Обогащение культуры кератиноцитов человека стволовыми клетками путем селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Спичкина, Ольга Георгиевна

• Спичкина, Ольга Георгиевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Спичкина, Ольга Георгиевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Строение кожи человека.

2.2. Дифференцировка кератиноцитов.

2.3. Маркеры стволовых клеток кожи.

2.4. Белки базальной мембраны.

2.5. Рецепторы кератиноцитов к белкам ВКМ.

2.6. Влияние белков ВКМ на культивируемые кератиноциты.

2.7. Методы выявления стволовых клеток для последующего обогащения ими культуры кератиноцитов.

Цель и задачи исследования.

Положения, выносимые на защиту.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Выделение и культивирование кератиноцитов.

3.2. Стриппинг многослойного пласта кератиноцитов и снятие клеток базального слоя.

3.3. Субстраты.

3.4. Схема селективной адгезии.

3.5. Определение числа прикрепившихся к субстрату кератиноцитов.

3.6. Получение и истощение иммуносывороток ИСб и ИСД.

3.7. Обработка стекол для приготовления препаратов.

3.8. Иммунофлуоресцентный анализ.

3.9. Анализ изображений клеток.

3.10. Разделение белков с помощью электрофореза.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4. 1. Взаимодействие свежевыделенных и культивируемых базальных кератиноцитов с разными белками внеклеточного матрикса.

4.2. Зависимость морфометрических параметров гетерогенной популяции кератиноцитов от времени адгезии к белкам внеклеточного матрикса.

4.3. Распределение маркеров стволовых клеток кожи (рбЗ, Ki67, К19) в гетерогенной популяции кератиноцитов.

4.4. Получение кроличьих антител к дифференцированным и недифференцированным кератиноцитам.

4.5. Выявление субпопуляций кератиноцитов, окрашиваемых полученными антителами ИСб и ИСД.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Обогащение культуры кератиноцитов человека стволовыми клетками путем селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса»

В последние годы большой интерес вызывают исследования, связанные с изучением и применением стволовых клеток в медицине для заместительной клеточной терапии поврежденных тканей. При этом до сих пор ведется много дискуссий на тему, что же понимать под термином «стволовые клетки», и можно ли их использовать в клинике. Кроме клинического применения, наличие такой линии способствовало бы изучению механизмов регуляции дифференцировки клеток, а также изучению влияния на нее различных факторов. Для того чтобы детально их изучать, необходимо наличие постоянной линии стволовых клеток с тем, чтобы исключить вариации каких-либо признаков, которые можно наблюдать при использовании материала от разных доноров. Кроме того, такая линия являлась бы постоянным источником материала для клеточных технологий. На данный момент из взрослого организма удается выделять в чистом виде только гемопоэтические мезенхимные стволовые клетки. Однако линии стволовых клеток взрослого организма до сих пор не созданы.

Было обнаружено, что в ряде тканей взрослого организма существуют ниши, в которых находятся стволовые клетки, например, в коже в базальном слое кератиноцитов. Кожный покров человека и животных постоянно обновляется за, счет пролиферации кератиноцитов и их последовательной дифференцировки по направлению от базальной мембраны к поверхности кожи. Согласно существующим представлениям покоящиеся стволовые клетки эпидермиса сосредоточены у базальной мембраны и в волосяных фолликулах. Они дают начало так называемым транзиторным клеткам, способным интенсивно размножаться, за счет чего эпидермис постоянно обновляется. После нескольких делений они вступают на путь дифференцировки. В результате образуются разные слои эпидермиса, содержащие кератиноциты, находящиеся на разных уровнях дифференцировки (Хэм, Кормак, 1983).

При переводе в культуру кератиноцитов базального слоя эпидермиса они способны размножаться и воспроизводить такой же процесс последовательной дифференцировки, как это происходит в коже. Образуется многослойный пласт эпидермальных клеток, который может быть использован в технологиях заместительной клеточной терапии (Limat, Klein, 1993; Romero et al., 1999).

В связи с тем, что доказано существование стволовых клеток в коже человека, представляется актуальным получить популяцию кератиноцитов, обогащенную стволовыми клетками, которые обладают большим пролиферативным потенциалом. Пул таких клеток можно было бы использовать как для фундаментальных исследований, так и для применения в заместительной клеточной терапии. Предполагается, что это позволит повысить эффективность технологий восстановления структурной и функциональной целостности кожного покрова.

Решить задачу получения линии стволовых клеток или, по крайней мере, обогащения ими гетерогенной популяции базальных кератиноцитов, можно было бы осуществить путем выявления стволовых клеток методом проточной цитометрии с помощью специфических маркеров. В литературе описан ряд подобных маркеров (Michel et al., 1996; Pellegrini et al., 2001). Однако на наш взгляд они не являются строго специфичными для этого типа клеток, так как они носят скорее количественный характер и найдены и в клетках других тканей (Fradette et al., 1998; Reis-Filho et al., 2002). Кератиноциты разной степени дифференцировки различаются лишь только по величине содержания в них маркерных белков (Moles, Watt, 1997; Yang et al., 1998).

В связи с отсутствием строго специфичных маркеров необходимо искать другие экспериментальные подходы для четкого выделения этих клеток или, по крайней мере, для обогащения ими культивируемой популяции кератиноцитов. Стволовые клетки эпидермиса локализованы на базальной мембране и, следовательно, тесно взаимодействуют с входящими в ее состав белками (Spradling et al., 2001). В связи с этим представлялось перспективным для указанной цели применить метод селективной адгезии выделенных кератиноцитов к разным белкам внеклеточного матрикса (ВКМ) базальной мембраны, с которыми они взаимодействуют в неповрежденной коже. Для проверки данного предположения и разработки метода селективного разделения гетерогенной популяции клеток необходимо прежде всего выяснить, какие из белков базальной мембраны могут быть использованы для этой цели. Кроме того, важно установить степень взаимодействия с этими белками как свежевыделенной популяции кератиноцитов, так и после их культивирования.

Таким образом, четкое определение и идентификация стволовых клеток, обладающих высоким пролиферативным потенциалом, а также возможность получения из общей популяции эпидермальных клеток фракции стволовых кератиноцитов, представляет собой насущную задачу как для решения ряда фундаментальных вопросов, так и с точки зрения применения этих клеток в медицине с целью сокращения сроков заживления ран.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Спичкина, Ольга Георгиевна

6. выводы

1. Первичные кератиноциты кожи человека отличаются по способности к взаимодействию с различными белками внеклеточного матрикса. Наиболее адгезивными для них являются коллагены I и IV типов, а также фибронектин.

2. Недифференцированные кератиноциты, выявляемые окрашиванием антителами на кератины 5 и 14, обнаруживают наибольшую степень сродства к субстрату при коротких временах адгезии до 30 минут.

3. Совмещение морфометрического анализа прикрепившихся клеток к субстрату с окрашиванием на кератин 19, считающийся маркером стволовых клеток кожи, позволило выявить субпопуляцию мелких круглых клеток, предположительно представляющих собой субпопуляцию стволовых кератиноцитов.

4. Проведенные исследования с использованием таких маркеров стволовых клеток эпидермиса, как рбЗ и кератина 19, показали, что с их помощью возможно лишь выявлять и охарактеризовать группы клеток по наличию в них данных белков, однако они не могут являться строго специфичными только для стволовых клеток кожи в условиях in vitro.

5. С целью выявления маркерных белков, специфичных для стволовых клеток кожи, получены антитела на поверхностные белки кератиноцитов, которые выявляют более четкие различия между дифференцированными и недифференцированными клетками.

6. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что с помощью селективной адгезии с использованием специфических маркеров возможно проводить обогащение гетерогенной популяции кератиноцитов стволовыми клетками.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Спичкина, Ольга Георгиевна, 2008 год

1. Васильев А.В. 2003. Клеточные механизмы репарации тканевых повреждений. Диссертация. М.

2. Васильев А.В., Волошин А.В., Терских В.В. 1991. Роль фидерных клеток в прикреплении и росте кератиноцитов человека и крысы. Цитология. 33 (12): 84-89.

3. Горелик Ю.В. 1996. «Влияние элементов внеклеточного матрикса на функциональную активность эпидермальных кератиноцитов в культуре и при заживлении ран». Диссертация. СПб.

4. Горелик Ю.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 1994. Влияние компонентов внеклеточного матрикса на распластывание кератиноцитов крысы на субстрате при культивировании в низкокальциевой среде. Цитология. 36(12): 1209-1212.

5. Калмыкова Н.В., Черепанова О.А., Горелик Ю.В., Воронкина И.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2002. Различное влияние ламинина-1 и ламинина 2/4 на адгезию и миграцию культивируемых кератиноцитов человека. Цитология. 44 (8): 792-798.

6. Хэм А., Кормак Д. 1983. Гистология. Перевод с англ. под ред. Афанасьева Ю.И., Ченцова Ю.С. М. Мир. т. 4. 244 с.

7. Черепанова О.А., Калмыкова Н.В., Воронкина И.В., Арэ А.Ф., Горелик Ю.В., Пинаев Г.П. 2002. Различия в характере взаимодействия нормальных и трансформированных кератиноцитов человека с изоформами ламинина. Цитология. 44 (2): 151 158.

8. Юдинцева Н. М., Горелик Ю. В., Дьяконов И. А., Калмыкова, Н. В., Блинова М. И., Пинаев Г. П. 1999. Трансплантация аллогенных эпителиальных пластов на ожоговые раны. Цитология. 41 (3/4): 328.

9. Adams, J. С., Watt, F. М. 1989. Fibronectin inhibits the terminal differentiation of human keratinocytes. Nature. 340: 307-309.

10. Adams J.C., Watt F.M. 1990. Changes in keratinocyte adhesion during terminal differentiation: reduction in fibronectin binding precedes alpha 5 beta 1 integrin loss from the cell surface. Cell. 63: 425-435.

11. Adams J.C., Watt,F.M. 1991. Expression of 131, B3, 134 and 135 integrins by human epidermal keratinocytes and non-differentiating keratinocytes. J. Cell Biol. 115: 829-841.

12. Akiyama M., Smith L.T., Shimizu H. 2000. Changing patterns of localization of putative stem cells in developing human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 114: 321-327.

13. Alitalo K., Kuismcmen E., Myllyla R., Kiistala U., Asko-Seljavaara S., Vaheri A. 1982. Extracellular matrix proteins of human epidermal keratinocytes and feeder 3T3 cells. J. Cell Biol. 94 (3): 497-505.

14. Allen T.D., Potten C.S. 1974. Fine-Structural Identification and Organization of the Epidermal Proliferative Unit. J. Cell Sci. 15: 291-319.

15. Alonso L., Fuchs E. 2003. Stem cells of the skin epithelium. PNAS. 100: 1183011835.

16. Are A., Pinaev G., Burova E., Lindberg U. 2001. Attachment of A-431 cells on immobilized antibodies to the EGF receptor promotes cell spreading and reorganization of the microfilament system. Cell Motil Cytoskeleton. 48: 24-36.

17. Aumailley M, Nurcombe V., Edgar D., Paulsson M., Timpl.R. 1987. The cellular interaction of laminin fragments. Cell adhesion correlates with two fragment-specific high affinity binding sites. J. Biol. Chem. 262:11532-11538.

18. Aumailley M., Rousselle P. 1999. Laminins of the dermo-epidermal junction. Matrix Biology. 18: 19-28.

19. Ballaun С., Weninger W., Uthman A., Weich H., Tschacler E. 1995. Human keratinocytes express the three major splice forms of vascular endothelial growth factor. J. Invest. Dermatol. 104: 7-10.

20. Balmain A., Loehren D., Fischer J., Alonso A. 1977. Protein synthesis during fetal development of mouse epidermis. I. The appearance of "histidine-rich protein". Dev Biol. 60(2): 442-452.

21. Banb-Schlegel S., Green H. 1981. Involucrin synthesis and tissue assembly by keratinocytes in natural and cultured human epithelia. J Cell Biol. 90(3): 732-737.

22. Barrandon Y. 1993. The epidermal stem cell: an overview. Seminars in DEVELOPMENTAL BIOLOGY. V. 4: 209-215.

23. Barrandon Y., Green H. 1985. Cell size as a determinant of the clone-forming ability of human keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 82: 5390-5394.

24. Barrandon Y., Green H. 1987. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci USA. 84(8): 2302-2306.

25. Bazzoni G., Hemler M.E. 1998. Are changes in integrin affinity and conformation overemphasized? Trends Biochem Sci. 23(1): 30-34. Review.

26. Beck K., Dixon T. W., Engel J., Parry D.A. 1993. Ionic interactions in the coiled-coil domain of laminin determine the specificity of chain assembly. J. Mol. Biol. 231: 311-323

27. Beck K., Hunter I., Engel J. 1990. Structure and function of laminin: anatomy of multidomain glycoprotein. FASEB J. 4: 148-160.

28. Bickenbach J.R. 1981. Identification of label-retaining cells in oral mucosa and skin. JDentRes 122C: 1611-1620.

29. Bickenbach J.R. 1998. Selection and growth of epidermal stem cells. In: Savage DM, ed. Bioengineering of Skin Substitutes. Southborough, MA: IBC Library Series. 7592.

30. Bickenbach J.R., Chism E. 1998. Selection and extended growth of murine epidermal stem cells in culture. Exp. Cell Res. 244: 184-195.

31. Bickenbach J.R., Grinnell K.L. 2004. Epidermal stem cells: interactions in developmental environments. Differentiation. 72: 371-380.

32. Bickenbach J.R., Mackenzie I.C. 1984. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. J Invest Dermatol 82:618-622.

33. Bjornson C.R.R., Rietze R.L., Reynolds B.A., Magli M.C., Vescovi A.L. 1999. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science 283: 534-537.

34. Borradori L., Sonnenberg A. 1999. Structure and function of hemidesmosomes: more than simple adhesion complexes. J. Investig. Dermatol. 112: 411-418.

35. Boudreau N.J., Jones P.L. 1999. Extracellular matrix and integrin signalling: the shape of things to come. Biochem J. 339 : 481-488.

36. Braun N., Papadopoulos Т., Muller-Hermelink H.K. 1988. Cell cycle dependent distribution of the proliferation-associated Ki-67 antigen in human embryonic lung cells. Virchows Arch В Cell Pathol Incl Mol Pathol. 56(1): 25-33.

37. Burgeson R.E., Chiquet M., Deutzmann R., Ekblom P., Engel J., Kleinman H., Martin G.R., Menegiizzsi G., Paulsson M., Sanes J., TimplR., Tryggvason K, Yamada Y., Yurchenco P.D. 1994. A new nomenclature for laminins. Matrix Biol. 14: 209-211

38. Caldwell C.J., Hobbs С., McKee P.H. 1997. The relationship of Ki67 and involucrin expression in proliferative, pre-neoplastic and neoplastic skin. Clin Exp Dermatol. 1997.22(1): 11-16.

39. Carter W.G., Ryan M.C., Gahr P.J. 1991. Epiligrin, a new cell adhesion ligand for integrin a3pl in epithelial basement membranes. Cell 65: 599-610.

40. Cary L.A., Han D.C., Polte T.R., Hanks S.K., Guan J.L. 1998. Identification of pl30Cas as a mediator of focal adhesion kinase-promoted cell migration. J Cell Biol. 140:211-221.

41. Chandrakasan G., Torchia D.A., Piez K.A. 1967. Preparation of intact monomeric collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution. J. Biol. Chem. 251: 6062-6067.

42. Chen J.D., Helmod M., Kim J.P. 1994. Human keratinocytes make uniquely liner phagokinetic tracks. Dermatology. 188: 6-12.

43. Cherepanova O.A., Kalmykova N., Petrov Y.P., Blinova M., Pinaev G. 2006. Contribution of a2pi, a3(31, абр4 integrins and 67kDa laminin receptor to the interaction of epidermoid carcinoma A-431 cells with laminin-2/4. Cell. Biol. Int. 30: 784-792.

44. Clark R.A.F. 1990. Fibronectin matrix deposition and fibronectin receptor expression in healing and normal skin. J.I nvest. Derm. 94:128-134.i103

45. Clark R.A.F., Folkvord J.M., Wertz R.L. 1985. Fibronectin, as well as other extracellular matrix proteins, mediate human keratinocyte adherence. J Invest Dermatol. 84(5): 378-383.

46. Clark R.A.F., Lanigan J.M., Delia Pelle P., Manseau E., Dvorak H.F., Colvin R.B. 1982. Fibronectin and fibrin provide a provisional matrix for epidermal cell migration during wound reepithelialization. J. Derm. Dermat. 79: 264-269.

47. Clausen O.P.F., Potten C.S. 1990. Heterogeneity of keratinocytes in the epidermal basal cell layer. J Cutan Pathol. 17: 129-143.

48. Concha M., Vidal M.A., Moreno I., Salem C., Figueroa C.D., Schmitt D., Peguet-Navarro J. 2003. Evidence for modulation of human epidermal differentiation and remodelling by CD40. Br J Dermatol. 148(6): 1105-1114.

49. Cotsarelis G., Sun T.T., Lavker R.M. 1990. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61(7):1329-1337.

50. Сох E.A., Sastry S.K., Huttenl'ocher A. 2001. Integrin-mediated adhesion regulates cell polarity and membrane protrusion through the Rho family of GTPases. Mol Biol Cell. 12:265-277.

51. Dale B.A. 1977. Purification and characterization of a basic protein from the stratum comeum of mammalian epidermis. Biochim Biophys Acta. 491(1): 193-204.

52. Damsky C., Sutherland A., Fisher S. 1993. Extracellular matrix 5: adhesive interactions in early mammalian embryogenesis, implantation, and placentation. FASEB. 7: 1320-1329.

53. Dawson R.A., Coberdhan N.J., Freedlander E., MacNeil S. 1996. Influence of extracellular matrix proteins on human keratinocyte attachment, proliferation and transfer to a dermal wound model. Burns. 22(2): 93-100.

54. DiPersio C.M., Hodivala-Dilke K.M., Jaenisch R., Kreidberg J.A., Hynes R.O. 1997. a3pi integrin is required for normal development of the epidermal basement, membrane. J. Cell Biol. 137: 729-742.

55. Dunnwald M., Tomanek-Chalkley A., Alexandrunas D., Fishbaugh J., Bickenbach J.R. 2001. Isolation a pure population of epidermal stem cells for use in tissue engineering. Exp. Dermatol. 10: 45-54.

56. Ehrig K., Leivo I., Argraves W.S., Ruoslanti E., and Engvall E. 1990. Merosin, a tissue- specific basement membrane protein, is a laminin-like protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 3264-3268.

57. Elices M.J., Hemler M.E. 1989. The human integrin VLA-2 is a collagen receptor on some cells and a collagen/laminin receptor on others. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24): 9906-9910.

58. Elices M.J., Urry L.A., Hemler M.E. 1991. Receptor functions for integrin VLA-3: fibronectin, collagen, and laminin binding are differentially influenced by Arg-Gly-Asp peptide and by divalent cations. J.Cell Biol.l 12: 169-181.

59. Fleischmajer R., PerlishJ.S., MacDonald E.D. 2nd, Schechter A., Murdoch A.D., Iozzo R. V. Yamada Y. 1988. There in binding of collagen IV to beta 1 integrin during early skin basement membrane assembly. Ann. N.Y. Acad. Sci. 857: 212-227.

60. Fradette J., Germain L., Seshaiah P., Coulombe P.A. 1998. The type I keratin 19 possesses distinct and context-dependent assembly properties. J. Biol. Chem. 273: 35176-35184.

61. Fuchs E. 1988. Keratins as biochemical markers of epithelial differentiation. Trends in Genetics. 4: 277-281.

62. Fuchs E. 1995. Keratins and the skin. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11: 123-153.

63. Fuchs E., Dow ling J., Segre J., Lo S.H., and Yu Q.-C. 1997. Integrators of epidermal growth and differentiation: distinct functions of pi and (34 integrins. Curr. Opin. Gen. Dev. 7: 672-682.

64. Fuchs E. Green H. 1980. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocytes. Cell. 19: 1033-1042.

65. Fuchs E., Weber К. 1994. Intermediate filaments: Structure, dynamics, function, and disease. Annual. Review of Biochemistry. 63: 345-382.

66. Gaffen J.D. 1992. Interaction between the cell surface and the extracellular matrix. Br. J. Rheumatol. 31: 74-76.

67. Gehlsen K.R., Dicker son K., Argraves W.S., Engvall E., Ruoslahti E. 1989. Subunit structure of a laminin-binding integrin and localization of its binding site on laminin. J Biol Chem. 264(32): 19034-19038.

68. Geiger В., Bershadsky A., Fankov R., Yamada K.M. 2001. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix—cytoskeleton crosstalk. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2: 793-805.

69. Gerdes J., Lemke H., Baisch H., Wacker H.-H., Schwab U., Stein H. 1984. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J. Immunol. 133: 1710- 1715.

70. Gerdes J., Schwab U., Lemke H., Stein H. 1983. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int. J. Cancer. 31: 13-20.

71. GianeottiF. G., Ruoslahti E. 1999. Integrin signaling. Science 285: 1028-1032.

72. Gilchrest B.A., Calhoun J.K., Maciag T. 1982. Attachment and growth of human keratinocytes in a serum-free environment. J Cell Physiol. 112(2): 197-206.

73. Goberdhan N.J., Edgecombe M., Freedlander E., MacNiel S. 1997. Extracellular matrix proteins induce changes in intracellular calcium and cyclic AMP signalling systems in cultured human keratinocytes. Burns. 23(2): 122-130.

74. Goldfinger L.E., Hopkinson S.B., deHart G. W., Collawn S., Couchman J.R., Jones J.C. 1999. The a3 laminin subunit, a6134 and a3131 integrin coordinately regulate wound healing in cultured epithelial cells and in the skin. J. Cell Sci. 112: 2615-2629.

75. Gorelik J. V., Cherepanova O.A., Voronkina I. V., Diakonov LA., Blinova M.L. and Pinaev G.P. 2001. Laminin-2/4 from human placenta is a better adhesion agent for primary keratinocytes than laminin-1 from EHS sarcoma. Cell Biol. Int. 25 (5): 395-402.

76. Graf J., Ogle R.C., Robey F.A., Sasaki M., Martin G.R., Yamada Y., Kleinman H.K. 1987. A pentapeptide from the laminin В1 chain mediates cell adhesion and binds the 67 000 laminin receptor. Biochem. 26: 6896-6900.

77. Green H. 1977. Terminal differentiation of cultured human epidermal cells. Cell. 11(2): 405-416.

78. Green H., Kehinde O., Thomas J. 1979. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 76: 5665-5668.

79. Grinnell F. 1992. Wound repair, keratinocyte activation and integrin modulation. J. Cell Sci. 101: 1-5.

80. Grose R., Hutter C., Bloch W., Thorey I., Watt F.M., Fassler R., Brakebusch C., Werner S. 2002. A crucial role of beta 1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Development (Cambridge, U.K.). 129 (9): 2303-2315.

81. Guillaud P., du Manoir S., Seigneurin D. 1989. Quantification and topographical description of Ki-67 antibody labelling during the cell cycle of normal, fibroblastic (MRC-5) and mammary tumour cell lines (MCF-7). Anal Cell Pathol. 1: 25-39.

82. Guo M., Toda K-I., Grinnell F. 1990. Activation of human keratinocyte migration on type I collagen and fibronectin . J. Cell Sci. 96: 197-205.

83. Haeffner E.W., Kolbe K, Schroeter D., Paweletz N. 1980. Plasma membrane heterogeneity in ascites tumor cells. Isolation of a light and a heavy membrane fraction of the glycogen-free Ehrlich-Lettre substrain. Biochim Biophys Acta. 603(1): 36-51.

84. Hakkinen L., Hildebrand H.C., Berndt A., Kosmehl H., Larjava H. 2000. Immunolocalization of tenascin-C , a9 integrin subunit and avP6 during wound healing in human oral mucosa. J. ITistochem. Cytochem. 48: 985-998.

85. Hakiknen L., Koivisto L., Larjava H. 2001. An improved method for culture of epidermal keratinocytes from newborn mouse skin. Methods Cell Sci. 23(4): 189196.

86. Hostikka L., Tryggvason K. 1987. Extensive structural differences between genes for the alpha 1 and alpha 2 chains of type IV collagen despite conservation of coding sequences. FEBS Lett. 224(2): 297-305.

87. Huelsken J., Vogel R., Erdmann В., Cotsarelis G., Birchmeier W. 2001. B-Catenin controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin. Cell. 105: 533-545.

88. Hynes R. 1985. Molecular biology of fibronectin. Review. Annu Rev Cell Biol. 1:67.90.

89. Jensen P.K., Bolund L. 1988. Low Ca2+ stripping of differentiating cell layers in human epidermal cultures: an in vitro model of epidermal regeneration. Exp Cell Res. 175(1): 63-73

90. Jensen U.B., Lowell S., Watt F.M. 1999. The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole mount labelling and lineage analysis. Development. 126: 2409-2418.

91. Jones P.H., Harper S., Watt,F.M. 1995. Stem cell patterning and fate in human epidermis. Cell. 80: 83-93.

92. Jones P.H., Watt F.M. 1993. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell. 73: 713-724.

93. Jones J., Watt F.M., Speight P.M. 1997. Changes in the expression of av integrins in oral squamous cell carcinomas. J. Oral Pathol. Med. 26: 63-68.

94. Karasek M.A. 1980. Effect of chemical modification of keratinocytes and collagen in keratinocyte-collagen interactions. Curr Probl Dermatol. 10: 143-158.

95. Karecla P.L., Timpl R., Watt F. 1994. Adhesion of human epidermal keratinocytes to laminin. Cell Adhesion Commun. 2: 309-318.

96. Kariniemi A.L., Lehto V.P., Vartio Т., Virtanen I. 1982. Cytoskeleton and pericellular matrix organization of pure adult human keratinocytes cultured from suction-blister roof epidermis. J Cell Sci. 58: 49-61.

97. Kaur P., Li A. 2000. Adhesive properties of human basal epidermal cells: an analysis of keratinocyte stem cells, transit amplifying cells, and postmitotic differentiating cells. J Invest Dermatol. 114(3): 413-420.

98. Kibbey M. C. 1994. Maintenance of the EHS sarcoma and matrigel preparation. J. Tissue Culture Methods. 16: 227-230.

99. Kikkawa Y., Sanzen N., Sekiguchi K. 1998. Isolation and characterization of laminin-10/11 secreted by human lung carcinoma cells. Laminin-10/11 mediates cell adhesion through integrin a3pl. J. Bio. Chem. 273: 15854-15859.

100. Kim J.P., Chen J.D., Wilke M.S. 1994. Human keratinocyte migration on type IV collagen . Role of heparin-binding site and alpha2 beta 1 integrin. Lab Invest. 74: 401408.

101. Kim D.S., Cho H.J., Choi H.R., Kwon S.B., Park K.C. 2004. Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents. Cell Mol. Life Sci. 61:2774-2781.

102. Kim J.P. Zhang K, Chen J.D. 1992. Mechanism of human keratinocyte migration on fibronectin: unique role of RGD sites and integrins. J. Cell Physiol. 151: 443-450.

103. Kleinman H.K. 1994. Isolation of laminin-1 and type IV collagen from the EHS sarcoma. J. Tissue Culture Methods. 16: 231-233.

104. Kleinman H.K., McGarvey M.L., Hassell J.R., Star V.L., Cannon F.B., Laurie G.W., Martin G.R. 1986. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25(2): 312-318.

105. Kopan R., Traska G., Fuchs E. 1987. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. J. Cell Biol. 105: 427-440.

106. Kreidberg J.A. 2000. Functions of alpha3betal integrin. Review. Curr Opin Cell Biol. 12(5): 548-553.

107. Kubo M., Kan M., Isemura M., Yamane I., Tagami H. 1987. Effects of extracellular matrices on human keratinocyte adhesion and growth and on its secretion and deposition of fibronectin in culture. J Invest Dermatol. 88(5): 594-601.

108. MacKenzie I.C., Bickenbach JR. 1985. Label-retaining keratinocytes and Langerhans cells in mouse epithelia. Cell Tissue Res. 242 (3): 551-556.

109. Mackenzie I.C., Mackenzie S.L., Rittman G.A. 1989. Isolation of subpopulations of murine epidermal cells using monoclonal antibodies against differentiation-related cell surface molecules. Differentiation 41: 127-138.

110. Matoltsy A.G. 1976. Keratinization. J. Invest. Dermatol. 67: 20-25.

111. Matoltsy A.G., Huszar T. 1972. Keratinization of the reptilian epidermis: an ultrastructural study of the turtle skin. J Ultrastruct Res. 38(1): 87-101.

112. Mercurio A.M., Rabinovitz I., Shaw L.M. 2001. The абр4 integrin and epithelial cell migration. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 541-545.

113. Moles J.-P., Watt F.M. 1997. The epidermal stem cell compartment: variation in expression levels of E-cadherin and catenins within the basal layer of human epidermis. J. Histochem. Cytochem. 45: 867-874.

114. Moll R., Frank W.W., Schiller D.L., Geiger В., Krepler R. 1982. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Review. Cell. 31(1): 11-24.

115. Monical P.L., Kefalides N.A. 1994. Coculture modulates laminin synthesis and mRNK levels in epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. Exp.Cell Res. 210(2): 154-159.

116. Morita K., Urabe K., Moroi Y., Koga Т., Nagai R., Horiuchi S., Furue M. 2005. Migration of keratinocytes is impaired on glycated collagen I. Wound Repair Regen. 13(1): 93-101.

117. Morris R.J., Fischer S.M., Slaga T.J. 1985. Evidence that the centrally and peripherally located cells in the murine epidermal proliferative unit are two distinct cell populations. J Invest Dermatol. 84(4): 277-281.

118. Morris R.J., Potten C.S. 1994. Slowly cycling (label-retaining) epidermal cells behave like clonogenic stem cells in vitro. Cell Prolif. 27(5): 279-289.

119. Morris R.J., Potten C.S. 1999. Highly persistent label-retaining cells in the hair follicles of mice and their fate following induction of anagen. J Invest Dermatol. 112(4): 470-475.

120. Murray J.C., Stingl G., Kleinman H.K., Martin G.R., Katz S.I. 1979. Epidermal cells adhere preferentially to type IV (basement membrane) collagen. J Cell Biol. 80(1): 197-202.

121. Nelson W., Sun T.-T. 1983. The 50- and 58-kdalton keratin classes as molecular markers for stratified squamous epithelia : cell culture studies. J. Cell Biol. 97: 244-251.

122. Nguyen B.P., Ryan M.C., Gil S.G., Carter W.G. 2000. Deposition of laminin 5 in epidermal wounds regulates integrin signaling and adhesion. Review. Curr Opin Cell Biol. 12(5): 554-562.

123. Nishimura S.L., Sheppard D., Pytela R. 1994. Integrin avl38. Interaction with vitronectin and functional divergence of the 138 cytoplasmic domain. J. Biol. Chem. 269: 28708-28715.

124. O'Keefe E.J., Woodley D.T., Gastillo G., Russell N., Payne R.E. 1984. Production of soluble and cell-associated fibronectin in cultured keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 82:150-155

125. Orkin R. W., Gehron P., McGoodwin E.B., Martin G.R., Valentine Т., Swarm R. 1977. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. J Exp Med 145(1): 204-220.

126. Palm S.L., Furcht L.T. 1983. Production of laminin and fibronectin by Schwannoma cells: cell-protein interactions in vitro and protein localization in peripheral nerve in vivo. J. Cell Biol. 96: 1218-1226.

127. Pellegrini G., Dellambra E., Golisano O., Martinelli E., Fantozzi I., Bondanza S., Ponzin D., McKeon F., De Luca M. 2001. p63 indentifies keratinocyte stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 3156-3161.

128. Petersen M.J., Woodley D.T., O'Keefe E.J. 1988. Cultured human keratinocytes synthesize and secrete type IV procollagen. Abstract. Clin. Res. 36: 378.

129. Petrov Yu. P., Krylova T. A., Tsupkina N. V., Pershina V.P. 2007. Spreading as the general attribute of cell population. J. Biol. Sciences. 7: 102-112.

130. Pilcher B.K., Dumin J.N., Sudbeck B.D., Krane S.M., Welgus H.J., Parks W.C. 1997. The Activity of Collagenase-1 Is Required for Keratinocyte Migration on a Type I Collagen Matrix. J.Cell.Biol. 137(6): 1445-1457.

131. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K, Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D. W. Craig S., Marshak D.R. 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284: 143-147.

132. Potten C. S. 1983. in Stem Cells: Their Identification and Characterization, ed. Potten C. S. Churchill Livingston, London. 200-232.

133. Potten С. S., Hendry J.H. 1973. Clonogenic cells and stem cells in the epidermis. Int. J. Radiat. Biol. 24: 537-540.

134. Potten C.S., Hume W.J., Reid P., Cairns J. 1978. Cell. The segregation of DNA in epithelial stem cells. 5(3): 899-906.

135. Potten C.S., Kovacs L., Hamilton E. 1974. Continuous labelling studies on mouse skin and intestine. Cell Tissue Kinet. 7(3): 271-283.

136. Potten C.S., Morris R.J. 1988. Epithelial stem cells in vivo. J Cell Sci. Suppl. 10:45.62.

137. Potten C.S., Wichmann H.E., Loeffler M, DobekK., Major D. 1982. Evidence for discrete cell kinetic subpopulations in mouse epidermis based on mathematical analysis. Cell Tissue Kinet. 15(3): 305-329.

138. Pytela R., Pirschbacher M.D., Ruoslahti E. 1985. Identification and isolation of a 140 kd cell surface glycoprotein with properties expected of a fibronectin receptor. Cell. 40: 191-198.

139. Quinlan R.A., Schiller D.L., Hatzfeld M., Achtstatter Т., Moll R., Jorcano J.L., Magin T.M., Franke W. W. 1985. Patterns of expression and organization of cytokeratin intermediate filaments. Ann. N.Y. Acad. Sci. 455: 282-306.

140. Radu E., Simionescu O., Regalia Т., Dumitrescu D., Popescu L.M. 2002. Stem cells (p63(+)) in keratinocyte cultures from human adult skin. J. Cell. Mol. Med. 6: 593598.

141. Raghow R. 1994. The role of extracellular matrix in postinflammatory wound healing and fibrosis. FASEB J. 8: 823-831.

142. Reis-Filho J.S., Torio В., Albergaria A., Schmitt F.C. 2002. p63 expression in normal skin and usual cutaneous carcinomas. J Cutan Pathol. 29(9): 517-523.

143. Rheinwald J.G. 1980. Serial cultivation of normal epidermal keratinocytes. Meth.Cell Biol. 21 A: 229-254.

144. Rice R.H., Green H. 1979. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18: 681-694.

145. Roskelley C.D., Srebrow A., Bissell M.J. 1995. A hierarchy of ECM-mediated signalling regulates tissue-specific gene expression. Curr. Opin. Cell Biol. 7:736-747.

146. Ruoslahti E., Hayman E.G., Pirschbacher M., Engvall E. 1982. Fibronectin: purification, immunochemical properties, and biological activities. Methods in Enzymology. 82: 803-830.

147. Schnapp L.M., Hatch N., Ramos D.M., Klimanskaya I. V., Sheppard D., Pytela R. 1995. The human integrin a8bl functions as a receptor fooor tenascin, fibronectin and vitronectin. J.Biol. Chem. 270: 23196-23202.

148. Sechler J.L., Corbett S.A., Wenk M.B., Schwarzbauer J.E. 1998. Modulation of cell-extracellular matrix interactions. Review. Ann N Y Acad Sci. 857:143-154.

149. Sewry C.A., Dalessandro M., Wilson L.A., Sorokin L.M., Naom I., Bruno S., Ferlini A., Dubowitz V., Muntoni F. 1996. Expression of laminin chains in skin in merosin deficient congenital muscular dystrophy. Neiropediatrics. 28: 217-222.

150. Sieg D.J., Hauck C.R., llic D., Klingbeil C.K., Schaefer E., Damsky C.H., Schlaepfer D.D. 2000. FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration. Nat Cell Biol. 2: 249-256.

151. Simonart Т., FaytL, Noel J.C. 2002. An immunohistochemical study of abnormal \ keratinocyte proliferation in molluscum contagiosum. British Journal of Dermatology146: 609-614.

152. Skerrow D., Skerrow C.J. 1983. Tonofilament differentiation in human epidermis: isolation and polypeptide chain composition of keratinocytes subpopulation. Exp. Cell Res. 143:27-35.

153. Smola H., Stark H.J., Thiekotter G., Mirancea N., Krieg Т., Fusenig N.E. 1998. \ Dynamics of basement membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions inorganotypic skin culture. Exp. Cell Res. 239: 399-410.

154. Sobel S., Rosenberg M.D. 1983. Characterization of cellular attachment and spreading molecules at liquid-liquid interfaces. Anal. Biochem. 140 : 486-489.

155. Sonnenberg A., Calafat J., Janssen H., Daams H., Van der Raalj-Helmer L.M.H., Faicioni R., Kennel S.J., Aplin J. D., Baker J., Loizidou M., Garrod D. 1991. Integrins

156. Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T. 2001. Stem cells find their niche. Nature. 414: 98-104.

157. Steinert P.M., Cantieri J.S., Teller D.C., Lonsdale-Eccles J.D., Dale B.A. 1981. Characterization of a class of cationic proteins that specifically interact with intermediate filaments. Proc Natl Acad Sci USA. 78(7): 4097-4101.

158. Stenn K.S., Malhotra R. 1992. Epithelialization. In: Wound healing-biochemical & clinical aspects, eds. Cohen I.K., Diegelmann R.F., Lindblad W.J. Pennsylvania: Saunders WB. pp. 115-127.

159. Stepp M.A. 1999. a9 and (38 integrin expression correlates with the merger of the developing mouse eyelids. Dev. Dyn. 214: 216-228.

160. Stepp M.A., Zhu L., Sheppard D. and Cranfill R.L. 1995. Localised distribution of a9 integrin in the cornea and changes in expression during corneal epithelial cell differentiation J. Histochem. Cytochem. 43: 353-362.

161. Stupack D. G. 2005. Integrins as a distinct subtype of dependence receptors. Cell Death Differ. 12 : 1021-1030.

162. Stupack D. G., Cheresh D.A. 2002. Get a ligand, get a life: integrins, signaling and cell survival. J. Cell Sci. 115: 3729-3738.

163. Suter M.M., Crameri F.M., Olivry Т., Mueller E., von Tscharner C., Jensen P.J. 1997. Keratinocyte biology and pathology. Veter. Dermatology. 8: 67-100.

164. Sutherland J., Denyer M., Britland S. 2005. Motogenic substrata and chemokinetic growth factors for human skin cells. J. Anat. 207: 67-78.

165. Tagami H., Parrish J.A., Ozawa T. (eds.). 1998. Skin. Interface of a living system. Amsterdam, Elsevier Science B.V. 212 p.

166. TakashimaA., Grinnell F. 1985. Fibronectin-mediated keratinocyte migration and initiation of fibronectin receptor function in vitro. J.Invest. Dermatol. 85 (4): 304-308.

167. Tani Т., Lehto V-P., Virtanen I. 1999. Expression of laminins 1 and 10 in carcinoma cells and comparison of their roles in cell adhesion. Exp.Cell Res. 248: 115121.

168. TaniH., Morris R.J., Kaur P. 2000. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 97: 10960-10965.

169. Timpl R. 1996. Macromolecular organization of basement membranes. Curr. Opin. Cell Biol. 8:618-624.

170. Timpl R., Tisi D., Talts J.F., Andac Z., Sasaki Т., Hohenester E. 2000. Structure and function of laminin LG modules. Review. Matrix Biol. 19(4): 309-317.

171. Timpl R., Wiedemann H., Van Delden V., Furthmayr H., Kiihn K. 1981. A network model for the organization of Type IV collagen molecules in basement membrane. Eur. J. Biochem. 120: 203-211.

172. Toole B.P. 1991". Proteoglycans and hyaluronan in morfogenesis and differentiation. In: Hay E.D., ed. Cell Biology of Exracellular matrix.2nd ed. New York: Plenum Press. 305-341.

173. Tseng S.C.J., Jarvinen M.J., Nelson W.G., Huang J.-W., Woodcock-Mitchell J., Sun T.-T. 1982. Correlation of specific keratins with different types of epithelial differentiation: monoclonal antibody studies. Cell. 30: 361-372.

174. Venstrom K. A., Reichardt L. F. 1993. Extracellular matrix. 2: Role of extracellular matrix molecules and their receptors in the nervous system. FASEB. 7: 996-1003.

175. Viae J., Staquet M.J., Thivolet J., Goujon C. 1980. Experimental production of antibodies against stratum corneum keratin polypeptides. Arch. Dermatol. Res. 267: 179188.

176. Watt F.W. 1983. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. Review. J Invest Dermatol. 81(1 Suppl): 100s-103s.

177. Watt F.M. 1984. Selective migration of terminally differentiating cells from the basal layer of cultured human epidermis. J. Cell Biol. 98: 16-21.

178. Watt F. W. 1987. Influence of cell shape and adhesiveness on stratification and terminal differentiation of human keratinocytes in culture. Review. J Cell Sci Suppl. 8: 313-326.

179. WattF. M. 1998. Epidermal stem cells: markers, patterning and the control of stem cell fate. Phil.Trans. R. Soc. Lond. B. 353: 831-837.

180. Watt F.M. 2002. Role of integrins in regulating epidermal adhesion, growth and differentiation. The EMBO Journal. 21(15): 3919-3926.

181. Watt F.M., Green H. 1982. Stratification and terminal differentiation of cultured epidermal cells. Nature. 295 (5848): 434-436.

182. Watt F.M., Hertle D.M. 1994. Keratinocytes integrins. In The Keratinosytes Handbook. UK, Cambridge University Press: 153-164.

183. Watt F.M., Kubler M.-D., Hotchin N.A., Nicholson L.J., Adams J.C. 1993. Regulation of keratinocyte terminal differentiation by integrin-extracellular matrix interactions. J. Cell Sci., 106:, 175-182.

184. Wayner E.A., Carter W.G. 1987. Identification of multiple cell adhesion receptors for collagen and fibronectin in human fibrosarcoma cells possessing unique a and common b subunits. Z Cell Biol. 105: 1873-1884.

185. Webb A., Li A., Kaur P. 2004. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72(8): 387-395.

186. Wewer U.M., Engvall E. 1994. Laminins. Meth.Enzymol. 245: 85-104.

187. Woodcock-Mitchell J., Eichner R., Nelson W.G., Sun T.-T. 1982. Immunolocalization of keratin polypeptides in human epidermis using monoclonal antibodies. J. Cell Biol. 95: 580-588.

188. Woodley D.T., Stanley J.R., Reese M.J., O'Keefe E.J. 1988. Human dermal fibroblasts synthesize laminin. J. Invest. Dermatol. 90: 679-683

189. Wu Y.J., Rheinwald J.G. 1981. A new small (40 kd) keratin filament protein made by some cultured human squamous cell carcinomas. Cell. 25(3): 627-635.

190. Yamada K.M., Kennedy D.W. 1985. Amino acid sequence specificities of an adhesive recognition signal. J.Cell Biol. 28: 99-104.

191. Yoshida I., Tashiro K-I., Monji A., Nagata I., Hayashi Y., Mitsuyama Y., Tashiro N. 1999. Identification of heparin binding site and the biological activities of the laminin al chain carboxy-terminal globular domain. J.Cellular Phys. 179: 18-28.

192. Yurchenco P.D., Amenta P.S., Patton B.L. 2004. Basement membrane assembly, stability and activities observed through a developmental lens. Matrix Biology. 22: 521538.

193. Yurchenco P.D., Cheng Y.S., Colognato H. 1992. Laminin forms an independent network in basement membranes. J.Cell Biol. 117 (5): 1119-1133.

194. Yurchenko R., Furthmayr H. 1984. Self-assembly of basement membrane collagen. Biochemistry 23: 1839-1850.

195. ZhuA.J., Watt F.M. 1999. beta-catenin signalling modulates proliferative potential of human epidermal keratinocytes independently of intercellular adhesion. Development. 126(10): 2285-2298.

196. Zillikens D. 1999. Acquired skin disease of hemidesmosomes. J. Dermatol. Sci. 20: 134-154.