О перспективах использования ингибиторов карбоангидразы человека в противораковой терапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Шаронова Татьяна Валерьевна

• Шаронова Татьяна Валерьевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Шаронова Татьяна Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 IX И XII ИЗОФОРМЫ КАРБОАНГИДРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И ИХ РОЛЬ В РАЗВИТИИ РАКА

1.1.1 Особенности строения IX и XII изоформ карбоангидразы человека

1.1.2 Связь КАЧ IX и XII с гипоксией и ацидозом

1.2 Применение ингибиторов КАЧ IX и XII в качестве индивидуальных ПРОТИВОРАКОВЫХ АГЕНТОВ

1.2.1 Ингибиторы КАЧ IX и XII как потенциальные противораковые средства

1.2.2 Ингибиторы КАЧ IX и XII, находящиеся на стадии клинических и доклинических испытаний в области онкологии

1.3 Ингибиторы КАЧ IX как кандидаты для комбинированной терапии при солидных опухолях

1.3.1 Ингибиторы КАЧ IX в комбинации с обычными цитостатическими препаратами

1.3.2 Ингибиторы карбоангидразы человека IX в комбинации с противораковыми препаратами

1.3.3 Ингибиторы КАЧ IX и XII в комбинации с агентами, влияющими на онкогенез

1.4 ПРЕПАРАТЫ ДВОЙНОГО ДЕЙСТВИЯ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА ИНГИБИРОВАНИЕ КАЧ IX И XII И ДРУГИХ МИШЕНЕЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПУХОЛЯМИ

ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1 ПОИСК ИНГИБИТОРОВ КАЧ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПРОТИВОРАКОВОЙ ТЕРАПИИ В КАЧЕСТВЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ АГЕНТОВ

2.1.1 Синтез исходных а-диазо-у-лактамов

2.1.2 Синтез исходных а-диазодикарбонильных соединений

2.1.3 Синтез исходных а-диазомонокарбонильных соединений

2.1.4 Проведение реакции МН-внедрения диазокарбонильных соединений в ароматические аминосульфонамиды

2.1.5 Изучение ингибиторного профиля продуктов внедрения карбеноидов по NH-связи и перегруппировки Вольфа

2.1.6 Исследование противораковой активности продуктов внедрения карбеноидов по NH-связи и перегруппировки Вольфа в качестве индивидуальных агентов

2.2 ИНГИБИТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ В ОТНОШЕНИИ КАЧ IX И XII КАК КРИТЕРИЙ ОТБОРА СОЕДИНЕНИЙ ПРИ РАЗРАБОТКЕ НОВЫХ ПРОТИВОРАКОВЫХ СРЕДСТВ

2.3 Двойное таргетирование, направленное на ингибирование IX и XII изоформ

КАЧ, А ТАКЖЕ ДРУГИЕ МИШЕНИ, СВЯЗАННЫЕ С ОНКОГЕНЕЗОМ

2.3.1 Комбинирование фармакофорных фрагментов, способных ингибировать КАЧ IX и XII и тиоредоксинредуктазу

2.3.1.1 Исследование противораковых свойств ингибиторов КАЧ IX и XII и TrxR как индивидуальных агентов

2.3.1.2 Комбинированное тестирование ингибиторов карбоангидразы IX и XII и тиоредоксинредуктазы на противораковую активность

2.3.1.3 Синтез гибридной молекулы, содержащей сульфонамидный фрагмент и фрагмент акцептора Михаэля

2.3.1.4 Исследование противораковых свойств гибридного соединения, содержащего сульфонамидный фрагмент и фрагмент акцептора Михаэля

2.3.2 Исследование противораковых свойств ингибиторов КАЧ IX и XII в комбинации с противоопухолевым препаратом гефитинибом

2.3.2.1 Влияние комбинаций ингибиторов КАЧ IX и XII с гефитинибом на рост культуры раковых клеток

2.3.2.2 Влияние ингибиторов КАЧ IX и XII и гефитиниба на миграционную способность раковых клеток

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 ОРГАНИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ

3.2 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КАЧ - карбоангидраза человека

PG-подобный домен - протеогликан-подобный домен

pHi - внутриклеточный pH

pHe - внеклеточный pH

HIF - фактор, индуцируемый гипоксией

NBC - котранспортер бикарбоната натрия

MCT - монокарбоксилатный транспортер

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

ЭМП - эпителиально-мезенхимальный переход

Ki - константа ингибирования

IC50 - концентрация полумаксимального ингибирования

МРЛ - мелкоклеточный рак легких

ESCC - плоскоклеточная карцинома пищевода

DOX - доксорубицин

CIS - цисплатин

KRAS - Ki-ras2 Kristen саркома крысы ОСТ - октилдисульфамат 3-АС - 3-О-ацетилбетулин

TNBC - трижды-отрицательный рак молочной железы SAHA - субероиланилид гидроксамовой кислоты HDAC - деацетилаза гистонов

РНК - рибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДГА - дигидроартемизинин

GEF - гефитиниб

COX-2 - циклооксигеназа-2

15-LOX - 15-липоксигеназа

P-gp - Р-гликопротеин

DBU - диазабициклоундецен

SAFE - диазоперенос бес использования сульфоназида

ТГФ - тетрагидрофуран

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Trx - тиоредоксин

TrxR - тиоредоксинредуктаза

ТФА - трифторуксусная кислота

Hepes - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота PBS - фосфатный буферный раствор

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «О перспективах использования ингибиторов карбоангидразы человека в противораковой терапии»

Актуальность темы

Карбоангидразы человека (КАЧ) - это семейство цинковых металлоферментов, катализирующих обратимую реакцию гидратации диоксида углерода до бикарбонат-иона и протона в живых организмах [1]. Эта простая реакция регулирует основную буферную систему как во внутриклеточном, так и внеклеточном пространстве в различных тканях и органах. Также активность различных изоформ КАЧ связана и с развитием ряда заболеваний, таких как глаукома, отек, ожирение, невропатическая боль и рак [2]. В частности, IX и XII изоформы КАЧ были признаны в качестве противораковых терапевтических мишеней. Эти трансмембранные белки в значительной степени экспрессируются в гипоксических солидных опухолях, где они играют ключевую роль в регуляции микроокружения, тем самым способствуя выживанию, пролиферации, метастазированию и развитию лекарственной устойчивости раковых клеток [4]. Поэтому ингибирование КАЧ IX и XII может являться перспективным терапевтическим подходом в противораковой терапии.

Степень разработанности темы исследования

Несмотря на то, что за последние десятилетия в литературе представлено огромное число ингибиторов КАЧ, еще ни один разработанный на их основе противораковый агент не нашел клинического применения. Многие примеры эффективных ингибиторов КАЧ демонстрируют желаемое цитотоксическое действие лишь при высоких концентрациях, либо таковое вовсе отсутствует. Так, из множества открытых ингибиторов КАЧ лишь один (8ЬС-0111) дошел до клинических испытаний в качестве монотерапии при лечении рака, а позже был перепрофилирован в антиметастатический агент, применяемый в комбинации с противоопухолевым препаратом - гемцитабином [5,6]. Однако в литературе встречается довольно ограниченное число сообщений о комбинациях, включающих ингибиторы КАЧ. Помимо этого, в литературе встречается очень

малое количество исследований, где был бы применен мультитаргетный подход, который подразумевает одновременное ингибирование КАЧ и других мишеней. Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы является оценка возможности применения ингибиторов карбоангидразы человека в противораковой терапии.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

• Получить, с применением новых синтетических подходов, бензолсульфонамид-содержащие соединения с разнообразной молекулярной периферией.

• Изучить ингибирующее действие полученных бензолсульфонамид-содержащих соединений в отношении различных изоформ карбоангидразы человека с использованием биологических тест-систем.

• Определить антипролиферативное действие, полученных ингибиторов карбоангидразы человека и оценить их потенциал в противораковой терапии.

Научная новизна работы

Получен и охарактеризован ряд новых первичных бензолсульфонамидов с помощью нового синтетического подхода, основанного на использовании диазосоединений. Изучен ингибиторный профиль полученных соединений в отношении различных изоформ КАЧ, а также определена их противораковая активность. Проведен мета-анализ данных с целью установления для описанных в литературе соединений корреляции их ингибиторных свойств с антипролиферативными свойствами. Впервые получено соединение, содержащее в своей структуре фармакофорные элементы, ответственные за ингибирование карбоангидразы, а также фермента тиоредоксинредуктазы; изучено его противораковое действие. Проведено тестирование в отношении раковых клеточных линий ингибиторов КАЧ в комбинации с противоопухолевым препаратом - гефитинибом, а также изучено их совместное влияние на миграцию раковых клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы

Исследованы возможности применения ингибиторов КАЧ in vitro для подавления роста культуры раковых клеток - как таковых, а также в комбинации с другим антипролиферативным агентом. Выявлены ингибиторы КАЧ, сами по себе обладающие антипролиферативным действием, а также такие ингибиторы, которые усиливают действие противоракового агента с иным механизмом действия. Показано, что ингибирование КАЧ (в частности, IX и XII изоформ) не является единственным определяющим критерием для поиска противораковых агентов. Установлено, что ингибиторы КАЧ могут являться эффективными адъювантами агентами для иных противораковых агентов в составе комбинированной терапии.

Использованные методы

При выполнении диссертационного исследования применялись физикохимические методы идентификации и анализа чистоты полученных соединений, в частности ЯМР - спектроскопия на ядрах 1H и 13C, методы масс-спектрометрии. Для разделения и очистки полученных соединений использовались методы высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии и препаративной колоночной хроматографии. Кинетику ингибирования рекомбинантных изоформ КАЧ измеряли методом остановленной струи. Анализ выживаемости клеток в присутствии ингибиторов КАЧ проводился с использованием MTT-теста в условиях гипоксии в концентрациях от 0,001 мкМ до 200 мкМ. Исследование миграционной активности клеток проводилось электроимпедансным методом.

Степень достоверности и апробация научных результатов

Достоверность положений, выносимых на защиту, и выводов диссертации подтверждена выполнением экспериментов в контролируемых воспроизводимых условиях, с использованием необходимого числа повторений, а также применением современных методов установления структуры полученных соединений. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 6 научных статей в международных рецензируемых научных изданиях,

индексируемых базами данных (Web of Science, Scopus) и 3 тезисов докладов на конференциях. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 5-я Российская конференция по медицинской химии с международным участием «МедХим-Россия 2021» (Волгоград, 16-19 мая, 2022); международная конференция по естественным и гуманитарным наукам «Science SPbU-2020» (Санкт-Петербург, 25 декабря, 2020); XXVII международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2020» (Москва, 10-27 ноября, 2020).

Опубликованные результаты:

1. Kalinin S., Malkova A., Sharonova T., Sharoyko V., Bunev A., Supuran C. T., Krasavin M. Carbonic anhydrase IX inhibitors as candidates for combination therapy of solid tumors // Int. J. Mol. Sci. - 2021. - vol. 22 (24). - p. 13405-13435.

2. Sharonova T., Paramonova P., Kalinin S., Bunev A., Gasanov R. E., Nocentini A., Sharoyko V., Tennikova T. B., Dar'in D., Supuran C. T., Krasavin M. Insertion of Metal Carbenes Into the Anilinic N-H Bond of Unprotected Aminobenzenesulfonamides Delivers Low Nanomolar Inhibitors of Human Carbonic Anhydrase IX and XII isoforms // Eur. J. Med. Chem. - 2021. - vol. 218. - p. 113352-113367.

3. Krasavin M., Kalinin S., Sharonova T., Supuran C. T. Inhibitory activity against carbonic anhydrase IX and XII as a candidate selection criterion in the development of new anticancer agents // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. - 2020. - vol. 35 (1). - p. 15551561.

4. Krasavin M., Sharonova T., Sharoyko V., Zhukovsky D., Kalinin S., Zalubovskis R., Tennikova T., Supuran C. T. Combining carbonic anhydrase and thioredoxin reductase inhibitory motifs within a single molecule dramatically increases its cytotoxicity // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. - 2020. - vol. 35 (1). - p. 665-671.

5. Krasavin M., Shetnev A., Sharonova T., Baykov S., Kalinin S., Nocentini A., Sharoyko V., Poli G., Tuccinardi T., Presnukhina S., Tennikova T. B., Supuran C. T. Continued exploration of 1,2,4-oxadiazole periphery for carbonic anhydrase-targeting primary arene sulfonamides: discovery of subnanomolar inhibitors of membrane-bound

hCA IX isoform that selectively kill cancer cells in hypoxic environment // Eur. J. Med. Chem. - 2019. - vol. 164 (164). - p. 92-105.

6. Krasavin M., Shetnev A., Sharonova T., Baykov S., Tuccinardi T., Kalinin S., Angeli A., Supuran C. T. Heterocyclic Periphery in the Design of Carbonic Anhydrase Inhibitors: 1,2,4-Oxadiazol-5-yl Benzenesulfonamides as Potent and Selective Inhibitors of Cytosolic hCA II and Membrane-Bound hCA IX Isoforms // Bioorg. Chem. - 2018. -vol. 76. - p. 88-97.

7. Шаронова Т.В., Калинин С.А., Бунев А.С., Красавин М.Ю. Изучение ингибиторного действия гефитиниба и ингибиторов IX и XII изоформ карбоангидразы человека в противораковой области // 5-я Российская конференция по медицинской химии с международным участием «МедХим-Россия 2021», Волгоград, Россия, 16-19 мая, 2022, с. 106.

8. Шаронова Т.В. Новый подход к разработке противораковых препаратов, основанный на объединении двух фармакофорных фрагментов, ингибирующих карбоангидразу и тиоредоксинредуктазу, в одной молекуле // Международная конференция по естественным и гуманитарным наукам «Science SPbU-2020», Санкт-Петербург, Россия, 25 декабря, 2020, с. 388-390.

9. Шаронова Т.В. Применение реакции N-H-внедрения карбенов в ароматические аминосульфонамиды для лечения онкологических заболеваний // XXVII международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2020», Москва, Россия, 10-27 ноября, 2020, с. 967.

Положения, выносимые на защиту

• Синтез первичных бензолсульфонамидов с разнообразной молекулярной периферией с использованием инструментария диазохимии;

• Ингибиторный профиль полученных первичных бензолсульфонамидов в отношении различных изоформ КАЧ;

• Потенциал полученных первичных бензолсульфонамидов в качестве индивидуальных противораковых агентов;

• Результаты мета-анализа данных по биологической активности ранее описанных ингибиторов карбоангидразы человека IX/XII, выполненного с целью установления возможной корреляции между величиной их ингибирующего действия и антипролиферативными свойствами в отношении раковых клеток;

• Антипролиферативное действие полученных в рамках настоящего исследования ингибиторов карбоангидразы человека в комбинации с противоопухолевым препаратом - гефитинибом;

• Синтез и исследование антипролиферативного действия гибридного соединения, содержащего фармакофорные элементы, ответственные за ингибирование карбоангидразы человека и фермента тиоредоксинредуктазы.

Соответствие паспорту специальности

Диссертация соответствует паспорту специальности 1.4.16. Медицинская химия - согласно пунктам: 1. Поиск, структурный дизайн и синтез соединений-лидеров - потенциальных физиологически активных (лекарственных) веществ, на основе: а) знания структурных параметров биомишени или особенностей патогенеза; б) анализа и модификации структур известных активных соединений; в) синтеза и биологического тестирования широкого разнообразия химических соединений. 5. Рациональное создание физиологически активных соединений, действующих на две и более молекулярные мишени (в том числе двойных, двоякодействующих, гибридных, мультитаргетных лекарств). 6. Биологическое и физиологическое (in vitro и in vivo) тестирование сконструированных и синтезированных соединений на предмет изучения особенностей их взаимодействия с молекулярными мишенями организма.

Личный вклад автора

Автор принимал участие в постановке цели и задач исследования совместно с научным руководителем. Самостоятельно произвел поиск, анализ и обобщение научной литературы по теме диссертации, а также осуществил мета-анализ данных. Автором осуществлены все химические эксперименты, выделение, очистка,

подготовка соединений к физико-химическим методам анализа и биологическим исследованиям. Автором было выполнено тестирование полученных соединений на клеточной линии рака аденокарциномы поджелудочной железы РАКС-1. Автор самостоятельно интерпретировал результаты, полученные в партнерских лабораториях. Кроме того, автор принимал участие в подготовке материалов работы к публикации, а также для представления данных на конференциях.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов и Списка литературы. Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста, содержат 49 рисунков, 11 схем, 3 таблицы и 149 ссылок.

Благодарности

Автор искренне благодарит ассистента Института химии СПбГУ к.х.н. Калинина С.А. за идеи и помощь в процессе проведения исследования. Автор благодарит Парамонову П.С. за помощь в синтезе соединений и подготовке образцов для биологических испытаний. Автор благодарит д.б.н. Шаройко В.В. за руководство работой по изучению противораковой активности полученных соединений и доцента Бунева А.С. (Тольяттинский государственный университет) за проведение тестирования на противораковую активность полученных соединений. Автор благодарит профессора Супурана К.Т. (Флорентийский университет) за определение ингибиторного профиля полученных соединений. Автор благодарит научного сотрудника с возложением обязанностей заведующего Лабораторией биомедицинских технологий и испытаний с опытным производством, канд. биол. наук Хотина М.Г. и старшего научного сотрудника, канд. биол. наук Тюряеву И.И. (Институт цитологии РАН) за выполнение исследования миграционной активности полученных соединений. Автор также благодарит весь коллектив кафедры Химии природных соединений (бывш. Лаборатория химической фармакологии) за позитивную и доброжелательную атмосферу, моральную и интеллектуальную поддержку в трудные моменты проведения исследования.

Диссертационная работа выполнена при поддержке гранта РФФИ№19-33-90017 «Применение реакции N-H-внедрения карбенов в ароматические аминосульфамиды к поиску селективных ингибиторов IX изоформы карбоангидразы человека для лечения онкологических заболеваний».

Исследования проведены с использованием оборудования ресурсных центров Научного парка СПбГУ: «Магнитно-резонансные методы исследования» и «Методы анализа состава вещества».

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 IX и XII изоформы карбоангидразы человека и их роль в развитии

рака

1.1.1 Особенности строения IX и XII изоформ карбоангидразы человека

Карбоангидразы - это семейство цинковых металлоферментов, катализирующих обратимую реакцию гидратации диоксида углерода до бикарбонат-иона и протона в живых организмах [1]. Эта реакция регулирует основную буферную систему как во внутриклеточном, так и внеклеточном пространстве и важна для всех биологических процессов, требующих контроля кислотно-щелочного баланса. Известно 15 изоформ КАЧ, которые очень схожи по строению активного сайта, однако существенно различаются по тканевому распределению, каталитической активности и субклеточной локализации [7,8]. Так, описаны цитозольные (I, II, III, VII, VIII, X, XI, XIII), митохондриальные (УА, VB), секретируемые (VI) и поверхностные трансмембранные (IV, IX, XII, XIV) изоформы КАЧ [9,10]. Некоторые КАЧ играют ключевую роль в фундаментальных физиологических процессах, таких как гомеостаз, рН-регуляция, секреция электролитов, глюконеогенез, липогенез, резорбция костной ткани и других процессах [11,12]. Более того, их аномальная активность или профили экспрессии связаны с рядом заболеваний, таких как глаукома, отек, ожирение, невропатическая боль и рак [2,3]. Соответственно, многие изоформы КАЧ признаны ценными терапевтическими мишенями, и до сих пор продолжают появляться новые сообщения о связи КАЧ с различными патологиями [13,14].

КАЧ IX и XII являются связанными с мембраной изоформами КАЧ. Их строение характеризуется наличием внеклеточного каталитического домена, короткого трансмембранного домена и короткого внутриклеточного (цитозольного) «хвоста». Однако существенным отличием в строении активного сайта распространенных цитозольных КАЧ (например, КАЧ II) от трансмембранных КАЧ IX и XII является наличие у последних четырех разных

неконсервативных аминокислот в положении 67, 91, 131 и 135 [15,16]. Кроме того, дополнительный протеогликан-подобный домен (РО-подобный домен), присутствующий только у КАЧ IX на А-конце, выполняет важные функции, связанные с распространением и прогрессией опухоли (рис. 1.1) [17,18].

Б)

1-76

101-375 376-398 399-422

1-269 270-296 297-325

СО

тм ст

Рв Сй тм ст

Рисунок 1.1 - Структура КАЧ IX (А) и КАЧ XII (Б). СБ - каталитический домен, СТ - С-концевой домен, РО - протеогликан-подобный домен, ТМ -

трансмембранный домен [19]

Примечательно, что мембранные изоформы КАЧ IX и XII экспрессируются в раковых клетках и почти не экспрессируются в нормальных (исключение составляют клетки эпителия желудка и желчного пузыря), поэтому являются связанными с опухолью ферментами. Повышенная экспрессия КАЧ IX и XII в опухолях объясняется тем, что эти ферменты функционально активны в областях, характеризующихся гипоксией и ацидозом, где они оказывают значительное

влияние на регуляцию внутриклеточного рН (р№) и внеклеточного рН (рНе) [7,8,20].

1.1.2 Связь КАЧ IX и XII с гипоксией и ацидозом

Рак - это многогранное и трудноизлечимое заболевание, которое представляет собой смертельную угрозу для человека. Основной особенностью солидных опухолей является их гетерогенность, благодаря которой это заболевание сложно поддается лечению. Условия микроокружения опухоли являются ключевыми факторами гетерогенности. Наличие гипоксических зон и/или областей ацидоза, а также недостаточная васкуляризация опухоли приводит к изменению метаболизма в сторону гликолиза [21-24]. Онкогенный метаболизм опухолевых клеток, формируемый гликолизом, генерирует избыток кислых конечных продуктов метаболизма, включая лактат и протоны. Поэтому в условиях гипоксии и ацидоза раковые клетки адаптируются для выживания, активируя фактор, индуцируемый гипоксией (НГР) (рис. 1.2) [25].

О О

Стабилизация

у

ее ^

и а: о С 2

конститутивная (^бъединица

Активация

транскрипционного

фактора

СШТ1/3 гликолиз)

\ZEGF (ангиогсксз) СА1Х (рН регуляция) и другие...

I

Рисунок 1.2 - Механизм индуцированной гипоксией экспрессии генов, опосредованной фактором транскрипции Н1Р [26]

В условиях гипоксии Н1Р (1 и 2) действуют через а-субъединицы, которые стабилизируются и активируются (рис. 1.2). После димеризации с в-субъединицей, факторы транскрипции НГР связываются с другими коактиваторами транскрипции и активируют или индуцируют их транскрипцию, что приводит к экспрессии

различных белков, участвующих в ангиогенезе, анаэробном гликолизе, миграции и регуляции рН. Такой сигнальный путь увеличивает экспрессию в том числе и КАЧ IX. Далее КАЧ IX принимает участие в нейтрализации избытка кислых конечных продуктов гликолитического метаболизма в цитозольном пространстве для предотвращения формирования внутриклеточного ацидоза [27].

со, / СО, сог

Гликолиз

Митохондрия

Рисунок 1.3 - Схематическая модель роли КАЧ IX в регуляции рН в гипоксических раковых клетках [28]

КАЧ IX согласованно действует с котранспортерами бикарбоната натрия (Na bicarbonate co-transporters, NBC), а также монокарбоксилатными транспортерами (monocarboxylate transporters, MCT) для выведения кислых продуктов из внутриклеточного пространства с целью обеспечения выживания клеток. В метаболоме бикарбонатного транспорта, т.е. комплексе ферментов, катализирующих последовательные биохимические реакции этого транспорта, (рис. 1.3 справа) КАЧ IX действует через внеклеточный ферментный домен,

который катализирует преобразование внеклеточного CO2 в протоны и HCO3-. HCO3- захватываются соседними NBC и транспортируются через плазматическую мембрану в цитоплазму. Внутри клетки HCO3- вступают в реакцию с внутриклеточными протонами, образующимися в результате различных метаболических процессов. Эта реакция (возможно, катализируемая цитоплазматической изоформой КАЧ II) приводит к генерации CO2, который покидает клетку путем диффузии. Нейтрализация внутриклеточных протонов импортируемыми бикарбонат-ионами способствует повышению pHi до значений, благоприятных для метаболических процессов, передачи сигналов и пролиферации клеток (pHi = 7,2). С другой стороны, внеклеточные протоны, образующиеся в результате той же реакции, катализируемой КАЧ IX, остаются вне клетки и способствуют закислению внеклеточной среды (pHe = 6,8) [1,29].

Хотя каталитическая активность КАЧ IX является ключевой для этих процессов, PG-подобный домен также может действовать посредством некаталитического механизма, в котором он служит некой антенной, усиливающей экспорт протонов, связанных с облегченным экспортом лактат-ионов через монокарбоксилатные транспортеры, которые работают по градиенту концентрации (рис. 1.3 слева) [28].

Соответственно, каталитическая активность КАЧ IX вызывает ацидоз, который возникает в микроокружении опухоли, поскольку кислотные продукты метаболизма не могут эффективно выводиться слаборазвитой сосудистой сетью опухоли [30]. Опухолевые клетки с активированным механизмом регулирования pH могут противостоять токсическому воздействию внеклеточного ацидоза, вызванного онкогенным метаболизмом, и даже извлекать пользу, модифицируясь в более агрессивные фенотипы опухоли. Следовательно, они обладают избирательным преимуществом против окружающих нормальных клеток, которые не могут адаптироваться к ацидозу [31]. Также низкий pH микроокружения опухоли подавляет экспрессию E-кадгерина и/или вызывает его расщепление, способствуя пролиферации раковых клеток [32]. Более того, в результате ацидоза, вызванного каталитической активностью КАЧ IX, межклеточные взаимодействия

становятся слабее, что способствует высвобождению кластеров раковых клеток в кровоток из первичной опухолевой массы. В кровеносной системе кластеры клеток выживают в неадгезивных условиях, а затем метастазируют на других тканях и органах [33,34]. Поэтому, возникающий ацидоз является важнейшей характеристикой микроокружения опухоли, который вносит значительный вклад в формирование различных негативных эффектов:

• уменьшение действия лекарственных препаратов на опухолевые клетки из-за протонирования препаратов [35];

• формирование агрессивных фенотипов и устойчивости раковых клеток к химио- и радиотерапии [22];

• усиление инвазии и метастатических процессов за счет нарушения клеточной адгезии посредством Е-кадгерина [32];

• индуцирование ангиогенеза посредством активации образующегося фактора роста эндотелия сосудов VEGF в результате экспрессии генов, опосредованной фактором транскрипции НШ [36].

В этом контексте были определены многочисленные роли КАЧ IX в различных этапах развития рака (рис. 1.4) [28].

Экспрессия КАЧ IX индуцируется локальной гипоксией и через регуляцию рН участвует в адаптации к метаболизму, генерирующему избыток кислых продуктов. Это обеспечивает выживание и пролиферацию раковых клеток (рис. 1^). В растущей опухоли КАЧ IX дополнительно защищает раковые клетки от гипоксии и внутриклеточного закисления. Более того, усиливая внеклеточный ацидоз, КАЧ IX активирует протеазы, способные расщеплять белки внеклеточного матрикса, способствует ангиогенезу, эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) и инвазии (рис. 1.4б, в).

Рисунок 1.4 - Участие КАЧ IX в различных этапах развития рака [28]

КАЧ IX опосредует адгезию раковых клеток к сосудам и с помощью внеклеточного ацидоза обеспечивает миграцию в просвет межу нормальными клетками. Далее КАЧ IX способствует метастазированию кластеров раковых клеток (рис. 1.4г, д). Также КАЧ IX способствует образованию адгезии и распространению опухолевых клеток, а начальный рост метастаза происходит за счет регуляции рН, которую опосредует КАЧ IX (рис. 1.4е). Прогрессирование метастаза протекает в условиях, схожих с теми, что характерны для первичной опухоли, где КАЧ IX защищает клетки от гипоксии и ацидоза (рис. 1.4ж) [28].

Роль КАЧ XII в онкогенезе менее изучена, однако этот фермент - так же, как и КАЧ IX - рассматривается как мишень для агентов противораковой терапии. Избыточная экспрессия КАЧ XII при различных типах рака объясняется тем же

механизмом, что и экспрессия КАЧ IX: вследствие плохой васкуляризации происходит смена метаболического пути на гликолитический. Дальнейший каскад реакций также приводит к изменению рНе микроокружения, вызывая ацидоз, тем самым способствуя инвазии и миграции опухолевых клеток [37].

Ввиду того, что изоформы КАЧ IX и XII принимают участие практически во всех стадиях онкогенеза, эти ферменты считаются достаточно валидированной мишенью для терапии некоторых видов опухолей, а разработка новых ингибиторов КАЧ IX и XII представляется актуальной задачей.

1.2 Применение ингибиторов КАЧ IX и XII в качестве индивидуальных

противораковых агентов

1.2.1 Ингибиторы КАЧ IX и XII как потенциальные противораковые

средства

Из-за специфической повышенной экспрессии КАЧ К^П в солидных опухолях, эти ферменты уже на протяжении 40 лет рассматриваются как мишени терапевтических агентов для лечения рака [38]. За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в разработке противораковых средств на основе направленных ингибиторов КАЧ IX и/или XII [1,39].

К настоящему моменту проведено множество исследований, и открыто огромное число ингибиторов КАЧ IX/XII. Самым распространенным хемотипом среди ингибиторов КАЧ являются первичные сульфонамиды [19]. Существует большое количество ингибиторов КАЧ К^П с бензолсульфонамидным фрагментом. Например, в 2018 году Eldehna и соавторы описали серию бензолсульфонамидов, связанных с привилегированным изатиновым скаффолдом 1.1 (рис. 1.5).

nh2

<' X J

9 о

R 1.2 0 1.3

Рисунок 1.5 - Структуры бензолсульфонамид-содержащих ингибиторов 1.1, 1.2,

1.3

Так, соединение 1.1 (R1 = H, R2 = Бг) продемонстрировало привлекательный профиль в отношении целевых изоформ КАЧ IX и XII (Ki = 9.9 и 7.1 нМ соответственно), а антипролиферативная активность в отношении клеточной линии рака молочной железы MCF-7 оказалась достаточно выраженной (IC50 = 56.1 мкМ) [40].

Другое семейство ингибиторов КАЧ IX и XII на основе бензолсульфонамида содержит [1,2,3]триазоло[4,5-&]пиридиновый фрагмент (структура 1.2, рис. 1.5). Значения Ki (КАЧ IX) для соединений с общей структурой 1.2 находятся в наномолярном диапазоне. Выбранные на основе ингибиторного профиля [1,2,3]триазоло[4,5-&]пиридиновые бензолсульфонамиды 1.2 показали некоторую антипролиферативную активность in vitro на панели из 57 линий опухолевых клеток человека [41].

В серии бензолсульфонамидов, включающих азотистые основания, также были обнаружены эффективные ингибиторы КАЧ IX и XII. Например, опубликованы соединения с пуриновыми/пиримидиновыми остатками (такие, как 1.3), некоторые из которых демонстрируют преимущественное ингибирование связанной с опухолью изоформы КАЧ IX (Ki = 29.9 нМ). Исследование in vitro цитотоксической активности против клеточной линии рака толстой кишки HT-29 подтвердило наличие антипролиферативных свойств для нескольких производных, в том числе и для соединения 1.3 [42].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шаронова Татьяна Валерьевна, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Neri D., Supuran C.T. Interfering with pH regulation in tumours as a therapeutic strategy // Nature Reviews Drug Discovery. Nature Publishing Group. - 2011. -Vol. 10. - № 10. - P. 767-777.

2. Zamanova S. et al. Carbonic anhydrases as disease markers // Expert Opin. Ther. Pat. - 2019. - Vol. 29. - № 7. - P. 509-533.

3. Supuran C.T. Carbonic anhydrases as drug targets--an overview // Curr. Top. Med. Chem. United Arab Emirates. - 2007. - Vol. 7. - № 9. - P. 825-833.

4. Saarnio J. et al. Immunohistochemistry of carbonic anhydrase isozyme IX (MN/CA IX) in human gut reveals polarized expression in the epithelial cells with the highest proliferative capacity // J. Histochem. Cytochem. United States. - 1998. - Vol. 46.

- № 4. - P. 497-504.

5. Riemann A. et al. Inhibition of Carbonic Anhydrase IX by Ureidosulfonamide Inhibitor U104 Reduces Prostate Cancer Cell Growth, But Does Not Modulate Daunorubicin or Cisplatin Cytotoxicity // Oncol. Res. - 2018. - Vol. 26. - № 2. -P. 191-200.

6. McDonald P.C. et al. A Phase 1 Study of SLC-0111, a Novel Inhibitor of Carbonic Anhydrase IX, in Patients With Advanced Solid Tumors // Am. J. Clin. Oncol. -2020. - Vol. 43. - № 7. - P. 484-490.

7. Martin Benej, Silvia Pastorekova and J.P. Carbonic Anhydrase IX: Regulation and Role in Cancer // Carbonic Anhydrase: Mechanism, Regulation, Links to Disease, and Industrial Applications. - 2013. - Vol. 11. - P. 199-219.

8. Swietach P. et al. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular pH in three-dimensional tumor cell growths // J. Biol. Chem. - 2009.

- Vol. 284. - № 30. - P. 20299-20310.

9. Gilmour K.M. Perspectives on carbonic anhydrase // Comp. Biochem. Physiol. Part A Mol. Integr. Physiol. - 2010. - Vol. 157. - № 3. - P. 193-197.

10. McDevitt M.E., Lambert L.A. Molecular evolution and selection pressure in alpha-class carbonic anhydrase family members // Biochim. Biophys. Acta - Proteins

Proteomics. - 2011. - Vol. 1814. - № 12. - P. 1854-1861.

11. Frost S.C. Physiological functions of the alpha class of carbonic anhydrases. // Subcell. Biochem. United States. - 2014. - Vol. 75. - P. 9-30.

12. McKenna R., Frost S.C. Overview of the carbonic anhydrase family. // Sub-cellular biochemistry. United States. - 2014. - Vol. 75. - P. 3-5.

13. Ismail I.S. The Role of Carbonic Anhydrase in Hepatic Glucose Production. // Curr. Diabetes Rev. United Arab Emirates. - 2018. - Vol. 14. - № 2. - P. 108-112.

14. Blandina P. et al. Carbonic anhydrase modulation of emotional memory. Implications for the treatment of cognitive disorders. // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. - 2020. - Vol. 35. - № 1. - P. 1206-1214.

15. Lomelino C.L., Andring J.T., McKenna R. Crystallography and Its Impact on Carbonic Anhydrase Research // Int. J. Med. Chem. - 2018. - Vol. 2018. - P. 1-21.

16. Alterio V. et al. Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases: How to design specific drugs targeting 15 different isoforms? // Chem. Rev. - 2012. -Vol. 112. - № 8. - P. 4421-4468.

17. Alterio V. et al. Crystal structure of the catalytic domain of the tumor-associated human carbonic anhydrase IX // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2009. - Vol. 106. - № 38. - P. 16233-16238.

18. Whittington D.A. et al. Crystal structure of the dimeric extracellular domain of human carbonic anhydrase XII, a bitopic membrane protein overexpressed in certain cancer tumor cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2001. - Vol. 98. - № 17. - P. 9545-9550.

19. Ilies M.A., Winum J.Y. Carbonic anhydrase inhibitors for the treatment of tumors: Therapeutic, immunologic, and diagnostic tools targeting isoforms IX and XII // Carbonic Anhydrases: Biochemistry and Pharmacology of an Evergreen Pharmaceutical Target. Elsevier Inc. - 2019. - Vol. 2. - 331-365 p.

20. Chiche J. et al. Hypoxia-inducible carbonic anhydrase IX and XII promote tumor cell growth by counteracting acidosis through the regulation of the intracellular pH // Cancer Res. - 2009. - Vol. 69. - № 1. - P. 358-368.

21. Terry S. et al. Role of hypoxic stress in regulating tumor immunogenicity, resistance

and plasticity // Int. J. Mol. Sci. - 2018. - Vol. 19. - № 10. - P. 3044-3063.

22. Kim I.S., Zhang X.H.F. One microenvironment does not fit all: heterogeneity beyond cancer cells // Cancer Metastasis Rev. Cancer and Metastasis Reviews. 2016. - Vol. 35. - № 4. - P. 601-629.

23. Junttila M.R., De Sauvage F.J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response // Nature. - 2013. - Vol. 501. - № 7467. -P. 346-354.

24. Mumenthaler S.M. et al. The impact of microenvironmental heterogeneity on the evolution of drug resistance in cancer cells // Cancer Inform. - 2015. - Vol. 14. -P. 19-31.

25. Parks S.K., Chiche J., Pouyssegur J. pH control mechanisms of tumor survival and growth // J. Cell. Physiol. United States. - 2011. - Vol. 226. - № 2. - P. 299-308.

26. Supuran C.T. Carbonic anhydrases: Novel therapeutic applications for inhibitors and activators // Nat. Rev. Drug Discov. - 2008. - Vol. 7. - № 2. - P. 168-181.

27. Ratcliffe P.J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: The implications of physiology for cancer // J. Physiol. - 2013. - Vol. 591. - № 8. - P. 2027-2042.

28. Pastorekova S., Gillies R.J. The role of carbonic anhydrase IX in cancer development: links to hypoxia, acidosis, and beyond // Cancer Metastasis Rev. Cancer and Metastasis Reviews. - 2019. - Vol. 38. - № 1-2. - P. 65-77.

29. Ames S., Pastorekova S., Becker H.M. The proteoglycan-like domain of carbonic anhydrase IX mediates non-catalytic facilitation of lactate transport in cancer cells // Oncotarget. - 2018. - Vol. 9. - № 46. - P. 27940-27957.

30. Raghunand N., Gatenby R.A., Gillies R.J. Microenvironmental and cellular consequences of altered blood flow in tumours // Br. J. Radiol. England. - 2003. -Vol. 76. - P. 11-22.

31. Gatenby R.A., Gillies R.J. A microenvironmental model of carcinogenesis // Nat. Rev. Cancer. England. - 2008. - Vol. 8. - № 1. - P. 56-61.

32. Riemann A. et al. Extracellular Acidosis Modulates the Expression of Epithelial-

Mesenchymal Transition (EMT) Markers and Adhesion of Epithelial and Tumor Cells // Neoplasia. - 2019. - Vol. 21. - № 5. - P. 450-458.

33. Avnet S. et al. Cancer-associated mesenchymal stroma fosters the stemness of osteosarcoma cells in response to intratumoral acidosis via NF-kB activation // Int. J. cancer. - 2017. - Vol. 140. - № 6. - P. 1331-1345.

34. Gkountela S. et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding // Cell. 2019. - Vol. 176. - № 1-2. - P. 98-112.

35. Raghunand N., Gillies R.J. pH and drug resistance in tumors // Drug Resist. Updat. Scotland. - 2000. - Vol. 3. - № 1. - P. 39-47.

36. Semenza G.L. Hypoxia-inducible factors: Mediators of cancer progression and targets for cancer therapy // Trends Pharmacol. Sci. Elsevier Ltd. - 2012. - Vol. 33. - № 4. - P. 207-214.

37. Tonissen K.F., Poulsen S.A. Carbonic anhydrase XII inhibition overcomes P-glycoprotein-mediated drug resistance: A potential new combination therapy in cancer // Cancer Drug Resist. - 2021. - Vol. 4. - № 2. - P. 343-355.

38. Supuran C.T. Advances in structure-based drug discovery of carbonic anhydrase inhibitors // Expert Opin. Drug Discov. Taylor & Francis. - 2017. - Vol. 12. - № 1. - P. 61-88.

39. Koch G. Medicinal Chemistry // Chimia (Aarau). - 2017. - Vol. 71. - № 10. - P. 643.

40. Eldehna W.M. et al. Tumor-associated carbonic anhydrase isoform IX and XII inhibitory properties of certain isatin-bearing sulfonamides endowed with in vitro antitumor activity towards colon cancer // Bioorg. Chem. Elsevier. - 2018. - Vol. 81. - P. 425-432.

41. El-Gazzar M.G. et al. Carbonic anhydrase inhibition with a series of novel benzenesulfonamide-triazole conjugates // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. Taylor & Francis. - 2018. - Vol. 33. - № 1. - P. 1565-1574.

42. Nocentini A. et al. Discovery of New Sulfonamide Carbonic Anhydrase IX Inhibitors Incorporating Nitrogenous Bases // ACS Med. Chem. Lett. - 2017. - Vol.

8. - № 12. - P. 1314-1319.

43. 43. Supuran C.T. et al. Inhibition of carbonic anhydrase IX targets primary tumors, metastases, and cancer stem cells: Three for the price of one // Med. Res. Rev. - 2018. - Vol. 38. - № 6. - P. 1799-1836.

44. Nocentini A., Supuran C.T. Carbonic anhydrase inhibitors as antitumor/antimetastatic agents: a patent review (2008-2018) // Expert Opin. Ther. Pat. England. - 2018. - Vol. 28. - № 10. - P. 729-740.

45. Supuran C.T. Carbonic anhydrase inhibitors as emerging agents for the treatment and imaging of hypoxic tumors // Expert Opin. Investig. Drugs. England. - 2018. -Vol. 27. - № 12. - P. 963-970.

46. Kurt B.Z. et al. Synthesis, biological activity and multiscale molecular modeling studies of bis-coumarins as selective carbonic anhydrase IX and XII inhibitors with effective cytotoxicity against hepatocellular carcinoma // Bioorg. Chem. Elsevier. - 2019. - Vol. 87. - P. 838-850.

47. Bonardi A. et al. Structural investigations on coumarins leading to chromeno[4,3-c]pyrazol-4-ones and pyrano[4,3-c]pyrazol-4-ones: New scaffolds for the design of the tumor-associated carbonic anhydrase isoforms IX and XII // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2018. - Vol. 146. - P. 47-59.

48. Angeli A. et al. Heterocoumarins Are Selective Carbonic Anhydrase IX and XII Inhibitors with Cytotoxic Effects against Cancer Cells Lines // ACS Med. Chem. Lett. - 2018. - Vol. 9. - № 9. - P. 947-951.

49. Cadoni R. et al. Exploring Heteroaryl-pyrazole Carboxylic Acids as Human Carbonic Anhydrase XII Inhibitors // ACS Med. Chem. Lett. - 2017. - Vol. 8. - №

9. - P. 941-946.

50. Nocentini A. et al. a-Diketocarboxylic Acids and Their Esters Act as Carbonic Anhydrase IX and XII Selective Inhibitors: rapid-communication // ACS Med. Chem. Lett. American Chemical Society. - 2019. - Vol. 10. - № 4. - P. 661-665.

51. Ivanova J. et al. X-ray crystallography-promoted drug design of carbonic anhydrase inhibitors // Chem. Commun. Royal Society of Chemistry. - 2015. - Vol. 51. - №

33. - P. 7108-7111.

52. Bua S. et al. "a Sweet Combination": Developing Saccharin and Acesulfame K Structures for Selectively Targeting the Tumor-Associated Carbonic Anhydrases IX and XII // J. Med. Chem. - 2020. - Vol. 63. - № 1. - P. 321-333.

53. D'Ascenzio M. et al. Design, synthesis and evaluation of N-substituted saccharin derivatives as selective inhibitors of tumor-associated carbonic anhydrase XII // Bioorganic Med. Chem. Elsevier Ltd. - 2014. - Vol. 22. - № 6. - P. 1821-1831.

54. Coviello V. et al. 1,2-Benzisothiazole Derivatives Bearing 4-, 5-, or 6-Alkyl/arylcarboxamide Moieties Inhibit Carbonic Anhydrase Isoform IX (CAIX) and Cell Proliferation under Hypoxic Conditions // J. Med. Chem. - 2016. - Vol. 59. - № 13. - P. 6547-6552.

55. Lou Y. et al. Targeting tumor hypoxia: suppression of breast tumor growth and metastasis by novel carbonic anhydrase IX inhibitors. // Cancer Res. United States.

- 2011. - Vol. 71. - № 9. - P. 3364-3376.

56. Pacchiano F. et al. Ureido-substituted benzenesulfonamides potently inhibit carbonic anhydrase IX and show antimetastatic activity in a model of breast cancer metastasis // J. Med. Chem. - 2011. - Vol. 54. - № 6. - P. 1896-1902.

57. Williams K.J., Gieling R.G. Preclinical evaluation of ureidosulfamate carbonic anhydrase IX/XII inhibitors in the treatment of cancers // Int. J. Mol. Sci. - 2019. -Vol. 20. - № 23. - P. 1-12.

58. Bernardino R.L. et al. Carbonic anhydrases are involved in mitochondrial biogenesis and control the production of lactate by human Sertoli cells // FEBS J. England. - 2019. - Vol. 286. - № 7. - P. 1393-1406.

59. Gieling R.G. et al. Antimetastatic effect of sulfamate carbonic anhydrase IX inhibitors in breast carcinoma xenografts // J. Med. Chem. - 2012. - Vol. 55. - № 11. - P. 5591-5600.

60. Bryant J.L. et al. Novel carbonic anhydrase IX-targeted therapy enhances the anti-tumour effects of cisplatin in small cell lung cancer // Int. J. cancer. United States.

- 2018. - Vol. 142. - № 1. - P. 191-201.

61. 61. Li Z. et al. Carbonic anhydrase 9 confers resistance to ferroptosis/apoptosis in malignant mesothelioma under hypoxia // Redox Biol. - 2019. - Vol. 26. - P. 101297.

62. Xu P. et al. Modulation of Tumor Microenvironment to Enhance Radiotherapy Efficacy in Esophageal Squamous Cell Carcinoma by Inhibiting Carbonic Anhydrase IX // Front. Oncol. - 2021. - Vol. 11. - P. 637252.

63. Cuffaro D., Nuti E., Rossello A. An overview of carbohydrate-based carbonic anhydrase inhibitors // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. Taylor & Francis. - 2020. -Vol. 35. - № 1. - P. 1906-1922.

64. Supuran C.T. Carbonic anhydrase inhibitors: an update on experimental agents for the treatment and imaging of hypoxic tumors // Expert Opin. Investig. Drugs. Taylor & Francis. - 2021. - Vol. 30. - № 12. - P. 1197-1208.

65. Andreucci E. et al. The carbonic anhydrase IX inhibitor SLC-0111 sensitises cancer cells to conventional chemotherapy // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. Taylor & Francis. - 2019. - Vol. 34. - № 1. - P. 117-123.

66. Boyd N.H. et al. Addition of carbonic anhydrase 9 inhibitor SLC-0111 to temozolomide treatment delays glioblastoma growth in vivo // JCI Insight. - 2017. - Vol. 2. - № 24. - P. 1-16.

67. Van Kuijk S.J.A. et al. The sulfamate small molecule CAIX inhibitor S4 modulates doxorubicin efficacy // PLoS One. - 2016. - Vol. 11. - № 8. - P. 1-14.

68. Winum J.Y. et al. Ureido-substituted sulfamates show potent carbonic anhydrase IX inhibitory and antiproliferative activities against breast cancer cell lines // Bioorganic Med. Chem. Lett. Elsevier Ltd. - 2012. - Vol. 22. - № 14. - P. 46814685.

69. Ward C. et al. Evaluation of carbonic anhydrase IX as a therapeutic target for inhibition of breast cancer invasion and metastasis using a series of in vitro breast cancer models // Oncotarget. - 2015. - Vol. 6. - № 28. - P. 24856-24870.

70. McDonald P.C. et al. Regulation of pH by Carbonic Anhydrase 9 Mediates Survival of Pancreatic Cancer Cells With Activated KRAS in Response to Hypoxia //

Gastroenterology. Elsevier, Inc. - 2019. - Vol. 157. - № 3. - P. 823-837.

71. Kleeff J. et al. Pancreatic cancer // Nat. Rev. Dis. Prim. Macmillan Publishers Limited. - 2016. - Vol. 2. - P. 1-23.

72. Lee K.E. et al. Hif1a deletion reveals pro-neoplastic function of B cells in pancreatic neoplasia // Cancer Discov. - 2016. - Vol. 6. - № 3. - P. 256-269.

73. Petrenko M. et al. Combined 3-O-acetylbetulin treatment and carbonic anhydrase IX inhibition results in additive effects on human breast cancer cells // Chem. Biol. Interact. - 2021. - Vol. 333. - P. 109326-109335.

74. Hedlund E.M.E. et al. Harnessing induced essentiality: Targeting carbonic anhydrase IX and angiogenesis reduces lung metastasis of triple negative breast cancer xenografts // Cancers (Basel). - 2019. - Vol. 11. - № 7. P. 1002-1020.

75. Mann B.S. et al. FDA Approval Summary: Vorinostat for Treatment of Advanced Primary Cutaneous T-Cell Lymphoma // Oncologist. - 2007. - Vol. 12. - № 10. -P.1247-1252.

76. Ruzzolini J. et al. A potentiated cooperation of carbonic anhydrase IX and histone deacetylase inhibitors against cancer // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. Taylor & Francis. - 2020. - Vol. 35. - № 1. - P. 391-397.

77. Chiche J., Brahimi-Horn M.C., Pouysségur J. Tumour hypoxia induces a metabolic shift causing acidosis: A common feature in cancer // J. Cell. Mol. Med. - 2010. -Vol. 14. - № 4. - P. 771-794.

78. Su J., Chen X., Kanekura T. A CD147-targeting siRNA inhibits the proliferation, invasiveness, and VEGF production of human malignant melanoma cells by down-regulating glycolysis // Cancer Lett. Elsevier Ireland Ltd. - 2009. - Vol. 273. - № 1. - P. 140-147.

79. Shimoda L.A. et al. HIF-1 regulates hypoxic induction of NHE1 expression and alkalinization of intracellular pH in pulmonary arterial myocytes // Am. J. Physiol. - Lung Cell. Mol. Physiol. - 2006. - Vol. 291. - № 5. - P. 941-949.

80. Bellot G. et al. Hypoxia-Induced Autophagy Is Mediated through Hypoxia-Inducible Factor Induction of BNIP3 and BNIP3L via Their BH3 Domains // Mol.

Cell. Biol. - 2009. - Vol. 29. - № 10. - P. 2570-2581.

81. Chen J.L.Y. et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers // PLoS Genet. -2008. - Vol. 4. - № 12. - P. 1000293-1000309.

82. Chafe S.C. et al. Genome-wide synthetic lethal screen unveils novel CAIX-NFS1/xCT axis as a targetable vulnerability in hypoxic solid tumors // Sci. Adv. -2021. - Vol. 7. - № 35. - P. 1-16.

83. Supuran C.T. Multitargeting approaches involving carbonic anhydrase inhibitors: hybrid drugs against a variety of disorders // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. - 2021. - Vol. 36. - № 1. - P. 1702-1714.

84. An R. et al. Discovery of novel artemisinin-sulfonamide hybrids as potential carbonic anhydrase IX inhibitors with improved antiproliferative activities // Bioorg. Chem. Elsevier Inc. - 2020. - Vol. 104. - P. 104347-104358.

85. Yu H. et al. Design, synthesis, cytotoxicity and mechanism of novel dihydroartemisinin-coumarin hybrids as potential anti-cancer agents // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2018. - Vol. 151. - P. 434-449.

86. Zhang B. et al. Design, synthesis and biological evaluation of sulfamoylphenyl-quinazoline derivatives as potential EGFR/CAIX dual inhibitors // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2021. - Vol. 216. - P. 113300-113317.

87. Elzahhar P.A. et al. Expanding the anticancer potential of 1,2,3-triazoles via simultaneously targeting Cyclooxygenase-2, 15-lipoxygenase and tumor-associated carbonic anhydrases // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS, 2020. Vol. 200. P. 112439.

88. Greene E.R. et al. Regulation of inflammation in cancer by eicosanoids // Prostaglandins Other Lipid Mediat. Elsevier Inc. - 2011. - Vol. 96. - № 1-4. - P. 27-36.

89. Teodori E. et al. Dual P-Glycoprotein and CA XII Inhibitors : A New Strategy to Reverse the P-gp Mediated Multidrug Resistance (MDR) in Cancer Cells // Molecules. - 2020. - Vol. 25. - P. 1748-1774.

90. Sharonova T. et al. Insertion of metal carbenes into the anilinic N-H bond of

unprotected aminobenzenesulfonamides delivers low nanomolar inhibitors of human carbonic anhydrase IX and XII isoforms // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2021. - Vol. 218. - P. 113352-113367.

91. Kalinin S. et al. From random to rational: A discovery approach to selective subnanomolar inhibitors of human carbonic anhydrase IV based on the Castagnoli-Cushman multicomponent reaction // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. -2019. - Vol. 182. - P. 111642-111660.

92. Zhukovsky D. et al. Synthetic Exploration of a-Diazo y-Butyrolactams // European J. Org. Chem. - 2019. - Vol. 2019. - № 13. - P. 2397-2400.

93. Dar'In D., Kantin G., Krasavin M. A "sulfonyl-azide-free" (SAFE) aqueous-phase diazo transfer reaction for parallel and diversity-oriented synthesis // Chem. Commun. - 2019. - Vol. 55. - № 36. - P. 5239-5242.

94. Dar'In D., Kantin G., Krasavin M. Practical Application of the Aqueous "Sulfonyl-Azide-Free" (SAFE) Diazo Transfer Protocol to Less a-C-H Acidic Ketones and Esters // Synth. - 2019. - Vol. 51. - № 22. - P. 4284-4290.

95. Chuprun S. et al. a-Diazoacetamides in Sc(OTf) 3 -Catalyzed Tiffeneau-Demjanov Ring Expansion: Application towards the Synthesis of Rare Bicyclic Pyrazoles // Synlett. - 2020. - Vol. 31. - № 4. - P. 373-377.

96. Zhukovsky D., Dar'in D., Krasavin M. Rh2(esp)2-Catalyzed Coupling of a-Diazo-Y-butyrolactams with Aromatic Amines // European J. Org. Chem. - 2019. - Vol. 2019. - № 27. - P. 4377-4383.

97. Tanaka J. et al. Photo-Induced ortho-C-H Borylation of Arenes through In Situ Generation of Rhodium(II) Ate Complexes // J. Am. Chem. Soc. American Chemical Society. - 2021. - Vol. 143. - № 30. - P. 11325-11331.

98. Popik V. V. The role of molecular geometry in the wolff rearrangement of a-diazocarbonyl compounds : Conformational control or structural constraints? // Can. J. Chem. - 2005. - Vol. 83. - № 9. - P. 1382-1390.

99. Sudrik S.G. et al. Microwave specific Wolff rearrangement of alpha-diazoketones and its relevance to the nonthermal and thermal effect // J. Org. Chem. United

States. - 2002. - Vol. 67. - № 5. - P. 1574-1579.

100. Khalifah R.G. The carbon dioxide hydration activity of carbonic anhydrase. I. Stop-flow kinetic studies on the native human isoenzymes B and C. // J. Biol. Chem. United States. - 1971. - Vol. 246. - № 8. - P. 2561-2573.

101. Krasavin M. et al. Heterocyclic periphery in the design of carbonic anhydrase inhibitors: 1,2,4-Oxadiazol-5-yl benzenesulfonamides as potent and selective inhibitors of cytosolic hCA II and membrane-bound hCA IX isoforms // Bioorg. Chem. - 2018. - Vol. 76. - P. 88-97.

102. Krasavin M. et al. Continued exploration of 1,2,4-oxadiazole periphery for carbonic anhydrase-targeting primary arene sulfonamides: Discovery of subnanomolar inhibitors of membrane-bound hCA IX isoform that selectively kill cancer cells in hypoxic environment // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2019. - Vol. 164. - № 2019. - P. 92-105.

103. Krasavin M. et al. Inhibitory activity against carbonic anhydrase IX and XII as a candidate selection criterion in the development of new anticancer agents // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. Taylor & Francis. - 2020. - Vol. 35. - № 1. - P. 15551561.

104. Grandane A. et al. 6-substituted sulfocoumarins are selective carbonic anhdydrase IX and XII Inhibitors with significant cytotoxicity against colorectal cancer cells // J. Med. Chem. - 2015. - Vol. 58. - № 9. - P. 3975-3983.

105. Abdelrasheed H., Fahim S.H., Abo-ashour M.F. European Journal of Medicinal Chemistry Application of hydrazino and hydrazido linkers to connect benzenesulfonamides with hydrophilic / phobic tails for targeting the middle region of human carbonic anhydrases active site: Selective inhibitors of hCA IX // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2019. - Vol. 179. - P. 547-556.

106. Bozdag M. et al. Carbonic anhydrase inhibitors based on sorafenib scaffold: Design, synthesis, crystallographic investigation and effects on primary breast cancer cells // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2019. - Vol. 182. - P. 111600.

107. Eldehna W.M. et al. Enhancement of the tail hydrophobic interactions within the

carbonic anhydrase IX active site via structural extension: Synthesis of novel N-substituted isatins- SLC-0111 hybrids as carbonic anhydrase inhibitors and antitumor agents // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2018. - Vol. 162. - № 15. - P. 147-160.

108. Tanini D. et al. Synthesis of novel tellurides bearing benzensulfonamide moiety as carbonic anhydrase inhibitors with antitumor activity // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2019. - Vol. 181. - № 1. -P. 111586-111616.

109. Krasavin M. et al. Pyridazinone-substituted benzenesulfonamides display potent inhibition of membrane-bound human carbonic anhydrase IX and promising antiproliferative activity against cancer cell lines // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2019. - Vol. 168. - P. 301-314.

110. Abo-Ashour M.F. et al. 3-Hydrazinoisatin-based benzenesulfonamides as novel carbonic anhydrase inhibitors endowed with anticancer activity: Synthesis, in vitro biological evaluation and in silico insights // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2019. - Vol. 184. - № 15. - P. 111768-111800.

111. Said M.A. et al. Sulfonamide-based ring-fused analogues for CAN508 as novel carbonic anhydrase inhibitors endowed with antitumor activity: Design, synthesis, and in vitro biological evaluation // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. -2020. - Vol. 189. - P. 112019-112056.

112. Khalil O.M. et al. Pyrrolo and pyrrolopyrimidine sulfonamides act as cytotoxic agents in hypoxia via inhibition of transmembrane carbonic anhydrases // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2020. - Vol. 188. - P. 112021-112062.

113. Akocak S. et al. PEGylated Bis-Sulfonamide Carbonic Anhydrase Inhibitors Can Efficiently Control the Growth of Several Carbonic Anhydrase IX-Expressing Carcinomas // J. Med. Chem. - 2016. - Vol. 59. - № 10. - P. 5077-5088.

114. Angeli A. et al. Discovery of New Selenoureido Analogues of 4-(4-Fluorophenylureido)benzenesulfonamide as Carbonic Anhydrase Inhibitors // ACS Med. Chem. Lett. - 2017. - Vol. 8. - № 9. - P. 963-968.

115. Kazokaitè J. et al. Novel fluorinated carbonic anhydrase IX inhibitors reduce

hypoxia-induced acidification and clonogenic survival of cancer cells // Oncotarget. - 2018. - Vol. 9. - № 42. - P. 26800-26816.

116. Angeli A. et al. Discovery of new 2, 5-disubstituted 1,3-selenazoles as selective human carbonic anhydrase IX inhibitors with potent anti-tumor activity // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2018. - Vol. 157. - P. 1214-1222.

117. Queen A. et al. Biological evaluation of p-toluene sulphonylhydrazone as carbonic anhydrase IX inhibitors: An approach to fight hypoxia-induced tumors // Int. J. Biol. Macromol. Elsevier B.V. - 2018. - Vol. 106. - P. 840-850.

118. Nocentini A. et al. 4-Hydroxy-3-nitro-5-ureido-benzenesulfonamides Selectively Target the Tumor-Associated Carbonic Anhydrase Isoforms IX and XII Showing Hypoxia-Enhanced Antiproliferative Profiles: research-article // J. Med. Chem. American Chemical Society. - 2018. - Vol. 61. - № 23. - P. 10860-10874.

119. Slawinski J. et al. Carbonic anhydrase inhibitors. Synthesis of heterocyclic 4-substituted pyridine-3-sulfonamide derivatives and their inhibition of the human cytosolic isozymes i and II and transmembrane tumor-associated isozymes IX and XII // Eur. J. Med. Chem. - 2013. - Vol. 69. - P. 701-710.

120. Koyuncu I. et al. Selective inhibition of carbonic anhydrase-IX by sulphonamide derivatives induces pH and reactive oxygen species-mediated apoptosis in cervical cancer HeLa cells // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. Taylor & Francis. - 2018. - Vol. 33. - № 1. - P. 1137-1149.

121. Gul H.I. et al. New anticancer drug candidates sulfonamides as selective hCA IX or hCA XII inhibitors // Bioorg. Chem. Elsevier Inc. - 2018. - Vol. 77. - P. 411-419.

122. Yamali C. et al. Synthesis, biological evaluation and in silico modelling studies of 1,3,5-trisubstituted pyrazoles carrying benzenesulfonamide as potential anticancer agents and selective cancer-associated hCA IX isoenzyme inhibitors // Bioorg. Chem. Elsevier. - 2019. - Vol. 92. - P. 103222-103235.

123. Shamsi F. et al. Synthesis and SAR studies of novel 1,2,4-oxadiazole-sulfonamide based compounds as potential anticancer agents for colorectal cancer therapy // Bioorg. Chem. Elsevier Inc. - 2020. - Vol. 98. - P. 103754-103820.

124. Zolnowska B. et al. Carbonic anhydrase inhibitors. Synthesis, and molecular structure of novel series N-substituted N'-(2-arylmethylthio-4-chloro-5-methylbenzenesulfonyl)guanidines and their inhibition of human cytosolic isozymes i and II and the transmembrane tumor-associa // Eur. J. Med. Chem. -2014. - Vol. 71. - P. 135-147.

125. Ibrahim H.S. et al. Dual-tail arylsulfone-based benzenesulfonamides differently match the hydrophobic and hydrophilic halves of human carbonic anhydrases active sites: Selective inhibitors for the tumor-associated hCA IX isoform // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2018. - Vol. 152. - P. 1-9.

126. Peerzada M.N. et al. Synthesis, characterization and biological evaluation of tertiary sulfonamide derivatives of pyridyl-indole based heteroaryl chalcone as potential carbonic anhydrase IX inhibitors and anticancer agents // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2018. - Vol. 155. - P. 13-23.

127. Koyuncu I. et al. Assessment of the antiproliferative and apoptotic roles of sulfonamide carbonic anhydrase IX inhibitors in HeLa cancer cell line // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. Taylor & Francis. - 2019. - Vol. 34. - № 1. - P. 75-86.

128. Vanchanagiri K. et al. Synthesis and biological investigation of new carbonic anhydrase IX (CAIX) inhibitors // Chem. Biol. Interact. Elsevier. - 2018. - Vol. 284. - P. 12-23.

129. Ghorab M.M. et al. Carbonic anhydrase inhibitors: Synthesis, molecular docking, cytotoxic and inhibition of the human carbonic anhydrase isoforms I, II, IX, XII with novel benzenesulfonamides incorporating pyrrole, pyrrolopyrimidine and fused pyrrolopyrimidine moieties // Bioorganic Med. Chem. Elsevier Ltd. - 2014.

- Vol. 22. - № 14. - P. 3684-3695.

130. Mojzych M. et al. Pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazine sulfonamides as carbonic anhydrase inhibitors with antitumor activity // Bioorganic Med. Chem. Elsevier Ltd.

- 2014. - Vol. 22. - № 9. - P. 2643-2647.

131. Wang Z.C. et al. Novel metronidazole-sulfonamide derivatives as potent and selective carbonic anhydrase inhibitors: Design, synthesis and biology analysis //

RSC Adv. Royal Society of Chemistry. - 2014. - Vol. 4. - № 62. - P. 3302933038.

132. Yilmaz Ö. et al. Synthesis of pro-apoptotic indapamide derivatives as anticancer agents // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. - 2015. - Vol. 30. - № 6. - P. 967-980.

133. Mojzych M. et al. New pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazine sulfonamides as carbonic anhydrase inhibitors // Bioorganic Med. Chem. Elsevier Ltd. - 2015. - Vol. 23. -№ 13. - P. 3674-3680.

134. Angeli A. et al. Synthesis of 4-(thiazol-2-ylamino)-benzenesulfonamides with carbonic anhydrase I, II and IX inhibitory activity and cytotoxic effects against breast cancer cell lines // Bioorg. Med. Chem. - 2016. - Vol. 24. - № 13. - P. 30433051.

135. Eldehna W.M. et al. Novel 4/3-((4-oxo-5-(2-oxoindolin-3-ylidene)thiazolidin-2-ylidene)amino) benzenesulfonamides: Synthesis, carbonic anhydrase inhibitory activity, anticancer activity and molecular modelling studies // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2017. - Vol. 139. - P. 250-262.

136. Zengin Kurt B. et al. Synthesis of coumarin-sulfonamide derivatives and determination of their cytotoxicity, carbonic anhydrase inhibitory and molecular docking studies // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2019. - Vol. 183. -P. 111702-111739.

137. Eldehna W.M. et al. Bioorganic Chemistry Synthesis, biological evaluation and in silico studies with 4-benzylidene-2- phenyl-5(4H)-imidazolone-based benzenesulfonamides as novel selective carbonic anhydrase IX inhibitors endowed with anticancer activity // Bioorg. Chem. Elsevier. - 2019. - Vol. 90. - P. 103102-103112.

138. Koyuncu I. et al. Evaluation of the anticancer potential of a sulphonamide carbonic anhydrase IX inhibitor on cervical cancer cells // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. Taylor & Francis. - 2019. - Vol. 34. - № 1. - P. 703-711.

139. Petreni A. et al. Inclusion of a 5-fluorouracil moiety in nitrogenous bases derivatives as human carbonic anhydrase IX and XII inhibitors produced a targeted action

against MDA-MB-231 and T47D breast cancer cells // Eur. J. Med. Chem. Elsevier Masson SAS. - 2020. - Vol. 190. - P. 112112-112126.

140. Gleeson M.P. et al. Probing the links between in vitro potency, ADMET and physicochemical parameters // Nat. Rev. Drug Discov. - 2011. - Vol. 10. - № 3. -P. 197-208.

141. Supuran C.T. Carbonic anhydrase inhibitors and their potential in a range of therapeutic areas // Expert opinion on therapeutic patents. England. - 2018. - Vol. 28. - № 10. - P. 709-712.

142. Kalinin S. et al. Carbonic anhydrase IX inhibitors as candidates for combination therapy of solid tumors // International Journal of Molecular Sciences. - 2021. -Vol. 22. - № 24. - P. 13405-13438.

143. Krasavin M. et al. Combining carbonic anhydrase and thioredoxin reductase inhibitory motifs within a single molecule dramatically increases its cytotoxicity // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. Taylor & Francis. - 2020. - Vol. 35. - № 1. - P. 665-671.

144. Jovanovic M. et al. Novel electrophilic amides amenable by the Ugi reaction perturb thioredoxin system via thioredoxin reductase 1 (TrxR1) inhibition: Identification of DVD-445 as a new lead compound for anticancer therapy // Eur. J. Med. Chem. -2019. - Vol. 181. - P. 111580-111594.

145. Sowa T. et al. Hypoxia-inducible factor 1 promotes chemoresistance of lung cancer by inducing carbonic anhydrase IX expression // Cancer Med. - 2017. - Vol. 6. -№ 1. - P. 288-297.

146. Pao W., Chmielecki J. Rational, biologically based treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2010. - Vol. 10. - № 11. - P. 760774.

147. Korte F. et al. Acyl-lacton-Umlagerung, XX. Zur protonkatalysierten Umlagerung von a-Acyl-lactamen in alkoholischer Lösung // Chem. Ber. - 1962. - Vol. 95. - P. 2424-2437.

148. Skinnider M.A. et al. Genomes to natural products PRediction Informatics for

Secondary Metabolomes (PRISM) // Nucleic Acids Res. - 2015. - Vol. 43. - № 20. - P. 9645-9662.

149. Cheng Y., Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction // Biochem. Pharmacol. England. - 1973. - Vol. 22. - № 23. - P. 30993108.

Saint Petersburg State University

Manuscript copyright

Sharonova Tatiana Valerievna

On the prospects of using human carbonic anhydrase inhibitors in anticancer

therapy

Scientific specialty 1.4.16. Medicinal chemistry

Dissertation is submitted for the degree of candidate of chemical sciences

Translation from Russian

Supervisor: Doctor of Chemical Science, Professor of the Russian Academy of Sciences Krasavin M. Yu.

Saint Petersburg 2022

CONTENTS

LIST OF ABBREVIATIONS.......................................................................................129

INTRODUCTION.........................................................................................................131

CHAPTER 1. LITERATURE REVIEW......................................................................138

1.1 IX AND XII ISOFORMS OF HUMAN CARBONIC ANHYDRASE AND THEIR ROLE IN THE DEVELOPMENT OF CANCER.........................................................................................138

1.1.1 Structural features of IX and XII isoforms of human carbonic anhydrase.............................................................................................................138

1.1.2 Association of hCA IX and XII with hypoxia and acidosis.....................139

1.2 Use of hCA inhibitors IX and XII as individual anticancer agents......144

1.2.1 hCA inhibitors IX and XII as potential anticancer agents........................144

1.2.2 hCA inhibitors IX and XII in clinical and preclinical trials in oncology . 148

1.3 INHIBITORS OF HCA IX AS CANDIDATES FOR COMBINATION THERAPY IN SOLID TUMORS......................................................................................................................149

1.3.1 hCA IX inhibitors in combination with conventional cytostatic agents ... 150

1.3.2 Inhibitors of human hCA IX in combination with anticancer drugs........156

1.3.3 hCA inhibitors IX and XII in combination with agents affecting tumorigenesis.........................................................................................................157

1.4 DUAL DRUGS AIMED AT INHIBITING HCA IX AND XII AND OTHER TUMOR-RELATED TARGETS.....................................................................................................................159

CHAPTER 2. RESULTS AND DISCUSSION............................................................164

2.1 FINDING HCA inhibitors for use in anticancer therapy as individual agents .................................................................................................................................164

2.1.1 Synthesis of starting a-diazo-y-lactams.......................................................164

2.1.2 Synthesis of starting a-diazodicarbonyl compounds...................................165

2.1.3 Synthesis of starting a-diazomonocarbonyl compounds.............................166

2.1.4 The reaction of NH-insertion of diazo carbonyl compounds into aromatic aminosulfonamides................................................................................................168

2.1.5 Studying the inhibitory profile of products of carbenoid NH insertion and Wolff rearrangement.............................................................................................172

2.1.6 Investigation of anticancer activity of products of carbenoid NH- insertion and the Wolff rearrangement as individual agents................................................177

2.2 Inhibitory activity against hCA IX and XII as a criterion for the

SELECTION OF COMPOUNDS IN THE DEVELOPMENT OF NEW ANTI-CANCER AGENTS.... 180

2.3 Dual targeting aimed at inhibiting IX and XII isoforms of hCA as well as

OTHER TARGETS ASSOCIATED WITH TUMORIGENESIS..................................................187

2.3.1 Combination of pharmacophore fragments capable of inhibiting hCA IX and XII and thioredoxin reductase...............................................................................188

2.3.1.1 Investigation of anticancer properties of inhibitors of hCA IX and XII and TrxR as individual agents....................................................................188

2.3.1.2 Combined testing of hCA IX and XII inhibitors and thioredoxin reductase for anticancer activity........................................................................190

2.3.1.3 Synthesis of a hybrid molecule containing a sulfonamide fragment and a Michael acceptor fragment......................................................................192

2.3.1.4 Investigation of anticancer properties of the hybrid compound containing sulfonamide fragment and Michael acceptor fragment...................193

2.3.2 Investigation of anticancer properties of inhibitors of hCA IX and XII in combination with antitumor preparation gefitinib................................................194

2.3.2.1 Effect of combinations of hCA IX and XII inhibitors with gefitinib on cancer cell culture growth............................................................................194

2.3.2.2 Effects of hCA IX and XII inhibitors and gefitinib on cancer cell migration capacity.............................................................................................198

CHAPTER 3. EXPERIMENTAL PART......................................................................203

3.1 Organic synthesis............................................................................................203

3.2 Study of the biological activity of the obtained compounds.................220

CONCLUSIONS...........................................................................................................224

REFERENCES

225

LIST OF ABBREVIATIONS

hCA - human carbonic anhydrase

PG-like domain - proteoglycan-like domain

pHi - intracellular pH

pHe - extracellular pH

HIF - hypoxia-induced factor

NBC - sodium bicarbonate cotransporter

MCT - monocarboxylate conveyor

VEGF - vascular endothelial growth factor

EMT - epithelial-mesenchymal transition

Ki - inhibition constant

IC50 - half-maximum inhibition concentration

SCLC - small cell lung cancer

ESCC - esophageal squamous cell carcinoma

DOX - doxorubicin

CIS - cisplatin

KRAS - Ki-ras2 Kristen rat sarcoma

ОСТ - octyl disulfamate

3-АС - 3-О- acetylbetulin

TNBC - triple-negative breast cancer

SAHA - hydroxamic acid suberoylanilide

HDAC - histone deacetylase

RNA - ribonucleic acid

DNA - deoxyribonucleic acid

DGA - dihydroartemisinin

GEF - gefitinib

COX-2 - cyclooxygenase -2

15-LOX - 15-lipoxygenase

P-gp - Р-glycoprotein

DBU - diazabicycloundecene

SAFE - diazoperenos without sulfonazide

THF - tetrahydrofuran

NMR - nuclear magnetic resonance

Trx - thioredoxin

TrxR - thioredoxin reductase

TFA - trifluoroacetic acid

Hepes - 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonic acid PBS - phosphate buffer solution

INTRODUCTION

Relevance of the topic

Human carbonic anhydrases (hCA) are a family of zinc metalloenzymes that catalyze the reversible reaction of the hydration of carbon dioxide to bicarbonate ions and proton in living organisms [1]. This simple reaction regulates the underlying buffer system in both intracellular and extracellular space in various tissues and organs. Also, the activity of various hCA isoforms is associated with the development of a number of diseases, such as glaucoma, edema, obesity, neuropathic pain, and cancer [2]. In particular, IX and XII hCA isoforms have been recognized as anticancer therapeutic targets. These transmembrane proteins are largely expressed in solid hypoxic tumors, where they play a key role in the regulation of the microenvironment, thereby promoting the survival, proliferation, metastasis, and development of drug resistance of cancer cells [4]. Therefore, inhibition of hCA IX and XII may be a promising therapeutic approach in anticancer therapy.

Degree of development of the research topic

Despite the fact that a huge number of hCA inhibitors have been presented in the literature over the past decades, no anti-cancer agent developed on their basis has found clinical use. Many examples of effective hCA inhibitors show the desired cytotoxic effect only at high concentrations or none at all. So, of the many hCA inhibitors described to date, only one (SLC-0111) has reached clinical trials as a monotherapy in the treatment of cancer and later was repurposed as an antimetastatic agent used in combination with the antitumor drug - gemcitabine [5,6]. However, there are a fairly limited number of reports of combinations, including hCA inhibitors, in the literature. In addition, there are very few studies in the literature where a multitarget approach would be used, which implies simultaneous inhibition of hCA and other targets.

Goal and objectives of the study

The goal of the dissertation work is to assess the possibility of using human carbonic anhydrase inhibitors in anticancer therapy.

To achieve this goal, the following objectives were identified:

• Obtain, using new synthetic approaches, benzenesulfonamide-containing compounds with a diverse molecular periphery.

• Study the inhibitory effect of the obtained benzenesulfonamide-containing compounds on various isoforms of human carbonic anhydrase using biological test systems.

• Determine the antiproliferative effects of the resulting human carbonic anhydrase inhibitors and assess their potential in anticancer therapy.

The scientific novelty of the work

A number of novel primary benzenesulfonamides have been prepared and characterized using a novel synthetic approach based on the use of diazo compounds. The inhibitory profile of the obtained compounds with respect to various hCA isoforms was studied, and their anticancer activity was also determined. Critical analysis of the data was carried out to establish for the compounds described in the literature the correlation of their inhibitory properties with antiproliferative properties. For the first time, a compound containing in its structure pharmacophore elements responsible for inhibiting carbonic anhydrase, as well as the enzyme thioredoxin reductase, was studied for its anticancer effect. hCA inhibitors were tested in combination with the antitumor drug -gefitinib against cancer cell lines, and their joint effect on the migration of cancer cells was studied.

The theoretical and practical significance of the work

The possibility of using hCA inhibitors in vitro to suppress the growth of cancer cell culture - as such, as well as in combination with another antiproliferative agent - has been investigated. hCA inhibitors have been identified, which themselves have an antiproliferative effect, as well as such inhibitors that enhance the action of an anticancer agent with a different mechanism of action. Inhibition of hCA (in particular IX and XII isoforms) has not been shown to be the only determining criterion for the search for anticancer agents. hCA inhibitors have been found to be effective adjuvants for other anticancer agents in combination therapy.

Methods used

During the dissertation work, physicochemical methods were used to identify and analyze the purity of the obtained compounds, in particular, 1H and 13C NMR spectroscopy and mass spectrometry methods. For the separation and purification of the obtained compounds, high-performance reverse-phase liquid chromatography and preparative column chromatography were used. Kinetics of inhibition of recombinant hCA isoforms were measured by a stopped-flow method. Cell survival analysis in the presence of hCA inhibitors was performed using an MTT-test under hypoxic conditions at concentrations ranging from 0,001 ^M to 200 ^M. The study of cell migration activity was carried out by the electrical impedance method.

Degree of reliability and testing of scientific results

The reliability of the positions submitted for defense and the conclusions of the dissertation were confirmed by performing experiments under controlled, reproducible conditions, using the required number of repetitions, as well as using modern methods for establishing the structure of the obtained compounds. Based on the materials of the dissertation, 9 scientific publications, including 6 scientific articles in international peer-reviewed scientific publications indexed by databases (Web of Science, Scopus) and 3 conference abstracts, were published. The results of the work were presented at the following conferences: 5th Russian Conference on Medical Chemistry with International Participation «MedChem-Russia 2021» (Volgograd, May 16-19, 2022); International Conference on Natural and Humanities «Science SPbU-2020» (St. Petersburg, December 25, 2020); XXVII International Scientific Conference of Students, Graduate Students and Young Scientists «Lomonosov-2020» (Moscow, November 10-27, 2020).

Published Results:

10. Kalinin S., Malkova A., Sharonova T., Sharoyko V., Bunev A., Supuran C. T., Krasavin M. Carbonic anhydrase IX inhibitors as candidates for combination therapy of solid tumors // Int. J. Mol. Sci. - 2021. - vol. 22 (24). - p. 13405-13435.

11. Sharonova T., Paramonova P., Kalinin S., Bunev A., Gasanov R. E., Nocentini A., Sharoyko V., Tennikova T. B., Dar'in D., Supuran C. T., Krasavin M. Insertion of Metal

Carbenes Into the Anilinic N-H Bond of Unprotected Aminobenzenesulfonamides Delivers Low Nanomolar Inhibitors of Human Carbonic Anhydrase IX and XII isoforms // Eur. J. Med. Chem. - 2021. - vol. 218. - p. 113352-113367.

12. Krasavin M., Kalinin S., Sharonova T., Supuran C. T. Inhibitory activity against carbonic anhydrase IX and XII as a candidate selection criterion in the development of new anticancer agents // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. - 2020. - vol. 35 (1). - p. 15551561.

13. Krasavin M., Sharonova T., Sharoyko V., Zhukovsky D., Kalinin S., Zalubovskis R., Tennikova T., Supuran C. T. Combining carbonic anhydrase and thioredoxin reductase inhibitory motifs within a single molecule dramatically increases its cytotoxicity // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. - 2020. - vol. 35 (1). - p. 665-671.

14. Krasavin M., Shetnev A., Sharonova T., Baykov S., Kalinin S., Nocentini A., Sharoyko V., Poli G., Tuccinardi T., Presnukhina S., Tennikova T. B., Supuran C. T. Continued exploration of 1,2,4-oxadiazole periphery for carbonic anhydrase-targeting primary arene sulfonamides: discovery of subnanomolar inhibitors of membrane-bound hCA IX isoform that selectively kill cancer cells in hypoxic environment // Eur. J. Med. Chem. - 2019. - vol. 164 (164). - p. 92-105.

15. Krasavin M., Shetnev A., Sharonova T., Baykov S., Tuccinardi T., Kalinin S., Angeli A., Supuran C. T. Heterocyclic Periphery in the Design of Carbonic Anhydrase Inhibitors: 1,2,4-Oxadiazol-5-yl Benzenesulfonamides as Potent and Selective Inhibitors of Cytosolic hCA II and Membrane-Bound hCA IX Isoforms // Bioorg. Chem. - 2018. -vol. 76. - p. 88-97.

16. Sharonova T.V., Kalinin S.A., Bunev A.S., Krasavin M.Yu. Study of the inhibitory effect of gefitinib and inhibitors of IX and XII isoforms of human carbonic anhydrase in the anticancer region // 5th Russian Conference on Medical Chemistry with International Participation «MedChem-Russia 2021», Volgograd, Russia, May 16-19, 2022, p. 106.

17. Sharonova T.V. A novel approach to the development of anticancer drugs based on combining two pharmacophore fragments inhibiting carbonic anhydrase and

thioredoxin reductase in one molecule // International Conference on Natural and Humanities «Science SPbU-2020», St. Petersburg, Russia, December 25, 2020, p. 388390.

18. Sharonova T.V. Use of the reaction of N-H-insertion carbenes into aromatic aminosulfonamides for the treatment of cancer // International Scientific Conference of Students, Graduate Students and Young Scientists «Lomonosov-2020», Moscow, Russia, November 10-27, 2020, p. 967.

Provisions being defended:

• Synthesis of primary benzenesulfonamides with diverse molecular periphery using diazo chemistry approach;

• Inhibitory profile of the obtained primary benzenesulfonamides with respect to various hCA isoforms;

• Potential of the obtained primary benzenesulfonamides as individual anticancer agents;

• Results of critical analysis of data on the biological activity of previously described inhibitors of human carbonic anhydrase IX/XII performed in order to establish a possible correlation between the value of their inhibitory action and antiproliferative properties on cancer cells;

• Antiproliferative effect of human carbonic anhydrase inhibitors obtained in the present study in combination with antitumor preparation - gefitinib;

• Synthesis and investigation of antiproliferative action of a hybrid compound containing pharmacophore elements are responsible for inhibition of human carbonic anhydrase and thioredoxin reductase.

Compliance with scientific specialty passport

The dissertation corresponds to the certificate of specialty 1.4.16. Medicinal Chemistry - according to paragraphs 1. Search, structural design, and synthesis of leader compounds - potential physiologically active (drug) substances, based on: a) knowledge of the structural parameters of biological targets or features of pathogenesis; b) analysis and modification of structures of known active compounds; c) synthesis and biological

testing of a wide variety of chemical compounds. 5. Rational design of physiologically active compounds acting on two or more molecular targets (including double, double-acting, hybrid, multi-target drugs). 6. Biological and physiological (in vitro and in vivo) testing of engineered and synthesized compounds in order to study the characteristics of their interaction with molecular targets of the body.

Author's personal contribution

The author took part in setting the goal and objectives of the study together with the supervisor. She independently searched, analyzed, and summarized the scientific literature on the topic of the dissertation and also carried out a meta-analysis of data. The author performed all chemical experiments, isolation, purification, and preparation of compounds for physicochemical methods of analysis and biological studies. The author executed testing of the compounds against the pancreatic adenocarcinoma cell line PANC-1. The author independently interpreted the results obtained in partner laboratories. In addition, the author participated in the preparation of the work for publication, as well as for the presentation of data at conferences.

Scope and structure of the dissertation

The thesis consists of an Introduction, Literature Review, Results and Discussion, Experimental Part, Conclusions, and References. The materials of the dissertation are presented on 116 pages (English version) of typewritten text, and contain 49 drawings, 11 diagrams, 3 tables and 149 references.

Acknowledgments

The author sincerely thanks Stanislav Kalinin, PhD, Assistant of the Institute of Chemistry of St. Petersburg State University, for his ideas and assistance in the process of conducting the study. The author thanks Ms. Polina S. Paramonova for her assistance in the synthesis of compounds and the preparation of samples for biological tests. The author thanks Dr. Vladimir V. Sharoyko for his help in the study of the anticancer activity of the obtained compounds and Associate Professor Alexander S. Bunev (Togliatti State University) for conducting testing for the anticancer activity of the obtained compounds. The author thanks Professor Claudiu T. Supuran (University of Florence) for determining the inhibitory profile of the obtained compounds. The author thanks the researcher for the

duties of the head of the Laboratory of Biomedical Technologies and Tests with Experimental Production, Candidate of Biological Sciences Khotin M.G. and Senior Researcher, Candidate of Biological Sciences Tyuryaeva I.I. (Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences) for conducting the study of the migration activity of the obtained compounds. The author also grateful to the entire staff of the Department of Chemistry of Natural Compounds for a positive and friendly atmosphere and mental and intellectual support in difficult moments of research.

Dissertation work was carried out with the support of Russian Federal Property Fund grant № 19-33-90017 «Application of the reaction of N-H-introduction of carbenes into aromatic aminosulfamides to the search for selective inhibitors of the IX isoform of human carbonic anhydrase for the treatment of oncological diseases.»

The research was carried out using the equipment of resource centers of the Scientific Park of St. Petersburg State University: «Magnetic resonance research methods» and « Methods for analyzing the composition of matter.»

CHAPTER 1. LITERATURE REVIEW

1.1 IX and XII isoforms of human carbonic anhydrase and their role in the

development of cancer

1.1.1 Structural features of IX and XII isoforms of human carbonic anhydrase

Carbonic anhydrases are a family of zinc metalloenzymes that catalyze the reversible reaction of the hydration of carbon dioxide to bicarbonate ions and protons in living organisms [1]. This reaction regulates the main buffer system in both intracellular and extracellular space and is important for all biological processes requiring control of acid-alkali balance. There are 15 known hCA isoforms that are very similar in structure to the active site but differ significantly in tissue distribution, catalytic activity, and subcellular localization [7,8]. Thus, cytosolic (I, II, III, VII, VIII, X, XI, XIII), mitochondrial (VA, VB), secreted (VI), and surface transmembrane (IV, IX, XII, XIV) isoforms of hCA are described. [9,10]. Some hCAs play a key role in fundamental physiological processes such as homeostasis, pH regulation, electrolyte secretion, gluconeogenesis, lipogenesis, bone resorption, and other processes [11,12]. Moreover, their abnormal activity or expression profiles are associated with a number of diseases such as glaucoma, edema, obesity, neuropathic pain, and cancer [2,3]. Accordingly, many hCA isoforms are recognized as valuable therapeutic targets, and new reports of the association of hCA with various pathologies continue to emerge [13,14].

hCA IX and XII are membrane-bound isoforms of hCA. Their structure is characterized by the presence of an extracellular catalytic domain, a short transmembrane domain, and a short intracellular (cytosolic) "tail." However, a significant difference in the structure of the active site of common cytosolic hCA (for example, hCA II) from transmembrane hCA IX and XII is the presence of four different non-conserved amino acids at positions 67, 91, 131, and 135 in the latter [15,16]. In addition, an additional proteoglycan-like domain (PG-like domain) present only in hCA IX at the ^-terminus performs important functions related to tumor spread and progression (Figure 1.1) [17,18].

Figure 1.1 - Structure of hCA IX (A) and hCA XII (B). CD - catalytic domain, CT - C-terminal domain, PG - proteoglycan-like domain, TM - transmembrane domain [19]

It is noteworthy that the membrane isoforms of hCA IX and XII are expressed in cancer cells and are hardly expressed in normal ones (the exception is the cells of the epithelium of the stomach and gallbladder) therefore they are enzymes associated with the tumor. The increased expression of hCA IX and XII in tumors is explained by the fact that these enzymes are functionally active in areas characterized by hypoxia and acidosis, where they have a significant effect on the regulation of intracellular pH (pHi) and extracellular pH (pHe) [7,8,20].

1.1.2 Association of hCA IX and XII with hypoxia and acidosis

Cancer is a multifaceted and intractable disease that poses a deadly threat to humans. The main feature of solid tumors is their heterogeneity, due to which this disease is difficult to treat. Tumor microenvironment conditions are key factors of heterogeneity.

The presence of hypoxic zones and/or regions of acidosis, as well as insufficient vascularization of the tumor, leads to a change in metabolism towards glycolysis [21-24]. Oncogenic tumor cell metabolism formed by glycolysis generates excess acidic metabolic end products, including lactate and protons. Therefore, under conditions of hypoxia and acidosis, cancer cells adapt for survival by activating hypoxia-induced factor (HIF) (Figure 1.2) [25].

Figure 1.2 - Mechanism of hypoxia-induced gene expression mediated by HIF

transcription factor [26]

Under hypoxic conditions, HIF (1 and 2) act through a-subunits that stabilize and activate (Figure 1.2). After dimerization with the y0-subunit, HIF transcription factors bind to other transcriptional coactivators and activate or induce their transcription, resulting in the expression of various proteins involved in angiogenesis, anaerobic glycolysis, migration, and pH regulation. Such a signaling pathway increases the expression of including hCA IX. Further, hCA IX takes part in the neutralization of excess acidic end products of glycolytic metabolism in the cytosolic space to prevent the formation of intracellular acidosis [27].

Q.

<

GLUT13 (KKmbic glycolysis) VEGF (■r.Eio'srjsis) hCA IX (pH irgiilitwn)

Etc...

CO

Glycolysis 2 Mitochondria

Figure 1.3 - Schematic model of the role of hCA IX in pH regulation in hypoxic cancer

cells [28]

hCA IX works in concert with sodium bicarbonate cotransporters (NBC), as well as monocarboxylate transporters (MCT) to remove acidic products from the intracellular space in order to ensure cell survival. In the metabolome of bicarbonate transport, that is, the complex of enzymes that catalyze the sequential biochemical reactions of this transport (Figure 1.3 on the right), hCA IX acts through an extracellular enzyme domain that catalyzes the conversion of extracellular CO2 to protons and HCO3-. HCO3- is captured by neighboring NBC and transported through the plasma membrane to the cytoplasm. Inside the cells, HCO3- react with intracellular protons formed as a result of various metabolic processes. This reaction (possibly catalyzed by the cytoplasmic isoform hCA II) leads to the generation of CO2, which leaves the cell by diffusion. Neutralization of intracellular protons by imported bicarbonate ions contributes to increasing pHi to values favorable for metabolic processes, signaling, and cell

proliferation (pHi = 7.2). On the other hand, extracellular protons formed by the same reaction catalyzed by hCA IX remain outside the cell and contribute to the acidification of the extracellular medium (pHe = 6.8) [1,29].

Although the catalytic activity of hCA IX is key for these processes, the PG-like domain can also operate through a non-catalytic mechanism in which it serves as a kind of antenna that enhances the export of protons associated with the facilitated export of lactate ions through monocarboxylate conveyors that operate along a concentration gradient (Figure 1.3, left) [28].

Accordingly, the catalytic activity of hCA IX causes acidosis, which occurs in the tumor microenvironment since the acidic metabolic products cannot be effectively excreted by the underdeveloped tumor vasculature [30]. Tumor cells with an activated pH regulation mechanism can resist the toxic effects of extracellular acidosis caused by oncogenic metabolism and even benefit by modifying into more aggressive tumor phenotypes. Therefore, they have a selective advantage against surrounding normal cells that cannot adapt to acidosis [31]. Also, the low pH of the tumor microenvironment inhibits the expression of E-cadherin and/or causes its cleavage, promoting the proliferation of cancer cells [32]. Moreover, as a result of acidosis caused by the catalytic activity of hCA IX, intercellular interactions become weaker, which contributes to the release of clusters of cancer cells into the bloodstream from the primary tumor mass. In the circulatory system, clusters of cells survive in non-adhesive conditions and then metastasize on other tissues and organs [33,34]. Therefore, emerging acidosis is an essential characteristic of the tumor microenvironment, which makes a significant contribution to the formation of various negative effects:

• reduced effect of drugs on tumor cells due to protonation of drugs [35];

• formation of aggressive phenotypes and resistance of cancer cells to chemo- and radiotherapy [22];

• increased invasion and metastatic processes by disrupting cellular adhesion through E-cadherin [32];

• inducing angiogenesis by activating the resulting VEGF vascular endothelial growth factor as a result of gene expression mediated by the HIF transcription factor [36].

In this context, numerous roles of hCA IX in different stages of cancer development were identified (Figure 1.4) [28].

Expression of hCA IX is induced by local hypoxia and, through regulation, is pH involved in adapting to metabolism that generates excess acidic products. This ensures the survival and proliferation of cancer cells (Figure 1.4a). In a growing tumor, hCA IX additionally protects cancer cells from hypoxia and intracellular acidification. Moreover, by enhancing extracellular acidosis, hCA IX activates proteases capable of cleaving extracellular matrix proteins and promotes angiogenesis, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and invasion (Figure 1.4b,c).

Figure 1.4 - Involvement of hCA IX in different stages of cancer development [28]

hCA IX mediates the adhesion of cancer cells to vessels and, by extracellular acidosis, allows migration into the lumen between normal cells. Further, hCA IX promotes metastasis of cancer cell clusters (Figure 1.4d,e). Also, hCA IX promotes the formation of adhesion and spread of tumor cells, and the initial growth of metastasis occurs through the regulation of pH, which is mediated by hCA IX (Figure 1.4f). Progression of metastasis occurs in conditions similar to those characteristics of the primary tumor, where hCA IX protects cells from hypoxia and acidosis (Figure 1.4g) [28].

The role of hCA XII in tumorigenesis is less studied, but this enzyme - like hCA IX - is considered a target for anti-cancer therapy agents. Excessive expression of hCA XII in various types of cancer is explained by the same mechanism as the expression of hCA IX: due to poor vascularization, the metabolic pathway changes to glycolytic. A further cascade of reactions also leads to a change in the pHe of the microenvironment, causing acidosis, thereby promoting invasion and migration of tumor cells [37].

Due to the fact that the hCA IX and XII isoforms take part in almost all stages of tumorigenesis, these enzymes are considered a sufficiently validated target for the therapy of certain types of tumors and the development of new hCA IX and XII inhibitors seems to be an urgent task.

1.2 Use of hCA inhibitors IX and XII as individual anticancer agents 1.2.1 hCA inhibitors IX and XII as potential anticancer agents

Due to the increased expression of hCA IX/XII in solid tumors, these enzymes have been considered targets of therapeutic agents for the treatment of cancer for 40 years [38]. Over the past decade, significant progress has been made in the development of anticancer agents based on targeted hCA IX and/or XII inhibitors [1,39].

To date, many studies have been carried out, and a huge number of hCA IX/XII inhibitors have been discovered. The most common chemotype among hCA inhibitors is primary sulfonamides [19]. There are a large number of hCA IX/XII inhibitors with a

benzenesulfonamide moiety. For example, in 2018, Eldehna et al. described a series of benzenesulfonamides associated with privileged isatin scaffold 1.1 (Figure 1.5).

Figure 1.5 - Structures of benzenesulfonamide-containing inhibitors 1.1, 1.2, 1.3

Thus, compound 1.1 (R1 = H, R2 = Br) showed an attractive profile with respect to the target isoforms of hCA IX and XII (Ki = 9.9 and 7.1 nM, respectively), and antiproliferative activity with respect to the breast cancer cell line was MCF-7 sufficiently pronounced (IC50 = 56.1 ^M) [40].

Another family of benzenesulfonamide-based hCA IX and XII inhibitors contains [1,2,3]triazolo[4,5-6]pyridine moiety (structure 1.2, Figure 1.5). The Ki (hCA IX) values for compounds of common structure 1.2 are in the nanomolar range. Selected on the basis of the [1,2,3]triazolo[4,5-6] pyridine benzenesulfonamides 1.2 inhibitory profile showed some in vitro antiproliferative activity on a panel of 57 human tumor cell lines [41].

In a series of benzenesulfonamides, including nitrogenous bases, effective inhibitors of hCA IX and XII have also been found. For example, compounds with purine/pyrimidine residues (such as 1.3), have been published, some of which show preferential inhibition of the tumor-related isoform hCA IX (Ki = 29.9 nM). An in vitro study of cytotoxic activity against colon cancer cell line HT-29 confirmed the presence of antiproliferative properties for several derivatives, including compound 1.3 [42].

Other interesting chemotypes of hCA inhibitors other than sulfanilamides and their bioisosteres are coumarins, thiocoumarins, sulfocoumarins, as well as compounds containing zinc-binding groups other than primary sulfonamide, such as carboxylic acids, selenazole and others [43-45].

In addition to having promising hCA inhibition profiles, some of their derivatives also have a strong effect on suppressing primary tumor growth and metastasis formation

o

o

R 1.2

1.3

and reducing the number of cancer stem cells [19]. For example, B. Kurt et al. presented a series of nanomolar inhibitors of hCA IX and XII 1.4 containing two coumarin fragments (Figure 1.6). The antiproliferative properties of these compounds against the breast cancer cell line are MDA-MB-231 assessed as high (IC50 is 1 to 13 ^M) [46].

CCX OCX

1.6 1.7

Figure 1.6 - Structures of coumarin and heterocumarin inhibitors hCA 1.4, 1.5, 1.6 and

1.7

Bonardi and coauthors published novel chromeno[4,3-c]pyrazol-4-one 1.5 inhibitor structures (Figure 1.6). Most of the compounds of type 1.5 turned out to be potent inhibitors of hCA IX and XII, and only some derivatives showed a selective effect on hCA IX. Studies on the antiproliferative properties of inhibitors 1.5 (7- or 8-substituted) (Figure 1.6) on colon cancer cell lines HT-29 under hypoxic conditions showed that only one derivative of type 1.5 (R1 = 8-NHCOAr, R2 = H) suppresses cell growth by 60 % at a concentration of 100 ^M [47].

In 2018, Angeli and co-authors described a new series of different chalcogenkumarins having a promising low nanomolar inhibition profile against tumor-related isoforms hCA IX and XII. A pair of molecules 1.6 and 1.7 (Figure 1.6) were investigated in vitro for antiproliferative activity. Compound 1.6 (Ki = 26.3 and 22.9 nM for hCA IX and XII, respectively) after 48 hours of incubation against the cancer cell line MDA-MB-231 showed a pronounced antiproliferative effect under hypoxic conditions (cell survival was about 45 % at a concentration of 30 ^M). Interestingly, tellurocoumarin 1.7 (Figure 1.6) had a pronounced antiproliferative profile under hypoxic conditions with respect to both cancer lines used in the experiment: cellular survival was 40 % and 25 % at a concentration of 100 ^M for PC-3 and MDA-MB-231, respectively [48].

Another promising approach to the development of powerful hCA IX/XII inhibitors is to use instead of sulfanilamides new functions capable of coordinating the

zinc ion in the catalytic site of the enzyme - for example, carboxylic acids and their esters. In 2017, Cadoni et al. [49] reported the synthesis of inhibitors based on 3-(1#-indol-3-yl)-1#-pyrazole-5-carboxylic acids and their esters. Among a number of compounds 1.8 (Figure 1.7), only one micromolar inhibitor (R1 = /-Pr, R2 = H, R3 = Me) with Ki = 7.36 ^M and 0.21 ^M (against hCA IX and XII, respectively) was tested for anticancer activity. When treated with this ester at a concentration of 100 ^M neuroblastoma cancer cell line SH-SY5Y under hypoxic conditions, the percentage of cell survival was 20 % [49]. Two years later, Nocentini et al. [50] studied the inhibitory profile and antiproliferative properties of /?-ketokarbonic acids and their ethyl esters 1.9 (Figure 1.7). Almost all compounds 1.9 turned out to be low nanomolar inhibitors of tumor-related isoforms hCA IX and XII (Ki = 11.3-37.9 and 7.5-34.6 nM, respectively). Cytotoxicity studies against two osteosarcoma MG63 and HOS cell lines showed that only one 1.9 (R1 = a-naphthyl, R2 = Et) suppresses cell growth of both lines more than 80 % already at a concentration of 25 ^M [50].

Novel chemotypes of hCA inhibitors also include saccharin derivatives [51], many examples of which have been studied in detail by various groups [52-54]. Saccharin derivatives 1.10, including amide substituents (Figure 1.7), showed inhibitory properties against hCA. Thus, derivatives of type 1.10 effectively inhibited transmembrane isoforms of hCA IX and XII with Ki values in the range of 27.2-231 nM and 35,9-670 nM, respectively. However, expressed antiproliferative properties against colon cancer cell line HT-29 were only recorded for two compounds of series 1.10 (R = m-ClC6H4 and R = Me) with IC50 values 44.10 ^M and 50.97 ^M, respectively [54].

Figure 1.7 - Examples of novel chemotypes of hCA inhibitors based on carboxylic acids and their esters 1.8, 1.9, as well as saccharin and acesulfame derivatives 1.10,

1.11

In other research Bua and coauthors [52] the large number of new streptocides on the basis of an acesulfame of 1.11 (Figure 1.7), which were rather active against isoforms of hCA IX and XII was presented. More hCA IX and XII strong inhibitors were investigated on anticarcinogenic activity against three lines of cages: cancer of easy A549, adenocarcinoma of a prostate of PC-3 and colon cancer of HT-116. For example, compound 1.11 (R1 = 5-Cl, R2 = H) has a pronounced antiproliferative effect and has IC50 values of 7.35 ^M for A549, 3.52 ^M for PC-3 and 7.57 ^M for HT-116 [52].

1.2.2 hCA inhibitors IX and XII in clinical and preclinical trials in oncology

Despite the huge number of highly active hCA IX and XII inhibitors described in the literature, few compounds have been investigated in detail in animal tumor models, and only one SLC-0111 compound (Figure 1.8) has reached the clinical trial stage [44,45].

SLC-0111 (Figure 1.8) is a selective inhibitor of hCA IX/XII and shows good both anti-cancer and anti-metastatic activity in many ex vivo trials as well as in animal cancer models [55,56]. His discovery led to the first clinical trial of a new generation cancer drug based on the hCA inhibitor [57].

Ki (ACA IX) 7.0 nM Ki (ACA XII) 2.0 nM

O.

O

N^N H H

SLC-0111

Ki (ACA IX) 45.1 nM Ki (ACA XII) 4.5 nM

VNH,

Figure 1.8 - hCA IX/XII inhibitors under preclinical studies (S4) and clinical trials

(SLC-0111)

Riemann et al. [5] showed that SLC-0111 is effective in reducing prostate cancer cell growth. Bernardino et.al. [58] used SLC-0111 to demonstrate the involvement of mitochondrial hCA isoforms (more specifically, hCA VB) in biosynthetic processes

leading to the formation of lactate in Sertoli cells. These and other studies confirmed the efficacy and lack of toxicity of SLC-0111 as an anti-tumor/anti-metastatic drug. In addition, in 2020, the results of phase I clinical trial aimed at determining the safety and tolerability of SLC-0111 in patients with common types of solid tumors were published. Three cohorts of patients were included in the study; for each cohort, doses of 500 mg, 1000 mg, and 2000 mg were set for daily oral administration, respectively. No toxicity was observed with lower doses (500 or 1000 mg/day) [6]. Overall, the drug proved safe and the recommended dose for subsequent clinical studies was 1000 mg/day.

A low-nanomolar inhibitor of hCA IX and XII S4 (Figure 1.8), comprising a sulfamate moiety as a zinc-binding group instead of sulfanilamide present in many other hCA inhibitors, was developed in collaboration between two research teams from Florence and Manchester [59,60]. S4 showed a significant reduction in primary tumor growth and breast carcinoma tumor metastases MDA-MB-231 in mice at a dose of 10 mg/kg [59]. In addition, S4 was active in an animal model of small cell lung cancer (SCLC) in mice [60]. This compound has also been used by other researchers against mesothelioma cancer cell lines [61], and recently - against esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) [62].

Thus, the literature presents a huge number of reports on the development of new hCA IX and XII inhibitors based on various chemotypes, some of which are given above. However, only a small group of potent hCA IX/XII inhibitors have pronounced antiproliferative properties. Moreover, of the entire array of currently developed inhibitors, only one anticancer agent (SLC-011) has reached the clinical trial stage [57]. Such observations suggest that hCA IX/XII inhibitors as individual anticancer agents are only able to slightly reduce the proliferation of cancer cells but not completely suppress them. Over time, more reports of the anti-cancer potential of hCA IX/XII inhibitors as adjuvant therapy began to appear.

1.3 Inhibitors of hCA IX as candidates for combination therapy in solid tumors

Recently, there has been a rapidly growing number of publications in the literature, where it is reported that inhibition of hCA IX in cancer cells not only increases the

effectiveness of standard chemotherapy in solid tumors but also helps overcome the resistance of already known anti-tumor drugs caused by acidosis. In addition, obstruction of glycolytic metabolism caused by hypoxia by preventing pHi alkalization in highly aggressive phenotypes is considered an effective tool for overcoming the invasion and metastasis of tumor cells [63]. In connection with these facts, the interest of researchers in using hCA IX inhibitors as adjuvants rather than individual anticancer agents is increasing.

1.3.1 hCA IX inhibitors in combination with conventional cytostatic agents

SLC-0111 and dacarbazine, temozolomide, doxorubicin, 5-fluorouracil

A striking example is the selective inhibitor of hCA IX SLC-0111, which first passed clinical trials as an individual antitumor agent, and recently entered the phase Ib/II clinical trials as an adjuvant agent [64]. Andreucci et. al. [65] conducted a detailed in vitro study on potentiating the efficacy of cytotoxic agents in the presence of SLC-0111. Human melanoma cell lines A375-M6, breast carcinoma MCF-7 and colorectal carcinoma were used for this purpose HCT-116 [65].

The authors demonstrated that SLC-0111 markedly increased the percentage of cell death, late apoptosis, and necrosis in melanoma cells A375-M6 when used together with guanine methylating agents (dacarbazine or temozolomide). The combination of SLC-0111+DOX (doxorubicin) had a similar effect on cells of breast cancer of MCF-7. In addition, all combinations effectively blocked the formation of cancer cell colonies. However, it doesn't belong to a combination of SLC-0111 and a 5-ftoruratsil which didn't affect the viability of cells of colorectal carcinoma of HCT-116. Thus, SLC-0111 demonstrated the potential for sensitization of cancer cells to conventional cytostatic agents, which was common for weakly basic drugs but not for the weak acid of 5-fluorouracil (Figure 1.9) [65].

Figure 1.9 - The scheme of a research of a combination SLC-0111+dakarbazin/temozolomide/D0X/ 5-fluorouracil by Andreucci et al. [65]

Boyd and colleagues [66] studied the ability of SLC-0111 to enhance the efficacy of temozolomide against glioblastoma in vitro and in vivo (Figure 1.10). The study showed that the use of SLC-0111 or temozolomide as individual antitumor agents significantly reduced the growth of glioblastoma cells in normoxia and hypoxia conditions, while the combination of these drugs caused a further decrease in cell growth but did not increase the toxicity of temozolomide against healthy astrocytes. The SLC-0111+temozolomide combination has been shown to significantly induce cell cycle arrest through DNA damage and reduce intracellular pH in cancer cells. In addition, this drug combination was highly effective in vivo when administered to naked mice having a tumor xenograft. In fact, the SLC-0111+temozolomide combination caused marked tumor regression in xenografts, and this effect was clearly higher than in drugs taken separately. Thus, the results obtained by Boyd suggest a significant benefit of adding SLC-0111 to the traditional treatment of glioblastoma with temozolomide (Figure 1.10) [66].

Figure 1.10 - Graphical diagram of the study of the combination of SLC-0111+

temozolomide [66]

S4 and doxorubicin, cisplatin