Новые тиоловые оксидоредуктазы систем тиоредоксина и глутаредоксина. Их роль в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Новосёлов, Сергей Владимирович

• Новосёлов, Сергей Владимирович
• доктор биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации доктор биологических наук Новосёлов, Сергей Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Супероксиддисмутаза и каталаза

1.1. CuZnSOD

1.1.2. История открытия CuZnSOD и распространённость в биологических системах

1.1.3 Структура и каталитические характеристики CuZnSOD

1.2. Марганец содержащая SOD (SOD2)

1.2.1 Общая характеристика и локализация

1.2.2. Структура MnSOD

1.3 Экстрацеллюлярная форма SOD. (SOD3)

2.1. Каталаза

2.1.1. История открытия и структура

2.1.2. Внутриклеточная локализация каталаз эукариот

Глава 2. Системы тиоредоксина и глутаредоксина

2.1 Общая характеристика

2.2 Тиоредоксины и тиоредоксинредуктазы

2.3 Глутаредоксины, глутатионпероксидазы и трансферазы

2.3.1. Глутаредоксины

2.3.2. Глутатионпероксидазы

2.3 .3. Глутатион-Б-трансферазы

3. Пероксиредоксины

4. Селен-содержащие белки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Белки, непосредственно вовлечённые в Тгх и Сгх системы 47 11. Тиоредоксинредуктазы

1 2. Идентификация нового глутаредоксина (тиолтрансферазы) млекопитающих (СЯх2)

1.3. ТиоредоксинГлутатионредуктазы(ТСЯ)

2. Новые селен-содержащие белки

2.1. Новый селен-содержащий белок Бе1М

2.2. Селенопротеом млекопитающих

2.3. Глутатионпероксидаза 6 (СРхб)

2.4. Селеновый белок V (8е1У)

2.5. Исследование селенового белка Н (БеШ)

2.6. Семейство ЯсЬс белков

2.6.1. Тканевая экспрессия ЯсЬс подобных белков млекопитающих

2.6.2. Внутриклеточная локализация 11(1x12 белков

2.6.3. Поиск белков-партнёров Яйх12 и БеШу млекопитающих

3. Исследования физиологической роли пищевого Селена у мышей

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые тиоловые оксидоредуктазы систем тиоредоксина и глутаредоксина. Их роль в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки»

В настоящее время у исследователей в области биологии и медицины имеется понимание важности окислительно-восстановительных процессов для жизнедеятельности организмов в норме, а также при патологиях. В последние десятилетия происходил очевидный прогресс в биомедицине, связанный с развитием биохимии и молекулярной биологии, с появлением принципиально новых подходов и технологий, а также с накоплением большого массива биологической информации, что привело еще к более ясному пониманию фундаментальной роли окислительно-восстановительных реакций в функционировании живых организмов [1, 2]. Известно, что существует очень широкий спектр биологических молекул с антиоксидантными свойствами, которые классифицированы по ряду признаков, в частности, по молекулярному весу (низко- и высокомолекулярные), по степени гидрофобности (липо- и водорастворимые) и т.д. При этом каждая из этих молекул имеет отличительные особенности, такие как специфичность субстрата, распределение на клеточном и тканевом уровне, регуляцию, зависимость от внешнего поступления и т.д. Кроме того, поскольку внутриклеточные окислительно-восстановительные системы функционируют одновременно, и при этом часто прямо или косвенно связаны через взаимную регуляцию, становится понятной необходимость изучения этих систем во всем многообразии их взаимодействий.

На молекулярном уровне биохимические реакции с вовлечением антиоксидантов, которые более целесообразно называть редокс-активными агентами, не ограничиваются простым удалением «вредных» свободных радикалов и/или их производных. Достаточно перечислить такие перспективные научные направления как апоптоз, трансляция РНК, регуляция клеточного цикла и т.д, в которых доказано прямое или косвенное участие редокс-агентов.

Из многообразия механизмов и биологических аспектов их действия становится понятной центральная роль редокс реакций, включающих мноц'численные каскады молекулярных превращений при целом ряде патологических состояний. По этой причине очевидна важность результатов фундаментальных исследований, посвященных роли антиоксидантов для практической медицины [3-5].

С позиций классической биохимии окислительно-восстановительные реакции проходят с участием кислорода, который в атмосфере присутствует в виде диатомной молекулы Ог- За исключением некоторых анаэробных и кислородо-устойчивых одноклеточных организмов, все животные, растения и бактерии нуждаются в кислороде для эффективной продукции энергии с использованием Ог-зависимых электронно-транспортных цепей. Однако это не противоречит тому, что кислород является токсичным и мутагенным газом, представляющим собой опасность для живых организмов, которые нуждаются в защите от избытка кислорода.

Принято считать, что первые примитивные бактерии, появившиеся на Земле, жили в условиях очень низкого содержания кислорода в атмосфере, и таким образом, были анаэробами. Анаэробные организмы до сих пор сохранились на планете, но их рост сильно замедлен, и они часто не выживают под воздействием действующей в настоящее время концентрации кислорода в атмосфере (21% Ог). При эволюционном процессе, по мере повышения концентрации кислорода в атмосфере, примитивные организмы либо вымерли, либо приспособились к изменяющимся условиям, и в настоящее время заселяют те биологические ниши, куда кислород не проникает Г6]. Однако в других организмах началось эволюционное развитие антиоксидантных защитных систем для борьбы с токсичными эффектами кислорода, и в ретроспективе это был очень продуктивный путь. Те бактерии, которые могли выживать в условиях высокой концентрации кислорода, начали использовать его в различных биохимических реакциях с участием оксидаз, оксигеназ и гидроксилаз, таких как тирозин-гидроксилазы или цитохром Р450, особенно для эффективной продукции энергии с использованием электронно-транспортных цепей, где кислород является конечным акцептором электронов. У современных эукариот этот процесс локализован преимущественно в митохондриях, производящих до 80% клеточного АТФ - универсального источника энергии для подавляющего числа биохимических процессов, протекающих в живых системах.

По мере эволюционного усложнения организации одноклеточных и появления многоклеточных организмов развивались ферментативные системы защиты от токсичных эффектов кислорода и продуктов его метаболизма, а также совершенствовались системы, использующие возможности его участия в метаболических процессах [6].

При рассмотрении конкретных ферментов, относящихся к системам редокс биологии, общий объём накопленных сведений по многим из них огромен, и по большому счёту число фактов выраженных, например, в количестве оригинальных научных публикаций фактически не поддаётся «абсолютному» анализу. Так, например, читатель, интересующийся каталазой, может найти более тридцати тысяч работ, так или иначе посвященных этому ферменту. Более шестнадцати тысяч источников посвящены ферменту супероксиддисмутазе. И это лишь два примера. По этой причине автор не ставит перед собой задачу представить всю информацию по этим белкам и не претендует на «полноту» и «абсолютность» обзора литературы - это заведомо невыполнимая задача. Вместо этого в первой части обзора была предпринята попытка на примере некоторых ферментов-антиоксидантов показать историю открытия и дальнейших работ по установлению их их свойств для иллюстрации общепринятого «алгоритма» и логики исследований в области редокс биологии. Для исследователей, интересующихся более подробным и полным обзором как общих, так и конкретных аспектов по данной теме на русском языке, автор рекомендует книгу, изданную в 2006, - «Окислительный стресс», написанную замечательным коллективом авторов: Е.Б. Меньщиковой, В.З. Панкиным, Н.К.Зеньковым, И.А. Бондарем, Н.Ф.Кругловых и В.А.Труфакиным, где не только подробно, но что очень важно - современно, с учётом последних открытий, охвачен практически весь спектр проблем по данной теме. Ссылка на этот труд представляется необходимой, поскольку, во-первых, поражает объём проделанной авторами работы, что делает по состоянию на современный момент (2008 год) любые литературные обзоры формата диссертаций в области редокс биологии лишь попыткой повтора отдельных её глав, и, во-вторых, что особенно необходимо подчеркнуть, в теме диссертации не отражены аспекты, относящиеся к биохимии низкомолекулярных редокс активных агентов, таких как витамин Е, коэнзим О, флавоноиды и т.д., которые, безусловно, играют очень важную роль.

Во второй части обзора будет более детально и систематизировано рассмотрена литература, относящаяся к тиоловым окидоредуктазам с тиоредоксин подобной укладкой (фолдом) - ферментам, имеющим непосредственное отношение к теме данной диссертации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Новосёлов, Сергей Владимирович

выводы

1. На основании проведенного филогенетического анализа было установлено, что из существующих двух форм тиоредоксин редуктазы животных («большая» и «малая»), «большая» форма эволюционно образовалась на уровне низших эукариот значительно раньше, чем «малая» форма ТЯ была утеряна в организмах, от которых произошли животные. Обе эти формы сосуществовали в процессе эволюции. Мы идентифицировали организм (СЫатуйотопаь геНгагскГ), который содержит оба фермента. Среди высших эукариот «большая» форма стала преобладать у животных, тогда как «малая» сохранилась в растениях и грибах.

2. «Большая» форма тиоредоксинредуктазы произошла от глутатионредуктазы низших эукариот путём удлинения карбокситерминального конца белка с появлением консервативного Иу-БесСуз-Суз-Иу мотива в новом каталитическом окислительно-восстановительном центре, который функционально заменил глутатион в качестве промежуточного (транзиторного) субстрата для этого фермента.

3. Идентифицирован и охарактеризован новый митохондриальный глутаредоксин (Сгх2). вгх2 человека и мыши катализирует восстановление смешанных дисульфидных связей, сформированных между глутатионом и НЕБ Б, Б-сульфоцистеином или Ь-цистеином. На основании кинетических данных установлено, что вгх2 обладает наиболее высоким сродством по отношению к Ьцистеину, и это сродство было эквивалентно таковому для HEDS и S-сульфоцистеина.

4. Показано, что белок TR2 структурно является тиоредоксинглутатионредуктазой (TGR), при этом in vitro он обладает тиолтрансферазной, глутатион- и тиоредоксинредуктазной, а также протеин дисульфид изомеразной активностью. Функционально TGR представляет собой изомеразу, одним из субстратов которой выявлена глутатион пероксидаза 4 (Gpx4), и, следовательно, TGR вовлечена в образование митохондриальной капсулы сперматозоидов.

5. Идентифицирован и охарактеризован новый селен-содержащий белок SelM, имеющий новый тип SECIS элемента.

6. Компьютерный анализ генома человека показал, что селенопротеом состоит из 25 селен-содержащих белка, семь из которых ранее не были известны. Среди них охарактеризованы новая глутатион пероксидаза Gpx6, экспрессирующаяся в обонятельном эпителии на определённых стадиях эмбриогенеза, а также селен-содержащий белок SelV - белок сперматоцитов.

7. Установлено, что селен-содержащий белок SelH - новая тиоловая оксидоредуктаза ядрышек, имеющая необычный паттерн экспрессии.

8. Обнаружена новая тиоловая оксидоредуктаза эукариот, названная нами 11(1x12. На основании компьютерного анализа белок 1?.с1х12, селен-содержащий белок селен-содержащий белок БеГУ, селен-содержащий белок БеГГ и селен-содержащий белок БеШ были объединены в новое семейство тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин-подобной укладкой. Это семейство было охарактеризовано и названо нами Ыс1х.

Список публикаций автора по теме диссертации

1. Novoselov SV. Lobanov AV, Hua D, Kasaikina MV, Hatfield DL, Gladyshev VN.

A highly efficient form of the selenocysteine insertion sequence element in protozoan parasites and its use in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 May 8;104(19):7857-7862.

2. Novoselov SV. Kryukov GV, Xu XM, Carlson BA, Hatfield DL, Gladyshev VN. Selenoprotein H is a nucleolar thioredoxin-like protein with a unique expression pattern. J Biol Chem. 2007 Apr 20;282(16): 11960-11968.

3. Novoselov SV, Hua D, Lobanov AV, Gladyshev VN.

Identification and characterization of Fepl5, a new selenocysteine-containing member of the Sep 15 protein family.

Biochem J. 2006 Mar 15;394(Pt 3):575-579.

4. Novoselov SV, Calvisi DF, Labunskyy VM, Factor VM, Carlson BA, Fomenko DE, Moustafa ME, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Selenoprotein deficiency and high levels of selenium compounds can effectively inhibit hepatocarcinogenesis in transgenic mice. Oncogene. 2005 Dec 1;24(54):8003-8011.

5. Novoselov SV, Gladyshev VN.

Non-animal origin of animal thioredoxin reductases: implications for selenocysteine evolution and evolution of protein function through carboxy-terminal extensions. Protein Sci. 2003 Feb;12(2):372-378.

6. Novoselov SV, Rao M, Onoshko NV, Zhi H, Kryukov GV, Xiang Y, Weeks DP, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Selenoproteins and selenocysteine insertion system in the model plant cell system,

Chlamydomonas reinhardtii.

EMBOJ. 2002 Jul 15;21(14):3681-3693.

7. Novoselov SV, Peshenko IV, Popov VI, Novoselov VI, Bystrova MF, Evdokimov VA, Kamzalov SS, Merkulova MI, Shuvaeva TM, Lipkin VM, Fesenko EE.

Localization of 28-kDa peroxiredoxin in rat epithelial tissues and its antioxidant properties.

Cell Tissue Res. 1999 Dec;298(3):471-480.

8. Bonilla M, Denicola A, Novoselov SV, Turanov AA, Protasio A, Izmendi D, Gladyshev VN, Salinas G.

Platyhelminth mitochondrial and cytosolic redox homeostasis is controlled by a single thioredoxin glutathione reductase and dependent on selenium and glutathione. J Biol Chem. 2008 Jun 27;283(26): 17898-17907.

9. Sengupta A, Carlson BA, Weaver JA, Novoselov SV, Fomenko DE, Gladyshev VN, Hatfield DL.

A functional link between housekeeping selenoproteins and phase II enzymes. Biochem J. 2008 Jul 1;413(1):151-161.

10. Merchant SS, Prochnik SE, Vallon O, Harris EH, Karpowicz SJ, Witman GB, Terry A, Salamov A, Fritz-Laylin LK, Maréchal-Drouard L, Marshall WF, Qu LH, Nelson DR, Sanderfoot AA, Spalding MH, Kapitonov VV, Ren Q, Ferris P, Lindquist E, Shapiro H, Lucas SM, Grimwood J, Schmutz J, Cardol P, Cerutti H, Chanfreau G, Chen CL, Cognat V, Croft MT, Dent R, Dutcher S, Fernández E, Fukuzawa H, González-Ballester D, González-Halphen D, Hallmann A, Hanikenne M, Hippler M, Inwood W, Jabbari K, Kalanon M, Kuras R, Lefebvre PA, Lemaire SD, Lobanov AV, Lohr M, Manuell A, Meier I, Mets L, Mittag M, Mittelmeier T, Moroney JV, Moseley J, Napoli C, Nedelcu AM, Niyogi K, Novoselov SV. Paulsen IT, Pazour G, Purton S, Ral JP, Riaño-Pachón DM, Riekhof W, Rymarquis L, Schroda M, Stern D, Urnen J, Willows R, Wilson N, Zimmer SL, Allmer J, Balk J, Bisova K, Chen CJ, Elias M, Gendler K, Hauser C, Lamb MR, Ledford H, Long JC, Minagawa J, Page MD, Pan J, Pootakham W, Roje S, Rose A, Stahlberg E, Terauchi AM, Yang P, Ball S, Bowler C, Dieckmann CL, Gladyshev VN, Green P, Jorgensen R, Mayfield S, Mueller-Roeber B, Rajamani S, Sayre RT, Brokstein P, Dubchak I, Goodstein D, Hornick L, Huang YW, Jhaveri J, Luo Y, Martínez D, Ngau WC, Otillar B, Poliakov A, Porter A, Szajkowski L, Werner G, Zhou K, Grigoriev IV, Rokhsar DS, Grossman AR. r\

The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 2007 Oct 12;318(5848):245-250.

11. Shchedrina VA, Novoselov SV, Malinouski MY, Gladyshev VN.

Identification and characterization of a selenoprotein family containing a diselenide bond in a redox motif.

Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Aug 28; 104(35): 13919-13924.

12. Dikiy A, Novoselov SV, Fomenko DE, Sengupta A, Carlson BA, Cerny RL, Ginalski K, Grishin NV, Hatfield DL, Gladyshev VN.

SelT, SelW, SelH, and Rdxl2: genomics and molecular insights into the functions of selenoproteins of a novel thioredoxin-like family. Biochemistry. 2007 Jun 12;46(23):6871-6882.

13. Shrimali RK, Weaver JA, Miller GF, Starost MF, Carlson BA, Novoselov SV, Kumaraswamy E, Gladyshev VN, Hatfield DL.

Selenoprotein expression is essential in endothelial cell development and cardiac muscle function.

Neuromuscul Disord. 2007 Feb;17(2): 135-142.

14. Lobanov AV, Delgado C, Rahlfs S, Novoselov SV, Kryukov GV, Gromer S, Hatfield DL, Becker K, Gladyshev VN.

The Plasmodium selenoproteome.

Nucleic Acids Res. 2006 Jan 20;34(2):496-505.

15. Sun QA, Su D, Novoselov SV, Carlson BA, Hatfield DL, Gladyshev VN. Reaction mechanism and regulation of mammalian thioredoxin/glutathione reductase. Biochemistry. 2005 Nov 8;44(44): 14528-14537.

16. Castellano S, Lobanov AV, Chappie C, Novoselov SV, Albrecht M, Hua D, Lescure A, Lengauer T, Krol A, Gladyshev VN, Guigó R.

Diversity and functional plasticity of eukaryotic selenoproteins: identification and characterization of the SelJ family.

Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Nov 8;102(45):16188-16193.

17. Su D, Novoselov SV. Sun QA, Moustafa ME, Zhou Y, Oko R, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Mammalian selenoprotein thioredoxin-glutathione reductase. Roles in disulfide bond formation and sperm maturation. J Biol Chem. 2005 Jul 15;280(28):26491-26498.

18. Castellano S, Novoselov SV, Kryukov GV, Lescure A, Blanco E, Krol A, Gladyshev VN, Guigó R.

Reconsidering the evolution of eukaryotic selenoproteins: a novel nonmammalian family with scattered phylogenetic distribution. EMBO Rep. 2004 Jan;5(l):71-77.

19. Carlson В A, Novoselov SV, Kumaraswamy E, Lee В J, Anver MR, Gladyshev VN, Hatfield DL.

Specific excision of the selenocysteine tRNA[Ser]Sec (Trsp) gene in mouse liver demonstrates an essential role of selenoproteins in liver function. J Biol Chem. 2004 Feb 27;279(9):8011-8017.

20. Rao M, Carlson BA, Novoselov SV. Weeks DP, Gladyshev VN, Hatfield DL. Chlamydomonas reinhardtii selenocysteine tRNA[Ser]Sec.

RNA. 2003 Aug;9(8):923-930.

21. Kryukov GV, Castellano S, Novoselov SV. Lobanov AV, Zehtab O, Guigo R, Gladyshev VN.

Characterization of mammalian selenoproteomes. Science. 2003 May 30;300(5624): 1439-14343.

22. Романова JIT, Новосёлов СВ. Егоров MM, Костина МБ, Шакшпаронов МИ. Экспрессия H+,K+-ATPase каталитической субъединици в эпидермисе крысы. Биоорганическая химия. 2002 Jul-Aug;28(4):351-356.

23. Korotkov KV, Novoselov SV, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Mammalian selenoprotein in which selenocysteine (Sec) incorporation is supported by a new form of Sec insertion sequence element. Mol Cell Biol. 2002 Mar;22(5): 1402-1411.

24. Gladyshev VN, Liu A, Novoselov SV, Krysan K, Sun QA, Kryukov VM, Kryukov GV, Lou MF.

Identification and characterization of a new mammalian glutaredoxin (thioltransferase), Grx2.

J Biol Chem. 2001 Aug 10;276(32):30374-30380.

25. Новосёлов ВИ, Амелина СЕ, Кравченко ИН, Новосёлов СВ, Янин В А, Садовников ВБ, Фесенко ЕЕ.

Роль пероксиредоксина в антиоксидантной системе лёгких. Доклады АН. 2000 Jul-Dec;373-375:64-66.

26. Новосёлов ВИ, Пешенко ИВ, Новосёлов СВ, Камзалов СС, Быстрова МФ, Евдокимов ВА, Николаев ЮВ, Фесенко ЕЕ.

Протекторная активность 28 кДа 1-цис пероксиредоксина определяется его пероксидазной активностью. Биофизика. 1999. 44(3):568-570.

27. Merkulova MI, Andreeva SG, Shuvaeva TM, Novoselov SV, Peshenko IV, Bystrova MF, Novoselov VI, Fesenko EE, Lipkin VM.

A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium: primary structure and localisation.

FEBSLett. 1999;450(l-2): 126-130.

28. Андреева СГ, Меркулова МИ, Шуваева ТМ, Новосёлов ВИ, Пешенко ИВ, Новосёлов СВ, Фесенко ЕЕ, Липкин ВМ.

Структурные исследования секреторного 28 кДа из обонятельного эпителия крысы. Биоорганическая химия. 1998;24(11):816-821.

29. Новосёлов ВИ, Пешенко ИВ, Евдокимов ВА, Камзалов СС, Новосёлов СВ, Николаев ЮВ, Быстрова МФ, Фесенко ЕЕ.

Свойства каталитического центра секреторного 28 кДа белка из обонятельного эпителия крысы.

Биофизика. 1998;43(4):610-616.

30. Gladyshev VN and Novoselov SV

Compositions and Methods for the Expression of Selenoprotein in Eukaryotic Cells. Заявка в Патентное бюро США - U.S. Provisional Patent Application Serial No. 6 1/125,822 от 29 арпеля 2008

31. Carlson В A, Xu XM, Shrimarli R, Sengupta A, Yoo MH, Zhong N, Hatfield DL, Irons R, Davis CD, Lee BJ, Novoselov SV. Gladyshev VN.

Mouse models for assessing the role of selenium in health and development. В сборнике: Selenium: Its Molecular Biology and role in Human Health. Springer, 2006. 333-343.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свободнорадикальные процессы в биологических системах привлекают внимание исследователей на протяжении более ста лет, за этот период накоплено огромное количество фактического материала по этой проблеме. Более того, в последние 5-7 лет, в течение которых был расшифрован геном человека и других организмов, т.е. в «постгеномную эру», стало понятно, что стандартные биохимические и молекулярные подходы и методы, разработанные и многократно апробированные в исследованиях «классических» антиоксидантных белков, применённые к новым, ранее неизвестным генам, число которых в геноме человека исчисляется многими сотнями, значительно ускорит появление новых открытий. В конечном итоге это может привести к качественным изменениям в современных представлениях о роли свободных радикалов во многих, если не во всех областях биомедицины. Вместе с тем всё ускоряющееся накопление биологической информации требует принципиально новой философии в подходах к методам её обработки и анализа, что также ставит перед исследователем сложную задачу выбора приоритетов среди огромного числа возможных направлений исследований. Иными словами, на практике в условиях одной конретной лаборатори едва ли возможно экспериментально охарактеризовать сразу «все» неизвестные ранее, но анотированные в геноме как «предположительные» (putative) представители белковых семейств или даже суперсемейств, к которым, в частности, относятся и тиоловые оксидоредуктазы с тиоредоксин подобной укладкой систем тиоредоксина и глутаредоксина. Таким образом, необходим компромисс между научным любопытством, новыми идеями, экспериментальным опытом, с одной стороны, и ограниченностью в ресурсах и времени, с другой стороны. Мы обратили внимание на наиболее важные, на наш взгляд, белки суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз, большинство из которых является селеновыми белками. При этом мы руководствовались следующими соображениями: 1) если белок содержит селеноцистеин, энергетически «дорогую» и эволюционно консервативную молекулу - то весьма вероятно, что его функция критична для выживания конкретного вида животных; 2) сам по себе поиск в геномах селенсодержащих белков - сложная задача, требующая особых подходов в силу нестандартности кодирования селеноцистеина ТвА кодоном. Последнее обстоятельство делает невозможным использование обычных компьютерных программ по автоматическому аннотированию, которые читают этот кодон как сигнал терминации трансляции. В случае успеха при таком подходе появляется возможность проведения коррекции в аннотации конкретного генома и, таким образом, можно внести важный вклад в решение фундаментальной проблемы, связанной с расшифровкой роли ферментов-антиоксидантов; 3) открытие новых селенсодержащих белков и изучение их свойств может принести достаточно быстрый и значительный практический вклад в биомедицину, так как селен, а следовательно, и селенсодержащие белки, обладают широким спектром фармакологических свойств, но при этом механизмы их действия во многом остаются неизвестными; 4) приобретённый практический опыт параллельной работы с десятью и более белками в лаборатории (высокопродуктивный подход) может быть применён в других проектах, направленных на изучение множества неизвестных генов одновременно, что в постгеномную эру становится особенно актуальным.

Руководствуясь этой логикой и поставленными конкретными задачами, мы провели большую работу, основные достижения и успехи которой отражены в главе «Результаты и обсуждение» и в статьях, опубликованных по теме данной диссертации. Можно перечислить основные достижения, полученные при выполнении работы:

- Был предложен простой механизм эволюции белков путём удлинения С-концевого участка, приводящего к «улучшению» или модификации функции белковой молекулы или даже появления у неё новых свойств.

- Был открыт и охарактеризован недостающий компонент системы глутаредоксина в митохондриях.

- Была охарактеризована недавно обнаруженная тиоредоксин глутаредоксин редуктаза млекопитающих (ТвЫ) - фермент, в котором функциональные субъединицы двух разных систем (тиоредоксина и глутаредоксина) объединены в одном белке. Мы обнаружили у этого белка весь спектр активностей, присущих представителям обеих систем, наличие которых объяснялось необычной доменной организацией ТвК. Сопоставляя и анализируя полученные данные иммуногистохимического анализа, профайл белков-партнёров, идентифицированных масспектрометрически, регуляцию экспрессии ТОЙ и других селеносодержащих белков в зависимости от возраста животного, селена в диете и генетически детерминированого селеленодефицита, мы предположили наличие неизвестных ранее функций у ТОК, а именно изомеризацию другого селенового белка вРх4 (РНСРх), который в тестикулах на ранних этапах сперматогенеза играет обычную для себя роль защиты биологических мембран, но по мере созревания сперматозоидов начинает претерпевать структурные изменения, приводящие к его полимеризации вокруг митохондрий, что ведёт к формированию капсулы сперматозоида. Мы обнаружили изомеризационную активность TGR по отношению к GPx4 и сделали вывод о том, что, скорее всего, большинство биохимических активностей этого фермента in vitro не являются физиологически значимыми, in vivo TGR является изомеразой GPx4, а его биологическая роль - это участие в сперматогенезе посредством катализируемой реакции изомеризации GPx4.

- Разработали очень чувствительный и специфичный биоинформационный метод поиска TGA кодонов, ответственных за встраивание селеноцистеина в полипетидные цепи, и проанализировав геном человека этим методом, мы нашли десять новых селенсодержащих белков, доказав, таким образом, что селенопротеом человека состоит из двадцати пяти селенопротеинов. С момента открытия первого представителя этой группы элитных белков в середине семидесятых годов прошлого века - классической или цитоплазматической глутатион пероксидазы (GPxl млекопитающих - по современной классификации), прошло более тридцати лет интенсивных исследований многих лабораторий. При этом до сих пор во всем мире было найдено всего пятнадцать селенсодержащих белков. Нам удалось практически удвоить этот список, что доказывает высокую эффективность применения компьютерных технологий в редокс биологии.

-С применением новейших приемов молекулярной биологии и биохимии был достигнут значительный прогресс при выяснении свойств восьми из ряда новых селенсодержащих белков. Особенно значительные результаты были получены при изучении БеШ, 8е1Т, 8е1У, 8е1\\^ и ранее неизвестного Кс1х12, родственного им цистеинового гомолога. На основании биоинформационного анализа эти белки были объединены в новое семейство тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин подобной укладкой (фолдом), названное нами Кс1х белками. Необходимо заметить, что впоследствии компьютерные данные, на основании которых это было сделано, подтвердились структурными исследованиями белка 8е1\У человека.

- Был проведен детальный анализ свойств белков 8е1Н, 8е1Т, 8е1У и К(1х12, что позволило доказать их дифференциальную экспрессию на клеточном и тканевом уровнях, на разных стадиях эмбриогенеза и в различных клеточных линиях, как на основе мониторинга матричной РНК, так и по измерению продукции белка. Кроме того, был проведен поиск возможных белков-партнёров для 8е1Н, 8е1\У и Ис1х12. Полученные в этих экспериментах данные, оформленные ввиде двух статей и опубликованные в престижных международных журналах, станут отправной точкой для дальнейшей работы по выяснению билогической роли представителей семейства 11с1х, что поможет выяснить механизмы влияния селена на здоровье человека.

- Предварительные данные по другим новым селенсодержащим белкам человека также являются основой для дальнейших исследований, имеющих, по нашему мнению, очень хорошие перспективы.

- Не отраженные в тексте диссертации работы автора по изучению селенопротеомов ряда простейших - паразитов, насекомых и рыб перечислены в списке литературы. Помимо ожидаемых, но, тем не менее, новых данных по тиоловым оксидоредуктазам тиоредоксин подобного фолда, в частности их роли в эволюции, было обнаружено два новых организм-специфичных (встречающихся только в определённом виде и не имеющих эволюционой консервативности) селен-содержащих белка. На этом основании был сделан вывод о пластичности селенопротеомов и значительной чувствительности этих генов к эволюционному давлению. Так, самым представительным из известных к настоящему моменту селенопротеомов обладают рыбы Damio rerio, содержащие как минмиум 34 таких белка, что может объясняться доступностью селена, как предшественника биосинтеза селеноцистеина для рыб в воде. И, напротив, животные, населяющие сушу, где, как правило, селен не так распространен, имеют тенденцию редуцировать количество генов, кодирующих эти молекулы. При этом млекопитающие являются исключением, что подчёркивает значение селена для человека и необходимость как можно более полного анализа всех селенсодержащих белков.

- В тексте диссертации не отражены результаты исследований по генетике и геномике Chlamidomonas reidhardtii, включая полученные в составе международного консорциума по расшифровке генома этого популярного для исследований организма. Эти результаты содержатся в четырёх публикациях, приведённых в списке публикаций. Автор сознательно не включил эту информацию в текст диссертации, чтобы не нарушать логики описания и не усложнять читателю восприятие ключевых фактов и выводов, отвлекая его внимание на частности. Главным же достижением анализа EST и генома Chlamidomonas reidhardtii стало открытие факта присутствия селеновых белков в этом организме, что было сделано прямыми методами MOLDI анализа, метаболического мечения с радиоактивным изотопом Se75 и биоинформационного поиска. Открытие присутствия селенопротеинов и системы его биосинтеза у Chlamidomonas reidhardtii, относящейся к царству растений, которые, как считалось, не имеют таких редокс молекул, продемонстрировало, что селенсодержащие белки встречаются у представителей всех царств живых организмов без исключения. Анализ гомологии отдельных компонентов системы биосинтеза и встраивания Sec показал её консервативность и указал на существование общих предшественников для всех эукариот.

- Наконец, результаты ряда проектов по изучению влияния селена в диетах на целый организм мышей с модифицированными генетическими параметрами, в частности, на процессы канцерогенеза у трансгенных животных. Это мыши, активно экспрессирующие онкогены TGF-alfa и с-тус, что приводит к спонтанному возникновению аденокарцином печени у 100% животных к концу пятого месяца жизни. Вопреки ожиданиям, в данной модели добавка селена в терапевтической дозе приводила к ухудшению состояния животных, ускорению процессов малигнизации по сравнению как с контрольной, так и селенодефицитной группами мышей. Поскольку этот эффект был противоположен тому, что наблюдался в этой модели при использовании Витамина Е, который, как и селен, считается редокс активным антираковым агентом, рекомендованным к регулярному применению в виде биологически активной добавки. Для объяснения этого несоответствия мы провели дифференциальный анализ экспрессии всех генов печени в зависимости от типа селеновой диеты методом генетических чипов, и обнаружили, что как при экстремальном селенодефиците, так и при приеме субтоксических доз селена, очень схожий набор из 150-200 генов регулируется одинаково (большинство из них были глутатион трансферазами (GST) и цитохромом С (CYP450). Таким образом, и селенодефицит, и сильный избыток селена может приводить к активации похожих путей детоксикации, которые приводили к подавлению роста карциномы. Напротив, при нормальном содержании селена в диете, а также при использовании его терапевтических доз, аденомы и аденокарценомы развивались со скоростью, обычной для этих животных, характеризующихся сверхпродукцией одновременно двух онкогенов.

Таким образом, были использованы самые разнообразные подходы, модельные системы и объекты для исследований тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин подобной укладкой, при этом был сделан акцент на те из них, которые с высокой долей вероятности обладают высокой активностью и физиологической значимостью.

Кроме упомянутых важных результатов настоящего исследования, необходимо отметить следующие выводы, сделанные автором при систематизировании всех данных и их анализе в контексте глобального значения окислительно-восстановительных реакций, протекающих в живых организмах:

Во-первых, опыт и прибретённые знания, полученные во время данной работы с различными тиоловыми оксидоредуктазами, сделал для нас очевидным то, что при изучении какого либо процесса с вовлечением этих белков (например, клеточный стресс различного генеза или влияние диет на целый организм) необходимо проводить одновременный мониторинг как можно большего числа редокс компонентов. Это связано с тем, что эти молекулы часто взаиморегулируются, или взаимокомпенсируются, или при сочетанном однонаправленном действии может возникать кумулятивный эффект и, соответственно, фенотипические последствия таких сочетанных реакций имеют совершенно неожиданные и парадоксальные последствия.

Во-вторых, систематика и классификация белков-антиоксидантов с учетом распространённости и многобразия тиоловых оксидоредуктаз, по нашему мнению, требует серьезных уточнений. Так, например, часто встречаемое в обзорах и монографиях простое перечисление ферментов-антиоксидантов виде: «каталазы, супероксид дисмутазы, тиоредоксины, глутатион пероксидазы, пероксиредоксины и др.» не отражает современных представлений о ферментативных окислительно-восстановительных системах, и более того привносит много разночтений и несоответствий. Поскольку тиоредоксины, глутатионпероксидазы и пероксиредоксины являются структурно-, биохимически- и функционально родственными ферментами, принимающими участие в процессах редокс регуляции и сигнализации, все тиоловые оксидоредуктазы с тиоредоксиновой укладкой должны быть объединены в одно суперсемейство. Принимая во внимание полученные в настоящей работе результаты, полагаем, что классификация редокс белков должна выглядеть следующим образом: «каталазы, супероксиддисмутазы, суперсемейство тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин подобной структурой», и дальнейшую систематику конкретных семейств (тиоредоксины, глутаредоксины, глутатионпероксидазы и т.д.) следует проводить внутри суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин подобной структурой.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Новосёлов, Сергей Владимирович, 2008 год

1. Владимиров, Ю.А., Арчаков, А.И., Перекиспое окисление липидов в биологических мембранах. 1972. 252.

2. Меньшикова, Е.Б., Ланкин, В.З., Зенков, Н.К., Бондарь, И.А., Круговых, Н.Ф., Труфакин, В.А., Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. 2006, Москва: Слово. 553.

3. Ланкин, В.З., Перекиси липидов и атеросклероз. Гипотеза: роль холестерина и свободнорадикального перекисного окисления липидов в изменении свойств клеточных мембран при гиперхолестеринемии и атеросклерозе. Кардиология, 1980. 20(8): р. 42-48.

4. Ланкин, В.З., Тихазе, А.К., Котелевцева, Н.В., Перекиси липидов и атеросклероз. . Кардиология, 1976. 16(2): р. 58-60.

5. Ярема, Н.И., Коновалова, Г.Г., Ланкин, В.З., Изменение активности антиоксидантных ферментов у больных гипертонической болезнью. Кардиология, 1992. 32(3): р. 46-48.

6. Скулачев, В.П., О биохимических механизмах эволюции и роли кислорода. . Биохимия, 1998. 63(11): р. 23-30.

7. Fridovich, I., Superoxide dismutases. An adaptation to a paramagnetic gas. J Biol Chem, 1989. 264(14): p. 7761-4.

8. Porter, H., M. Sweeney, and E.M. Porter, Human Hepatocuprein. Isolation of a Copper Protein from the Subcellular Soluble Fraction of Adult Human Liver. Arch Biochem Biophys, 1964.105: p. 319-25.

9. Porter, H. and J. Folch, Cerebrocuprein I. A copper-containing protein isolated from brain. J Neurochem, 1957.1(3): p. 260-71.

10. McCord, J.M. and I. Fridovich, Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem, 1969. 244(22): p. 6049-55.

11. Liochev, S.I. and I. Fridovich, The effects of superoxide dismutase on H202 formation. Free Radic Biol Med, 2007. 42(10): p. 1465-9.

12. Zelko, I.N., T.J. Mariani, and R.J. Folz, Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SODJ), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression. Free Radic Biol Med, 2002. 33(3): p. 337-49.

13. Fridovich, I., Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem, 1995.64: p. 97-112.

14. Wanders, R.J. and S. Denis, Identification of superoxide dismutase in rat liver peroxisomes. Biochim Biophys Acta, 1992. 1115(3): p. 259-62.

15. O'Neill, P., et al., The effects ofpH and various salts upon the activity of a series of superoxide dismutases. Biochem J, 1988. 251(1): p. 41-6.

16. Hough, M.A. and S.S. Hasnain, Structure of fully reduced bovine copper zinc superoxide dismutase at 1.15 A. Structure, 2003.11(8): p. 937-46.

17. Tainer, J.A., V.A. Roberts, and E.D. Getzoff, Protein metal-binding sites. Curr Opin Biotechnol, 1992. 3(4): p. 378-87.

18. Zanma, A., Y. Matsumoto, and Y. Masuho, Conjugates of superoxide dismutase with the Fc fragment of immunoglobulin G. J Biochem, 1991.110(6): p. 868-72.

19. Marklund, S.L., Human copper-containing superoxide dismutase of high molecular weight. Proc Natl Acad Sci USA, 1982. 79(24): p. 7634-8.

20. Marklund, S.L., Expression of extracellular superoxide dismutase by human cell lines. Biochem J, 1990. 266(1): p. 213-9.

21. Hassan, H.M. and L.W. Schrum, Roles of manganese and iron in the regulation of the biosynthesis of manganese-superoxide dismutase in Escherichia coll. FEMS Microbiol Rev, 1994.14(4): p. 315-23.

22. Alscher, R.G., N. Erturk, and L.S. Heath, Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. J Exp Bot, 2002. 53(372): p. 1331-41.

23. Schmidt, M., et al., Solution Structure of a Functional Biomimetic and Mechanistic Implications for Nickel Superoxide Dismutases. Chembiochem, 2008. 9(13): p. 2135-2146.

24. Bonomini, F., et al., Atherosclerosis and oxidative stress. Histol Histopathol, 2008. 23(3): p. 381-90.

25. Paravicini, T.M., G.R. Drummond, and C.G. Sobey, Reactive oxygen species in the cerebral circulation: physiological roles and therapeutic implications for hypertension and stroke. Drugs, 2004. 64(19): p. 2143-57.

26. Noor, R., S. Mittal, and J. Iqbal, Superoxide dismutase—applications and relevance to human diseases. Med Sci Monit, 2002. 8(9): p. RA210-5.

27. Maier, C.M. and P.H. Chan, Role of superoxide dismutases in oxidative damage and neurodegenerative disorders. Neuroscientist, 2002. 8(4): p. 323-34.

28. Ланкин B.3., В.Д.Б., Тихазе A.K., Косых В.А., Помойнецкий В.Д., Вихерт A.M., Влияние гипероксии на активность супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в тканях мышей. Докл. АН СССР, 1981. 259(1): р. 229-231.

29. Schroeder, W.A., et al., The amino acid sequence of bovine liver catalase: a preliminary report. Arch Biochem Biophys, 1969. 131(2): p. 653-5.

30. Murthy, M.R., et al., Structure of beef liver catalase. J Mol Biol, 1981. 152(2): p. 465-99.

31. Reid, T.J., 3rd, et al., Structure and heme environment of beef liver catalase at 2.5 A resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 1981. 78(8): p. 4767-71.

32. Chance, В., H. Sies, and A. Boveris, Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol Rev, 1979. 59(3): p. 527-605.

33. Mates, J.M., et al., Intracellular redox status and oxidative stress: implications for cell proliferation, apoptosis, and carcinogenesis. Arch Toxicol, 2008. 82(5): p. 273-99.

34. Holmgren, A., Thioredoxin and glutaredoxin systems. J Biol Chem, 1989. 264(24): p. 13963-6.

35. Berndt, C., C.H. Lillig, and A. Holmgren, Thioredoxins and glutaredoxins as facilitators of protein folding. Biochim Biophys Acta, 2008.1783(4): p. 641-50.

36. Meister, A., Glutathione-ascorbic acid antioxidant system in animals. J Biol Chem, 1994. 269(13): p. 9397-400.

37. Meister, A., Glutathione, ascorbate, and cellular protection. Cancer Res, 1994. 54(7 Suppl): p. 1969s-1975s.

38. Meyer, A. J., The integration of glutathione homeostasis and redox signaling. J Plant Physiol, 2008. 165(13): p. 1390-403.

39. Rouhier, N., E. Gelhaye, and J.P. Jacquot, Plant glutaredoxins: still mysterious reducing systems. Cell Mol Life Sci, 2004. 61(11): p. 1266-77.

40. Sengupta, A., et al., A functional link between housekeeping selenoproteins and phase II enzymes. Biochem J, 2008. 413(1): p. 151-61.

41. Linke, K. and U. Jakob, Not every disulfide lasts forever: disulfide bond formation as a redox switch. Antioxid Redox Signal, 2003. 5(4): p. 425-34.

42. Azevedo, D., et al., Two redox centers within Yapl for H202 and thiol-reactive chemicals signaling. Free Radic Biol Med, 2003. 35(8): p. 889-900.

43. Delaunay, A., et al., A thiol peroxidase is an H202 receptor and redox-transducer in gene activation. Cell, 2002. 111(4): p. 471-81.

44. Veal, E.A., et al., A 2-Cys peroxiredoxin regulates peroxide-induced oxidation and activation of a stress-activated MAP kinase. Mol Cell, 2004. 15(1): p. 12939.

45. Juarez, J.C., et al., Superoxide dismutase 1 (SOD1) is essential for H202-mediated oxidation and inactivation of phosphatases in growth factor signaling. Proc Natl Acad Sci USA, 2008.105(20): p. 7147-52.

46. Salmeen, A., et al., Redox regulation of protein tyrosine phosphatase IB involves a sulphenyl-amide intermediate. Nature, 2003. 423(6941): p. 769-73.

47. Ilbert, M., et al., The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nat Struct Mol Biol, 2007.14(6): p. 556-63.

48. Jakob, U., M. Eser, and J.C. Bardwell, Redox switch of hsp33 has a novel zinc-binding motif. J Biol Chem, 2000. 275(49): p. 38302-10.

49. Dalle-Donne, I., et al., S-glutathionylation in protein redox regulation. Free Radic Biol Med, 2007. 43(6): p. 883-98.

50. Dalle-Donne, I., et al., Molecular mechanisms and potential clinical significance of S-glutathionylation. Antioxid Redox Signal, 2008.10(3): p. 445-73.

51. Sun, J., C. Steenbergen, and E. Murphy, S-nitrosylation: NO-related redox signaling to protect against oxidative stress. Antioxid Redox Signal, 2006. 8(9-10): p. 1693-705.

52. Krezel, A., Q. Hao, and W. Maret, The zinc/thiolate redox biochemistry of metallothionein and the control of zinc ion fluctuations in cell signaling. Arch Biochem Biophys, 2007. 463(2): p. 188-200.

53. Kim, J.W. and C.V. Dang, Multifaceted roles of glycolytic enzymes. Trends Biochem Sci, 2005. 30(3): p. 142-50.

54. Zavasnik-Bergant, T. and B. Turk, Cysteine proteases: destruction ability versus immunomodulation capacity in immune cells. Biol Chem, 2007. 388(11): p. 11419.

55. Zhang, F.L. and P.J. Casey, Protein prenylation: molecular mechanisms and functional consequences. Annu Rev Biochem, 1996. 65: p. 241-69.

56. Martin, J.L., Thioredoxin--a fold for all reasons. Structure, 1995. 3(3): p. 245-50.

57. Engstrom, N.E., et al., Isolation and characterization of calf liver thioredoxin. J Biol Chem, 1974. 249(1): p. 205-10.

58. Holmgren, A., Bovine thioredoxin system. Purification of thioredoxin reductase from calf liver and thymus and studies of its function in disulfide reduction. J Biol Chem, 1977. 252(13): p. 4600-6.

59. Holmgren, A., The function of thioredoxin and glutathione in deoxyribonucleic acid synthesis. Biochem Soc Trans, 1977. 5(3): p. 611-2.

60. Holmgren, A., B.B. Buchanan, and R.A. Wolosiuk, Photosynthetic regulatory protein from rabbit liver is identical with thioredoxin. FEBS Lett, 1977. 82(2): p. 351-4.

61. Luthman, M. and A. Holmgren, Rat liver thioredoxin and thioredoxin reductase: purification and characterization. Biochemistry, 1982. 21(26): p. 6628-33.

62. Moutevelis, E. and J. Warwicker, Prediction of pKa and redox properties in the thioredoxin superfamily. Protein Sci, 2004.13(10): p. 2744-52.

63. Powis, G. and W.R. Montfort, Properties and biological activities of thioredoxins. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2001. 30: p. 421-55.

64. Arner, E.S. and A. Holmgren, The thioredoxin system in cancer. Semin Cancer Biol, 2006.16(6): p. 420-6.

65. Holmgren, A., Thioredoxin. Annu Rev Biochem, 1985. 54: p. 237-71.

66. Das, K.C., c-Jun NH2-terminal kinase-mediated redox-dependent degradation of IkappaB: role of thioredoxin in NF-kappaB activation. J Biol Chem, 2001. 276(7): p. 4662-70.

67. Kabe, Y., et al., Redox regulation of NF-kappaB activation: distinct redox regulation between the cytoplasm and the nucleus. Antioxid Redox Signal, 2005. 7(3-4): p. 395-403.

68. Sen, C.K., Cellular thiols and redox-regulated signal transduction. Curr Top Cell Regul, 2000. 36: p. 1-30.

69. Arrigo, A.P., Gene expression and the thiol redox state. Free Radic Biol Med, 1999. 27(9-10): p. 936-44.

70. McEligot, A.J., S. Yang, and F.L. Meyskens, Jr., Redox regulation by intrinsic species and extrinsic nutrients in normal and cancer cells. Annu Rev Nutr, 2005. 25: p. 261-95.

71. Hainaut, P. and K. Mann, Zinc binding and redox control of p53 structure and function. Antioxid Redox Signal, 2001. 3(4): p. 611-23.

72. Williams, C.H., et al., Thioredoxin reductase two modes of catalysis have evolved. Eur J Biochem, 2000. 267(20): p. 6110-7.

73. Lundstrom, J. and A. Holmgren, Protein disulfide-isomerase is a substrate for thioredoxin reductase and has thioredoxin-like activity. J Biol Chem, 1990. 265(16): p. 9114-20.

74. Kumar, S., M. Bjornstedt, and A. Holmgren, Selenite is a substrate for calf thymus thioredoxin reductase and thioredoxin and elicits a large non-stoichiometric oxidation of NADPH in the presence of oxygen. Eur J Biochem, 1992. 207(2): p. 435-39.

75. Bjornstedt, M., et al., Selenium and the thioredoxin and glutaredoxin systems. Biomed Environ Sci, 1997.10(2-3): p. 271-9.

76. Bjornstedt, M., S. Kumar, and A. Holmgren, Selenodiglutathione is a highly efficient oxidant of reduced thioredoxin and a substrate for mammalian thioredoxin reductase. J Biol Chem, 1992. 267(12): p. 8030-4.

77. Nikitovic, D. and A. Holmgren, S-nitrosoglutathione is cleaved by the thioredoxin system with liberation of glutathione and redox regulating nitric oxide. J Biol Chem, 1996. 271(32): p. 19180-5.

78. Bjornstedt, M., et al., The thioredoxin and glutaredoxin systems are efficient electron donors to human plasma glutathione peroxidase. J Biol Chem, 1994. 269(47): p. 29382-4.

79. Zhong, L. and A. Holmgren, Essential role of selenium in the catalytic activities of mammalian thioredoxin reductase revealed by characterization of recombinant enzymes with selenocysteine mutations. J Biol Chem, 2000. 275(24): p. 18121-8.

80. Bjornstedt, M., et al., Human thioredoxin reductase directly reduces lipid hydroperoxides by NADPH and selenocystine strongly stimulates the reaction via catalytically generated selenols. J Biol Chem, 1995. 270(20): p. 11761-4.

81. Holmgren, A. and C. Lyckeborg, Enzymatic reduction of alloxan by thioredoxin and NADPH-thioredoxin reductase. Proc Natl Acad Sci USA, 1980. 77(9): p. 5149-52.

82. Arner, E.S., J. Nordberg, and A. Holmgren, Efficient reduction of lipoamide and lipoic acid by mammalian thioredoxin reductase. Biochem Biophys Res Commun, 1996. 225(1): p. 268-74.

83. May, J.M., et al., Reduction of dehydroascorbate to ascorbate by the selenoenzyme thioredoxin reductase. J Biol Chem, 1997. 272(36): p. 22607-10.

84. Becker, K., et al., Thioredoxin reductase as a pathophysiological factor and drug target. Eur J Biochem, 2000. 267(20): p. 6118-25.

85. Moore, E.C., P. Reichard, and L. Thelander, Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleotides.V. Purification and Properties of Thioredoxin Reductase from Escherichia Coli B. J Biol Chem, 1964. 239: p. 3445-52.

86. Holmgren, A., Hydrogen donor system for Escherichia coli ribonucleoside-diphosphate reductase dependent upon glutathione. Proc Natl Acad Sci USA, 1976. 73(7): p. 2275-9.

87. Bushweller, J.H., et al., Structural and functional characterization of the mutant Escherichia coli glutaredoxin (C14—S) and its mixed disulfide with glutathione. Biochemistry, 1992. 31(38): p. 9288-93.

88. Holmgren, A. and F. Aslund, Glutaredoxin. Methods Enzymol, 1995. 252: p. 28392.

89. Holmgren, A., et al., Thiol redox control via thioredoxin and glutaredoxin systems. Biochem Soc Trans, 2005. 33(Pt 6): p. 1375-7.

90. Wells, W.W., et al., Mammalian thioltransferase (glutaredoxin) and protein disulfide isomerase have dehydroascorbate reductase activity. J Biol Chem, 1990. 265(26): p. 15361-4.

91. Bandyopadhyay, S., et al., Thioltransferase (glutaredoxin) reactivates the DNA-binding activity of oxidation-inactivated nuclear factor I. J Biol Chem, 1998. 273(1): p. 392-7.

92. Hirota, K., et al., Nucleoredoxin, glutaredoxin, and thioredoxin differentially regulate NF-kappaB, AP-1, and CREB activation in HEK293 cells. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 274(1): p. 177-82.

93. Daily, D., et al., Glutaredoxin protects cerebellar granule neurons from dopamine-induced apoptosis by dual activation of the ras-phosphoinositide 3-kinase and jun n-terminal kinase pathways. J Biol Chem, 2001. 276(24): p. 21618-26.

94. Mills, G.C., Hemoglobin catabolism. I. Glutathione peroxidase, an erythrocyte enzyme which protects hemoglobin from oxidative breakdown. J Biol Chem, 1957. 229(1): p. 189-97.

95. Hafeman, D.G., R.A. Sunde, and W.G. Hoekstra, Effect of dietary selenium on erythrocyte and liver glutathione peroxidase in the rat. J Nutr, 1974. 104(5): p. 580-7.

96. Flohe, L., W.A. Gunzler, and H.H. Schock, Glutathione peroxidase: a selenoenzyme. FEBS Lett, 1973. 32(1): p. 132-4.

97. Epp, O., R. Ladenstein, and A. Wendel, The refined structure of the selenoenzyme glutathione peroxidase at 0.2-nm resolution. Eur J Biochem, 1983. 133(1): p. 5169.

98. Ren, B., et al., The crystal structure of seleno-glutathione peroxidase from human plasma at 2.9 A resolution. J Mol Biol, 1997. 268(5): p. 869-85.

99. Sevanian, A., S.F. Muakkassah-Kelly, and S. Montestruque, The influence of phospholipase A2 and glutathione peroxidase on the elimination of membrane lipid peroxides. Arch Biochem Biophys, 1983. 223(2): p. 441-52.

100. Grossmann, A. and A. Wendel, Non-reactivity of the selenoenzyme glutathione peroxidase with enzymatically hydroperoxidized phospholipids. Eur J Biochem, 1983.135(3): p. 549-52.

101. Ursini, F., M. Maiorino, and C. Gregolin, The selenoenzyme phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Biochim Biophys Acta, 1985. 839(1): p. 62-70.

102. Roved, A., et al., Purification and characterization of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase from rat testis mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta, 1994.1208(2): p. 211-21.

103. Maiorino, M., et al., The thioredoxin specificity of Drosophila GPx: a paradigm for a peroxiredoxin-like mechanism of many glutathione peroxidases. J Mol Biol, 2007. 365(4): p. 1033-46.

104. Delaunay, A., A.D. Isnard, and M.B. Toledano, H202 sensing through oxidation of the Yapl transcription factor. Embo J, 2000.19(19): p. 5157-66.

105. Kho, C.W., et al., Gpx3-dependent responses against oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. J Microbiol Biotechnol, 2008. 18(2): p. 270-82.

106. Menezes, R.A., et al., Contribution of Yapl towards Saccharomyces cerevisiae adaptation to arsenic-mediated oxidative stress. Biochem J, 2008. 414(2): p. 30111.

107. Gallogly, M.M. and J.J. Mieyal, Mechanisms of reversible protein glutathionylation in redox signaling and oxidative stress. Curr Opin Pharmacol, 2007. 7(4): p. 381-91.

108. Ланкин, B.3., Бондарь, Т.Н., Тихазе. А.К, Влияние свободных жирных кислот на липопероксидазную активность антиоксидантных ферментов-Se-содержащей глутатионпероксидазы и неселеновой глутатион-S-трансферазы. Докл. АН СССР, 1997. 357(6): р. 828-831.

109. Wallig, М.А., Xenobiotic metabolism, oxidant stress and chronic pancreatitis. Focus on glutathione. Digestion, 1998. 59 Suppl 4: p. 13-24.

110. Ketterer, B. and D.J. Meyer, Glutathione transferases: a possible role in the detoxication and repair of DNA and lipid hydroperoxides. Mutat Res, 1989. 214(1): p. 33-40.

111. Carlson, B.A., et al., Specific excision of the selenocysteine tRNASer.Sec (Trsp) gene in mouse liver demonstrates an essential role of selenoproteins in liver function. J Biol Chem, 2004. 279(9): p. 8011-7.

112. Townsend, D.M., V.L. Findlay, and K.D. Tew, Glutathione S-transferases as regulators of kinase pathways and anticancer drug targets. Methods Enzymol, 2005. 401: p. 287-307.

113. Manevich, Y., S.I. Feinstein, and A.B. Fisher, Activation of the antioxidant enzyme 1-CYS peroxiredoxin requires glutathionylation mediated by heterodimerization with pi GST. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(11): p. 3780-5.

114. Ralat, L.A., et al., Direct evidence for the formation of a complex between 1-cysteine peroxiredoxin and glutathione S-transferase pi with activity changes in both enzymes. Biochemistry, 2006. 45(2): p. 360-72.

115. Ralat, L.A., et al., Characterization of the complex of glutathione S-transferase pi and 1-cysteine peroxiredoxin. Arch Biochem Biophys, 2008. 474(1): p. 109-18.

116. Fomenko, D.E., et al., High-throughput identification of catalytic redox-active cysteine residues. Science, 2007. 315(5810): p. 387-9.

117. Fomenko, D.E., S.M. Marino, and V.N. Gladyshev, Functional Diversity of Cysteine Residues in Proteins and Unique Features of Catalytic Redox-Active Cysteines in Thiol Oxidoreductases. Mol Cells, 2008. 26(3).

118. Hofmann, B., H.J. Hecht, and L. Flohe, Peroxiredoxins. Biol Chem, 2002. 383(3-4): p. 347-64.

119. Poole, L.B. and H.R. Ellis, Flavin-dependent alkyl hydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium. 1. Purification and enzymatic activities of overexpressed AhpFand AhpCproteins. Biochemistry, 1996. 35(1): p. 56-64.

120. Bryk, R., P. Griffin, and C. Nathan, Peroxynitrite reductase activity of bacterial peroxiredoxins. Nature, 2000. 407(6801): p. 211-5.

121. Rhee, S.G., H.Z. Chae, and K. Kim, Peroxiredoxins: a historical overview and speculative preview of novel mechanisms and emerging concepts in cell signaling. Free Radic Biol Med, 2005. 38(12): p. 1543-52.

122. Kim, K., S.G. Rhee, and E.R. Stadtman, Nonenzymatic cleavage of proteins by reactive oxygen species generated by dithiothreitol and iron. J Biol Chem, 1985. 260(29): p. 15394-7.

123. Kim, K., et al., The isolation and purification of a specific "protector" protein which inhibits enzyme inactivation by a thiol/Fe(III)/02 mixed-function oxidation system. J Biol Chem, 1988. 263(10): p. 4704-11.

124. Chae, H.Z., et al., Cloning and sequencing of thiol-specific antioxidant from mammalian brain: alkyl hydroperoxide reductase and thiol-specific antioxidantdefine a large family of antioxidant enzymes. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91(15): p. 7017-21.

125. Chae, H.Z., et al., Cloning, sequencing, and mutation of thiol-specific antioxidant gene of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 1993. 268(22): p. 16815-21.

126. Jackson, A.L., et al., Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. Rna, 2006.12(7): p. 1197-205.

127. Manevich, Y., et al., 1-Cys peroxiredoxin overexpression protects cells against phospholipid peroxidation-mediated membrane damage. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(18): p. 11599-604.

128. Monteiro, G., et al., Reduction of 1-Cys peroxiredoxins by ascorbate changes the thiol-specific antioxidant paradigm, revealing another function of vitamin C. Proc Natl Acad Sci USA, 2007.104(12): p. 4886-91.

129. Pedrajas, J.R., et al., Mitochondria of Saccharomyces cerevisiae contain one-conserved cysteine type peroxiredoxin with thioredoxin peroxidase activity. J Biol Chem, 2000. 275(21): p. 16296-301.

130. Rhee, S.G., et al., Sulfiredoxin, the cysteine sulfinic acid reductase specific to 2-Cys peroxiredoxin: its discovery, mechanism of action, and biological significance. Kidney Int Suppl, 2007(106): p. S3-8.

131. Poole, L.B. and K.J. Nelson, Discovering mechanisms of signaling-mediated cysteine oxidation. Curr Opin Chem Biol, 2008.12(1): p. 18-24.

132. Driscoll, D.M. and P.R. Copeland, Mechanism and regulation of selenoprotein synthesis. Annu Rev Nutr, 2003. 23: p. 17-40.

133. Hatfield, D.L. and V.N. Gladyshev, How selenium has altered our understanding of the genetic code. Mol Cell Biol, 2002. 22(11): p. 3565-76.

134. Carlson, B.A., et al., Identification and characterization of phosphoseryl-tRNASer.Sec kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 2004.101(35): p. 12848-53.

135. Xu, X.M., et al., New developments in selenium biochemistry: selenocysteine biosynthesis in eukaryotes and archaea. Biol Trace Elem Res, 2007. 119(3): p. 234-41.

136. Benton, D., Recent changes in the GenBank On-line Service. Nucleic Acids Res, 1990.18(6): p. 1517-20.

137. Benson, D.A., et al., GenBank. Nucleic Acids Res, 2006. 34(Database issue): p. D16-20.

138. Bairoch, A., et al., Swiss-Prot: juggling between evolution and stability. Brief Bioinform, 2004. 5(1): p. 39-55.

139. Boeckmann, B., et al., The SWISS-PROT protein knowledgebase and its supplement TrEMBL in 2003. Nucleic Acids Res, 2003. 31(1): p. 365-70.

140. Fumoto, M., S. Miyazaki, and H. Sugawara, Genome Information Broker (GIB): • data retrieval and comparative analysis system for completed microbial genomes and more. Nucleic Acids Res, 2002. 30(1): p. 66-8.

141. Adams, M.D., et al., Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science, 1991. 252(5013): p. 1651-6.

142. Lee, Y., et al., The TIGR Gene Indices: clustering and assembling EST and known genes and integration with eukaryotic genomes. Nucleic Acids Res, 2005. 33(Database issue): p. D71-4.

143. Bonilla, M., et al., Platyhelminth mitochondrial and cytosolic redox homeostasis is controlled by a single thioredoxin glutathione reductase and dependent on selenium and glutathione. J Biol Chem, 2008. 283(26): p. 17898-907.

144. Dikiy, A., et al., SelT, SelW, SelH, and Rdxl2: genomics and molecular insights into the functions of selenoproteins of a novel thioredoxin-like family. Biochemistry, 2007. 46(23): p. 6871-82.

145. Lobanov, A.V., et al., Evolutionary dynamics of eukaryotic selenoproteomes: large selenoproteomes may associate with aquatic life and small with terrestrial life. Genome Biol, 2007. 8(9): p. R198.

146. Novoselov, S.V., et al., Identification and characterization of Fepl5, a new selenocysteine-containing member of the Sepl5 protein family. Biochem J, 2006. 394(Pt 3): p. 575-9.

147. Castellano, S., et al., Reconsidering the evolution of eukaryotic selenoproteins: a novel nonmammalian family with scattered phylogenetic distribution. EMBO Rep, 2004. 5(1): p. 71-7.

148. Kryukov, G.V., et al., Characterization of mammalian selenoproteomes. Science, 2003. 300(5624): p. 1439-43.

149. Novoselov, S.V. and V.N. Gladyshev, Non-animal origin of animal thioredoxin reductases: implications for selenocysteine evolution and evolution of protein function through carboxy-terminal extensions. Protein Sei, 2003. 12(2): p. 372-8.

150. Novoselov, S.V., et al., Selenoproteins and selenocysteine insertion system in the model plant cell system, Chlamydomonas reinhardtii. Embo J, 2002. 21(14): p. 3681-93.

151. Gladyshev, V.N., et al., Identification and characterization of a new mammalian glutaredoxin (thioltransferase), Grx2. J Biol Chem, 2001. 276(32): p. 30374-80.

152. Altschul, S.F., et al., Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 1990. 215(3): p. 403-10.

153. Gish, W. and D J. States, Identification of protein coding regions by database similarity search. Nat Genet, 1993. 3(3): p. 266-72.

154. Madden, T.L., R.L. Tatusov, and J. Zhang, Applications of network BLAST server. Methods Enzymol, 1996. 266: p. 131-41.

155. Altschul, S.F., et al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 1997. 25(17): p. 3389-402.

156. Zhang, Z., et al., A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J Comput Biol, 2000. 7(1-2): p. 203-14.

157. Zhang, J. and T.L. Madden, PowerBLAST: a new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. Genome Res, 1997. 7(6): p. 649-56.

158. Gardy, J.L., et al., PSORTb v.2.0: Expanded prediction of bacterial protein subcellular localization and insights gained from comparative proteome analysis. Bioinformatics, 2005. 21(5): p. 617-623.

159. Horton, P. and K. Nakai, Better prediction of protein cellular localization sites with the k nearest neighbors classifier. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol, 1997. 5: p. 147-52.

160. Bannai, H., et al., Extensive feature detection of N-terminal protein sorting signals. Bioinformatics, 2002. 18(2): p. 298-305.

161. Gasteiger, E., et al., ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res, 2003. 31(13): p. 3784-8.

162. Pagni, M., et al., My Hits: improvements to an interactive resource for analyzing protein sequences. Nucleic Acids Res, 2007. 35(Web Server issue): p. W433-7.

163. Emanuelsson, O., et al., Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. J Mol Biol, 2000. 300(4): p. 1005-16.

164. Tusnady, G.E. and I. Simon, Principles governing amino acid composition of integral membrane proteins: application to topology prediction. J Mol Biol, 1998. 283(2): p. 489-506.

165. Hirokawa, T., S. Boon-Chieng, and S. Mitaku, SOSUI: classification and secondary structure prediction system for membrane proteins. Bioinformatics, 1998.14(4): p. 378-9.

166. Matsuda, S., et al., A novel representation of protein sequences for prediction of subcellular location using support vector machines. Protein Sci, 2005. 14(11): p. 2804-13.

167. Soding, J., A. Biegert, and A.N. Lupas, The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucl. Acids Res., 2005. 33(suppl2): p. W244-248.

168. Bendtsen, J.D., et al., Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol, 2004. 340(4): p. 783-95.

169. Jia, P., et al., Prediction of subcellular protein localization based on functional domain composition. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 357(2): p. 366-70.

170. Claros, M.G. and P. Vincens, Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting sequences. Eur J Biochem, 1996. 241(3): p. 779-86.

171. Small, I., et al., Predotar: A tool for rapidly screening proteomes for N-terminal targeting sequences. Proteomics, 2004. 4(6): p. 1581-90.

172. Kneller, D.G., F.E. Cohen, and R. Langridge, Improvements in protein secondary structure prediction by an enhanced neural network. J Mol Biol, 1990. 214(1): p. 171-82.

173. Rost, B., G. Yachdav, and J. Liu, The PredictProtein server. Nucleic Acids Res, 2004. 32(Web Server issue): p. W321-6.

174. Via, A., A. Zanzoni, and M. Helmer-Citterich, Seq2Struct: a resource for establishing sequence-structure links. Bioinformatics, 2005. 21(4): p. 551-3.

175. Shi, J., T.L. Blundell, and K. Mizuguchi, FUGUE: sequence-structure homology recognition using environment-specific substitution tables and structure-dependent gap penalties. J Mol Biol, 2001. 310(1): p. 243-57.

176. Bryson, K., et al., Protein structure prediction servers at University College London. Nucleic Acids Res, 2005. 33(Web Server issue): p. W36-8.

177. Jones, D.T., Improving the accuracy of transmembrane protein topology prediction using evolutionary information. Bioinformatics, 2007. 23(5): p. 53844.

178. Jones, D.T., W.R. Taylor, and J.M. Thornton, A model recognition approach to the prediction of all-helical membrane protein structure and topology. Biochemistry, 1994. 33(10): p. 3038-49.

179. Painter, J. and E.A. Merritt, Optimal description of a protein structure in terms of multiple groups undergoing TLS motion. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2006. 62(Pt 4): p. 439-50.

180. Korotkov, K.V., et al., Mammalian selenoprotein in which selenocysteine (Sec) incorporation is supported by a new form of Sec insertion sequence element. Mol Cell Biol, 2002. 22(5): p. 1402-11.

181. Higgins, D.G. and P.M. Sharp, CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene, 1988. 73(1): p. 237-44.

182. Chenna, R., et al., Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acids Res, 2003. 31(13): p. 3497-500.

183. Larkin, M.A., et al., Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 2007. 23(21): p. 2947-8.

184. Fink, W.L., Microcomputers and Phylogenetic Analysis. Science, 1986. 234(4780): p. 1135-1139.

185. DeSalle, R., C. Wray, and R. Absher, Computational problems in molecular systematics. Exs, 1994. 69: p. 353-70.

186. Page, R.D., Visualizing phylogenetic trees using TreeView. Curr Protoc Bioinformatics, 2002. Chapter 6: p. Unit 6 2.

187. Morrison, D.A., Phylogenetic tree-building. Int J Parasitol, 1996. 26(6): p. 589617.

188. Highton, R., Molecular phytogeny of plethodonine salamanders and hylid frogs: statistical analysis of protein comparisons. Mol Biol Evol, 1991. 8(6): p. 796818.

189. Gascuel, O. and M. Steel, Neighbor-joining revealed. Mol Biol Evol, 2006. 23(11): p. 1997-2000.

190. Kryukov, G.V., V.M. Kryukov, and V.N. Gladyshev, New mammalian selenocysteine-containing proteins identified with an algorithm that searches for selenocysteine insertion sequence elements. J Biol Chem, 1999. 274(48): p. 33888-97.

191. Castellano, S., et al., In silico identification of novel selenoproteins in the Drosophila melanogaster genome. EMBO Rep, 2001. 2(8): p. 697-702.

192. Kryukov, G.V. and V.N. Gladyshev, Mammalian selenoprotein gene signature: identification and functional analysis of selenoprotein genes using bioinformatics methods. Methods Enzymol, 2002. 347: p. 84-100.

193. Boon, K., et al., An anatomy of normal and malignant gene expression. Proc Natl Acad Sei USA, 2002. 99(17): p. 11287-92.

194. Pylouster, J., C. Senamaud-Beaufort, and T.E. Saison-Behmoaras, WEBSAGE: a web tool for visual analysis of differentially expressed human SAGE tags. Nucleic Acids Res, 2005. 33(Web Server issue): p. W693-5.

195. Studier, F.W. and B.A. Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol, 1986.189(1): p. 113-30.

196. Rosenberg, A.H., et al., Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene, 1987. 56(1): p. 125-35.

197. Studier, F.W., et al., Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol, 1990.185: p. 60-89.

198. Derman, A.I., et al., Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli. Science, 1993. 262(5140): p. 1744-7.

199. Sun, Y., et al., The molecular mechanism of protecting cells against oxidative stress by 2-selenium-bridged beta-cyclodextrin with glutathione peroxidase activity. Biochim Biophys Acta, 2005.1743(3): p. 199-204.

200. Sawadogo, M. and M.W. Van Dyke, Indirect use of immobilized metal affinity chromatography for isolation and characterization of protein partners. Genet Eng (N Y), 1995.17: p. 53-65.

201. Hochuli, E., H. Dobeli, and A. Schacher, New metal chelate adsorbent selectiveifor proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr, 1987. 411: p. 177-84.

202. Kunkel, T.A., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA, 1985. 82(2): p. 488-92.

203. Zhdanov, R.I., O.V. Podobed, and V.V. Vlassov, Cationic lipid-DNA complexes-lipoplexes-for gene transfer and therapy. Bioelectrochemistry, 2002. 58(1): p. 5364.

204. Rocha, A., S. Ruiz, and J.M. Coll, Improvement ofDNA transfection with cationic liposomes. J Physiol Biochem, 2002. 58(1): p. 45-56.

205. Graham, F.L. and A.J. van der Eb, A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 1973. 52(2): p. 456-67.

206. Wigler, M., et al., Biochemical transfer of single-copy eucaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell, 1978.14(3): p. 725-31.

207. Kassavetis, G.A., et al., Bacteriophage SP6-specific RNA polymerase. II. Mapping of SP6 DNA and selective in vitro transcription. J Biol Chem, 1982. 257(10): p. 5779-88.

208. Kessler, C., et al., Non-radioactive labeling and detection of nucleic acids. I. A novel DNA labeling and detection system based on digoxigenin: anti-digoxigenin ELISA principle (digoxigenin system). Biol Chem Hoppe Seyler, 1990. 371(10): p. 917-27.

209. Fedorov, Y., et al., Different delivery methods-different expression profdes. Nat Methods, 2005. 2(4): p. 241.

210. Boese, Q., et al., Mechanistic insights aid computational short interfering RNA design. Methods Enzymol, 2005. 392: p. 73-96.219.220.221.222.223.224.225.226.

211. Birmingham, A., et al., A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nat Protoc, 2007. 2(9): p. 2068-78.

212. Anderson, E., et al., Identifying siRNA-induced off-targets by microarray analysis. Methods Mol Biol, 2008. 442: p. 45-63.

213. Mieyal, J.J., et al., Thioltransferase in human red blood cells: purification and properties. Biochemistry, 1991. 30(25): p. 6088-97.

214. Raghavachari, N. and M.F. Lou, Evidence for the presence of thioltransferase in the lens. Exp Eye Res, 1996. 63(4): p. 433-41.

215. Ursini, F., et al., Diversity of glutathione peroxidases. Methods Enzymol, 1995. 252: p. 38-53.