert A.J. and Brand M.D. The proton permeability of inner membrane of liver mitochondria from ectothermic and endothermic vertebrates and from obese rats: correlations with standard metabolic rate and phospholipid fatty acid composition // Comp. Biochem. Physiol. 1998. Vol. 119B. P. 325-334.

45.Brooks S.P.J, and Story K.B. Influence of hormones, second messengers and pH on expression of metabolic responses to anoxia in a marine whelk // J. Exp. Biol. 1989. Vol. 145. P. 31-43.

46.Brown G.C. The relative proton stoichiometrics of the mitochondrial proton pumps are independent of the mitochondrial proton-motive force // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 64. P. 14704-14709.

47.Brown G.C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells // Biochem. J. 1992. Vol. 284. P. 1-13.

48.Brown G.C. and Brand M.D. Changes in permeability to protons and other cations at high proton motive force in rat liver mitochondria // Biochem J. 1986. Vol. 234. P. 75-81.

49.Brown G.C. and Brand M.D. On the nature of mitochondrial proton leak // Biochim. Biophys. Acta. 1991. Vol. 1059. P. 55-62.

50.Brown G.C., Hafner R.P. and Brand M.D. A "top-down" approach to the determination of control coefficients in metabolic control theory // Eur. J. Biochem. 1990a. Vol. 188. P. 321-325.

51.Brown G.C., Lakin-Tomas P.L. and Brand M.D. Control of mitochondrial respiration and ATP synthesis in isolated rat liver cell // Eur. J. Biochem. 1990b. Vol. 192. P. 355-362.

52.Buck L.T. and Hochachka P.W. Anoxic suppression of Na+K+ ATPase and constant membrane potential in hepatocytes: support for channel arrest // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. P. R1020-R1025.

53.Buck L.T., Land, S.C. and Hochachka P.W. Anoxia-tolerant hepatocytes: model system for study of reversible metabolic suppression // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. P. R49-R56.

54.Buono RJ. and Sheffield J.B. Changes in distribution of mitochondria in developing chick retina// Exp. Eye Res. 1991. Vol. 53. P. 178-198.

55.Busa W.B. and Nuccitelli R. Metabolic regulation via intracellular pH // Am. J. Physiol. 1984. Vol. 246. P. R409-R438.

56.Buttgereit F. and Brand M.D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells // Biochem. J. 1995. Vol.312. P.163-167.

57.Buttgereit F., Brand M.D. and Muller M. ConA-induced changes in energy metabolism of rat thymocytes // Biosci. Rep. 1992. Vol. 12. P. 381-386.

58.Buttgereit F., Muller M. and Rapoport S.M. Quantification of ATP-producing and consuming processes in quiescent pig spleen lymphocytes // Biochem. Int. 1991. Vol. 24. P. 59-67.

59.Cassuto Y. Oxidative activities of liver mitochondria from mammals, birds, reptiles and amphybia as function of temperature // Comp. Biochem. Physiol. 1971. Vol. 39B. P. 919-923.

60.Castellini M.A., Kooyman G.L. and Ponganis P.J. Metabolic rates of freely diving Weddel seals: correlations with oxygen stores, swim velocity and diving duration // J. Exp. Biol. 1992. Vol. 165. P. 181-194.

61.Chance B. and Williams G.R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation //Adv. Enzymol. 1956. Vol.17. P. 65-134.

62.Chang J., Musser J.H. and McGregor H. Phospholipase A2: function and pharmacological regulation // Biochem. Pharm. 1987. Vol. 36. P. 2422-2436.

63.Chih C.P., Feng Z.C., Rosenthal M., Lutz P.L. and Sick T.J. Energy metabolism, ion homeostasis and evoked potentials in anoxic turtle brain // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 257. P. R854-R860.

64.Clausen T.C., van Hardeveld C. and Everets M.E. Significance of cation transport in control of energy metabolism and thermogenesis // Physiol Rev. 1991. Vol. 71. P. 733-774.

65.Clegg J.S. Metabolic consequences of the extent and disposition of the aqueous intracellular environment // J. Exp. Zool. 1981. Vol. 215. P. 303-313.

66.Clegg J.S. Respiration of Artemia franciscana embryos after continuos anoxia over 1-year period//J. Comp. Physiol. 1993. Vol. 163B. P. 48-51.

67.Connet R.J., Gayeski T.E.J, and Honig C.R. Energy sources in fully aerobic rest-work transitions: a new role for glycolysis // Am. J. Physiol. 1985. Vol. 248. P. H922-H929.

68.Couture P. and Hulbert A.J. On the relationship between body mass, tissue metabolic rate and sodium pump activity in mammalian liver and kidney cortex // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 268. P. R641-R650.

69.Czyzyk-Krzeska M.F. Molecular aspects of oxygen sensing in physiological adaptation to hypoxia // Respir. Physiol. 1997. Vol. 110. P. 99-111.

70.Davis J.E. and Davis-Van Thienen W.A. Control of mitochondrial metabolism by the ATP/ADP ratio // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. Vol. 83. P. 12601266.

71.Davis J.E. and Lumeng L. Relationships between the phosphorylation potentials generated by liver mitochondria and respiratory state under conditions of adenosine diphosphate control // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P.2275-2282.

72.Davis J.E., Lumeng L. and Bottoms D. On the relationship between the stoichiometry of oxidative phosphorylation potential of the rat liver mitochondria as function of respiratory state // FEBS Lett. 1974. Vol. 39. P. 9-12.

73.Dobson G.P. and Hochachka P.W. Role of glycolysis in adenylate depletion and repletion during work and recovery in teleost white muscle // J. Exp. Biol. 1987. Vol. 129. P. 125-140.

74.Doll C.J., Hochachka P.W. and Hand S.C. A microcalorimetric study of turtle cortical slices: insights into brain metabolic depression // J. Exp. Biol. 1994. Vol. 191. P. 141-153.

75.Doll C.J., Hochachka P.W. and Reiner P.B. Reduced ionic conductance in turtle brain//Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. P. R929-R933.

76.Donohoe P.H. and Boutilier R.G. The protective effects of metabolic rate depression in hypoxic cold submerged frogs // Respir. Physiol. 1998. Vol. 111. P. 325-336.

77.Dora K.A., Richards S.M., Rattigan S., Colquhoun E.Q. and Clark M.G. Serotonine and norepinephrine vasoconstriction in rat hindlimb have different oxygen requirements // Am. J. Physiol. 1992. Vol. 269. P. H698-H703.

78.van Doom J.E., Goormachting P.F.J, and de Haan A. Influence of perchloric acid on ion-pair high-performance liquid chromatography of nucleotides // J. Chrom. 1989. Vol. 496. P. 441-449.

79.Drabkin D.L. The distribution of chromoproteins, haemoglobin, mioglobin and cytochrome c in the tissues of the different species and the relationship of the total content of each chromophore to body mass // J. Biol. Chem. 1950. Vol. 182. P. 317-333.

80.Dubinsky W.P. and Cockrell R.S. Respiratory control and mitochondrial monovalent cation permeability of isolated liver cells // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1974. Vol.56. P.415-422.

81.Duszynski J., Groen A.K., Wanders J.A., Vervoorn R.C. and Tager J.M. Quantification of the role of the adenine nucleotide translocator in the control of mitochondrial respiration in isolated rat-liver cells // FEBS Lett. 1982. Vol. 146. P. 116-119.

82.Duszynsky J. and Woitchzak L. The apparent non-linearity of the relationship between the rate of respiration and the protonmotive force in rat liver mitochondria // FEBS Lett. 1985. Vol. 182. P. 243-248.

83 .van Dyke R.W., Gollan J.L. and Scharschmidt B.F. Oxygen consumption by rat liver: effects of taurocholate and sulfobromophthalein transport, glucagon and cation substitution // Am J. Physiol. 1983. Vol. 244. P. G523-GG531.

84.Else, P.L. Oxygen consumption and sodium pump thermogenesis in a developing mammal // Am. J. Physiol. 1991. Vol. 261. P. R1575-R1578.

85.Else P.L. and Hulbert A.J. Comparison of the "mammal machine" and "reptile machine": energy production // Am. J. Physiol. 1981. Vol. 240. P. R3-R.9.

86.Else P.L. and Hulbert A.J. An allometric comparison of the mitochondria from mammalian and reptilian tissues: the implications for the evolution of endothermy // J. Comp. Physiol. 1985a. Vol. 156B. P. 3-11.

87.Else P.L. and Hulbert A.J. Mammals: an allometric study of metabolism at the tissue and mitochondrial level // Am. J. Physiol. 1985b. Vol. 248. P. R415-R421.

88.Else P.L. and Hulbert A.J. Evolution of mammalian endothermic metabolism: "leaky" membranes as a source of heat // Am. J. Physiol. 1987. Vol. 253. P. R1-R7.

89.Else P.L., Windmill D.J. and Markus V. Molecular activity of sodium pumps in endotherms and ectotherms // Am. J. Physiol. 1996. Vol. 271. P. R1287-R1294.

90.Erecinska M. and Silver I.A. ATP and brain function // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1989. Vol. 234. P. C82-C89.

91.Erecinska M., Wilson D.F. and Nichiki K. Homeostatic regulation of cellular energy metabolism: experimental characterisation in vivo and fit to a model // Am. J. Physiol. 1978. Vol. 234. P. C82-C89.

92.Eveback S., Jacobsson A., Simson E.M., Guerra C., Yamashita M., Harper M.-E. and Kozak L.P. Mice lacking uncoupling protein are cold-sensitive but not obese // Nature. 1997. Vol. 387. P. 90-94.

93.Faggioni R., Shigenage J., Moser A., Feingold K.R. and Grunfield C. Induction of UCP-2 gene expression by LSP: a potential mechanism for increasing thermogenesis during infection // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 244. P. 75-78.

94.Famme P., Kundsen J. and Hansen E.S. The effect of oxygen on the aerobic-anaerobic metabolism in the marine bivalve, Mutilus edulus II Mar. Biol. Lett. 1981. Vol. 2. P. 345-351.

95.Fergusson R.A. and Boutilier R.G. Metabolic-membrane coupling in red blood cells of trout: the effects of anoxia and adrenergic stimulation // J. Exp. Biol. 1989. Vol. 143. P. 149-164.

96.Firth J.D., Ebert B.L., Pugh C.V. and Ratcliffe P.J. Oxygen-regulated control elements in the phosphoglycerate kinase 1 and lactate dehydrogenase A genes; similarities with the erythropoetin 3' enchancer // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. Vol. 91. P. 6496-6500.

97.Fishman A.P., Pack A.J., DeLaney R.G. and Galante RJ. In: The biology and the evolution of langfish. Bemis W.E., Burggren W.W. and Kemp N.E. (eds.) New York: AlanR. Liss. 1982. P. 237-248.

98.Flanigan J.E., Withers P.C., Fuery C.J. and Guppy M. Metabolic depression and Na+/K+ gradients in the aestivating frog, Neobatrachus wilsmorei II J. Comp. Physiol. 1993. Vol. 163B. P. 587-593.

99.Flanigan J.E., Withers P.C and Guppy M. In vivo metabolic depression of tissues from the aestivating frog Neobatrachus wilsmorei II J. Exp. Biol. 1991. Vol. 161. P. 273-283.

100.Fleury C., Neverova M., Collins S., Raimbault S., Champigny O., Levi-Meyrues C., Bouliaud F., Seldin M.F., Survit R.S., Ricquier D. and Warden C.H. Uncoupling protein 2: A novel gene linked to obesity and hyperinsulinaemia // Nat. Genet. 1997. Vol. 15. P. 269-272.

101.Freese E., Olempska-Beer Z. and Eisenberg M. Nucleotide composition of cell extracts analyzed by full - spectrum recording in high-performance liquid chromatography//J. Chrom. 1984.Vol. 284. P. 125-142.

102.From A.H.L., Zimmer S.D., Michurski S.P., Mohanakrishnan P., Ulstad V.K., Thoma W.J. and Ugurbil K. Regulation of the oxidative phosphorylation rate in the intact cell // Biochemistry. 1990. Vol. 29. P. 3731-3743.

103.Geiser F. Reduction of metabolism during hibernation and daily torpor in mammals and birds: temperature effect or physiological inhibition? // J. Comp. Physiol. 1988. Vol. 158B. 25-37.

104.Glasheen J.S. and Hand S.C. Anhydrobiosis in embryos of brine shrimp Artemia: characterization of metabolic arrest during reductions in cell-associated water // J. Exp. Biol. 1988. Vol. 135. P. 363.-380.

105.Gnaiger E., Steinlechner-Maran R., Mendez G., Eberl T. and Margreiter R. Control of mitochondrial and cell respiration by oxygen // J. Bioenerg. Biomembr. 1995. Vol. 27. P. 583-596.

106.Gores G.J., Neiminen A.-L., Fleishman K.E., Dawson T.L., Herman B. and Lemasters J.J. Extracellular acidosis delays onset of cell death in ATP-depleted hepatocytes // Am. J. Physiol. 1988. Vol. 255. P. C315-C322.

107.Graf J. and Haussinger D. Ion transport in hepatocytes: mechanisms and correlations to cell volume, hormone actions and metabolism // J. Hepatol. 1996. Vol. 24. P. 53-77.

108.Groen A.K., Wanders R.J.A., Westerhoff H.V., van der Meer R. and Tager J.M. Quantification of contribution of various steps to control of mitochondrial respiration // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257. P. 2754-2757.

109.Gross L. and Yeung E.S. Indirect fluorimetric detection and quantification in capillary zone electrophoresis of inorganic anions and nucleotides // J. Chrom. 1989. Vol.480. P. 169-178.

110.Guppy M., Fuery C.J. and Flanigan J.E. Biochemical principles of metabolic depression//Comp. Biochem. Physiol. 1994. Vol. 109B. P. 175-189.

11 l.Hafner R.P. and Brand M.D. Effect of proton motive force on the relative proton stoichiometries of the mitochondrial proton pumps // Biochem. J. 1991. Vol. 274. P. 75-80.

112.Hafner R.P., Brown G.C. and Brand M.D. Analysis of the control of respiration rate, phosphorylation rate, proton leak rate and proton motive force in isolated mitochondria using top-down approach of metabolic control theory // Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 188. P. 313-319.

113.Hamman H.C. and Haynes R.G. Elevated intramitochondrial adenine nucleotides and mitochondrial functions // Arch. Biochem. Biophys. 1983. Vol. 223. P. 85-94.

114.Hammer D.F., Unverferth D.V., Kelly, R.E., Harvan P.A. and Altshuld R.A. Extraction and measurement of myocardial nucleotides and purine bases by highperformance liquid chromatography//Anal. Biochem. 1988. Vol. 169. P. 300-305.

115.Hand S.C. and Gnaiger E. Anaerobic dormancy quantified in Artemia embryos: a calorimetric test of the control mechanisms // Science. 1988. Vol. 239. P. 14251427.

116.Hand S.C. Metabolic dormancy in aquatic invertebrates. In: Advances in comparative and environmental physiology. Gilles R. (ed.) Vol. 8. New York: Springer-Verlag. 1991. P. 1-47.

117.Hardisty M.W. and Potter I.S. The biology of lampreys. London - New York: Academic Press, 1971, Vol. 1,- 423p.

118.Harper M.E. Obesity research continues to spring leaks // Clin. Invest. Med. 1997. Vol. 20. P. 239-244.

119.Harper M.-E., Ballantyne J.S., Leach M. and Brand M.D. Effects of thyroid hormones on oxidative phosphorylation // Biochem. Soc. Trans. 1993. Vol. 21. P. 785-792.

120.Harper M.-E. and Brand M.D. The quantitative contributions of mitochondrial proton leak and ATP turnover reactions to the changed respiration rate of hepatocytes isolated from rats of different thyroid status // J. Biol. chem. 1993. Vol. 268. P. 14850-14860.

121.Harper M.-E. and Brand M.D. Hyperthyroidism stimulates mitochondrial proton leak and ATP turnover in rat hepatocytes but does not change the overall kinetic of substrate oxidation reactions // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1994. Vol. 72. P. 899908.

122.Harris S.I., Balaban R.S., Barret L. and Mandel L.J. Mitochondrial respiratory capacity and Na+ and K+-dependent adenosintriphosphate-mediated ion transport in the intact renal cell // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256. P. 10319-10328.

123.Harrison D.C., Lemasters J.J. and Herman B. A pH-dependent phospholipase A2 contributes to loss of plasma membrane integrity during chemical hypoxia in rat hepatocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. Vol. 174. P. 654-659.

124.Heinrich R and Rappoport T.A. A linear steady-state treatment of enzymatic chains //Eur. J. Biochem. 1974. Vol. 42. P. 89-95.

125.Heinrich R. Rapoport S.M. and Rapoport T.A. Metabolic regulation and mathematical models // Prog. Biophys. Molec. Biol. 1977. Vol. 32. P. 1-82.

126.Henderson R.J. and Griffin C.A. Analysis of adenosine, inosine and hypoxantine in suspensions of cardiac miocytes by high-performance liquid chromatography // J. Chrom. 1981. Vol. 226. P. 202-207.

127.Herbert C.V. and Jackson D.C. temperature effects on the responses to prolonged submergence in the turtle Chrysemys picta bellii. II Metabolic rate, blood acid-base and ionic changes and cardiovascular function in aerated and anoxic water // Physiol. Zool. 1985. Vol. 58. P. 670-681.

128.Hochachka P.W. Defense strategies against hypoxia and hypothermia //Science. 1986. Vol. 23l.P. 234-241.

129.Hochachka P.W. Muscles and molecular and metabolic machines. Boca Raton FL: CRC Press. 1994,-157p.

130.Hochachka P.W., Buck L.T., Doll C.J. and Land S.C. Unifying theory of hypoxia tolerance: molecular/metabolic defense and rescue mechanisms for surviving oxygen lack //. Proc. Natl. Acad. Sci. 1996 Vol. 93. P. 9493-9498.

131.Hochachka P.W. and Guppy M. Metabolic arrest and the control of biological time. Cambrige, MA: Harvard University Press. 1987,- 237p.

132.Hochachka P.W., Land S.C. and Buck L.T. Oxygen sensing and signal transduction in metabolic defense against hypoxia: lessons from vertebrate facultative anaerobes // Comp. Biochem. Physiol. 1997. Vol. 118A. P. 23-29.

133.Hochachka P.W. and Mateheson G.O. Regulation of ATP turnover over board dynamic muscle work ranges // J. Appl. Physiol. 1992. Vol. 73. P. 1697-1703.

134.Hochachka P.W. and McCleland G.B. Cellular metabolic homeostasis during large-scale change in ATP turnover rates in muscles // J. Exp. Biol. 1997. Vol. 200. P. 381-386.

135.Hofmann G.E. and Hand S.C. Arrest of cytochrome c oxidase synthesis coordinated with catabolic arrest in dormant Artemia embryos // Am. J. Physiol. 1990. Vol. 258. P. R1184-R1191.

136.Hofmann G.E. and Hand S.C. Comparison of messenger RNA pools in active and dormant Artemia franciscana embryos: evidence for translational control // J. Exp. Biol. 1992. Vol. 164. P. 103-116.

137.Holian A., Owen C.S., Wilson D.F. Control of respiration in isolated mitochondria: quantitative evaluation of the dependence of respiratory rates on [ATP], [ADP] and [Pi] //Arch. Biochem. Biophys. 1977. Vol. 181. P. 164-171.

138.Holiday M.A., Potter D., Jarrah A. and Bearg S. The relation of metabolic rate to body weight and organ size // Pediatr. Res. 1967. Vol. 1. P. 185-195.

139.Hotta S.S. Oxidative metabolism of isolated brain mitochondria; changes caused by aminoxyacetate // Archs. Biochem. Biophys. 1968. Vol. 127. P. 132-139.

140.Hulbert A.J. and Else P.L. Comparison of the "mammal machine" and "reptile machine": energy use and thyroid activity // Am. J. Physiol. 1981. Vol. 241. P. R350-R.356.

141.Hulbert A.J. and Else P.L. Evolution of mammalian endothermic metabolism: mitochondrial activity and cell composition // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 256. P. R63-R69.

142.Hulbert A J. and Williams C.A. Thyroid function in lizard, a tortoise and a crocodile, compared with mammals // Comp. Biochem. Physiol. 1988. Vol. 90A. P. 41-48.

143.Jankowsky D., Hottop W. and Seibert H. Influence of thermal acclimation on glucose production and ketogenesis in isolated eel hepatocytes // Am. J. Physiol. 1984. Vol. 246. P. R471-R478.

144.Jansky L. Total cytochrome oxidase activity and its relation to the basal and maximal metabolism//Nature. 1961. Vol. 189. P. 921-922.

145.Jobis F.J., Keizer J.H., La Manna J.C. and Rosenthal M. Reflectance spectroscopy of cytochrome aas in vivo II J. Appl. Physiol. 1977. Vol. 43. P. 858872.

146.Jochansson D., Nilsson G.E. and Tornblom E. Effects of anoxia on energy metabolism in crucian carp brain slices studied with microcalorymetry //J. Exp. Biol. 1995. Vol. 198. P. 853-859.

147Joplin K.H. and Denlinger D.L. Cycles of protein synthesis during pupal diapause in the flesh fly Sarcophaga crassipalpis II Arch. Insect. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 12. P. 111-122.

148 Jorgensen I.B. and Mustafa T. The effect of hypoxia on carbohydrate metabolism in flounder (Platichtys flesus L.). 2. High energy phosphate compounds and the role of glycolitic and gluconeogenetic enzymes // Comp. Biochem. Physiol. 1980. Vol. 67B. P. 249-256.

149.Kacser H. and Burns J. A. The control of flux // Symp. Soc. Exp. Biol. 1973. Vol. 32. P. 64-104.

150.Kelly D.A. and Storey K.B. Organ-specific control of glycolysis in anoxic turtles // Am. J. Physiol. 1988. Vol. 255. P. R744-R779.

151.Kingsly-Hickman P.B., Sako E.Y., Mohanachrishnan P., Robitaille P.M.L., From A.H.L., Foker J.E. and Ugurbil K. 31P NMR studies of ATP synthesis and hydrolysis kinetics in the intact myocardium // Biochemistry. 1987. Vol. 26. P. 7501-7510.

152.Kleiber M. Body size and metabolism // 1932. Hilgardia. Vol. 6. P. 315-353.

153.Klingenberg M. Reversibilität der energiumwandhegen in der atmungskette // Angew. Chem. 1963. Vol. 75. P. 900-907

154.Kobayashi H., Nomani T., Kurokawa T., Sugiyama S., Ozawa T. and Takagi H. Effects of preceding ishemic time on the recovery course of energy metabolism in rat liver //Biochem. Int. 1990. Vol. 22. P. 227-223.

155.Korzeniewski B. Regulation of ATP supply during muscle contraction: theoretical studies // Biochem. J. 1998. Vol. 330. P.l 189-1195.

156.Koretsky A.P. and Balaban R.S. Changes in pyridine nucleotides levels and extramitochondrial phosphates after oxygen consumption in isolated mitochondria: a 31P NMR and fluorescence study // Biochim. Biophys. Acta. 1987. Vol. 893. P. 398-408.

157.Krebs H.A. Body size and tissue respiration // Biochim. Biophys. Acta. 1950. Vol. 4. P. 249-269.

158.Krumschnabel G., Biasi C., Schwarzbaum P.J. and Weiser W. Membrane-metabolic coupling in anoxia-tolerant and anoxia-intolerant hepatocytes // Am. J. Physiol. 1996. Vol. 270. P. R614-R620.

159.Krumschnabel G., Biasi C., Schwarzbaum P.J. and Weiser W. Acute and chronic effects of temperature and of nutritional state, on ion homeostasis and energy metabolism in teleost hepatocytes // J. Comp. Physiol. 1997. Vol. 167B. P. 280286.

160.Kunkel H.O., Spalding J.F., Franciscis J. and Futrell M.F. Cytochrome oxidase activity and body weight in rats and three species of large animals //Am. J. Physiol. 1956. Vol. 186. P. 203-206.

161.Kunz W., Bohnensack R., Bohme G., Kuster U. Letko G. and Schonfeld P. Relations between extramitochondrial and intramitochondrial adenine nucleotide systems // Arch. Biochem. Biophys. 1981. Vol. 209. P. 219-229

162.Kusaka M. and Ui M. Tracer kinetic analysis of Cori cycle activity in the rat: effect of feeding // Am. J. Physiol. 1977. Vol. 232. P. E136-E144.

163.Kushmerick M.J., Meyer R.A. and Brown T.P. Regulation of oxygen consumption in fast- and slow-twitch muscle // Am. J. physiol. 1992. Vol. 263. P. C598-C606.

164.Kuster U., Bohnensack R. and Kunz W. Control of oxidative phosphorylation by the extramitochondrial ATP/ADP ratio // Biochim. Biophys. Acta. 1976. Vol. 440. P.391-402.

165.Lakin-Tomas P.L. and Brand M.D. Stimulation of respiration by mitogens in rat timocytes is independent of mitochondrial calcium // Biochem. J. 1988. Vol. 256. P. 167-173.

166.Land S.C., Buck L.T. and Hochachka P.W. Response of protein synthesis to anoxia and recovery in anoxia tolerant hepatocytes // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. P. R41-R48.

167.Land S.C. and Hochachka P.W. Protein turnover during metabolic arrest in turtle hepatocytes: role and energy dependence of proteolysis // Am. J. Physiol. 1994. Vol. 266. P. C1028-C1036.

168.La Noue K., Strzelecki T. and Finch F. The effect of glucagon on hepatic respiratory capacity // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 4116-4121.

169.La Noue K.F., Jefferies F.M. and Rada G.K. Kinetic control of mitochondrial ATP synthesis // Biochemistry. 1986. Vol. 25. P. 7667-7675.

170.Lappova Y.L. and Leibush B.N. Receptor-mediated endocytosis of insulin in lower vertebrates: internalization and intracellular processing of I-insulin in isolated hepatocytes of lamprey and frog // Gen. Comp. Endocrinol. 1995. Vol.100. P. 1-9.

171.Lardy H.A. and Wellman H. Oxidative phosphorylation: role of innorganic phosphate as an acceptor system in control of metabolic rates //J. Biol. Chem. 1952. Vol. 195. P. 215-224.

172.Larsen L.O. Effects of gonadectomy in the cyclostome // Gen. Comp. Endocrinol. 1969. Vol. 35. P. 197-204.

173.Larsen L.O. Physiology of adult lampreys, with special regard to natural starvation, reproduction, and death after spawning // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1980. Vol. 37. P. 1762-1779.

174.Lemasters J.J., DiGuiseppi J., Nieminen A.-L. and Herman B. Blebbing, free Ca2+ and mitochondrial membrane potential preceding cell death in hepatocytes // Nature 1987. Vol. 325. P. 78-81.

175.Lehninger A.L., Nelson D.L. and Kox M.M. Principles of biochemistry. Second edition. New York: Worth Publishers, 1993,- 1020p.

176.Longmuir I.R. Respiration rate of rat-liver cells at low oxygen concentrations // Biochem. J. 1957. Vol. 65. P. 378-382.

177.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

178.Lutz P.L. and Nilsson G.E. Contrasting strategies for anoxic brain survival -glycolysis up or down // J. Exp. Biol. 1997. Vol. 200. P. 411-419.

179.Luvisetto S., Schmecl I., Intravia E., Conti E. and Azzone G.F. Mechanism of loss of thermodynamic control in mitochondria due to hyperthyroidism and temperature //J. Biol. Chem. 1993. Vol. 267. P. 15348-15355.

180.Lyman C.P., Willis J.S., Malan A. and Wang L.C.H. (eds.) Hibernation and torpor in mammals and birds. New York: Academic Press. 1982,- 317p.

181.Malik A. High performance capillary electrophoresis of basic proteins and nucleotides on highly cross-linked polymer-coated columns // Eighteen international symposium on capillary chromatography, May 20-24, 1996. Vol. III. P. 2165-2177.

182.Maxwell P.H., Pugh C.W. and Ratcliffe P.J. Inducible operation of the erythropoetin 3' enchancer in multiple cell lines: evidence for a widespread oxygen-sensing mechanism // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 2423-2427.

183.McCormack J.G. and Denton R.M. The role of mitochondrial Ca2+ transport and matrix Ca in signal transduction in mammalian tissues. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. Vol. 1018. P. 287-291.

184.Mead R.A. Embryonic diapause in vertebrates // J. Exp. Zool. 1993. Vol. 266. P. 629-641.

185.Muller M., Siems W., Buttgereit F., Dumdey R. and Rappoport S.M. Quantification of ATP-producing and consuming processes in Ehrlich ascites tumour cells // Eur. J. Biochem. 1986. Vol. 161. P. 701-705.

186.Murphy M.P. Slip and leak in mitochondrial oxidative phosphorylation //Biochim. Biophys. Acta. 1989. Vol. 977. P. 123-141.

187.Murphy M.P. and Brand M.D. Variable stoichiometry of proton pumping by mitochondrial respiratory chain//Nature. 1987. Vol. 329. P. 170-172.

188.Murphy M.P. and Brand M.D. Membrane-potential dependent changes in the stoichiometry of charge translocation by the mitochondrial electron transport chain // Eur. J. Biochem. 1988a. Vol. 173. P. 637-644.

189.Murphy M.P. and Brand M.D. The stoichiometry of charge translocation by cytochrome oxidase and cytochrome bci complex of mitochondria of high membrane potential // Eur. J. Biochem. 1988b. Vol. 173. P. 645-665.

190.Nakazawa T. and Nunokawa T. Energy transduction and adenine nucleotides in mitochondria from rat liver after hypoxic perfusion // J. Biochem. 1977. Vol. 82. P. 1575-1583.

191.Nazaki N., Thomas A.P., Hoek J.B. and Farber J.L. Intracellular acidosis protects cultured hepatocytes from the toxic consequences of a loss of mitochondrial energization//Arch. Biochem. Biophys. 1989. Vol. 272. P. 152-161.

192.Neiminen A.-L., Dawson T.L., Gores G.J., Kawanishi T., Herman B. and Lemasters J.J. Protection by acidotic pH and fructose against lethal injury to rat hepatocytes from mitochondrial inhibitors, and oxidant chemicals // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. Vol. 167. P. 600-606.

193.Neiminen A.-L., Saylor A.K., Herman B. and Lemasters J.J. ATP depletion rather than mitochondrial depolarization mediates hepatocyte killing after metabolic inhibition // Am. J. Physiol. 1994. Vol. 267. P. C67-C74.

194. Nichols D.G. The influence of respiration and ATP hydrolysis on the proton-electrochemical gradient across the inner membrane of rat liver mitochondria as determined by ion distribution //1994. Eur. J. Biochem. Vol. 50. P. 305-315.

195.Nichols B.J. and Denton R.M. Towards the molecular basis for the regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions // Mol. Cell Biochem. 1995. Vol. 149-150. P. 203-212.

196.Nilsson G.E. A comparative study of aldehyde dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in crucian carp and three other vertebrates: apparent adaptations to the ethanol production // J. Comp. Physiol. 1988. Vol. 158B. P. 479-485

197.Nobes C.D., Lakin-Thomas P.L. and Brand M.D. The contribution of ATP turnover by the Na/K-ATPase to the rate of respiration of hepatocytes. Effects of thyroid status and fatty acids // Biochim. Biophys. Acta. 1989. Vol. 976. P. 241245.

198.Nobes C.D., Brown G.C., Olive P.N. and Brand M.D. Non-ohmic conductance of mitochondrial inner membrane of hepatocytes // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 12903-12909.

199.0'Brien J. and Block B.A. Effect of Ca on oxidative phosphorylation in mitochondria from the termogenic organ of marlin // J. Exp. Biol. 1996. Vol. 199. P. 2679-2687.

200.Perez-Pinzon M., Rosenthal M., Sick T., Lutz P.L., Pablo P. and Marsh D. Down regulation of sodium channels during anoxia: a putative survival strategy of turtle brain // Am. J. Physiol. 1992. Vol. 262. P. R712-R715.

201.Pietrobon D., Azzone G.F. and Walz D. Effect of funiclocin and antimicin A on the redox driven H+ pumps: on the nature of "leaks" // Eur. J. Biochem. 1981. Vol. 117. P. 389-394.

202.Pietrobon D., Zoratti M. and Azzone G.F. Molecular slipping in redox and ATPase H+ pumps // Biochim. Biophys. Acta. 1983. Vol. 723. P. 317-321.

203.Plisetskaya E. Some aspects of hormonal regulation of metabolism in agnathans. In: Evolutionary biology of primitive fishes. Foreman R.E., Gorbman A., Dodd J.M. and Olsson R. (eds.) New York and London: Plenum press. 1985.- P. 339361.

204.Porter R.K. and Brand M.D. Body mass dependence of H+ leak in mitochondria and its relevance to metabolic rate //Nature. 1993. Vol. 362. P. 628-630.

205.Porter R.K. and. Brand M.D. Cellular oxygen consumption depends on body mass // Am. J. Physiol. 1995a. Vol.269. P.R226-R228.

206.Porter R.K. Brand M.D. Causes of differences in respiration rate of hepatocytes from mammals of different body mass // Am. J. Physiol. 1995b. Vol.269. P.R1213-R1224.

207.Porter R.K. and Brand M.D. Mitochondrial proton conductance and H+/0 ratio are independent of electron transport rate in isolated hepatocytes // Biochem. J. 1995c. Vol. 310. P. 379-382.

208.Porter R.K., Hulbert AJ. and Brand M.D. Allometry of mitochondrial proton leak: influence of membrane surface area and fatty acid composition // Am. J. Physiol. 1996. Vol. 271. R1550-R1560.

209.Rabkin M. and Blum J.J. Quantitative analysis of intermediary metabolism in hepatocytes incubated in the presence and absence of glucagon with a substrate mixture containing glucose, ribose, fructose, alanine and acetate // Biochem. J. 1985. Vol. 225. P. 761-786.

210.Reeds P.J. and Harris C.I. Protein turnover in animals: man in his content. In: Nitrogen metabolism in man, J.C. Waterlow and J.M.L. Stephen (eds.). Essex UK.: Appl. Sci. 1981,-P. 391-408.

211.Reipschlager A. and Portner H.O. Metabolic depression during environmental stress: the role of extracellular versus intracellular pH in sipunculus nudus II 1996. J. Exp. Biol. Vol. 199. P. 1801-1806.

212.Richalet J.P. Oxygen sensors in the organism: Examples of regulation under altitude hypoxia in mammals // Comp. Biochem. Physiol. 1997. Vol. 118A. P. 914.

213.Riccardi A., Servidei T., Losorella A. and Riccardi R. High-performance liquid chromatography assay for cytosine arabinoside and uracil arabinoside in cerebrospinal fluid and plasma II J. Chrom. 1989. Vol. 497. P. 302-307.

214.Richter C., Schwezer M., Cossarizza A. and Franceschi C. Control of apoptosis by the cellular ATP level // FEBS Lett. 1996. Vol. 378. P. 107-110.

215.Rolfe D.F.S. and Brand M.D. The contribution of mitochondrial proton leak to the rate of respiration in rat skeletal muscle and to SMR // Am. J. Physiol. 1996a. Vol. 271. P. C1380-C1389.

216.Rolfe D.F.S. and Brand M.D. Proton leak and control of oxidative phosphorylation in perfused rat skeletal muscle // Biochim. Biophys. Acta. 1996b. Vol. 1188. P. 405-416.

217.Rolfe D.F. and Brand M.D. The physiological significance of mitochondrial proton leak in animal cells and tissues // Biosci. Rep. 1997. Vol.17. P. 9-16.

218.Rolfe D.F.S and Brown G.C. Cellular energy utilisation and molecular origin of standard metabolic rate in mammals // Physiol. Rev. 1997. Vol. 77. P. 731-758.

219.Rosenthal M., La Manna J.C., Jobsis F.F., Levasseurr J.E., Koutos H.A. and Patterson J.L. Effects of respiratory gases on cytochrome a in intact cerebral cortex: is there a critical P02? //Brain Res. 1976. Vol. 108. P. 143-154.

220.Rowan A.N. and Newsholm E.A. Changes in the content of adenine nucleotides and intermediates of glycolysis and the Citric acid cycle in flight muscle of the locust upon flight and their relationship to the control of the cycle // Biochem. J. 1979. Vol. 178. P. 209-216.

221.Sakaida T., Thomas A.P. and Farber J.L. Phospholipid metabolism and intracellular Ca2+ homeostasis in cultured rat hepatocytes intoxicated with cyanide //Am. J. Physiol. 1992. Vol. 263. P. C684-C690.

222.Savina M.V. and Gamper N.L. Respiration and adenine nucleotides of Baltic lamprey (Lampetra fluviatilis L.) hepatocytes during spawning migration 11 Comp. Biochem. Physiol. 1998. Vol. 120B. P. 375-383.

223.Savina M.V. and Derkachev E.F. Switch on and switch off phenomenon of liver gluconeogenic function in lamprey (Lampetra fluviatilis L.) under the influence of season and temperature // Comp Biochem. Physiol. 1983. Vol. 75B. P. 531-539.

224.Schmidt H., Siems W., Muller M., Dimdey R., Jakstadt M. and Rapoport S.M. Balancing of mitochondrial and glycolytic ATP production and of the ATP-consuming processes of Ehrlich mouse ascites tumour cells in a high phosphate medium // Biochem. Int. 1989. Vol. 19. P. 985-992.

225. Schmidt-Nielsen K. Animal physiology. Adaptation and Environment. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1997.- 607 p.

226.Schoch G., Sander G., Fuch E., Johren O., Heller-Schoch G. and Topp H. The whole body degradation rates of cytoplasmatic tRNA, rRNA and mRNA are correlated with basal metabolic rate in mammals of various sizes // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1991. Vol. 372. P. 749.

227.Scholz T.D., Laughlin M.R., Balaban R.S., Kupriyanov V.V. and Heineman F.W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 268. P. H82-H91.

228.Schwarzbaum P.J., Niederstatter H. and Wieser W. Effects of temperature on the (Na +K )-ATPase and oxygen consumption in hepatocytes of two species of freshwater fish, roach (Rutilus rutilus) and brook trout (Salvelinus fontinalis) // Physiol. Zool. 1992. Vol.65. P.699-711.

229.Seibert H. Viability control and oxygen consumption of isolated hepatocytes from thermally acclimated rainbow trout (Salmo gairdneri) II Comp. Biochem. Physiol. 1985. Vol. 80B. P. 677-683.

230.Semenza G.L., Roth P.H., Fang H.-M. and Wang G.L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1 // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 23757-23763.

231.Seren S., Caporin G., Galiazzo F. and Lippe G. Current - voltage relationships for proton flow through the Fo sector of the ATP-synthase, carbonylcyanide-p-trifluoromethoxy-phenilhydrazone or leak pathways in submitochondrial particles //Eur. J. Biochem. 1985. Vol. 152. P. 373-379.

232.Shick J.M., de Zwaan A. and de Bout A.M.T. Anoxic metabolic rate in the mussel Mutilus edulus L. estimated by direct calorimetry and biochemical analysis // Physiol. Zool. 1983. Vol. 56. P. 56-63.

233.Sholz R. and Bucher T. Hemoglobin-free perfusion of rat liver. In: Control of energy metabolism, Chance B. (ed.). New York: Academic Press, 1965, P. 393414.

234.Shutz Y. The basis of direct and indirect calorimetry and their potentials // Diabetes metab. Rev. 1995. Vol. 383-408.

235.Sick T.J., Rosenthal M., Lemanna J.C. and Lutz P.L. Brain potassium ion homeostasis, anoxia and metabolic inhibition in turtles and rats // Am. J. Physiol. 1982. Vol. 243. P. R281-R288.

236.Siems W., Dubiel W., Dumdey R., Holzhutter H.-G., Rathmann J. and Rappoport S.M. Quantification of pathways of glucose utilisation and balance of energy metabolism of rabbit reticulocytes // Eur. J. Biochem. 1982. Vol. 124. P. 567-576.

237.Siems W., Dubiel W., Dumdey R., Muller M. and Rappoport S.M. Accounting for the ATP-consuming processes in rabbit reticulocytes // Eur. J. Biochem. 1984. Vol. 139. P. 101-107.

238.Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics // Biochimica. Biophysica Acta. 1998. Vol. 1363. P. 100-124.

239.Smith C.L. The temperature dependence of oxidative phosphorylation and of the activity of various enzyme systems in liver mitochondria from cold- and warmblooded animals // Comp. Biochem. Physiol. 1973. Vol. 46B. P. 445-46 L

240. Smith R.E. Quantitative relations between liver mitochondrial metabolism and total body weight in mammals //Ann. NY. Acad. Sci. 1956. Vol. 62. P. 403-422.

241.Sobol S. Regulation of energy metabolism in liver // J. Bioenerg. Biomembr. 1995. Vol. 27. P. 571-582.

242.Soltof S.P. ATP and regulation of renal cell function // Annu. Rev. Physiol. 1986. Vol. 48. P. 9-31.

243.Storey K.B. Freeze tolerance in terrestrial frogs // Cryo Lett. 1985. Vol. 6. P. 115134.

244.Storey K.B. and Storey J.M. Freeze tolerance in animals // Physiol Rev. 1988. Vol. 68. P. 27-84.

245.Storey K.B. and Storey J.P. Metabolic rate depression and biochemical adaptation in anaerobiosis, hibernation and estivation // Qart. Rev. Biol. 1990. Vol.65. P. 145174.

246.Tager J.M. Wanders R.J.A., Groen A.K., Kunz W., Bohnensack R., Kuster U., Letko G., Bohme G., Duszynski J. and Woitczak L. Control of mitochondrial respiration//FEBS Lett. V 1983. Vol. 151. P. 1-9.

247.Tailor C.L. and Waibel E.R. Design of mammalian respiratory system. I Problem and strategy//Resp. Physiol. 1981. Vol. 44. P. 1-10.

248.Tailor C.R., Weibel E.R., Weber J.-M., Vock R., Hoppeler H., Roberts T.J. and Brichon G. Design of the oxygen and substrate pathways. I. Model and strategy to test symmorphosis in a network structure //J. Exp. Biol. 1996. Vol. 199. P. 16431649.

249.Tauber M.J., Tauber C.A. and Masaki S. Seasonal adaptations of insects. New York: Oxford University Press. 1986,- 41 lp.

250.Thillart van den G. Adaptations of fish energy metabolism to hypoxia and anoxia // Mol. Physiol. 1982. Vol. 2. P. 49-61.

251.Thillart van den G., Kesbeke F. and Waarde van A. Anaerobic energy-metabolism of goldfish, Carassius auratus (L.). Influence of hypoxia and anoxia on phosphoiylated compounds and glycogen // J. Comp. Physiol. 1980. Vol. 136B. P. 45-52.

252.Ultch G.G. and Jackson D.C. Long term submergence at 3°C of the turtle chrysemys picta bellii in normoxic and severely hypoxic water // J. Exp. Biol. 1982. Vol. 96. P. 11-28.

253.Vera M.F., Almeida-Val L., Buck T. and Hochachka P.W. Substrate and acute temperature effect on turtle heart and liver mitochondria // Am. J. Physiol. 1994. Vol. 266. P. R858-R862.

254.Vorhaben J.E., Klotz A.V. and Campbell J.W. Activity and oxidative metabolism of the land snail. Helix aspersa II Physiol. Zool. 1984. Vol. 57. P. 357-365.

255.Waarde van A., Thillart van den G. and Kesbeke F. Anaerobic energy metabolism of the European eel, Anguilla anguilla L. // J. Comp. Physiol. 1983. Vol. 149B. P. 469-475.

256. Wang G.L. and Semenza G.L. General involvement of hypoxia induced factor 1 in transcriptional response to hypoxia // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 4304-4308.

257.Wasser J.S., Jackson D.C., Chang S.Y. and Warburton S.J. Maintenance of high extracellular pH does not influence cell pH or metabolism of submerged anoxic bullfrogs //J. Exp. Zool. 1993. Vol. 265. P. 619-626.

258.Waterlow J.C. Protein turnover with special reference to man // Q. J. Exp. Physiol. 1984. Vol. 69. P. 409-438.

259.Werner A., Siens W., Kowalewski J. and Gerber G. Interrelationships between purine nucleotide degradation and radical formation during intestinal ischemia and reperfusion, an application of ion-pair high-performance liquid chromatography of nucleotides, nucleosides and nucleobases // J. Chrom. 1989. Vol. 491. P. 77-88.

260.West T.G. and Boutilier R.G. Metabolic suppression in anoxic frog muscle // J. Comp. Physiol. 1998. Vol. 168B. P. 273-280.

261. Whitman R. In: the cellular functions of membrane transport. Hoffman J.P.(ed.). Prentice Hall: Engcewood Cliffs, 1974.- P. 139-154.

262. Wilson D.F. Factors affecting the rate and energetics of mitochondrial oxidative phosphorylation//Med. Sci. Sports Exerc. 1994. Vol.26. P.37-43.

263.Wilson D.F. and Erecinska M. The oxygen dependence of cellular energy metabolism // Adv Exp Med Biol. 1986. Vol. 194. P. 229-239.

264.Wilson D.F., Erecinska M., Drown C. and Silver I.A. The oxygen dependence of cellular energy metabolism // Arch. Biochem. Biophys. 1979. Vol. 195. P. 485-493.

265.Wilson D.F., Owen C., Mela. L. and Weiner L. Control of mitochondrial respiration by the phosphate potential // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. Vol. 53. P. 326-333.

266.Wulfson A.N. and Yakimov S.A. HPLS of nucleotides. II. General methods and their development for analysis and preparative separation. An approach to selectivity control // J. High Resol. Chrom. 1984. Vol. 8. P. 442-460.

267.Yacoe M.E. Protein metabolism in the pectoralis muscle and liver of hibernating bats, Eptesicus fuscus II J. Comp. Physiol. 1983. Vol. 152B. P. 137-144.

268.Zakaria M. and Brown P.R. High-performance liquid column chromatography of nucleotides, nucleosides and bases // J. Chrom. 1981. Vol. 226. P. 267-290.

269.Ziegler M., Dubiel W., Pimenov A.M., Tikhonov Y.V., Toguzov R.T., Henke W. and Gerber. G. Purine compounds in mitochondria: a quantitative evaluation // Biomed. Biochim. Acta. 1989. Vol. 48. P. 57-61.

270.Zhegunov G.F., Mikulinsky Y.E. and Kudokotsev E.V. Hyperactivation of protein synthesis in tissues of hibernating animals on arousal //Cryo Lett. 1988. Vol. 9. P. 236-245.

271.Zolkiewska A., Zablocka B., Duszynsky J. and Woitczak L. Resting state respiration of mitochondria: reappraisal of the role of passive ion fluxes // Arch. Biochem. Biophis. 1989. Vol. 275. P. 580-590.

272.Zoratti M., Favaron M., Pietrobon, D. and Azzone G.F. Intrinsic uncoupling of mitochondrial proton pumps. 1. Non-ohmic conductance can not account for the non-linear dependence of static head respiration on ApH+ // Biochemistry. 1986. Vol. 25. P. 760-767.