Новые подвижные фазы для формирования внутренних градиентов pH в катионообменных системах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Вакштейн, Максим Сергеевич

• Вакштейн, Максим Сергеевич
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Вакштейн, Максим Сергеевич

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИЕ НА АНИОНООБМЕННЫХ И КАТИОНООБМЕННЫХ КОЛОНКАХ.

1.1. Принципы разделения цвиттер-ионных макромолекул методом ХФ.

1.2. Разделение переходных металлов методом ХФ.

1.3. Ионообменные сорбенты для хроматофокусирования.

1.3.1. Матрица.

1.3.2. Функциональные группы.

1.4. Катионообменные сорбенты.

1.4.1. Разделение белков.

1.4.2. Разделение пептидов.

1.5. Подвижные буферные фазы в градиентном элюировании.

1.5.1. Стартовые (уравновешивающие) растворы.

1.5.2. Элюенты, используемые в хроматофокусировании.

1.5.2.1. Полибуферные элюенты (полиамфолиты, полибуферы).

1.5.2.2. Многокомпонентные буферные смеси.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ФОРМИРОВАНИЯ ГРАДИЕНТОВ РН.

2.1. Моделирование градиентов рН.

2.1.1. Модель Слайтермана.

2.1.2. Модель Мурела.

2.1.3. Модель Фрея.

2.1.4. Модель Тессмана.

2.2. Изучение процессов формирования градиентов рН.

2.2.1. Влияние ионной силы.

2.2.2. «Аномальный» подъем.

2.2.3. Совместное влияние ионной силы и слабого основания в подвижных фазах.

2.2.4. Примеры разделения.

ГЛАВА 3. ИНДУЦИРОВАННЫЕ ГРАДИЕНТЫ РН.

ГЛАВА 4. АППАРАТУРА, РЕАГЕНТЫ, МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

4.1. Аппаратура.

4.2. Сорбенты, реагенты, растворы.

4.3. Методики экспериментов.

ГЛАВА 5. СВОЙСТВА КАРБОКСИЛЬНЫХ СОРБЕНТОВ.

5.1. Выбор сорбента для ХФ металлов.

5.2. Кислотно-основные свойства карбоксильных сорбентов.

5.3. Комплексообразующие свойства СМ-52.

5.4. Сравнение свойств карбоксильных сорбентов.

5.4.1. Кинетика сорбции.

5.4.2. Комплексообразующие свойства карбоксильных сорбентов.

5.4.3. Сорбционная емкость.

5.4.4. Селективность сорбции.

5.4.5. Извлечение ионов Си2+ в зависимости от рН.

ГЛАВА 6. НИСХОДЯЩИЕ ГРАДИЕНТЫ РН В ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИИ.

6.1. Выбор подвижных фаз.

6.1.1. Полиамфолитные элюенты.

6.1.2. Влияние природы стартового раствора.

6.1.3. Простые элюенты.

6.2. Влияние ионной силы элюента.

6.3. Разделение переходных металлов.

6.4. Градиент ионной силы.

ГЛАВА 7. ИНДУЦИРОВАННЫЕ НИСХОДЯЩИЕ ГРАДИЕНТЫ РН.

7.1. Выбор подвижных фаз.

7.1.1. Влияние концентрации ИР.

7.1.2. Влияние концентрации элюента.

7.1.3. Влияние слабого основания в составе элюента.

7.1.4. Влияние природы элюента.

7.1.5. Влияние ионной силы подвижных фаз.

7.1.6. Влияние природы электролита в составе элюента.

7.1.7. Ацетатная система.

7.2. Разделение ионов металлов.

ГЛАВА 8. ВОСХОДЯЩИЕ ГРАДИЕНТЫ РН В ХРОМАТОФОКУСИРОВАНИИ.

8.1. Выбор подвижных фаз.

8.1.1. Влияние природы и концентрации стартового раствора.

8.1.2. Влияние природы элюента.

8.1.3. Влияние слабого основания в составе стартового раствора.

8.2. Влияние ионной силы элюента.

8.3. Разделение модельной смеси белков.

8.4. Влияние ионной силы стартового раствора.

8.5. Восходящие градиенты рН на сорбенте для ВЭЖХ.

8.5.1. Влияние ионной силы подвижных фаз.

8.5.2. Разделение изоформ ферментов.

8.6. Восходящие градиенты рН на сильных катионообменниках.

8.6.1. Влияние ионной силы элюента.

8.6.2. Разделение пептидов.

8.6.2.1. Выбор подвижных фаз.

8.6.2.2. Влияние ионной силы стартового раствора.

8.6.2.3. Влияние добавок ацетонитрила.

8.6.2.4. Влияние ионной силы элюента.

8.6.2.5. Одновременное влияние ионной силы и добавок ацетонитрила.

ВЫВОДЫ:.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые подвижные фазы для формирования внутренних градиентов pH в катионообменных системах»

Актуальность работы. Ионообменная и комплексообразовательная хроматография находят все большее применение в аналитической химии за счет расширения круга определяемых соединений и появления все новых модификаций данных вариантов жидкостной хроматографии. Одним из важнейших параметров, позволяющих повышать селективность разделения, является рН подвижной фазы. Часто в хроматографии используют градиентное элюирование, т.е. изменяют состав элюента по определенному правилу. Так, в 1979 г. Слайтерман разработал хроматофокусирование (ХФ) - метод ионообменной хроматографии, основанный на элюировании с внутренним (создаваемым внутри колонки) градиентом рН. В настоящее время используют две техники формирования градиентов рН - «классическое» хроматофокусирование и индуцирование. ХФ обычно применяют для разделения биологических объектов - белков, пептидов, аминокислот, реже азокрасителей и других цвиттер-ионных соединений. В начале 1990-х П.Н. Нестеренко и А.В. Ивановым был предложен метод концентрирования и разделения переходных металлов на одной колонке с использованием техники хроматофокусирования. Традиционно для этих целей формируют нисходящие градиенты рН на анионообменных сорбентах. Однако комплексообразование ионов металлов с аминогруппами является многоступенчатым процессом с медленной кинетикой, в связи с чем целесообразен переход к катионообменным карбоксильным сорбентам.

Хроматофокусирование на катионообменных сорбентах является малоизученным, развивающимся методом разделения и концентрирования цвиттер-ионных соединений. Метод применим для разделения цвиттер-ионов с положительным зарядом в кислой среде, становящихся незаряженными в целом в нейтральной или щелочной средах, что характерно для белков и пептидов. Традиционно в данном методе используют подходы, характерные для ХФ на анионообменных сорбентах. В частности, применяют полиамфолитные элюенты, обладающие рядом недостатков - высокой ценой, склонностью к биодеградации, взаимодействием с разделяемыми компонентами и значительным светопоглощением в используемой для детектирования области спектра. Актуальна замена подобных подвижных фаз на более простые, не имеющие таких ограничений.

Перспективно изучение нисходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок из-за возможности применения их для разделения и концентрирования переходных металлов. Несмотря на высокий уровень развития метода ХФ в целом, в литературе отсутствуют данные по нисходящим внутренним градиентам на катионообменных колонках. Также не изучен другой вариант хроматофокусирования - индуцирование градиентов рН в слое катионообменного сорбента.

При хроматофокусировании пептидов не удается проводить УФ детектирование при оптимальных длинах волн (ниже 254 нм) из-за высокого фонового поглощения компонентов подвижных фаз. Поиск простых элюентов, позволяющих регистрировать сигнал пептидов при 214 нм, является очень важной задачей при анализе гидролизатов белков.

Цель и задачи исследования.

• Изучение кислотно-основных и комплексообразующих свойств карбоксильных сорбентов. Определение селективности данных сорбентов по отношению к ионам переходных металлов в зависимости от рН в статических условиях.

• Формирование внутренних, нисходящих и восходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок при использовании техники «классического» хроматофокусирования и техники индуцирования.

• Изучение влияния на профиль градиентов рН состава, концентрации и ионной силы подвижных фаз (стартовых и индуцирующих растворов, элюентов) с целью получения линейных градиентов в широком диапазоне рН.

• Демонстрация принципиальной возможности разделения ионов переходных металлов на катионообменниках при использовании вышеупомянутых техник формирования градиентов рН внутри хроматографических колонок.

• Разделение смесей белков и пептидов методом хроматофокусирования с использованием простых низкомолекулярных элюентов.

Научная новизна. Получены нисходящие градиенты рН внутри катионообменных карбоксильных колонок при использовании техники хроматофокусирования. Изучены основные закономерности формирования подобных градиентов и разработаны подходы, позволяющие варьировать профиль градиента в широких пределах в зависимости от целей анализа. Ионная сила подвижных фаз существенно влияет на процессы, протекающие внутри колонки, что позволяет управлять формой градиента. Предложены простейшие одно-двухкомпонентные элюенты, которые в сочетании с варьированием ионной силы могут успешно заменить дорогостоящие коммерческие полиамфолитные буферные растворы. Показана возможность разделения ионов переходных металлов методом хроматофокусирования на катионообменных карбоксильных сорбентах.

Предложено использование техники индуцирования для формирования нисходящих градиентов рН внутри катионообменных колонок. Исследовано влияние природы и состава подвижный фазы и индуцирующего раствора на профиль градиентов рН. Подобраны новые индуцирующие растворы и простые элюенты, ранее не использовавшиеся в данном методе. Возможности простых элюентов показаны на примере разделения модельных смесей металлов на карбоксильной колонке в условиях нисходящего градиента рН.

Найдены условия для формирования линейных восходящих градиентов рН методом хроматофокусирования на катионообменных колонках при использовании простых элюентов. Модельные смеси белков разделены методом ХФ при использовании двухкомпонентного элюента в сочетании с высокой ионной силой.

Новым направлением развития хроматофокусирования для разделения пептидов является использование сильных катионообменников. При хроматофокусировании смесей пептидов значительно улучшены условия детектирования за счет замены традиционно используемых полиамфолитных буферных элюентов простыми смесями низкомолекулярных протолитов.

Практическая значимость работы. Предложены рекомендации по формированию нисходящих градиентов рН на новом для хроматофокусирования типе сорбентов - карбоксильных катионообменных сорбентах. Показана принципиальная возможность использования техники индуцирования и техники «классического» хроматофокусирования для разделения переходных металлов на катионообменниках с УФ-детектированием.

Подобраны условия, в которых простые одно-двухкомпонентные элюенты могут заменить дорогостоящие и обладающие целым рядом недостатков коммерческие полиамфолитные буферные растворы для формирования градиентов рН внутри катионообменных колонок. В данных условиях разделены смеси белков и пептидов. При хроматофокусировании трипсиновых пептидов предложен подход, позволяющий проводить детектирование при низких длинах волн (214 нм), что значительно расширяет количество регистрируемых соединений в гидролизате белка.

Положения, выносимые на защиту.

1. Данные по кислотно-основным и сорбционным свойствам карбоксильных сорбентов СМ-52, Ольвагель-СООН, МасгоРгер 50 CM, MN.

2. Применение катионообменных сорбентов для формирования нисходящих и восходящих градиентов рН.

3. Результаты по изучению влияния ионной силы подвижных фаз на профиль внутренних градиентов рН, формируемых на катионообменниках.

4. Применение техники индуцирования и техники «классического» хроматофокусирования для разделения модельных смесей переходных металлов.

5. Способы получения линейных градиентов рН с простыми низкомолекулярными одно-двухкомпонентными элюентами вместо полиамфолитных.

6. Данные по разделению смесей белков на слабых катионообменниках методом хроматофокусирования при создании градиента рН простыми элюентами.

7. Метод разделения смесей пептидов при одновременном формировании градиентов рН и ионной силы внутри колонки, позволяющий проводить детектирование при 214 нм.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов "Ломоносов-2000, 2003, 2005". (Москва, МГУ); Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, РАН, 2000); Международных симпозиумах по ионной хроматографии (IICS-2000, 2004) (Франция, Ницца, 2000; Германия, Трир, 2004); Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, РАН, 2001); Всероссийском симпозиуме "Современные проблемы хроматографии", посвященного 100-летию К.В.Чмутова (Москва, РАН, 2002); 3-м международном симпозиуме по разделению в бионауках (SBS-03) "100 лет хроматографии" (Москва, 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии". (Саратов, СГУ, 2003); 10-й Международной конференции "Разделение ионных соединений" (SIS'03) (Словакия, Высокие Татры, Подбаньске, 2003); XVI! Международном Менделевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, КазНЦ РАН, 2003); Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хроматографические приборы" (Москва, РАН, 2004); Международном симпозиуме по компьютерным приложениям и хемометрике в аналитической химии (SCAC-2004) (Венгрия, Вешпрем, оз. Балатон, 2004); VII Всероссийской конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока" (Новосибирск, 2004); "Ломоносовских чтениях-2005" (Москва, МГУ); Международной конференции "Analytical Chemistry and Chemical Analysis" (AC&CA-05) (Украина, Киев, 2005); II Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар, 2005); X Международной конференции "Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии". (Москва, РАН, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей и 19 тезисов докладов:

1. Иванов A.B., Тессман А.Б., Вакштейн М.С. Влияние состава подвижных фаз на профиль начального участка градиента pH в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2000. Т. 41. №4. С.251-255.

2. Тессман А.Б., Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Влияние ионной силы и присутствия слабого основания на профиль градиента pH в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 2001. Т. 75. №2. С.342-347.

3. Иванов A.B., Тессман А.Б., Нестеренко П.Н., Вакштейн М.С., Матвеев A.B. Ионная сила стартового раствора как эффективное средство оптимизации в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2001. Т.42. №2. С.109-111.

4. Тессман А.Б., Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Сравнение протолитических свойств кремнеземов с привитыми аминогруппами для моделирования внутренних градиентов pH. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2002. Т.43. №1. С.13-16.

5. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Формирование нисходящего градиента pH внутри колонки с карбоксильным катионообменником. // Журн. физич. химии. 2003. Т. 77. №1. С.137-139.

6. Вакштейн М.С., Иванов A.B., Нестеренко П.Н., Хасанова Е.М. Использование карбоновых кислот для формирования нисходящих градиентов pH внутри колонки, заполненной сверхсшитым полистиролом с карбоксильными группами. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т. 44. №4. С.258-263.

7. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Хасанова Е.М. Оптимизация профиля градиента pH внутри карбоксильных колонок за счет ионной силы подвижных фаз. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т. 44. №5. С.318-323.

8. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Хасанова Е.М., Чернышев И.А., Януль Н.Ю. Сорбция ионов переходных металлов и свинца на карбоксиметилцеллюлозном сорбенте СМ-52. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2003. Т. 44. №6. С.412-416.

9. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н., Хасанова Е.М. Способ формирования внутренних градиентов pH в хроматографической колонке с карбоксильным катионообменником. //Журн. физич. химии. 2003. Т. 77. №12. С.2241-2245.

10. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Хасанова Е.М, Нестеренко П.Н. Влияние сильного электролита в подвижных фазах на индуцирование градиента pH внутри карбоксильной колонки. //Журн. физич. химии. 2005. Т.79. №5. С.814-817.

11. Vakstein M.S., Nesterenko P.N., Ivanov A.V., Tessman A.B. Single-Component Eluents for Quasi-Linear pH Gradients in Weak Cation Exchange Columns. // J. of Liquid Chromatogr. & Related Techn. 2006. V.29. №4. P.485-496.

12. Иванов A.B., Тессман А.Б., Вакштейн M.C. Формирование линейных градиентов pH в хроматофокусировании при использовании элюентов простого состава. / Тез. докл. Всеросс. конф. "Химический анализ веществ и материалов". Москва, РАН, 16-21 апреля 2000. С.119.

13. Tessman A.B., Ivanov A.V., Vakshtein M.S. Quasi-Linear pH Gradients for Chromatofocusing Using Simple Eluents: Computer Modeling and Experimental Verification. I Proc. International Ion Chromatogr. Symposium (IICS-2000). France, Nice, 11-14 September 2000. № 143.

14. Иванов A.B., Тессман А.Б., Вакштейн M.C., Нестеренко П.Н. Сравнение протолитических свойств кремнеземов с привитыми аминогруппами для моделирования в хроматофокусировании. / Тез. докл. VIII Всеросс. симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу. Москва, РАН, 15-19 октября 2001 г. С.66.

15. Иванов A.B., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Формирование нисходящих градиентов pH в колонках, заполненных карбоксильными > катионообменниками. / Тез. докл. Всеросс. симпозиума "Современные проблемы хроматографии", посвященного 100-летию К.В.Чмутова. Москва, РАН, 18-22 марта 2002. №40.

16. Хасанова Е.М., Вакштейн М.С. Простые элюенты для формирования градиентов pH внутри колонок с карбоксильными сорбентами. / Тез. докл. Международ, конф. студентов и аспирантов "Ломоносов-2003". М.: МГУ, 15-18 апреля 2003. С.46.

17. Vakstein M.S., Ivanov A.V., Nesterenko P.N., Tessman A.B. Linear pH gradient for chromatofocusing using single-component eluents within carboxylic column. I "100

Years of Chromatography". Abstr. of 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies (SBS-03). Moscow, 13-18 May 2003. №211. P.321.

18. Вакштейн M.C., Иванов A.B., Хасанова E.M., Чернышев И.А., Януль Н.Ю. Сорбция ионов переходных металлов на карбоксильном катионообменнике СМ-52. / Тез. докл. IV Всеросс. конф. молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии". Саратов, СГУ, 23-25 июня 2003 г. С.141. (доклад получил диплом III степени от Оргкомитета конференции).

19. Vakstein M.S., Ivanov A.V., Nesterenko P.N., Dubovik D.B. A single-component eluent for generation of pH gradients within column packed with hyper-crosslinked polystyrene having attached carboxylic groups. / Abstr. of 10-th International Conf. "Separation of Ionic Solutes" (SIS'03). Slovakia, High Tatras, Podbanske, 6-11 September 2003. P.138-139.

20. Нестеренко П.Н., Иванов А.В., Вакштейн M.C., Тессман А.Б. Нисходящие градиенты рН внутри слабоосновных и слабокислотных ионообменных колонок. / Тез. докл. XVII Международного Менделевского съезда по общей и прикладной химии. Казань, КазНЦ РАН, 21-26 сентября 2003. Т.2. С.123. (№ А-556).

21. Нестеренко П.Н., Вакштейн М.С., Иванов А.В., Хасанова Е.М., Кубышев С.С. Индуцирование градиентов рН в какрбоксильных колонках и в тонких капиллярах со свободной неподвижной фазой. / Тез. докл. Всеросс. симп. "Хроматография и хроматографические приборы". М.: РАН, 15-19 марта 2004. №131. С.161.

22. Ivanov А.V., Chirkov V.V., Tessman А.В., Garmash A.V., Vakstein M.S. The Computer Database on Internal pH-Gradients in ion-Exchange Chromatography. / Abstr. of Symposium on Computer Application and Chemometrics in Analytical Chemistry (SCAC-2004). Hungary, Veszprem, Lake Balaton, 31 August - 3 September 2004. № P-05.

23. Vakstein M.S., Ivanov A.V., Khasanova E.M., Nesterenko P.N. Induced QuasiLinear pH Gradients within Cation-Exchange Carboxylic Column. / Abstr. of 17th International ion Chromatography Symposium (IICS-2004). Germany, Trier, 20-23 September 2004. P-05-T. P.53-54.

24. Вакштейн M.C., Иванов A.B., Нестеренко П.Н., Смирнова Н.Ю., Хасанова Е.М., Чернышев И.А. Комплексообразующие свойства карбоксильных сорбентов для хроматофокусирования. / Тез. докл. VII конф. "Аналитика Сибири и Дальнего Востока". Новосибирск, 11-16 октября 2004 г. Секция III. № СД-Ш-7.

25. Вакштейн М.С. Физико-химические аспекты формирования градиентов рН внутри катионообменных колонок. / Тез. докл. Международ, конф. студентов и аспирантов "Ломоносов-2005". М.: МГУ, 12-15 апреля 2005. С.11.

26. Иванов А.В., Вакштейн М.С., Нестеренко П.Н. Поиск простых элюентов для формирования градиентов рН в слабоосновных и слабокислотных ионообменных колонках. / Тез. докл. конф. "Ломоносовские чтения-2005". М.: МГУ, 18-23 апреля 2005. С.19.

27. Ivanov A.V., Nesterenko P.N., Vakstein M.S., Kubyshev S.S. Induced decreasing pH gradients in chelating chromatography. I Abstr. International Conf. "Analytical Chemistry and Chemical Analysis" (AC&CA-05) (to the 100-th anniversary of A.Babko). Ukraine, Kiev, 12-18 September 2005. № P1-29.

28. Вакштейн M.C., Иванов A.B., Нестеренко П.Н., Кубышев С.С. Индуцированные градиенты рН в колонках с комплексообразующими сорбентами. / Тез. докл. II Межд. симп. "Разделение и концентрирование в аналитической химии (к юбилею акад. Б.Ф.Мясоедова). Краснодар, 25-30 сентября 2005 г. С. 140.

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Вакштейн, Максим Сергеевич

66 Kang X., Frey D.D. Chromatofocusing using micropellicular column packings with computer-aided design of the elution buffer composition. // Anal. Chem. 2002. V.74. N5. P.1038-1045.

67 Murel A., Vilde S., Pank M., Shevchuk I., Kirret O. Chromatophoresis: a new approach to theory and practice of chromatofocusing. I. General principles. // J. Chromatogr. 1985. V.347. P.325-334.

68 Murel A., Vilde S., Pank M., Shevchuk I., Kirret O. Chromatophoresis: a new approach to theory and practice of chromatofocusing. II. Experimental verification. // J. Chromatogr. 1986. V.362. P.101-112.

69 Frey D.D., Barnes A., Strong J. Numerical studies of multicomponent chromatography using pH-gradient. //AlChE J. 1995. V.41. N5. P.1171-1183.

70 Хроматофокусирование полибуфером на ПБИ. (russian translation).Stockholm-Uppsala: LKB, 1981. 44 с.

71 R. Mhatre, W. Nashabeh, D. Schmalzing, X. Yao, M. Fuchs, D. Whitney and F. Regnier. Purification of antibody Fab fragments by cation-exchange chromatography and pH gradient elution // J. Chromatogr. A. 1995. V.707, P.225-231.

72 Yang Y-B., Harrison K. and Kindsvater J. Characterization of a novel stationary phase derived from a hydrophilic polystyrene-based resin for protein cation-exchange high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A, 1996. V.723. P.1 -10.

73 Malmquist G. and Lundell N. Characterization of the influence of displacing salts on retention in gradient elution ion-exchange chromatography of proteins and peptides // J. Chromatogr. A. 1992. V.627. P.107-124.

74 Barnidge D.R., Tschumper R.C., Jelinek D.F., Muddiman D.C. and Kay N.E. Protein expression profiling of CLL В cells using replicate off-line strong cation exchange chromatography and LC-MS/MS // J. Chromatogr. B. 2005. V.819. P.33-39.

75 Bihan T.L., Duewel H.S. and Figeys D. On-line strong cation exchange |j-HPLC-ESI-MS/MS for protein identification and process optimization // J. Am. Soc. Mass Spectr. 2003. V.14. P.719-727.

76 Granger M., Todorov S.D., Matthew M.K., Dicks L.M. Growth of Enterococcus mundtii ST15 in medium filtrate and purification of bacteriocin ST15 by cation-exchange chromatography. // J Basic Microbiol. 2005. V.45. P.419-25.

77 Mirzaei H., Regnier F. Enrichment of carbonylated peptides using Girard P reagent and strong cation exchange chromatography. //Anal. Chem. 2006. V.78. P.770-778.

78 Francina A., Dorleac E., Cloppet H., Delaunay J. Chromatofocusing of human hemoglobins: application to the quantitation of hemoglobin A2. // J. Chromatogr. 1982. V.228. P.177-185.

79 Slais К. Simultaneous conductivity and potentiometric detector for miniaturized liquid chromatography and flow analysis.//J. Chromatogr. 1991. V.540. P.41-51.

80 Muller W. New ion exchangers for the chromatography of biopolymers // J. Chromatogr. 1990. V.510. P.133-140.

81 Weitzhandler M., Farnan D., Horvath J., Rohrer J.S., Slingsby R.W., Avdalovic N., Pohl C. Protein variant separations by cation-exchange chromatography on tentacle-type polymeric stationary phases // J. Chromatogr. A 1998. V.828. P.365-372.

82 Alpert A.J. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of proteins on poly(aspartic acid)—silica II J. Chromatogr. 1983. V.266. P.23-37.

83 Ofman R., Wanders R.J.A. Purification of peroxisomal acyl-CoA: dihydroxyacetonephosphate acyltransferase from human placenta. // Biochim. Biophys. Acta 1994. V.1206. N1. P.27-34.

84 Jacob L., Beecken V., Bartunik L.J., Rose M., Bartunik H.D. Purification and crystallization of yeast hexokinase isoenzymes: Characterization of different forms by chromatofocusing. //J. Chromatogr. 1991. V.587. P.85-92.

85 Wall R.A. Separation of peptides on macroreticular ion exchangers. // Anal. Biochem. 1970. V.35. N1. P.203-208.

86 Alpert A.J, Andrews P.C. Cation-exchange chromatography of peptides on poly(2-sulfoethyl aspartamide)-silica. // J. Chromatogr. 1988. V.443. P.85-96.

87 Croft L.R. Handbook of protein sequence analysis: a compilation of amino acid sequences of proteins with an introduction to the methodology. New York: Wiley, 1980. 628 p.

88 Fermo I, De Vecchi E., Diomede L., Paroni R. Serum amino acid analysis with pre-column derivatization: comparison of the o-phthaldialdehyde and N,N-diethyl-2,4-dinitro-5-fiuoroaniline methods. II J. Chromatogr. 1990. V.534. P.23-35.

89 Gulati D., Bongers J., Burman S. RP-HPLC tryptic mapping of lgG1 proteins with post-column fluorescence derivatization. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. V.21. N5. P.887-893.

90 Liu H., Cho B.-Y., Strong R., Krull I.S., Cohen S., Chan K.C., Issaq H.J. Derivatization of peptides and small proteins for improved identification and detection in capillary zone electrophoresis (CZE)// Anal. Chim. Acta1999. V.400. P.181-209.

91 Mantabe T. Capillary electrophoresis of proteins for proteomic studies. // Electrophoresis 1999. V.20. P.3116-3121.

92 Mazzeo J.R., Martineau J.A., Krull I.S. Peptide mapping using EOFDriven capillary isoelectric focusing. // Anal. Biochem. 1993. V.208 P.323- 329.

93 Mohan D., Lee C.S. Extension of separation range in capillary isoelectric focusing for resolving highly basic biomolecules. //J. Chromatogr. A. 2002. V.979 P.271-276.

94 Shen Y., Berger S.J., Anderson G.A., Smith R.D. High-efficiency capillary isoelectric focusing of peptides. II Anal. Chem. 2000. V.72 P.2154- 2159.

95 Bates R.C., Frey D.D. Quasi-linear pH gradients for chromatofocusing using simple buffer mixtures: local equibrium theory and experimental verification. // J. Chromatogr. 1998. V.814. P.43-54.

96 Righetti P.G., Gianazza E., Bjellqvist B. Modern aspects of isoelectric focusing: two-dimensional maps and immobilized gradients. // J. Biochem.Biophys.Methods. 1983. V.8 N 2. P.89-108.

97 Righetti P.G., Pagani M., Gianazza E. Characterization of synthetic carrier ampholytes for isoelectrofocusing.//J. Chromatogr. 1975. V.109. P.341-356.

98 Charlionet R., Martin J.P., Sesboue R., Madec P.J., Lefebvre F. Synthesis of highly diversified carrier ampholytes. Evaluation of the resolving power of isoelectric focusing in the Pi-system.//J. Chromatogr. 1979. V.176. P.89-101.

99 Charlionet R., Morcamp C., Sesboue R., Martin J.P. Limiting factors for the resolving power of isoelectric focusing in natural pH-gradient. // J. Chromatogr. 1981. V.205. P.355-366.

100 Liu Y., Anderson D.J. Gradient chromatofocusung high-performance liquid chromatography I. Practical aspects. // J. Chromatogr. 1997. V.762. P.207-217.

101 Strong J.C., Frey D.D. Experimental and numerical studies of the chromatofocusing of dilute proteins using retained pH gradients formed on a strong-base anion-exchange column.//J. Chromatogr. A 1997. V.769. P.129-143.

102 Иванов A.B., Тессман А.Б., Нестеренко П.Н., Вакштейн М.С., Матвеев А.В. Ионная сила стартового раствора как эффективное средство оптимизации в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2001. Т.42. №2. С.109.

103 Frey D.D. Local-Equilibrium Behavior of Retained pH and Ionic Strength Gradients in Preparative Chromatography. // Biotechnol. Prog. 1996. V12. N1. P.65-72.

104 Farnan D., Frey D.D., Horvath C. Intraparticle Mass Transfer in High-Speed Chromatography of Proteins. // Biotechnol. Prog. 1997. V.13. N4. P.429-439.

105 Narahari C.R, Strong J.C., Frey D.D. Displacement chromatography of proteins using a self-sharpening pH front formed by adsorbed buffering species as the displacer. II J. Chromatogr. 1998. V.825. P.115-126.

106 Bates R.C., Kang X., Frey D.D. High-performance chromatofocusing using linear and concave pH gradients formed with simple buffer mixtures: I. Effect of buffer composition on the gradient shape. // J. Chromatogr. 2000. V.890. P.25-36.

107 Narahari C.R., Randers-Eichhorn L., Strong J.C., Ramasubramanyan N., Rao G., Frey D. D. Purification of Recombinant Green Fluorescent Protein Using Chromatofocusing with a pH Gradient Composed of Multiple Stepwise Fronts II Biotechnol. Prog. 2001. 17. P.150.

108 Frey D.D., Narahari C.R., Butler C.D. General Local-Equilibrium Chromatographic Theory for Eluents Containing Adsorbing Buffers // AlChE J. 2002. V.48. N3. P.561-571.

109 Farnan D., Frey D.D., Horvath Cs. Surface and pore diffusion in macroporous and gel-filled gigaporous stationary phases for protein chromatography. // J. Chromatogr. 2002. V.959. P.65-73.

110 Shen H., Frey D.D. Charge regulation in protein ion-exchange chromatography: Development and experimental evaluation of a theory based on hydrogen ion Donnan equilibrium. II J. Chromatogr. 2004. V.1034. P.55-68.

111 Тессман А.Б., Иванов A.B., Вакштейн M.C., Нестеренко П.Н. Влияние ионной силы и слабого основания на профиль градиента рН в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 2001.Т.75. №2. С.342.

112 Тессман А.Б. Формирование внутренних градиентов рН в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка. Дисс. канд. хим. наук. М.: МГУ, 2000. 158 с.

113 Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н., Гармаш А.В. Применение слабых органических протолитов для формирования градиента рН в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 1999. Т. 73. N 8. С. 1476-1479.

114 Тессман А.Б., Иванов А.В., Гармаш А.В., Нестеренко П.Н. Образование аномальных участков внутреннего градиента рН в хроматофокусировании // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1999. Т. 23. С.20-23.

115 Тессман А.Б., Иванов А.В., Нестеренко П.Н., Гармаш А.В., Рунов В.К. Аномальные участки на профиле внутреннего градиента рН в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 2000. Т.74. N6. С.1069-1072.

116 Иванов А.В., Тессман А.Б., Вакштейн М.С. Влияние состава подвижных фаз на профиль начального участка градиента рН в хроматофокусировании. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2000. Т. 41. №4. С.251-255.

117 Slais К. Microcolumn liquid chromatography with sample-induced internal pH-gradient. //J. Microcol. Sep. 1991. V.3. P.191-197.

118 Janecek M., Salamoun J., Slais K. Sample-induced internal pH-gradients in microcolumn liquid chromatography of proteins. // Chromatographia 1991. V.32. N 1-2. P.61-64.

119 Slais K., Friedl Z. Control of column influence on the wide range pH-gradient in ion-exchange chromatography. // Chromatographia. 1992. V.33. N 5-6. P. 231-236.

120 Slais K., Friedl Z. Ampholyte dyes for spectroscopic determination of pH in electrofocusing. //J. Chromatogr. 1995. V.695. P.113-122.

121 Иванов А.В. Хроматофокусирование переходных металлов. Дисс. канд. хим. наук. М.: МГУ, 1997. 204 с.

122 Иванов А.В., Фигуровская В.Н., Иванов В.М. Молекулярная абсорбционная спектроскопия комплексов 4-(2-пиридилазо)резорцина как альтернатива атомно-абсорбционной спектроскопии. // Вестн. Моск. ун-та. Сер.2: Химия. 1992. Т.ЗЗ. N 6. С.570-574.

123 Кудрявцев Г.В., Лисичкин Г.В., Иванов В.М. Сорбция цветных металлов кремнеземами с привитыми органическими соединениями. //Журн. аналит. химии. 1983. Т.38. N 1. С.22-32.

124 Sillen L.G., Martell А.Е. Stability constants of metal-ion complexes. Special publication N 17. London: The Chemical Society. 1964. 754 pp.

125 Салдадзе K.M., Копылова-Валова В.Д. Комплексообразующие иониты (комплекситы). М.: Химия. 1980. 336 с.

126 Иванов А.В., Тессман А.Б. Непрерывный контроль рН эффлюента в хроматографии с градиентом рН. // Вестн.Моск.Ун-та. Сер.2. Химия. 1999. Т.40. N4. С.241-244.

127 Тессман А.Б., Иванов А.В. Компьютерный расчет кислотно-основных равновесий в водных растворах с помощью программы "Acid-Base Calculator". // Журн. аналит. химии. 2002. Т.57. №1. С.6-11.

128 Kolla P., Kohler J., Schomburg G. Polymer-coated cation-exchange stationary phases on the basis of silica // Chromatographia. 1987. 23. P.465-472.

129 Morris J., Fritz J.S. Ion chromatography of metal cations on carboxylic acid resins. // J. Chromatogr. 1992. V.602. P.111-117.

130 Макроциклические соединения в аналитической химии. П/ред. Ю.А.Золотова и Н.М.Кузьмина. М.: Наука, 1993. 320 с.

131 Паршина И.Н., Стряпков А.В. Сорбция ионов металлов органическими катионитами из карьерных растворов. // Вестник ОГУ. Химия 2003. №5. С. 107-109.

132 Нестеренко П.Н., Шпигун О.А. Высокоэффективная комплексообразовательная хроматография ионов металлов на сорбентах с привитой иминодиуксусной кислотой. // Координац. химия 2002. Т.28. №10 С.772-782.

133 Кебец П.А., Кузьмина К.А., Нестеренко П.Н. Теплоты адсорбции катионов металлов на силикагеле с ковалентно закрепленной полиаспарагиновой кислотой. //Журн. физич. химии 2002 Т.76. №9. С.1639.

134 Цизин Г.И., Седых Э.М., Банных Л.Н., Сорокина Н.М., Золотое Ю.А. Проточное сорбционно-атомно-абсорбционное определение металлов в природных водах и растворах. // ЖАХ 1995. Т.50. №1. С.76-83.

135 Nesterenko P.N., Jones P. Isocratic separation of lanthanides and yttrium by high-performance chelation ion chromatography on iminodiacetic acid bonded to silica. // J. Chromatogr. A. 1998. V.804. P.223-231.

136 Tanford C. Physical chemistry of macromolecules. N.Y.: Wiley, 1961. 457 p:

137 Пеннер H.A. Применение сверхсшитых полистирольных сорбентов в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Дисс. канд. хим. наук. М.: МГУ, 2000.

138 Нестеренко П.Н., Кебец П.А., Волгин Ю.В. Применение сульфокатионообменника на основе сверхсшитого полистирола для разделения органических кислот. //ЖАХ. 2001. Т.56. №8. С.801.

139 Snow J.T. Peptides: The Drugs of the Future and Derivatized Amino Acids for Synthesis. New York: Calbiochem, 1988.

140 http://www.hamiltoncompany.com/product/hplc/prpx800.html

141 http://www.alltechweb.com/productinfo/technical/app/A0009.pdf