Новые методы анализа динамики почвенного микробиома, изученной с использованием метагеномных технологий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Першина, Елизавета Владимировна

• Першина, Елизавета Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Першина, Елизавета Владимировна

Введение

Цель и задачи исследования

Глава 1. Обзор литературы.

Структура почвенного метагенома и методы ее изучения

Введение

1. Источники почвенной ДНК

2. Пространственная организация почвенного метагенома

3. Биоразнообразие почвенных микробных сообществ как результат воздействия селективных географических и физико-химических факторов среды

4. Влияние засоления на почвенное микробное сообщество

5. Современные филогенетические и таксономические аспекты исследования биоразнообразия

Глава 2. Объекты и методы исследования

1. Отбор почвенных образцов

2. Приготовление препарата почвенной ДНК

2.1. Выделение ДНК из почвы

2.2. Очистка препарата ДНК

3. Проведение количественной ПЦР

4. Секвенирование нуклеотидных последовательностей

5. Обработка результатов секвенирования

6. Анализ нуклеотидных последовательностей ампликонных библиотек

7. Использование статистических крнитериев для оценки достоверности различий средних и дисперсий

Глава 3. Результаты и обсуждение

1. Анализ численности и общих показателей биоразнообразия микробных сообществ

2. Анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях природного почвенного засоления

3. Анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях искусственного почвенного засоления

4. Сравнительный анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях природного и искусственного почвенного засоления

5. Разработка новых подходов для анализа структуры и динамики микробиома

5.1.Выявление экологических групп галофильных, галотолерантных и негалофиль-ных микроорганизмов

5.2. Разработка и использование модели таксономического пространства (ТП) для гена 16Б рРНК

Выводы

Заключение

Список литературы

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые методы анализа динамики почвенного микробиома, изученной с использованием метагеномных технологий»

Введение

Долгое время изучение почвенных микробных сообществ было основано на выделении культур микроорганизмов с последующим изучением их свойств. При этом прямой подсчет клеток микроорганизмов в почве показал, что их число примерно на порядок превышает оценки численности, полученные с использованием методов культивирования (Мишустин и др., 1978). Анализ почвенной ДНК подтвердил наличие в почве большого числа некультивируемых микроорганизмов, доля которых может составлять до 90% от состава сообщества. Доступ к изучению некультивируемых микроорганизмов появился только с внедрением в микробиологическую практику молекулярно-генетических подходов (Rondon et al., 1999). Оказалось, что почвенный метагеном содержит в себе огромный объем генетической информации (в 1 гр почвы может содержаться до 1015 - 1016 п.н. ДНК, что примерно соответствует 109 - Ю10 бактериальным геномам). Качественный анализ таксономического состава почвенного сообщества, проведенный на основе изучения полиморфизма гена 16S рРНК, показал, что число видов микроорганизмов, формирующих микробное сообщество, исчисляется тысячами (Vogel et al., 2009).

Уже сейчас становятся очевидными перспективы применения молекулярно-генетических методов в почвенной микробиологии. В первую очередь, это возможность более полного исследования почвенного микробиома, в перспективе включающее изучение свойств не только культивируемых, но и некультивируемых микроорганизмов, определение состава и функций почвенных микробных ассоциаций, выяснение объема и функциональной нагрузки почвенного микробиологического и генетического потенциала.

В начале своего развития исследования почвенного микробиома были ограничены отсутствием эффективных методик секвенирования (Wooley et al., 2010). Используемая в то время стандартная методика секвенирования по Сэнджеру требовала больших временных и материальных затрат (Маниатис и др., 1984). С появлением методов высокопроизводительного секвенирования стало возможным не только полное исследование таксономической структуры почвенного микробиома, но и изучение ее динамики (Lombard et al., 2011). В результате этого появилась

возможность использовать метагеномные данные для решения основных задач почвенной микробиологии, среди которых большое значение имеет определение общих закономерностей в формировании и функционировании микробиомов различных почвенных местообитаний. Для решения данного вопроса требуется проведение микробиологического скрининга почв различных типов, а также осуществление масштабных мониторинговых исследований по изучению динамики микро-биома в ответ на действие того или иного экологического фактора. Данные исследования будут являться фундаментом для использования метагеномных данных на практике. В частности, они могут быть использованы в природоохранной сфере для сохранения природного биоразнообразия микроорганизмов и выявления факторов, нарушающих его структуру. Также данные по структуре почвенного микробиома могут быть востребованы для решения ряда проблем современного земледелия, таких как: ранняя диагностика и профилактика почвенного состояния, поиск новых потенциально плодородных земель, микробиологическая ремедиация почв, оптимизация использования биопрепаратов, создание новых эффективных растительно-микробных систем в практике адаптивного земледелия и др.

Технологическая база для проведения данных исследований намного опережает в своем развитии методологическую базу, связанную с разработкой адекватных методов анализа метагеномных данных, которые позволили бы извлекать из них биологически значимую информацию. На данный момент устойчивой тенденцией является применение методов, которые представляют собой синтез методов биоинформатики и традиционных экологических подходов к оценке биоразнообразия (Schloss et al., 2009). Очевидно, что работа со «списками организмов» при проведении масштабных мониторинговых исследований представляет собой практически невыполнимую задачу, поэтому использование данных по структуре метагено-ма для решения поставленных ранее задач фундаментальной и прикладной почвенной микробиологии будет напрямую зависеть от применения новых аналитических подходов, которые позволили бы упростить процедуру анализа данных по биоразнообразию и извлечь из них биологически значимую информацию. Работы в направлении поиска качественно новых методов обработки результатов метагеномных исследований активно ведутся (Lilburn et al., 2004; Hur et al., 2004, Hughes et al., 2004; Lee et al., 2006). Также наметилась ярко выраженная тенденция к инте-

грации метагеномных данных, проявляющаяся в возникновении крупных международных проектов по изучению биоразнообразия, таких как EMP (Earth Microbi-ome Project), HMP (Human Microbiome Project) и др.

В рамках данной работы нами будут предложены методы для обработки данных по таксономическому разнообразию гена 16S рРНК с целью их более эффективного использования в исследованиях по микробиологическому мониторингу почвенного состояния. Решение этой задачи необходимо начинать с создания наиболее простых модельных систем, в которых микробные сообщества будут подвергаться действию экологического фактора, вызывающего контрастные изменения в их структуре. Одним из таких факторов является засоление (Lozupone et al., 2007). Выбор этого фактора является важным не только с методической, но и с практической точки зрения, поскольку почвенное засоление является одним из факторов, ограничивающих эффективность современного земледелия, и с каждым годом достигает все больших масштабов (Evelin et al., 2009).

В качестве объектов данного исследования нами были выбраны две системы - природного засоления (пробы почвы, отобранные по градиенту засоленности в солончаке) и искусственного засоления (лабораторный эксперимент по искусственному засолению каштановой почвы).

Цель и задачи исследования:

Целью исследования является разработка новых методов для анализа данных по таксономическому разнообразию микробных сообществ, полученных с использованием метагеномных технологий, на примере анализа модельных систем природного и искусственного почвенного засоления.

Задачами работы являлись:

1. На основе анализа данных пиросеквенирования библиотек гена 16S рРНК изучить изменение таксономической структуры почвенного микробиома вдоль градиента засоленности в условиях природного почвенного засоления;

2. Изучить изменение таксономической структуры почвенного микробиома в условиях искусственного засоления;

3. Выявить группы микроорганизмов, являющиеся маркерами процессов природного и искусственного засоления;

4. Разработать математические методы для анализа данных высокопроизводительного секвенирования, позволяющие провести ранжирование микроорганизмов в соответствии с реакцией на действие засоленности и дать интегральную оценку структуры и динамики микробных сообществ.

Научная новизна:

Впервые на основе анализа данных высокопроизводительного секвенирования описано изменение таксономической структуры метагенома микробного сообщества в условиях природного и искусственного почвенного засоления и выявлены кандидаты на роль индикаторов засоления - бактерий из сем. ВасШасеае (ПгтгсМез) и пор. 8рЫп§оЬас(епа1е$ (Вас1егогс1е1е&). Впервые предложены новые методы для анализа данных высокопроизводительного секвенирования: 1) метод ранжирования микроорганизмов в соответствии с реакцией на засоленность, позволяющий выявить экологические группы галофильных, галотолерантных и негалофильных микроорганизмов на уровне рода 2) метод математического моделирования динамики микробиомов в таксономическом пространстве гена 16Б рРНК с вычислением интегральных параметров, описывающих их структуру (центральная точка) и динамику (вектор смещения центральной точки), позволяющих установить факт и определить направление сукцессии микробного сообщества.

Научно-теоретическая и практическая значимость исследования.

Предложенные новые методы могут быть использованы для анализа структуры и динамики почвенного микробиома. Они будут востребованы во многих областях практической микробиологии. В природоохранной сфере станет возможным

проведение масштабных мониторинговых исследований по действию основных биогенных и антропогенных экологических факторов на структуру почвенных микробоценозов, что будет способствовать развитию программ, направленных на сохранение их природного биоразнообразия. В сельскохозяйственной практике исследование почвенного микробиома будет способствовать поиску новых потенциально плодородных земель, в криминалистике - формированию базы микробиологических маркеров, позволяющих установить регион происхождения почвенного образца.

Выполнение работы было поддержано:

Программой поддержки фундаментальных исследований по приоритетным направлениям Санкт-Петербургского государственного университета в рамках проекта «Метагеномный анализ микробиома как многофункционального высоко-интегрированного биосферного «интерфейса», грантом РФФИ 12-04-01371-а «Основные факторы, влияющие на формирование структуры почвенного микробиома по данным высокопроизводительного секвенирования» и ГК № 16.512.11.2132 «Разработка метода массового метагеномного скрининга почв сельскохозяйственного назначения в целях оптимизации их использования».

Апробация работы.

Материалы диссертации опубликованы в 12 научных работах (из которых 8 статей и 4 тезиса). По результатам работы были сделаны сообщения на конференциях: VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 19-22 марта 2013 г., Москва, Россия (устный доклад), VI Всероссийской конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», 24-28 сентября 2012 г., Саратов, Россия (первая премия за устный доклад), школа-конференция для аспирантов AB-RMS («Адаптация к изменению климата в регионе Балтийского моря: вклад исследований из области растительной и микробной биотехнологии») 12-17 июля 2010 г., Миккеле, Финляндия, 4-й съезд европейского микробиологического общества 26-

30 июня 2011 г., Женева, Швейцария, 14-й международный симпозиум по экологии микроорганизмов 19-24 августа 2012 г., Копенгаген, Дания.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (8 статей и одна глава в монографии) и 5 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 117 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 5 глав обзора литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводы и список литературы. Работа проиллюстрирована 7 таблицами и 31 рисунками, указатель литературы содержит 154 источника, в том числе 10 отечественных и 144 иностранных.

Глава 1. Обзор литературы. Структура почвенного метагенома и методы ее изучения

Введение

Главной проблемой в изучении микробных сообществ является то, что подавляющее большинство микроорганизмов не поддаются лабораторному культивированию и, поэтому, о биоразнообразии этих микроорганизмов мы можем судить исключительно по разнообразию выделяемых из среды нуклеотидных последовательностей.

Под термином метагеном принято понимать «совокупный» геном микробного сообщества того или иного местообитания (Riesenfeld et al., 2004; Raes et al., 2007; Simon et al., 2011; Mocali et al., 2010). Изучение генетического состава метагенома происходит на основе анализа молекул ДНК, выделенных непосредственно из биоценоза. Дальнейший анализ ДНК подразумевает решение двух задач - исследование таксономической и функциональной структуры микробного сообщества. В первом случае используются ген-специфичные праймеры для изучения филогенетических маркеров биоразнообразия (прежде всего это ген 16S рРНК), во втором случае происходит изучение функциональных генов (например, гены, продукты которых участвуют в процессах нитрификации (атоА), азотфиксации (гены nif) и др.) или совокупного генетического материала сообщества (секвенирование коротких фрагментов генома, их последующая сборка и аннотация).

Исторически первыми были исследования таксономической структуры сообщества, которые с появлением технологий высокопроизводительного секвениро-вания достигли своего расцвета. Производительность современных секвенаторов растет с каждым годом и уже приближается к решению проблемы полного секве-нирования почвенного метагенома (Delmont et al., 2010).

Иногда в литературе можно встретить мнение о том, что в потенциале исследование полноразмерных геномов полностью заменит исследование одной лишь таксономической структуры сообщества (Rondon et al., 2000). Но вопрос о принципиальной возможности для сборки полноценных геномов из метагеномных данных,

по-прежнему, остается открытым. Во-первых, при одновременном анализе множества родственных по своей структуре геномов значительно повышается вероятность сборки химерных геномов (Chaisson et al., 2008; Kunin et al., 2008; Wooley и Ye, 2009) и, во-вторых, результатом исследования большинства микробных сообществ, ввиду свойственного им большого объема генетической информации, является получение лишь отдельных фрагментов генома (реже единичных геномов) для доминирующих видов микроорганизмов (Tringe et al., 2005; Singh et al., 2009a). Особенно остро обозначенные выше проблемы возникают при анализе почвы, которая является одним из самых «густонаселенных» местообитаний на планете - в одном грамме плодородной почвы может содержаться до 1000 Gb генетической информации (Vogel et al., 2009).

Поэтому анализ таксономического разнообразия гена 16S рРНК продолжает оставаться наиболее популярным и многообещающим методом при анализе микробных сообществ и интерес к нему не только не уменьшается, но и с каждым годом растет (Расе, 2009; Tyson и Banfield, 2005; Kakirde et al., 2010, Lombard et al. 2011; Forney et al., 2004; Tringe и Hugenholtz, 2009). Это связано не только с относительной простотой данного анализа, но и с рядом других преимуществ. Во-первых, ген 16S рРНК присутствует у всех ныне живущих прокариот. Кодируя молекулы рибосомной РНК, он может служить для реконструкции эволюционной истории прокариот. Во-вторых, ввиду своей исключительной популярности среди исследователей, ген 16S рРНК обладает на сегодняшний день, самой полной представленностью в базах данных (число генов 16S рРНК в базе данных RDPII насчитывает более 2,5 млн., http://rdp.sme.msu.edu). И, в-третьих, при сравнении таксономической и функциональной структуры сообществ в литературе отмечалось, что основные различия при сравнении микробных сообществ различных местообитаний наблюдаются именно в таксономическом профиле сообщества, в то время как «функциональный портрет» сообщества остается относительно стабильным (Turnbaugh et al., 2008; Koren et al., 2012) (Рис. 1).

При изучении таксономической структуры сообщества по данным высокопроизводительного секвенирования исследователь сталкивается и с целым рядом проблем. Первая из них связана с внутривидовым полиморфизмом гена 16S рРНК. Так, для подавляющего большинства бактерий было показано наличие множе-

ственных и порой существенно различающихся между собой копий рибосомного оперона (Acinas et al., 2004; Crosby et al., 2003). Известную погрешность в определение таксономического состава вносит также этап ПЦР, где для амплификации последовательностей гена 16S рРНК используются универсальные прайм еры, последовательности которых не являются в равной степени комплементарными всем амплифицируемым матрицам (Polz et al., 1998; Ishii et al., 2001; Acinas et al., 2005).

її Функциональный профиль сообщества

уууууууууу 1 234 56 7 8 9 10

а> Таксономический профиль сообщества

1 2345678 9 10

■ Деградация ксенобиотиков

■ Метаболизм нуклеотидов

■ Метаболизм терпенов и поликетонов Метаболизм аминокислот

■ Метаболизм кофакторов и витаминов

■ Метаболизм липидов

■ Метаболизм гликанов

■ Энергетический метаболизм

■ Метаболизм углеводов

■ Синтез вторичных метаболитов

■ Метаболизм основных аминокислот

■ Трансляция Транскрипция

■ Репликация и репарация

■ Фолдинг, сортинг и деградация белков Сигналинг

■ Транспортные системы плазматической мембраны

■ Bacteroidetes

■ Firmicutes

■ Actinobacteria Verrucomicrobia

■ Proteobacteria

Рисунок 1. Различия в таксономической и функциональной структуре микробного сообщества кишечника беременных женщин (1-10) в первом (А) и третьем (В) триместре беременности. Иллюстрация из статьи Koren et al., 2012.

Влияние эффекта избирательной праймер-зависимой амплификации в муль-тиматричной ПЦР на конечное соотношение последовательностей было наглядно показано в работе Бергман с соавторами (Bergman et al., 2011).

Так, из-за сравнительно слабого сродства всех современных конструкций универсальных праймеров к последовательностям бактерий из филы Verrucomicrobia данные по обилию этих микроорганизмов в почве были довольно сильно занижены, и численность этих бактерий может быть сопоставима с численностью фил «большой четверки» и составлять до 23% от общего биоразнообразия (Bergmann et al., 2011).

Помимо методологических проблем, связанных с получением репрезентативных данных, исследователь также сталкивается с проблемой анализа и биологической интерпретации полученной информации. Существенным препятствием при решении данной проблемы является высокий уровень биоразнообразия микробных сообществ. По разным оценкам число видов в 1 грамме почвы исчисляется сотнями и даже тысячами. Понятно, что при таком объеме информации сравнительный анализ сообществ на основе сопоставления их видового состава представляет собой крайне сложную, а при большом количестве образцов - принципиально неразрешимую задачу. Поэтому возникла необходимость в создании методов, которые позволили бы систематизировать и обобщить данные по биоразнообразию. На решение данной проблемы сейчас направлены усилия ряда крупных международных проектов, таких как МЕР (Microbial Earth Project), EMP (Earth Microbiome Project), TerraGenome (Vogel et al., 2009) и другие, в задачи которых входит аккумуляция, хранение, интегральный анализ метагеномных данных и выработка международных стандартов по проведению исследований в области молекулярной экологии. Масштабы исследований почвенного метагенома увеличились и в пределах отдельных лабораторий, так, например, активно ведутся работы по изучению биогеографии микробных сообществ (Lauber et al., 2009; Fierer et al., 2006).

Помимо накопления и анализа экспериментального материала с использованием традиционных подходов биоинформатики, осуществляется поиск новых методов для работы с нуклеотидными последовательностями (Garrity et al., 2002). Работа по обозначенным направлениям уже принесла целый ряд важных сведений

как об особенностях организации почвенного метагенома, так и о методах его исследования. Наиболее значимые из них будут изложены в настоящем обзоре.

1. Источники почвенной ДНК.

В составе почвенного метагенома мы можем выделить как минимум 5 различных компонентов. Первый компонент включает ДНК физиологически активных клеток микроорганизмов. С ним тесно связан второй компонент, который включает ДНК временно неактивных (покоящихся) микрооганизмов. Оставшиеся три компонента - ДНК, содержащаяся в мертвых клетках, микробная ДНК, находящаяся в вирусных частицах и внеклеточная ДНК (Levy-Booth et al., 2007; Pietramellara et al., 2009), по всей видимости, составляют значительную, если не основную часть выделяемых из среды молекул ДНК. Было показано, что в отдельных случаях доля внеклеточной ДНК в почвенном ДНК экстракте может достигать 60% (Agnelli et al., 2004).

В литературе практически отсутствуют данные о составе этих пяти основных пулов почвенной ДНК. Поэтому на данном этапе мы можем только догадываться о возможных способах интеграции почвенного метагенома и о связанных с ними особенностях функционирования почвенных микробных сообществ. Одной из причин неполноты знаний в этом вопросе является отсутствие методик дифференцированного выделения почвенной ДНК.

В отличие от других местообитаний микроорганизмов (например, водных местообитаний), полная и, в особенности, дифференциальная экстракция почвенных нуклеиновых кислот представляет большую трудность из-за сильной адгезии молекул ДНК и самих клеток микроорганизмов на различных компонентах почвенного матрикса (Nielsen et al., 2006; Saeki et al., 2010; Bakken et al., 2006). Поиск эффективных методик выделения ДНК занимает значительную часть в современной почвенной микробиологии, о чем свидетельствует большое число публикаций по данному вопросу (Biirgmann et al., 2001; Sagova-Mareckova et al., 2008; Martin-Laurent et al. 2001; Robe et al. 2003). Главная дилемма, с которой сталкиваются авторы работ по выделению почвенной ДНК, это неспособность «мягких» процедур обеспечить выделение достаточного количества

адсорбированной ДНК и отсутствие специфичности совместно с высокой степенью деградации генетического материала при использовании «грубых» методов экстракции с разрушением также спор бактерий. В ходе проведения ряда последовательных экстракций ДНК из различных типов почв (Feinstein et al., 2009), удалось показать, что полученные экстракты сильно различались по составу и соотношению в них основных бактериальных фил. Так, первая (наиболее щадящая) процедура экстракции давала на выходе препарат ДНК, в котором доминировали такие филы как Acidobacteria, Gemmatimonadetes и Verrucomicrobia, в то время как при последующих более «полных» экстракциях препарат ДНК содержал последовательности, принадлежащие филам Proteobacteria и Actinobacteria (Feinstein et al., 2009). Таким образом, на данный момент невозможно полностью разделить основные пулы почвенной ДНК.

Заметных успехов удалось достигнуть только в области изучения внеклеточной почвенной ДНК. Интерес к исследованию внеклеточной ДНК в почве был в значительной степени вызван процессами распространения генетических конструкций ГМО в природных популяциях почвенных микроорганизмов. Другой интригующей проблемой, связанной с изучением внеклеточной ДНК является изучение так называемой реликтовой ДНК и связанных с ней биологических процессов, происходивших на ранних стадиях биологической эволюции (Saeki et al., 2010). И наконец, сравнительно недавно было показано, что внеклеточная ДНК является одним из основных компонентов, выделяемых бактериальными клетками при формировании биопленок (Böckelmann et al., 2007, Chiang et al., 2010). Формирование биопленок является очень характерным именно для почвенных микроорганизмов, связи с неравномерным распределением в почве питательных веществ и связанных с этим процессов активной адгезии к почвенным частицам, а также с потребностью в более эффективном разложении сложных органических субстратов и совместной адаптации к стрессам.

На данный момент проведен целый ряд исследований по адсорбции ДНК в почве (Saeki et al., 2010; Cai et al., 2006) и ее перемещению по почвенным капиллярам (Ascher et al., 2005; Ceccherini et al., 2007), времени жизни почвенной внеклеточной ДНК (Romanowsky et al., 1992), а также исследования генетического переноса генов (в основном генов генетически модифицированных микроорганизмов)

между различными группами почвенной микробиоты (Paget et al., 1998; Wackernagel, 2006).

По результатам проведенных исследований стало известно, что ДНК, высвобождающаяся из клеток микроорганизмов в почву, достаточно продолжительное время (до нескольких десятков лет) сохраняет свою целостность (Wackernagel, 2006; Cai et al., 2006). Это происходит за счет стабилизации внеклеточной ДНК на различных компонентах почвенного матрикса, в том числе на гуминовых веществах (Saeki и Kunito 2010; Cai et al., 2006).

ДНК может выделяться в почву не только пассивно после гибели клеток, но и активно за счет секреции клетками микроорганизмов. Так, Нильсену с соавторами (Nielsen et al., 2007) удалось показать, что значительное количество бактериальных изолятов могут выделять ДНК в чистых культурах, это свойство оказалось характерным для типичных почвенных бактерий, таких как, например, Pseudomonas и Azotobacter. Также было показано, что обнаруживаемая секреция ДНК усиливается при совместном культивировании с другими бактериями или эукариотами (Nielsen et al., 2007). Эти экспериментально полученные данные свидетельствуют в пользу интегративной функции внеклеточной ДНК в межвидовых взаимоотношениях почвенных про- и эукариот.

Количество внеклеточной ДНК в почве может значительно варьировать в зависимости от почвенного горизонта и типа почвы и составляет в среднем от 0,03 до 2 мкг на грамм сухой почвы. Интересные результаты были получены Агнелли с соавторами (Agnelli et al., 2004) при анализе DGGE профилей из различных горизонтов лесной почвы. Оказалось, что в отличие от общей почвенной ДНК, количество которой стабильно снижалось по мере движения от верхних к нижним почвенным горизонтам, количество внеклеточной ДНК было наибольшим в гумусо-аккумулятивном (А2) почвенном горизонте (Agnelli et al., 2004). Такое локальное накопление внеклеточной ДНК в горизонте А2 может быть связано как с более интенсивным использованием внеклеточной ДНК микроорганизмами в горизонте AI, так и, что более вероятно, с вертикальной миграцией внеклеточной ДНК и ее способностью к связыванию с компонентами гумуса. Таким образом, аккумуляция гумуса тесно связана с накоплением внеклеточной ДНК, что делает гумусовый гори-

зонт зоной интенсивного накопления не только специфических органических компонентов, но и основной массы генетического материала почвы.

В ряде работ было показано, что большая часть внеклеточной ДНК, сразу после высвобождения из клетки прочно связывается с органическими или глиняно-органическими почвенными частицами в непосредственной близости с метаболически активными микроорганизмами (Cai et al., 2006; Nielsen, 2007). В экспериментах по генетической трансформации бактерии Azotobacter vinelandii очищенной ДНК, ДНК, адсорбированной на силикатном носителе, и ДНК, связанной с органическим веществом авторам удалось показать достоверное увеличение частоты трансформации в двух последних случаях: с 6 ■ 10~5 для свободной ДНК до 2,5 ■ 10~4 для ДНК, связанной с органическим веществом (Lu et al., 2010).

На значительную роль внеклеточной ДНК в функционировании микробных сообществ также указывает увеличение способности к адгезии внеклеточной ДНК в присутствии органических кислот, которые входят в группу основных растительных экссудатов (Pietramellara et al., 2009). В связи с этим мы можем сделать предположение о том, что внеклеточная ДНК концентрируется в основном в ризосфере - наиболее густонаселенном районе почвенной экосистемы.

Суммируя все приведенные выше факты, мы можем заключить, что внеклеточная ДНК составляет значительную часть общей почвенной ДНК и ассоциирована в большинстве своем с почвенным органическим веществом, что позволяет ей концентрироваться в местах наибольшей активности почвенных микроорганизмов. В связи с повышенной способностью к генетической трансформации фрагментами внеклеточной ДНК (Lu et al., 2010), почвенные микроорганизмы приобретают доступ к генетической информации, содержащейся в клетках как ныне живущих членов микробного сообщества (пространственная генетическая интеграция), так и микроорганизмов, обитавших в почве ранее (временная генетическая интеграция). Возможность активного использования почвенного генетического потенциала микроорганизмами может быть одной из причин высокой адаптационной пластичности почвенных микробных сообществ. Так, обращает на себя внимание тот факт, что именно почвенные бактерии, принадлежащие к таким хорошо изученным родам как Pseudomonas, Arthrobacter, Burkholderia и др. встречаются практически во всех типах почв, от полярных регионов до тропиков и, особенно, в нарушенных место-

обитаниях (Ruberto et al, 2008; Wagner, 2008; Lucas et al., 2008) и могут усваивать до сотни различных по своей природе источников углерода. Их повсеместное распространение может быть связано, в том числе, и с интенсивными процессами горизонтального переноса генов с активным задействованием пула внеклеточной ДНК. Вполне вероятно, что внеклеточная ДНК может осуществлять интегрирующие сообщество функции не только на генетическом, но и на структурном уровне, способствуя формированию биопленок, а также моделируя межвидовые симбиоти-ческие взаимоотношения.

2. Пространственная организация почвенного метагенома

Большое значение для изучения почвенного метагенома имеет исследование пространственной организации микробного сообщества, которая, в свою очередь, зависит от микроструктуры почвенного матрикса и вертикальной стратификации, выраженной в наличие в почве специфических горизонтов.

Образование почвенных агрегатов играет важную роль во многих типичных почвенных процессах, особенно в процессах биодеградации растительных остатков и в формировании гумуса (Chotte, 2005). В российской школе почвоведения выделяют три вида почвенных агрегатов в зависимости от их размера -микроагрегаты (< 0,25 мм), мезоагрегаты (0,25 — 7 (10) мм) и макроагрегаты (>7 (10) мм).

Несмотря на то, что многие исследователи сейчас все больше склоняются к рассмотрению почвы на микро-морфологическом уровне, вопрос об отборе проб почвы остается дискуссионным (Kakirde et al., 2010, Lombard et al. 2011; Young et al., 2004; Grundmann, 2004), при этом наиболее часто встречается отбор стандартного объема (1 грамма) гомогенизированного почвенного образца из верхних почвенных горизонтов (чаще всего из горизонта А1). Существуют лишь отдельные молекулярно-экологические исследования, посвященные изучению таксономического разнообразия микробного сообщества в агрегатах различного размера (Sessitsch et al. 2001; Davinic et al., 2012), a также внутри и на поверхности почвенных агрегатов (Mummey et al., 2006).

Давиник с соавторами (Davinic et al., 2012) были первыми, кто использовал технологию пиросеквенирования для изучения структуры микробного сообщества в трех почвенных агрегатных фракциях: макроагрегатах (>250|о.т), микроагрегатах (53-250цт) и глиняно-песчаных частицах (<53 цт). Состав микробных сообществ, а также количество доступного азота и углерода существенно различались между исследуемыми фракциями. Макроагрегаты характеризовались высокими уровнями доступного углерода и азота и содержали в основном бактерий принадлежащих к филам Actinobacteria, Bacteroidetes, Verucomicrobia и 8-Proteobacteria. Микроагрегаты характеризовались наименьшим микробным биоразнообразием и были сформированы в основном двумя группами — Rubrobacteriales и Chloroflexi. Глиняно-песчаные частицы имели наименьший показатель доступного углерода и содержали в основном бактерий относящихся к так называемым «минорным» почвенным филам - Nitrospira, ОРЮ, WS3, а также бактерий, входящих в состав наиболее крупных и широко-распространенных фил Acidobacteria и а-Proteobacteria. Сходная пространственная организация бактериальных фил наблюдалась также и в ряде других работ (Sessitsch et al., 2001; Mummey и Stahl 2004; Mummey et al., 2006). Авторы этих работ также наблюдали преобладание бактерий из порядка Rubrobacteriales (Actinobacteria) внутри микроагрегатов нарушенной почвы, в противоположность микроагрегатам ненарушенной почвы, населенным преимущественно бактериями из семейства Actinobacteridac (Actinobacteria) (Mummey и Stahl, 2004). Учитывая тот факт, что Давиник с соавторами (Davinic et al., 2012) исследовали достаточно экстремальную среду обитания микроорганизмов (почвы засушливых регионов США) и бактерии, относящиеся к порядку Rubrobacteriales, являются в большинстве своем экстремофилами, эта группа может являться важным микробиологическим показателем почвенного здоровья.

Не менее важным показателем почвенного здоровья является фила Proteobacteria, численность которой заметно возрастает в нарушенной почве и достигает 70%. Также было показано, что данная фила преимущественно встречается на поверхности почвенных агрегатов (Mummey et al., 2004).

Исследования микробных сообществ почвенных агрегатов представляют ценность не только для сельскохозяйственной практики, но и для изучения

процесса биодеградации органических остатков. Учитывая магистральный путь разложения растительных остатков, где вещества, образованные на предыдущих стадиях разложения, используются в качестве субстрата микроорганизмами последующих стадий, формирование агрегатов будет во многом способствовать концентрации конечных продуктов каждой из стадий, что повышает эффективность всего процесса биодеградации.

Формирование изолированного компартмента внутри микроагрегата также способствует более экономному расходованию выделяемых микроорганизмами экзоферментов. Таким образом, почвенный агрегат может рассматриваться как специфическая адаптивная структура, которая активно формируется и поддерживается различными группами микроорганизмов (Young et al., 2004), интегрированными в наименьшую «экологическую единицу» почвенного микробиома - микробный консорциум почвенного агрегата. Процесс формирования этого сообщества отчасти напоминает взаимодействие гриба и фототрофных микроорганизмов в процессе формирования лишайников и, судя по всему, является примером высокоинтегрированных симбиотических отношений в процессе формирования принципиально новой адаптивной структуры.

Из всех приведенных фактов можно заключить, что почвенные агрегаты являются не только и не столько основными структурными единицами почвы, сколько структурно-функциональными единицами почвенного микробного сообщества и почвенного метагенома и, безусловно, должны привлекать к себе основное внимание в метагеномных исследованиях.

Агрегатная структура почвенного матрикса представляет собой микроморфологический почвенный показатель, макроморфология почв определяется наличием того или иного почвенного профиля, сформированного почвенными горизонтами. В обзоре мы сконцентрируем внимание на наиболее населенном гумусовом горизонте. Процесс почвообразования изначально соответствует непрерывно эволюционирующим взаимоотношениям между растениями и микроорганизмами. Конечной точкой этого процесса является формирование двух специфических почвенных микробных местообитаний -ризосферы и гумуса. Они тесно связаны между собой и вместе определяют почвенное плодородие, которое является важнейшим свойством почв. Поэтому

именно эти почвенные образования вызывают основной интерес, как среди биологов, так и среди почвоведов (Kuske et al., 2002; Andreetta et al., 2004).

В настоящее время все больше фактов свидетельствует в пользу активного участия микроорганизмов в продукции специфических гумусовых веществ (Chotte, 2005; Бабьева с соавт., 1989). Можно предположить, что активное формирование гумусового горизонта является адаптивным ответом микробного сообщества на существование в гетерогенных и часто меняющихся условиях жизни в почве. С одной стороны, благодаря своей пористой структуре гумус играет роль природной «губки», накапливающей воду с растворенными в ней минеральными веществами и, с другой стороны, гумус содержит много «полезной органики» и является богатым источником связанного азота в почве (Voroney, 2010). Из сельскохозяйственной практики известно, что мощный гумусовый горизонт способен препятствовать процессам почвенной эрозии. Именно гумусовый горизонт населен абсолютным большинством почвенных микроорганизмов (Chotte, 2005).

Большая часть исследований, посвященных почвенным микробным сообществам, так или иначе, касается гумус содержащих почвенных горизонтов, но только единичные работы рассматривают гумусо аккумулятивный почвенный горизонт как структурно и функционально изолированную и постоянно эволюционирующую почвенную структуру.

Среди них особого внимания заслуживает серия исследований, описывающая развитие гумусового горизонта в лесном массиве Fagus silvatica (Trapet al., 2011).

В ходе работы было произведено описание множества макроморфологических характеристик гумусо-аккумулятивного горизонта, который формировался под лесом различного возраста и показано, что микробные сообщества различных типов гумуса существенно различаются по своему составу и метаболической активности.

В ходе развития лесной экосистемы начиная с 15-летнего леса и заканчивая 130-летним, происходила закономерная смена мулевого гумуса, с большим количеством доступных органических веществ на гумус типа модер, богатый рекальцитрантными соединениями углерода и обладающего сравнительно большей

кислотностью. Несмотря на такие неблагоприятные условия, гумус-модер характеризовался большим микробным разнообразием. Трап с соавторами (Trap et al., 2011) объяснили этот феномен присутствием оппортунистических бактерий, питающихся продуктами деградации сложных органических субстратов в мулевом гумусе, которые не позволяют развиваться в нем специализированным группам бактерий, питающихся в основном трудно-разлагаемыми органическими веществами и преобладающих в соответствии с этим в основном в гумусе типа модер. В гумусе типа модер относительно высокая концентрация рекальцитрантной органики создает селективные условия, благоприятные для медленно растущих специализированных групп бактерий (Trap et al., 2011). Несмотря на существующую потребность в исследованиях гумусо-аккумулятивного горизонта, на данный момент мы располагаем лишь единичными работами, где авторы исследовали микробное разнообразие в этом горизонте с использованием современных технологий высокопроизводительного секвенирования. Примером такого исследования служит работа (Will et al., 2010) в которой авторы изучали структуру микробного сообщества в верхних (А) и нижних (В) почвенных горизонтах с использованием метода пиросеквенирования. Микробные сообщества в горизонтах А характеризовалось наличием таких таксонов как Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Fibrobacteres, Firmicutes, Spirochaetes, Verrucomicrobia, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria и Gammaproteobacteria, в то время как в горизонтах В преобладали бактерии из минорных фил, таких как Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Nitrospira, ТМ7 и WS3 и представители одной из наиболее крупных бактериальных фил - Acidobacteria. Интересным представляется тот факт, что микробное сообщество из верхних горизонтов является синонимичным микробному сообществу макроагрегатов, а сообщество нижних почвенных горизонтов проявляет сходство с сообществом микроагрегатов и в большей степени глиняно-песчаных частиц (Davinic et al., 2012; Mummey et al., 2004). Так, авторы исследования (Mummey et al., 2006) также выделяли филу Chloroflexi, как наиболее типичного обитателя внутреннего пространства почвенного агрегата и отделяли ее от филы Bacteroidetes, распространенной преимущественно на поверхности почвенных агрегатов.

Эти данные являются очень ценными, поскольку позволяют найти связь между микро и макроструктурой почвенной экосистемы и отделить бактерий, участвующих в переработке гумуса или растительных остатков, задействованных на первых стадиях цикла углерода (Вас1его1с1е1е$, АсИпоЬас(епа) от бактерий, участвующих в циклах других элементов и осуществляющих, например, процессы нитрификации {Шгозрма), а также от бактерий населяющих микроаэрофильные и анаэробные зоны (СЫого/1ех1, АсчЛоЬаМепа).

Следует отметить, что все исследуемые почвы характеризовались нейтральными и близкими к нейтральным значениями рН (от 6,03 до 7,40) и низкими значениями влажности, что, как это будет продемонстрировано в следующем разделе, обычно приводит к доминированию в верхних почвенных горизонтах бактерий из фил Рго1еоЬас1епа и АсИпоЬас(епа, в противовес бактериям из филы АЫс1оЬас1епа, распространенным в этом случае в нижних слоях почвы. (ЬаиЬег й а1., 2009). По всей видимости, это связано с тем, что две наиболее крупные бактериальные филы - Ас1с/оЬас1ег1а и Рго1еоЬас(ег1а имеют сходные экологические предпочтения, при этом фила Рго(еоЬас1епа в отличие от Ас1с1оЬас1епа имеет селективное преимущество при нейтральном и щелочных значениях почвенного рН и «вытесняет» последнюю из верхних в нижние почвенные горизонты. В кислых же почвах, в верхних горизонтах преобладают ацидобактерии (Вги е1 а1., 2011; ЬаиЬег е1 а1., 2009). Поэтому описанные различия в микробных сообществах очень сильно зависят от свойств самой почвы и требуют большей выборки для установления каких-либо закономерностей.

3. Биоразнообразие микробных сообществ как результат воздействия

селективных географических и физико-химических факторов среды.

Наиболее типичными бактериальными филами, которые широко представлены в почве, являются филы (по их встречаемости в почвенных образцах): Рго1еоЬас1епа, Асгс1оЬас1епа, АсНпоЬаМепа, УеггисотгсгоЫа, Вас1его1с1е1е$, СЫогоАехг, Р1апс1отусе(е$, ОеттаНтопас1е1е8 и F//7шcиtes (1апшеп, 2006). Соотношение этих фил в почве может меняться в зависимости от условий конкретного почвенного местообитания. Также список из приведенных выше бактериальных

фил может дополняться такими филами как Nitrospira, Chlamidia и «минорными» филами, такими как Spirochaetes, ТМ7, OPIO, WS3, численность которых не превышает десятых долей процента (Podar et al., 2007). Несмотря на то, что здесь были названы 9 бактериальных фил, доминирующих в почве, на практике чаще всего наблюдается доминирование четырех из них, а именно Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria и Bacteroidetes. В отдельных случаях эта так называемая «большая четверка» составляет до 90% почвенного микробного разнообразия (Tsai et al., 2009).

В качестве исключения в состав доминирующих почвенных бактериальных фил может входить фила Firmicutes (например, это происходит в сообществах ги-пергалинных солончаковых почв), где представители филы Firmicutes "занимают позиции" бактерий из фил Acidobacteria или Actinobacteria (подробнее см. раздел

4).

В результате проведения исследований по влиянию разнообразных факторов среды (рН, почвенная текстура, характер растительного покрова, количество доступного углерода и др.) на структуру почвенного сообщества (Brockett et al., 2012; Singh et al., 2009 6; Castro et al., 2010; King et al., 2010; Lauber et al., 2008) было установлено, что среди всего многообразия экологических факторов всего два фактора оказывали по-настоящему сильное влияние на микробное биоразнообразие, ими оказались кислотность (значение рН) и влажность почвы (Bru et al., 2011; Lauber et al., 2009).

Исследования по влиянию кислотности на таксономический состав почвенного микробиома показали, что бактерии из филы Acidobacteria развиваются преимущественно в почвах с низкими значениями рН, в то время как такие филы как Actinobacteria, Bacteroidetes и Proteobacteria предпочитают нейтральные и высокие значения этого показателя (Fierer et al., 2006; Campbell et al., 2010; Lauber et al., 2009).

Влажность почвы определяет относительное содержание в ней бактерий из филы Actinobacteria, с максимальным их содержанием в почвах засушливых регионов (Connon et al., 2007; Brockett et al., 2012; Chowdhury et al., 2009; Gómez-Silva et al., 2008). Этот результат легко предсказать исходя из биологических особенностей бактерий из этой группы, обеспечивающих их существование в условиях низкой

влажности (Drenovsky et al., 2004). Влияние показателя влажности на структуру почвенного микробиома тесно связано с почвенной текстурой. В ряде работ (Carson et al., 2010; Chau et al., 2011) было показано, что это влияние обуславливается наличием или отсутствием изоляции между почвенными локальными местообитаниями микроорганизмов (микросредами). Снижение такого сообщения (например, за счет увеличения песчаной составляющей в текстуре почвы или пониженной влажности почвы) приводит к увеличению коэффициентов биоразнообразия и наоборот (Torsvik et al., 2002; Chau et al., 2011). Природа влияния влажности и почвенной структуры на состав микробного сообщества до сих пор остается дискуссионной. В частности, Карсон с соавторами (2010) были получены данные свидетельствующие в пользу увеличения микробного биоразнообразия в увлажненных почвах (Carson et al., 2010).

Неожиданным оказался тот факт, что почвенное микробное сообщество в меньшей степени было подвержено действию таких факторов как географическая широта и температура, которые являются наиболее значимыми факторами в экологии многоклеточных эукариот (Bru et al., 2011; Chong et al., 2012; Fierer et al., 2006).

Это было подтверждено исследованиями арктических и высокогорных почв (Chu et al.; 2010; King et al., 2010). Несмотря на «экстремальную природу» данных местообитаний, микробные сообщества, обнаруженные в этих почвах, имели те же структурные особенности, что и сообщества почв умеренной зоны. Изучая микробные сообщества почв, расположенных в горном районе Колорадо и пытаясь обнаружить паттерны в пространственном расположении доминирующих бактериальных фил, Кинг с соавторами, показал, что наиболее значимыми экологическими факторами, полностью определяющими состав микробного сообщества в этом регионе, являются обозначенный ранее почвенный рН, обилие растительности, а также толщина снежного покрова. Стоит отметить, что толщина снежного покрова в этом случае может представлять собой пример вторичного фактора, определяющего влажность почвы.

Факторы, обнаруженные Кингом, определяли наличие и соотношение доминирующих бактерий из четырех основных порядков: Rhodospirillales, Rhizobiales, Acidobacteria G4 и Saprospirales. Обилие бактерий из первых двух порядков коррелировало в значительной степени с плотностью растительного покрова: так, пред-

ставители порядка Rhizobiales преимущественно встречались на участках с богатой растительностью (ту же экологическую нишу этот порядок занимает и в почвах арктических регионов) и полностью сменялись порядком Rhodospirillales, включающим в основном фототрофных бактерий, на «голых» участках или в зонах с бедной растительностью (Chu et al., 2010; King et al., 2010). Интересно, что до проведения широкомасштабных исследований по секвенированию ДНК почвенных образцов, бактерии из порядка Rhodospirillales были описаны исключительно для морских и экстремальных местообитаний, и лишь в последнее время стало известно, что данная группа широко распространена и в разнообразных почвенных местообитаниях, включая почвы солончаков (Hollister et al., 2010).

Сходный характер носили результаты, полученные во время исследования популяций бактерий и архей, вовлеченных в цикл азота в южных и северных областях Франции (Bru et al., 2011). Было показано, что среди пяти категорий экологических факторов, таких как географическое расположение, сельскохозяйственное использование земель, климат, физико-химические характеристики почвы, последний фактор (в частности, pH почвы) играет главную роль в прогнозировании структуры микробного сообщества. Заметное влияние на сообщество оказывал и такой фактор как характер землепользования, роль оставшихся факторов была минимальной (Bru et al., 2011). Так, авторы показали отсутствие какой-либо связи состава микробного сообщества с географической широтой, при этом, действительно значимым фактором, определяющим состав почвенного сообщества в северных и южных регионах страны, оказалась материнская порода, определяющая минеральный состав почв и представленная известковыми породами на севере и кристаллическими на юге.

Даже при анализе таких разнородных экстремальных почвенных местообитаний как почвы пустынь, вечная мерзлота, почвы, загрязненные нефтепродуктами и др., можно обнаружить «вездесущих» микроорганизмов, которые, по всей видимости, составляют коровую часть почвенного метагенома.

Абсолютными чемпионами среди таких микроорганизмов могут считаться бактерии из родов Pseudomonas (Gammaproteobacteria), Arthrobacter (Actinobacteria), Sphingomonas (Alphaproteobacteria), Bacillus (Firmicutes), Rhodococcus (Actinobacteria), Flavobacterium (Bacteroidetes) и некоторые другие

(Ruberto et al., 2008; Wagner, 2008). Все эти бактерии распространены не только в экстремальных, но и во всех других типах почв.

Только сейчас мы подходим к пониманию почвенного метагенома как высокоорганизованной системы, состоящей из компонентов, в той или иной степени изолиованных во времени и пространстве, и в то же время, находящихся в постоянном взаимодействии друг с другом и выполняющих взаимодополняющие роли в функционировании экосистемы в целом.

4. Влияние засоления на почвенное микробное сообщество

Засоленные местообитания широко распространены по всему миру и включают в себя как водные (озера, горячие источники), так и наземные (солончаки, солонцы) экосистемы. Гипергалинными водами называются местообитания, концентрация солей в которых превышает таковую в морской воде (Rodriguez-Valera, 1988). Поскольку большинство почв имеет низкое содержание растворимых солей, для определения почвы как гипергалинной, концентрация солей в ней должна превышать определенный порог, который, по разным источникам, может варьировать от 0,2 до 1% (w/v) (Кирюшин, 2011).

В зависимости от содержащейся в среде концентрации солей, выделяют следующие физиологические группы микроорганизмов: негалофильные микроорганизмы развиваются при концентрациях NaCl не превышающих 1%, слабогало-фильные микроорганизмы имеют оптимум развития, лежащий в пределах от 1 до 3% содержания NaCl в среде, оптимум роста для умеренных галофилов находится в пределах 3 - 15% концентрации NaCl, экстремальные галофилы развиваются в интервале от 15 до 25% NaCl. Микроорганизмы, способные приспосабливаться к существованию в широком диапазоне концентраций солей (от незасоленных местообитаний до сред с 10% содержанием NaCl) называются галотолерантными (Kushner et al, 1988). Концентрация солей в почвенном растворе резко меняется в зависимости от дождей или засухи, поэтому почвенные организмы (в отличие от микроорганизмов водных экосистем) должны приспосабливаться к резким изменениям осмотических свойств среды обитания. Большинство почвенных микроорганизмов являются галотолерантными.

Приспособление к существованию в средах с высокими концентрациями растворимых солей является частным случаем осмоадаптации. Регуляция тургор-ного давления плазматическй мембраны осуществляется с помощью синтеза низкомолекулярных органических веществ - осмопротекторов. К ним относится широкая категория веществ, различных у разных групп организмов. Из аминокислот такую роль играют пролин и глутамат, из Сахаров — трегалоза, свойственные слабым галофилам. Наиболее распространенным осмопротектором служит бетаин, свойственный и почвенным микроорганизмам. Во всех случаях для поддержания осмотического равновесия организмы вынуждены синтезировать возрастающие количества осмопротекторов, которые могут составлять существенную часть общей биомассы. Эти осмопротекторы называют совместимыми, потому что они не нарушают энзиматической активности в клетке и даже служат протекторами от других неблагоприятных влияний. Иная стратегия осмоадаптации (КС1-тип осмоадаптации, стратегия «соль внутри») наблюдается у экстремальных галофилов. В цитоплазме клеток этой группы галофилов накапливаются высокие концентрации КС1, способные уравновесить внешнюю концентрацию солей. При этом, поскольку присутствие молярных концентраций солей в клетке в норме ингибирует активность ее компонентов, стратегия адаптации «соль внутри» также ведет к существенным модификациям в химическом составе клеточных ферментов (Ермилова, 2007).

Как было показано нами в главе о действии физико-химических и географических факторов на микробное сообщество (см. раздел 3), наиболее значимыми, средообразующими экологическими факторами для почвы являются ее кислотность и влажность. Тем не менее, в исследовании (Ьогиропе е1 а1., 2007) авторами была проанализирована большая библиотека 16Б рРНК (порядка 20 000 последовательностей) из 111 разнообразных местообитаний, удалось показать, что именно засоленность является наиболее мощным фактором среды, полностью определяющим биоразнообразие. На следующем этапе авторами были дифференцированы сообщества, обитающие в водных местообитаниях от сообществ, населяющих почву, а также обводненные, периодически затапливаемые участки суши и донные отложения. Так, если сообщества гипергалинного горячего источника группировались вместе с другими водными засоленными местообитаниями, сообщество дон-

ных отложений источника уже группировалось с сообществами незасоленных осадков (Lozupone et al, 2007). Таким образом, засоленность, как это было подтверждено рядом исследований (Herlemann et al., 2011; Lozupone et al., 2007; Crump et al., 2004), играет решающую роль в определении микробного разнообразия водных местообитаний. Для наземных почвенных экосистем пока еще не удалось прийти к единому мнению и определить, какой из экологических факторов играет решающую роль в формировании микробного сообщества, вполне возможно, что им может оказаться наряду со значениями рН и влажности также и засоленность.

При анализе литературных данных обнаруживается существенных недостаток в исследовании микробных сообществ засоленных почв (Caton et al., 2004; Ventosa et al, 2008; Walsh et al., 2005). По всей видимости, это связано с тем, что традиционно интерес ученых привлекали водные засоленные местообитания, в частности огромное количество работ посвящено исследованию гипергалинных озер (Crump et al., 2004; Mesbah et al., 2007; Hollister et al., 2010). При этом прибрежная зона соленых озер исследована в значительно меньшей степени.

Одной из наиболее интересных работ является исследование, проведенное Холлистер (Hollister et al., 2010) с соавторами, в котором авторы проанализировали влияние целого ряда физико-химических параметров, таких как рН, влажность, за-соленость, количество доступного органического вещества и др. на микробное сообщество солончака. Оказалось, что засоленность, являясь, безусловно, мощным экологическим фактором, тем не менее, не являлась главным фактором, определяющим структуру микробного сообщества. Основную роль в этом Холлистер с соавторами (Hollister et al., 2010) отводили, как и в исследованиях незасоленных почв (Fierer et al., 2006; Fierer et al., 2007; Lauber et al., 2009) почвенной влажности, кислотности и содержанию органики.

Объектом исследования, проведенного Холлистер с соавторами, было почвенное сообщество берега соленого озера Ла-Сал-Дель-Рей в США. Авторами были показано, что даже наиболее засоленные участки трансекты характеризовались очень высокими индексами разнообразия, при этом бактерии по численности во много раз превосходили архей. Из бактерий доминировали представители трех фил - Proteobacteria, Bacteroidetes и Firmicutes. Доминирование этих фил было отмече-

но и при исследовании других гипергалинных экосистем, в частности при исследовании затапливаемых «соленых полей», расположенных по берегам соленых озер.

В ходе исследования «соленых полей» центра «The Salt Plains National Wildlife Refuge» (SPNWR) в Оклахоме (США) была проведена оценка почвенного микробного сообщества с использованием культуральных методов, путем получения накопительных культур галотолерантных аэробных гетеротрофных бактерий (Caton et al., 2004). Доминирующими группами микроорганизмов оказались про-теобактерии (в частности род Pseudomonas) и бактерии из сборной группы грампо-ложительных бактерий с низким содержанием GC-nap в ДНК (большую часть которых составляли бактерии из филы Firmicutes). Наибольшее количество изолятов принадлежало к родам грамотрицательных бактерий Halomonas, Idiomarina, Salinivibrio, и Bacteroidetes. Грамположительные бактерии в основном были представлены родами Bacillus, Salibacillus, Oceanobacillus и Halobacillus (Caton et al., 2004).

Сходные результаты были получены и при исследовании берега соленых озер в Китае (Dong et al., 2006). В исследовании также использовались культураль-ные методы и были выделены бактерии из родов Bacillus, Halomonas, Nesterenkonia, Zhihengliuella, Stenotrophomonas и Alkalimonas. Таким образом, как и в предыдущих исследованиях, значительную долю в микробном сообществе занимали представители фил Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes и класса Gammaroteobacteria.

Исследование затапливаемых берегов соленых озер проводились также и с использованием молекулярно-генетических методов, в частности, были описаны почвенные микробные сообщества, населяющие берег озера Текскоко (Мексика). В составе сообществ доминировали бактерии из фил Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Cloroflexi. В трех исследуемых сайтах (с высокими, средними и низкими уровнями засоления) авторами были обнаружены протеобактерии из порядков Rhizobiales, Rhodobacterales и Xanthomonadales. Для наиболее засоленных участков были характерны такие группы микроорганизмов как Rhodospirillales, Sphingobacteriales, Clostridials, Oscillatoriales и Caldilineales, для средних по уровню засоленности проб отмечалось наличие бактерий из порядков Sphingomonadales, Burkholderiales и

Pseudomonadales, в образцах с низкими концентрациями солей доминировали бактерии из групп Myxococcales и Actinomycetales (Valenzuela-Encinas et al., 2009).

Помимо берегов соленых озер, при исследовании засоленных почв можно выделить такие местообитания как пересыхающие лагуны, расположенные в прибрежной зоне морей. В обзоре Вентоза с соавторами (Ventosa et al., 2008) подробно описывается разнообразие микробных сообществ данного местообитания. Большинство изолятов, полученных из данного местообитания, относились к грамот-рицательным бактериям из родов Pseudomonas, Alcaligenes, Salinivibrio, Flavobacterium и Acinetobacter (1%). Как отмечает автор обзора, описанные в исследованиях на основе изучения культуральных свойств микроорганизмы из родов Alcaligenes, Salinivibrio, Flavobacterium по современной классификации должны быть объединены в род Halomonas. Грамположительные бактерии были представлены такими родами как Bacillus, Micrococcus, Arthrobacter, Marinococcus, Sporosarcina (Halobacillus), Staphylococcus, Corynebacterium, Brevibacterium, Nocardia и Actinomyces.

Для данных местообитаний было также отмечено низкое содержание архей (примерно 1% от общей численности микроорганизмов), что в данном случае, скорее всего, связано с неподходящими для этой группы условиями культивирования. Все изолированные археи принадлежали к роду Halobacterium, весьма характерному для засоленных местообитаний. Интересно отметить, что обнаруженные группы микроорганизмов также часто доминируют и в незасоленных почвах. При этом состав микробного сообщества засоленных почв достаточно сильно отличается от такового в водных засоленных местообитаниях, для которых характерно доминирование таких родов бактерий как Salinivibrio и Halomonas (Ventosa et al., 2008).

Исследования пересыхающих водоемов по берегам океанов и морей показали, что доминирующей группой микроорганизмов в данных экосистемах являются актинобактерии. В частности, в исследовании, проведенном в Индии (Тутикорин, Индия) были получены и охарактеризованы накопительные культуры актинобакте-рий, из родов Streptomyces, Micromonospora, Nocardia, Nocardiopsis, Saccharopolyspora и Nonomuraea (Jose, 2012).

Во всех вышеперечисленных исследованиях авторами отмечался высокий уровень разнообразия бактерий, при этом доля архей составляла часто менее 1% от

общей численности микроорганизмов. По всей видимости, наличие и повышенный уровень биоразнообразия археотного сообщества более характерны для почв с максимально высокими уровнями засоленности, таких как прибрежная зона соленых источников (например, источника, расположенного в Колумбии), где было проведено исследование структуры сообщества архей по градиенту засоленности от 7 до 18% содержания хлорида натрия (Walsh et al., 2005). Наиболее распространенной группой в данном местообитании оказались археи из группы Haloarchaea (70% последовательностей из библиотеки гена 16S рРНК), за ними следовали другие представители Euryarchaeota (26%), Crenarchaeota (3%), а также галофильные ме-таногены (1%).

Все приведенные выше исследования были проведены в местообитаниях, характеризующихся высокими значениями влажности. Для засоленных местообитаний с низкими значениями влажности (которые широко представлены на юге России, территориях, прилегающих к Каспийскому морю и Казахстане) известны примеры исследований, посвященных структурному и функциональному разнообразию культивируемых бактерий, распространенных в данных местообитаниях (Звягинцев и др., 2008; Kotenko et al., 2008). Особый интерес для данного обзора представляют работы Д.Г. Звягинцева и М.Е. Котенко.

Как в той, так и в другой работе объектами исследования являлись сходные с выбранными нами почвы - образцы из солончаков и каштановые почвы с сульфид-но-хлоридным типом засоления. В работе Звягинцева с соавторами (Звягинцев и др., 2008) было проведено масштабное исследование, охватывающее порядка девяти различных регионов, где распространены засоленные почвы, в котором авторам удалось получить культуры гало фил ьных актинобактерий, большая часть которых принадлежала родам Streptomyces и Micromonospora. Выделенные культуры были охарактеризованы по их росту при различных значениях рН и концентрациях NaCl2 в среде. Были выделены группы умеренно галофильных (рост в диапазоне 1 - 8% концентрации NaCl2, при оптимуме 4 — 5%), слабо галофильных (рост в диапазоне 1-7% концентрации NaCl2, при оптимуме 2 - 3%), а также негалофильных (рост в диапазоне 0.1-4% концентрации NaCl2, при оптимуме 0,5%) актинобактерий. При сравнении засоленных и незаселенных почв было отмечено снижение общей численности бактерий с увеличением уровня засоленности на 1 - 3 порядка.

В работе Котенко с соавторами (Крепко ег а!., 2008) с использованием системы мульти-субстратного тестирования были получены «функциональные портреты» микробных сообществ из образцов каштановых почв и солончака, расположенных на территории республики Дагестан. Микробные сообщества сравнивались с использованием интегрального параметра, оценивающего «микробиологический статус» почв, который складывался из количественных и качественных показателей по ассимиляции микробным сообществом различных субстратов. По результатам данного исследования авторами было показано снижение данного интегрального параметра при переходе от незасоленных участков (в частности, темно-каштановой почвы) к солончаку, что свидетельствовало о снижении ассимиляционной активности микробных сообществ в засоленных почвах. Также была определена оптимальная для роста и развития микробных сообществ концентрация растворимых солей в почве, которая составила (<1 мгэкв/100 г почвы).

Поскольку нам не удалось найти метагеномных исследований таксономиче-сой структуры сообщества засоленных местообитаний с низкими значениями влажности, объектом исследования данной диссертации был выбран солончак, расположенный на территории Казахстана, а также ряд типичных каштановых почв данного региона.

5. Современные таксономичекие и филогенетические аспекты

исследования биоразнообразия.

Современный анализ метагеномных данных имеет в своей основе классические методы филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей, которые, с момента их применения в метагеномных исследованиях, претерпели лишь незначительные модификации.

Наиболее эффективные компьютерные программы, которые были разработаны в конце прошлого века для анализа нуклеотидных последовательностей, продолжают активно использоваться и при анализе микробных сообществ. Естественно, со временем, в них были внесены изменения, которые учитывали специфику входных данных (Кигип ег а1., 2008), а также наметилась тенденция к интеграции накопленного опыта, в результате чего были созданы как программы (МОТНТЖ

(Schloss et al., 2009), QIIME (Caporaso et al., 2010)), так и интернет-ресурсы (RDP Pyrosequencing Pipeline (Cole et al., 2008; Cardenas et al., 2010), VAMPS (http://vamps.mbl.edu/index.php), MG-RAST (Meyer et al., 2008)), сводящие процесс анализа микробного сообщества к единой схеме.

Классическая схема анализа микробных сообществ состоит из последовательных этапов: 1) проверка качества секвенирования нуклеотидных последовательностей; 2) выравнивание последовательностей и построение матрицы генетических дистанций; 3) выявление ОТЕ (Операционных Таксономических Единиц) -групп, в которые входят последовательности 16S рРНК, объединенные по установленному исследователем критерию сходства нуклеотидных последовательностей; 3) присвоение ОТЕ таксономических характеристик; 4) построение таблицы представленности ОТЕ в пробах; 5) сравнение микробных сообществ с использованием кластерного анализа или методов многомерной статистики.

Данная схема анализа микробных сообществ, хоть и является общепринятой, несет в себе некоторые существенные недостатки, которые отмечаются многими исследователями. Так, например, критерии сходства для объединения последовательностей в общую ОТЕ обычно варьируют в пределах от 90 до 97%. Наиболее часто для объединения родственных последовательностей гена 16S рРНК в ОТЕ используют критерий 97% сходства, что, как предполагается, соответствует таксономической категории вида. Различаются и сами алгоритмы для объединения сходных последовательностей в ОТЕ, что как было показано в работе Уайта с соавторами, очень сильно влияет на результаты анализа структуры микробного сообщества (White et al., 2010). Также значительная часть ОТЕ в ходе дальнейшего анализа не получает таксономической характеристики как на уровне рода, так и на более высоких таксономических уровнях вплоть до филы. Последовательности без таксономической характеристики получили название неатрибутируемые (НА) последовательности (не имеющие гомологов в базах данных).

В то же время, для полноценного анализа структуры микробных сообществ необходима информация, по крайней мере, о семействе или роде микроорганизмов. Только знание этих характеристик позволяет нам предсказывать функциональную роль микроорганизмов в сообществе и проводить их сравнительный анализ. На практике этого практически никогда не происходит по причине информационной

неполноты имеющихся баз данных нуклеотидных последовательностей (Bietz et al., 2009).

Присуждение последовательностям определенной таксономической характеристики непосредственно зависит от состава выбранной базы данных нуклеотидных последовательностей 16S рРНК. На сегодняшний день существует, по крайней мере, три банка данных для последовательностей 16S рРНК (RDPII (Cole et al., 2008), SILVA (Pruesse et al., 2007), Green Genes (de Santis et al., 2006)), которые пользуются наибольшей популярностью среди исследователей. При этом они имеют в той или иной степени различный состав. Но, даже при создании единой базы данных (попытки создания такой базы активно ведутся в последние годы, Bietz et al., 2009), ее состав не будет однородным (последовательности, относящиеся к ряду фил, будут представлены в избытке, в то время как другие филы останутся «недопредставленными») .

В связи с описанными выше недостатками традиционных подходов, а также увеличением количества данных по составу нуклеотидных последовательностей, появляется тенденция к использованию качественно новых подходов в анализе микробных сообществ (Garrity et al., 2004; Hur et al., 2004; Pommier et al., 2009; Rudi et al., 2006; Lozupone et al., 2008; Sharpton et al., 2011; Newman, 2006; Illian et al., 2009; Mering et al., 2007). Здесь мы кратко опишем некоторые из них, идейно наиболее близкие к методам, рассматриваемым в данной диссертации.

Главная идея, объединяющая эти методы, заключается в представлении данных по разнообразию в виде «таксономической карты» с использованием как методов многомерной статистики (Garrity et al., 2002), так и с помощью других систем, позволяющих представить данные в трехмерном (Hughes et al., 2004; Lee et al., 2006) и многомерном пространстве (Kitazoe et al., 2001).

Появление работы «Mapping taxonomic space: an overview of the road map to the second edition of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology» (Garrity et al., 2002) было вызвано, как следует из ее названия, необходимостью в создании системы для упорядочивания данных по биоразнообразию, количество которых к моменту выхода очередного выпуска определителя прокариот Берги увеличилось на несколько порядков, по сравнению с тем, которое описывалось в том же определителе 10-ти летней давности. В данном исследовании авторы анализировали матрицу генетиче-

Методы построения филогенетических деревьев разделяются на две большие группы - первые из них основаны на измерении и работе с генетическими дистанциями между нуклеотидными последовательностями и учитывают лишь количество различающихся нуклеотидных позиций между последовательностями, не анализируя, при этом, их качественный состав (количественные методы). Наиболее распространенными из них являются методы UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) и его усовершенствованная модификация - NJ (Neighbour Joining method). Первым этапом в алгоритме UPGMA является идентификация в анализируемой группе двух последовательностей А и В с наименьшим значением эволюционной дистанции, после чего данные последовательности объединяют в единый узел (композитную последовательность АВ), на следующем этапе производят пересчет матрицы генетических дистанций в соответствии с наличием новой последовательности АВ, после чего действия алгоритма повторяются.

В противоположность данным методам можно привести методы максимальной экономии и максимального подобия, которые позволяют построить дендро-граму родства нуклеотидных последовательностей на основе подробного анализа их нуклеотидного состава (качественные методы). Так, например, метод максимальной экономии определяет топологию филогенетического древа, которая требует минимального количества нуклеотидных замен для описания эволюционных событий в группе анализируемых последовательностей (Лукашов, 2009). Методы качественного анализа нуклеотидных последовательностей по точности проводимого анализа во много раз превышают методы количественного анализа, но требуют значительных временных затрат, которые не позволяют использовать данные методы в молекулярно-экологических исследованиях, где требуется установление филогенетических связей между сотнями и тысячами последовательностей. Использование количественных методов в филогенетическом анализе дает лишь приблизительную оценку эволюционной истории, так, для филогенетического двухмерного древа содержащего п последовательностей формально существует 2п возможных представлений его структуры (Lee et al., 2006).

Эти ограничения современных методов филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей вызвали появление целого ряда работ, целью которых

вершину, в правильном симплексе эти вершины расположены на равном расстоянии друг от друга (по аналогии с равносторонним треугольником, Рис. 7).

При анализе матрицы генетических дистанций мы часто сталкиваемся с ситуацией равенства генетических дистанций между последовательностями. Например, если мы имеем дело с тремя нуклеотидными последовательностями, разница между любой парой из которых составляет 2 нуклеотида, мы можем расположить их на плоскости в виде равностороннего треугольника. Если к этим последовательностям добавить четвертую, расстояние от которой до оставшихся трех также равняется 2 нуклеотидам, то для сохранения расстояний между последовательностями потребуется переход в трехмерное пространство, так как соответствующая геометрическая фигура является тетраэдром. Если число таких последовательностей увеличится до пяти, то потребуется переход в четырехмерное пространство и.т.д. (Рис.

7).

Для определения минимальной размерности пространства гена 16S рРНК нами был проведен анализ 210 651 последовательностей данного гена доступных на сервере базы данных SILVA. Максимальное число последовательностей, имеющих равные попарные генетические дистанции, оказалось равным 14, что соответствует симплексу с 14-ю вершинами, или 13D мерному метрическому пространству. Всего было обнаружено 25 вариантов наборов из 14-ти равноудаленных последовательностей (Дольник с соавт., 2012) (Рис. 8).

На рисунке 8 видно, что последовательности, образующие вершины всех этих симплексов довольно равномерно распределены между основными бактериальными филами. Наиболее разнообразным в таксономическом отношении оказался набор последовательностей для симплекса № 6 (Рис. 8), этот симплекс в дальнейшем использовался нами для определения координат точек ЭП. Алгоритм определения координат для каждой точки (нуклеотидной последовательности) в ЭП основан на измерении расстояния между картируемой последовательностью 16S рРНК и вершинами симплекса (Дольник с соавт., 2012). В результате проделанной работы было построено тринадцатимерное ЭП, в котором были определены координаты для всех 210 651 последовательностей. Перед описанием результатов данного исследования необходимо описать теоретическую структуру эволюционного пространства. В рамках ЭП эволюция последовательностей 16S рРНК пред-

для прокариотных фил. Поэтому, если мы попытаемся поместить в ЭП все известные на данный момент последовательности 16S рРНК мы с известной долей вероятности получим структуру, геометрически представляющую собой нерегулярный фрактал (рис. 9, е).

Представленная модель эволюции в известной мере является приблизительной, но, тем не менее, содержит принципиально новую информацию по сравнению с традиционными подходами в филогенетике. Представляя эволюционные события в полном объеме с описанием как ныне существующих последовательностей, так и «эволюционных полостей», ЭП дает нам возможность реконструкции эволюционных событий прошлого и даже предсказания еще не произошедших в эволюции генетических изменений. Также в рамках ЭП в том или ином виде могут решаться вопросы о моно или полифилетичном происхождении бактериальных таксонов, о предположительной структуре гена 16S рРНК предковых последовательностей, о скорости и механизмах эволюционного процесса в различных филах и другие.

Из проведенного нами анализа по картированию последовательностей 16S рРНК в 1 ЗБ-мерном ЭП, очевидно, что представление этих данных в пространствах меньшей размерности (в двухмерных или трехмерных проекциях) не позволит визуализировать предполагаемую дискретную структуру ЭП («эволюционные полости» будут заполнены спроецированными на них последовательностями из другой области ЭП). Поэтому, для решения этой задачи нами была построена серия параллельных срезов, имеющих минимальную толщину и проходящих через гипотетический центр пространства (Дольник с соавт., 2012). На рисунке 10 представлена серия таких срезов. На срезах отчетливо видно обособление бактериальных фил в виде скоплений точек различной конфигурации, а также видны структуры, подобные «эволюционным полостям» (Рис. 10), которые были описаны нами в ходе теоретических построений (Рис. 9).

Обособление бактериальных фил на полученных срезах свидетельствует в пользу справедливости наших построений и указывает на принципиальную возможность использования ЭП для описания эволюции нуклеотидных последовательностей.

Данное исследование является первой попыткой отображения данных по разнообразию нуклеотидных последовательностей 16S рРНК в многомерном мате-

матическом пространстве, по его результатам был получен низкий по абсолютной величине, хотя и характеризующийся высокой статистической поддержкой, коэффициент корреляции между геометрическими расстояниями между точками ЭП и генетическими дистанциями между соответствующими последовательностями 168 рРНК (Я = 0,3; р<0,001).

-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6

Рисунок 10. Отображение нуклеотидных последовательностей из основных бактериальных фил в эволюционном пространстве гена 16S рРНК (серия срезов, проходящих через гипотетический цент пространства). Стрелками отмечены структуры, напоминающие «эволюционные полости». PRT - Proteobacteria, ВСТ - Bacteroidetes, CNB - Cyanobacteria, ACT -Actino-bacteria, FRM - Firmicutes, CHL - Chloroflexi, ACD - Acidobacteria, OTH - другие филы. Иллюстрация из статьи Дольник с соавт., 2012.

Поэтому, для применения данного подхода на практике, требуется его модификация. В данной диссертации эта задача будет решена, посредством построения альтернативной версии таксономического пространства, с выбором для его построения оптимального набора координат. Выбор координат будет осуществляться с целью получения максимального коэффициента корреляции между генетическими дистанциями между последовательностями и их геометрическими аналогами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Першина, Елизавета Владимировна

Выводы:

1. Использование кластерного анализа и теста Мантеля показало, что основным фактором, определяющим структуру микробного сообщества в почвах солончака Шингирлау, является засоленность, определяющая смену состава микробного сообщества с доминирующих в незаселенных участках актинобактерий ЯиЬгоЬас1еп'асеае и 8оИгиЪгоЪас1епасеае на некультивируемых бактерий из класса АсИпоЬас1ег1а и бактерий из фил РШеоЪаМепа, Firmicut.es и Bacteroidetes в наиболее засоленном участке.

2. В модельном опыте по искусственному засолению наблюдалось значительное снижение уровня разнообразия. В сообществе увеличилась доля бактерий из семейств ВасШасеае, 8[гер1отусе1асеае, Nocardioidaceae и Ва1пео1асеае (в том числе его слабогалофильных представителей из рода СгасШтопая).

3. Выявлены группы микроорганизмов, которые могут рассматриваться в качестве кандидатов на роль индикаторов процесса засоления - бактерии из семейств ВасШасеае и Ва1пео1асеае.

4. Ранжирование микроорганизмов с использованием модели линейной регрессии позволило систематизировать данные по разнообразию и выявить роды микроорганизмов, принадлежащие к предполагаемым группам га-лофильных, галотолерантных и негалофильных микроорганизмов.

5. Разработанная модель таксономического пространства на основе оценки двух интегральных математических параметров - центральной точки и вектора ее смещения позволяет учитывать неидентифицируемые последовательности, проводить сравнительный анализ метагеномов и оценивать направление и глубину их сукцессии.

Заключение

На примере анализа процессов природного и искусственного почвенного засоления мы показали, что традиционный метагеномный анализ сталкивается с рядом методологических проблем при изучении динамики микробных сообществ. Прежде всего, это связано с большим объемом данных по биоразнообразию и отсутствием системности в их анализе. Предложенная в работе модель ТП представляет собой один из вариантов системного подхода к анализу метагеномных данных, рассматривая почвенный метагеном, как целостную надорганизменную систему наследственности, структура и динамика которой может быть описана с использованием интегральных математических параметров. Использование ТП для анализа микробных сообществ в условиях засоления показало, что данный подход позволяет оценивать глубину и направление сукцессии микробного сообщества при действии стрессовых экологических факторов различной природы. Помимо решения вопросов, связанных с динамикой микробиома, в работе предложен метод для выявления микроорганизмов, претендующих на роль экологических индикаторов при стрессовом воздействии. Совместное применение данных подходов в исследовании процессов почвенного засоления позволило выявить группы галофиль-ных, негало фильных и галотолерантных прокариот и показать наличие сходных тенденций в развитии систем природного и искусственного почвенного засоления. Поскольку в работе применялись наиболее простые статистические критерии, использование которых для оценки сходства или различия сообществ в ТП не вполне соответствует природе исследуемых данных, в дальнейшем необходима разработка дополнительных статистических оценок для каждого из интегральных параметров ТП.

Также стала очевидной необходимость в проведении ряда дополнительных экспериментов, позволяющих проводить градацию экологических факторов в зависимости от степени их влияния на структуру микробиома. Дальнейшая работа по обозначенным направлениям позволит перейти к практическому использованию информации о структуре почвенного метагенома для диагностики и профилактики почвенного агроэкологического состояния, а также для использования в таких отраслях сельскохозяйственной практики как биоремедиация, оптимизация использования биопрепаратов, поиск перспективных видов микроорганизмов, обеспечивающих рост и развитие растений и др.

Помимо решения проблем, связанных с описанием биоразнообразия в целом, ТП может быть использовано для решения проблемы наличия большого числа не-идентифицируемых последовательностей при анализе метагенома. Напомним, что в ходе исследования структуры микробного сообщества с помощью традиционных подходов, нами было отмечено наличие большого числа неидентифицируемых последовательностей (в том числе последовательностей с неустановленной таксономической характеристикой на уровне филы). Отсутствие точных таксономических характеристик у значительной части микроорганизмов не позволяет проводить сравнительный анализ данных, полученных в различных экспериментах. Представление данных в ТП позволяет решить данную проблему, посредством переноса анализа в систему, где строго фиксированное положение может быть определено для любого варианта гена 16Б рРНК без процедуры его таксономической идентификации. Это дает каждому микроорганизму своеобразное «удостоверение личности» в виде набора из 42 координат, которое позволяет идентифицировать его в различных экспериментах и, таким образом, производить интеграцию данных различных исследований.

Еще одной проблемой современных метагеномных исследований является проблема выбора критерия для формирования ОТЕ (большинство исследователей в данном случае используют формальный критерий 97% сходства в структуре гена 16Б рРНК). Использование ТП позволит осуществить научно-обоснованный выбор данного критерия. Поскольку в основе данной модели лежит описание филогенетических связей между нуклеотидными последовательностями, то при описании микробного сообщества, мы можем в полной мере использовать описанные выше эволюционные построения (см. главу «Обзор литературы»), В соответствии с ними можно, например, попытаться определить степень варьирования нуклеотидной последовательности гена 168 рРНК в пределах вида для различных таксонов или даже просто «разделить» ЭП на формальные сектора.

В рамках модели ТП могут найти свое решение и фундаментальные вопросы, связанные с эволюцией нуклеотидных последовательностей. Поскольку модель позволяет дать описание любому варианту структуры гена 16Б рРНК (включая как реализованные, так и еще не реализованные в ходе эволюции варианты), то в ее рамках могут решаться вопросы, связанные с происхождением и эволюцией прока-риотных таксонов (например, может быть определен гипотетический центр происхождения таксона). В последнем случае ТП может быть реорганизовано в эволюционное пространство. Реорганизация ТП в ЭП очевидно будет связана с предъявлением новых требований к выбору координат, участвующих в его построении. Рассмотрение микробных сообществ в эволюционном пространстве позволит подойти к решению целого ряда вопросов, таких как, например, установление связи между изменением таксономической структуры сообщества и эволюционными событиями в микробных популяциях, поиск «центров происхождения» прокариотных таксонов и многих других.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Першина, Елизавета Владимировна, 2013 год

Список литературы:

1. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ, 1989. 336 с.

2. Воробьева JI.A, Паикова Е.И. Щелочные засоленные почвы России // Почвоведение. 2008. №5. С. 517-532.

3. Дольник А.С., Тамазян Г.С., Першина Е.В., Вяткина К.В., Порозов Ю.Б., Пинаев А.Г., Андронов Е.Е. Концепция универсальной таксономической системы бактерий: эволюционное пространство гена 16S рРНК v. 1.0. // Сельскохозяйственная биология. 2012. №5. С. 111-120.

4. Ермилова Е.В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот. СПб.: Издательство С.-Петербургского университета, 2007. 299 с.

5. Звягинцев Д.Г, Зенова Г.М, Оборотов Г.В. Мицелиальные бактерии засоленных почв // Почвоведение. 2008. №10. С. 1250-1257.

6. Кирюшин В.И. Классификация почв и агроэкологическая типология земель. СПб.: Лань, 2011.288 с.

7. Лукашов В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. 256 с.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479 с.

9. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. М.: Колос, 1978. 351 с.

10. Першина Е.В., Тамазян Г.С., Дольник А.С., Пинаев А.Г., Сергалиев Н.Х., Андронов Е.Е. Изучение структуры микробного сообщества засоленных почв сиспользованием высокопроизводительного секвенирования //Экологическая генетика. 2012. Т.Х. №2. С.31-38.

11. Acinas S.G., Marcelino L.A., Klepac-Cerajand V., Polz M.F. Divergence and redundancy of 16S rRNA sequences in genomes// Journal of bacteriology. 2004. №186. P. 2629-2635.

12. Acinas S.G., Sarma-Rupavtarm R., Klepac-Ceraj V. et al. PCR-Induced sequence artifacts and bias: insights from comparison of two 16S rRNA clone libraries constructed from the same sample // Applied and environmental microbiology. 2005. V. 71. № 12. P. 8966-8969.

13. Agnelli A., Ascherb J., Cortia G., Ceccherini M.T., Nannipieri P., Pietramellara G. Distribution of microbial communities in a forest soil profile investigated by microbial biomass, soil respiration and DGGE of total and extracellular DNA // Soil Biol Biochem. 2004. №36. P. 859-868.

14. Andreetta A., Macci C., Ceccherini M.T., Cecchini G., Masciandaro G., Pietramellara G., Carnicelli S.Microbial dynamics in mediterranean moder humus //Biol Fertil Soils. 2004. №48. P. 259-270.

15. Ventosa A., Mellado E., Sanchez-Porro C. et al. Halophilic and halotolerant microorganisms from soils. In Dion P., Nautiyal C.S. (Eds) Microbiology of the extreme soils. 2008. P. 85-115.

16. Ascher J., Ceccherini M.T.., Nannipieri P., Pietramellara G.Extracellular DNA rise up in soil by water capillarity // Geophysical Research Abstracts. 2005. № 7. P. 07946.

17. Bakken L., Frostegard A. Nucleic acid extraction from soil. In: Nannipieri P., Smalla K. (Eds) Nucleic Acids and Proteins in Soil. 2006. P. 49-73.

18. Baveye P.C. To sequence or not to sequence the whole-soil metagenome? // Nat Rev Microbiol. 2009. V. 10. № 7. P. 756.

19. Bent S.J., Forney L.J. The tragedy of the uncommon: understanding limitations in the analysis of microbial diversity // ISME. 2008. № 2. P. 689-695.

20. Bergmann G.T., Bates S.T., Eilers K.G., Lauber C.L., Caporaso J.G., Walters W.A., Knight R., Fierer N. The under-recognized dominance of Verrucomicrobia in soil bacterial communities // Soil Biol Biochem. 2011. № 43. P. 1450-1455.

21. Bietz M.J., Lee C.P. Collaboration in metagenomics: Sequence databases and the organization of scientific work. In Balka E., Ciolfi L., Simone C., Tellioglu H., Wagner I. (Eds) ECSCW: Proceedings of the 11th European Conference on Computer Supported Cooperative Work. 2009.

22. Bockelmann U., Liinsdorf H., SzewzykU.The detection of extracellular DNA as a structural component in the EPS of bacterial strains // Geophysical Research Abstracts. 2007. № 9. P. 01325.

23. Brockett B.F.T., Prescott C.E., Grayston S.J. Soil moisture is the major factor influencing microbial community structure and enzyme activities across

seven biogeoclimatic zones in western Canada // Soil Biol Biochem. 2012. № 44. P. 9-20.

24. Bru D., Ramette A., Saby N.P., Dequiedt S., Ranjard L., Jolivet C., Arrouays D., Philippot L. Determinants of the distribution of nitrogen-cycling microbial communities at the landscape scale // ISME J. 2011. № 5. P. 532-542.

25. Bürgmann H., Pesaro M., Widmer F., Zeyer J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil // J Microbiol Meth. 2001. № 45. P. 7-20.

26. Burm0lle M., Johnsen K., Abu Al-Soud W., Hansen L.H., S0rensen S.J. The presence of embedded bacterial pure cultures in agar plates stimulate the culturability of soil bacteria // J Microbiol Meth. 2009. №79. P. 166-173.

27. Crump B.C., Hopkinson C.H., Sogin M.L. et al. Microbial biogeography along an estuarine salinity gradient: combined influences of bacterial growth and residence time // Applied and environmental microbiology. 2004. V. 70. № 3. P. 1494-1505.

28. Cai P., Huang Q., Zhang X. Interactions of DNA with clay minerals and soil colloidal particles and protection against degradation by DNase// Environ Sci Techno1. 2006. №40. P. 2971-2976.

29. Caporaso J.G., Kuczynski J., Stombaugh J. et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data// Nature Methods. 2010. V. 5. №7. P. 335-336.

30. Cardenas E., Cole J.R., Tiedje J.M. et al. Microbial Community Analysis using RDP II (Ribosomal Database Project II): methods, tools and new advances // Environ Eng Res. 2009. V. 14. №1. P. 3-9.

31. Carson J.K., González-Quiñones V., Murphy D.V., Hinz C., Shaw J.A., Gleeson D.B. Low pore connectivity increases bacterial diversity in soil // Appl Environ Microb. 2010. № 76. P. 3936-3942.

32. Castro H.F., Classen A.T., Austin E.E., Norby R.J., Schadt C.W. Soil microbial community responses to multiple experimental climate change drivers // Appl Environ Microb. 2010. № 76. P. 999-1007.

33. Caton T.M. Witte L.R., Ngyuen H.D et al. Schneegurt halotolerant aerobic heterotrophic bacteria from the great salt plains of Oklahoma // Microbial Ecology. 2004. V. 48. P. 449-462.

34. Ceccherini M.T., Ascher J., Agnelli A., Borgogni F., Pantani O.L., Pietramellara G. Experimental discrimination and molecular characterization of the extracellular soil DNA fraction // Antonie van Leeuwenhoek. 2009. № 96. P. 653-657.

35. Ceccherini M.T., Aschera J., Pietramellara G., Vogel T.M., Nannipieri P. Vertical advection of extracellular DNA by water capillarity in soil columns // Soil Biol Biochem. 2007. № 39. P. 158-163.

36. Chaisson M.J., Pevzner P.A. Short read fragment assembly of bacterial genomes // Genome Res. 2008. № 18. P. 324-330.

37. Chau J.F., Bagtzoglou A.C., Willig M.R.The effect of soil texture on richness and diversity of bacterial communities // Environmental Forensics. 2011. №12. P. 333-341.

38. Chiang W., Tolker-Nielsen T. Extracellular DNA as matrix component in microbial biofilms. In: Kikuchi Y., Rykova E.Y. (Eds) Extracellular Nucleic Acids. 2010. P. 1-14.

39. Choi D.H., Zhang G.I., Noh J.H. et al. Gracilimonas tropica gen. nov., sp. no v., isolated from a Synechococcus culture // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2009. V.59. P. 1167-1172.

40. Chong C.W., Pearce D.A., Convey P., Yew W.S., Tan I.K.P. Patterns in the distribution of soil bacterial 16S rRNA gene sequences from different regions of Antarctica // Geoderma. 2012. V. 181-182. P. 45-55.

41. Chotte J.Importance of Microorganisms for Soil Aggregation. In: Buscot F, Varma A (Eds) Microorganisms in Soils: Roles in Genesis and Functions. 2005. P. 107-119.

42. Chowdhury S.P., Schmid M., Hartmann A., Tripathi A.K. Diversity of 16S-rRNA and nifH genes derived from rhizosphere soil and roots of an endemic drought tolerant grass, Lasiurus sindicus //European journal of soil biology. 2009. №45. P. 114-122.

43. Chu H., Fierer N., Lauber C.L., Caporaso J.G., Knight R., Grogan P. Soil bacterial diversity in the Arctic is not fundamentally different from that found in other biomes // Environ Microb. 2010. №12. P. 2998-3006.

44. Cole J.R., Wang Q., Cardenas E. et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis // Nucleic Acids Research. 2009. V. 37. P. D141-D145.

45. Connon S.A., Lester E.D., Shafaat H.S., Obenhuber D.C., Poncel A. Bacterial diversity in hyperarid Atacama Desert soils // J Geophys Res. 2007. № 112. P. G04S17.

46. Crosby L.D., Criddle C.S. Understanding bias in microbial community analysis techniques due to rrn operon copy number heterogeneity // Bio Techniques. 2003. V. 34. № 4. P. 790-794.

47. Davinic M., Fultz L.M., Acosta-Martinez V., Calderón F.J., Cox S.B., Dowd S.E., Allen V.G., Zak J.C., Moore-Kucera J. Pyrosequencing and mid-infrared spectroscopy reveal distinct aggregate stratification of soil bacterial communities and organic matter composition // Soil Biol Biochem. 2012. № 46. P. 63-72.

48. Dechesne A., Pallud C., Debouzie D., Flandrois J.P., Vogel T.M., Gaudet J.P., Grundmann G.L. A novel method for characterizing the microscale 3D spatial distribution of bacteria in soil // Soil Biol Biochem. 2003. № 35. P. 1537-1546.

49. Delmont T.O, Robe P., Cecillon S., Clark I.M., Constancias F., Simonet P., Hirsch PR., Vogel T.M. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity // Applied and environmental microbiology. 2011. V. 77. №. 4. P. 13151324.

50. DeSantis T.Z., Hugenholtz P., Larsen N. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB // Applied and environmental microbiology. 2006. V. 72. №. 7. P. 5069-5072.

51. Drenovsky R.E., Vo D., Graham K.J. et al. Soil water content and organic carbon availability are major determinants of soil microbial community composition//Microbial Ecology. 2004. V. 48. P. 424-430.

52. Drenovsky R.E., VoD., GrahamK.J., Scow. K.M. Soil water content and composition // Microb. Ecol. 2004. № 48. P 424-430.

53. Elshahed M.S., Youssef N.H., Spain A.M., Sheik C., Najar F.Z., Sukharnikov L.O., Roe B.A., Davis J.P., Schloss P.D., Bailey V.L., Krumholz L.R. Novelty and uniqueness patterns of rare members of the soil biosphere // Appl Environ Microbiol. 2008. №74. P. 5422-5428.

54. Ettema C.H., Wardle D.A.Spatial soil ecology // TRENDS in Ecology & Evolution. 2002. №17. P. 177-183.

55. Feinstein L.M., Sul W.J., Blackwood C.B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil // Appl Environ Microb. 2009. № 75. P. 5428-5433.

56. Fierer N., Bradford M.A., Jackson R.B. Toward an ecological classification of soil bacteria // Ecology. 2007. V6. № 88. P. 1354-1364.

57. Fierer N., Jackson R.B. The diversity and biogeography of soil bacterial communities // P Natl Acad Sci USA. 2006. № 103. P. 626-631.

58. Fierer N., Jackson R.B. The diversity and biogeography of soil bacterial communities // PNAS. 2006. V. 103. № 3.P. 626-631.

59. Forney L.J., Zhou X., Brown C.J. Molecular microbial ecology: land of the one-eyed king // Current Opinion in Microbiology. 2004. № 7 P. 210-220.

60. Ganley A., Kobayashi T. Total rDNA repeat variation revealed by whole-genome shotgun sequence data// Genome Research. 2007. №17. P. 184-191.

61. Garber R.C., Turgeon B.G., Selker E.U., Yoder O.C. Organization of ribosomal RNA genes in the fungus Cochliobolus heterostrophusll Current Genetics. 1988. V. 14. № 6. P. 573-582.

62. Garrity T., Lilburn G. Exploring prokaryotic taxonomy// International journal of systematic and evolutionarymicrobiology. 2004. V. 54. P. 7-13.

63. Grundmann G.L. Spatial scales of soil bacterial diversity - the size of a clone // FEMS Microb Ecol. 2004. №48. P. 119-127.

64. Grundmann G.L., Gourbiere F. A micro-sampling approach to improve the inventory of bacterial diversity in soil // Appl Soil Ecol. 1999. № 13. P. 123-126.

65. Handelsman J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms // Microbiology and molecular biology reviews. 2004. № 68. P. 669-685.

66. Herlemann D.P.R., Labrenz M., Jurgens K. et al. Transitions in bacterial communities along the 2000km salinity gradient of the Baltic Sea // The ISME Journal.2011. V. 5. P. 1571-1579.

67. Hillis D.M., Heath T.A., John K.S. Analysis and visualization of tree space // Syst Biol. 2005. № 54. V.3. P. 471-482.

68. Hollister E.B., Engledow A.S., Hammett A.J.M., Provin T.L., Wilkinson H.H., Gentry T.L. Shifts in microbial community structure along an ecological gradient of hypersaline soils and sediments // ISME. 2010. № 4. P. 829-838.

69. Hughes T., Hyun Y., Liberies D.A. Visualising very large phylogenetic trees in three dimensional hyperbolic space// BMC Bioinformatics. 2004. V. 5. P. 48.

70. Hur I., Chun J. A method for comparing multiple bacterial community structures from 16S rDNA clone library sequences// The Journal of Microbiology. 2004. V. 42. № 1. P.9-13.

71. Illian J.B., Prosser J.I., Baker K.L. et al. Functional principal component data analysis: A new method for analysing microbial community fingerprints // Journal of Microbiological Methods. 2009. V. 79. P. 89-95.

72. Ishii K., Fukui M. Optimization of annealing temperature to reduce bias caused by a primer mismatch in multitemplate PCR// Applied and environmental microbiology. 2001. V. 67. № 8. P. 3753-3755.

73. Janssen P.H. Identifying the dominant soil bacterial taxa in libraries of 16S rDNA and 16S rRNA genes //Appl Environ Microb. 2006. № 72. P. 1719-1728.

74. Jose P.A., Robinson S., Jebakumar D. Phylogenetic diversity of actinomycetes cultured from coastal multipond solar saltern in Tuticorin, India // Aquatic Biosystems. 2012. V. 8. P. 23.

75. Kakirde K.S., Parsley L.C., Liles M.R. Size does matter: application-driven approaches for soil metagenomics // Soil Biol Biochem. 2010. №42. P. 1911-1923.

76. King A.J., Freeman K.R., Mccormick K.F., Lynch R.C., Lozupone C., Knight R., Schmidt S.K. Biogeography and habitat modelling of high-alpine bacteria//Nature Comm. 2010. № 1. P. 53.

77. Kitazoe Y., Kurihara Y., Narita Y. et al. A New Theory of Phylogeny Inference Through Construction of Multidimensional Vector Space // Mol Biol Evol. 2001. V. 18. № 5. P. 812-828.

78. Kotenko M.E., Zubkova T.A., Gorlenko M.V. Functional diversity of microbial communities in saline soils of the semidesert zone // Moscow University Soil Science Bulletin. 2009. V. 64. № 2. P. 89-92.

79. Kunin V., Copeland A., Lapidus A., Mavromatis K., Hugenholtz P. A bioinformatician's guide to metagenomics // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2008. №72. P. 557-578.

80. Kuske C.R., Ticknor L.O., Miller M.E., Dunbar J.M., Davis J.A., Barns S.M., Belnap J. Comparison of soil bacterial communities in rhizospheres of three plant species and the interspaces in an arid grassland // Appl Environ Microbiol. 2002. V. 4. № 68. P. 1854-1863.

81. Kushner D.J., Kamekura M. Physiology of halophilic eubacteria. In: Rodriguez-Valera F. (Ed) Halophilic Bacteria. 1988. P. 87-103.

82. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing.In: Stackebrandt E., GoodfellowM. (Eds) Nucleic acid techniques in bacterial systematics. 1991. P. 115-175.

83. Lauber C.L., Hamady M., Knight R., Fierer N. Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale //Appl Environ Microbiol. 2009. V. 15. № 75.P. 5111-5120.

84. Lauber C.L., Strickland M.S., Bradford M.A., Fierer N. The influence of soil properties on the structure of bacterial and fungal communities across land-use types // Soil Biol Biochem. 2008. № 40. P. 2407-2415.

85. Lee S., Ka J., Cho J.Members of the phylum Acidobacteria are dominant and metabolicallyactive in rhizosphere soil // FEMS Microbiol Lett. 2008. № 285. P. 263-269.

86. Lee S.H., Hwang K.S., Lee H.R. Proceedings of the 5th WSEAS Int. Conf. on Circuits, systems, electronics, control & signal processing// Embedding Operational Taxonomic Units in Three-Dimensional Space for Evolutionary Distance Relationship in Phylogenetic Analysis. November 1-3. 2006, Dallas, USA.

87. Levy-Booth D.J., Campbell R.G., Gulden R.H., Harta M.M., Powellc J.R., Klironomos J.N., Pauls K.P., Swanton C.J., Trevorsa J.T., Dunfieldd K.E. Cycling of extracellular DNA in the soil environment // Soil Biol Biochem. 2007. № 39. P. 2977-2991.

88. Lo' pez K.S., Alice A.F., Heras H. et al. Role of anionic phospholipids in the adaptation of Bacillus subtilis to high salinity// Microbiology. 2006. V. 152. P. 605-616.

89. Lombard N., Prestat E., Elsas J.D.V., Simonet P. Soil-specific limitations for access and analysis of soil microbial communities by metagenomics // FEMS Microbiol Ecol. 2011. № 78. P. 31-49.

90. Lozupone C.A., Knight R. Global patterns in bacterial diversity // PNAS. 2007. V. 104. № 27. P. 11436-11440.

91. Lozupone C.A., Knight R. Species divergence and themeasurementofmicrobial diversity // FEMS Microbiol Rev. 2008. V. 32. P. 557578.

92. Lu N., Zilles J.L., Nguyen T.H. Adsorption of extracellular chromosomal DNA and its effects on natural transformation of Azotobacter vinelandii II Appl Environ Microbiol. 2010. V. 13. № 76. P. 4179-4184.

93. Martin-Laurent F., Philippot L., Hallet S., Chaussod R., Germon J.C., Soulas G., Catroux G. DNA extraction from soils: old bias for new microbial diversity analysis methods // Appl Environ Microb. 2001. № 67. P. 2354-2359.

94. Mering von C., Hugenholtz P., Raes J. et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments // Science.2007. V. 315. P.1126-1130.

95. Mesbah N.M., Abou-El-Ela S.H., Wiegel J. Novel and unexpected prokaryotic diversity in water and sediments of the alkaline, hypersaline lakes of the Wadi AnNatrun, Egypt // Microbial Ecology. 2007. V. 54. P. 598-617.

96. Meyer F., Paarmann D., D'Souza M.D., Olson R., Glass E.M., Kubal M., Paczian T., Rodriguez A., Stevens R., Wilke A., Wilkening J., Edwards R.A. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes // BMC bio informatics. 2008. № 9. P 386.

97. Mocali S., Benedetti A. Exploring research frontiers in microbiology: the

challenge of metagenomics in soil microbiology // Research in Microbiology. 2010. № 161. P. 497-505.

98. Mohamed D.J., Martiny J.B. Patterns of fungal diversity and composition along a salinity gradient // ISME J. 2011. V. 3. № 5. P. 379-388.

99. Mummey D., Holben W., Six J.,Stahl P. Spatial stratification of soil bacterial populations in aggregates of diverse soils // Microbial Ecol. 2006.№51. P. 404-411.

100. Mummey D.L., Stahl P.D. Analysis of soil whole- and innermicroaggregate bacterial communities // Microbial Ecol. 2004. № 48. P. 41-50.

101. Newman M. E. J. Modularity and community structure in networks // PNAS.2006. V. 103. № 23. P. 8577-8582.

102. Nielsen K.M., Calamai L., Pietramellara G. Stabilization of extracellular DNA and proteins by transient binding to various soil components. In: Nannipieri P., Smalla K. (Eds) Nucleic Acids and Proteins in Soil. 2006. P. 141-157.

103. Nielsen K.M., Johnsen P.J., Bensasson D., Daffonchio D. Release and persistence of extracellular DNA in the environment // Environ Biosafety Res. 2007.№ 6. P. 37-53.

104. Nunan N., Wu K., Young I.M., Crawford J.W., Ritz K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil // FEMS Microb Ecol. 2003. № 44. P. 203-215.

105. Oren A. Halophilic microorganisms and their environments. Dordrecht: Kluwer academic publishers, 2002. 575 c.

106. Pace N.R. Mapping the tree of life: progress and prospects // Microbiology and molecular biology reviews. 2009. V. 73. № 4.P. 565-576.

107. Paget E., Lebrun M., Freyssinet G., Simonet P. The fate of recombinant plant DNA in soil // Eur J Soil Biol. 1998. V. 2. № 34. P. 81-88.

108. Pietramellara G., Ascher J., Borgogni F., Ceccherini M.T., Guerri G., Nannipieri P.Extracellular DNA in soil and sediment: fate and ecological relevance // Biol Fert Soils. 2009. № 45. P. 219-235.

109. Podar M., Abulencia C.B., Walcher M.,Hutchison D., Zengler K., Garcia J.A., Holland T., Cotton D., Hauser L., Keller M. Targeted access to the genomes

of low-abundance organisms in complex microbial communities // Appl Environ Microb. 2007. V. 10. № 73. P. 3205-3214.

110. Polz M.F., Cavanaugh C.M. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR// Applied and environmental microbiology. 1998. V. 64. № 10. P. 3724-3730.

111. Pommier T., Canbäck B., Lundberg P. et al. RAMI: a tool for identification and characterization of phylogenetic clusters in microbial communities// Bioinformatics.2009. V. 25. № 6.P. 736-742.

112. Pruesse E., Quast C., Knittel K. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB //Nucleic Acids Research. 2007. V. 35. № 21.P. 7188-7196.

113. Raes J., Foerstner U.K., Bork P. Get the most out of your metagenome: computational analysis of environmental sequence data // Current Opinion in Microbiology. 2007. № 10. P. 1-9.

114. Riesenfeld C.S., Schloss P.D., Handelsman J. Metagenomics, genomic analysis of microbial communities // Annual Review of Genetics. 2004. № 38. P. 525-552.

115. Robe P., Nalin R., Capellano C., Vogel T.M., Simonet P.Extraction of DNA from soil // Eur J Soil Biol. 2003. № 39. P. 183-190.

116. Rodriguez-Valera F. Characteristics and microbial ecology of hypersaline environments. In: Rodriguez-Valera F. (Ed) Halophilic Bacteria. 1988. P. 3-30.

117. Roesch L.F.W., Fulthorpe R.R., Riva A., Casella G., Hadwin A.K.M., Kent A.D., Daroub S.H., Camargo F.A.O., Farmerie W.G., Triplett E.W.Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity // ISME J. 2007. № 1. P. 283290.

118. Romanowski G., Lorenz M.G., Sayler G., Wackernagel W. Persistence of free plasmid DNA in soil monitored by various methods, including a transformation assay // Appl Environ Microb. 1992. № 58. P. 3012-3019.

119. Rondon M.R., August P.R., Bettermann A.D., Brady S.F., Grossman T.H., Liles M.R., Loiacono K.A., Lynch B.A., MacNeil I.A., Minor C., Tiong C.L., Gilman M., Osburne M.S., Clardy J., Handelsman J., Goodman R.M. Cloning the

soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms // Appl Environ Microb. 2000.№ 66. P. 2541-2547.

120. Ruberto L.A.M., Vazquez S.C., Mac Cormack W.P. Bacteriology of extremely cold soils exposed to hydrocarbon pollution. In: Dion P., Nautiyal C.S. (Eds) Microbiology of Extreme Soils. 2008. P. 247-274.

121. Rudi K., Zimonja M., Naes T. Alignment-independent bilinear multivariate modelling (AIBIMM) for global analyses of 16S rRNA gene phylogeny// International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2006. V. 56. P. 1565-1575.

122. Saeki K., Kunito T. Adsorptions of DNA molecules by soils and variable-charged soil constituents. In: Mendez-Vilas A. (Ed) Current research technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. 2010. P. 188-195.

123. Sagova-Mareckova M., Cermak L., Novotna J., Plhackova K., Forstova J., Kopecky J. Innovative methods for soil DNA purification tested in soils with widely differing characteristics // Appl Environ Microb. 2008. № 74. P. 29022907.

124. Santhanam R., Okoro S.K., Rong X. Streptomyces deserti sp. nov., isolated from hyper-arid Streptomyces deserti sp. nov., isolated from hyper-arid // Antonie van Leeuwenhoek. 2012. V. 101. P. 575-581.

125. Schloss P.D., Westcott S.L., Ryabin T. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities // Applied and environmental microbiology. 2009. V. 75. № 23. P. 7537-7541.

126. Sessitsch A., Weilharter A., Gerzabek M.H., Kirchmann H., Kandeler E. Microbial population structures in soil particle size fractions of a long-term fertilizer field experiment // Appl Environ Microb. 2001. № 67. P. 4215-4224.

127. Sharpton T.J., Riesenfeld S.J., Kembel S.W. PhylOTU: a high-throughput procedure quantifies microbial community diversity and resolves novel taxa from metagenomic data // PLoS Computational Biology. 2011. V. 7. № 1. P. el001061.

128. Simon C., Daniel R. Metagenomic analyses: past and future trends // Appl Environ Microbiol. 2011. V. 4. № 77. P. 1153-1161.

129. Singh B.K., Campbell C.D., Sorenson S.D., Zhou J.Soil genomics //Nature Reviews Microbiology. 2009a. № 7. P. 756.

130. Singh B.K., Dawson L.A., Macdonald C.A., Buckland S.M. Impact of biotic and abiotic interction on soil microbial communities and functions: a field study // Applied soil ecology. 20096. № 41. P. 239-248.

131. Torsvik V., Ovreas L. Microbial diversity and function in soil, from genes to ecosystems // Curr Opin Microbiol. 2002. № 5. P. 240-245.

132. Trap J., Laval K., Akpa-Vinceslas M., Gangneux C., Bureau F., Decaens T., Aubert M. Humus macro-morphology and soil microbial community changes along a 130-yr-old Fagus sylvatica chronosequence // Soil Biol Biochem. 2011. № 43. P. 1553-1562.

133. Tringe S.G., Hugenholtz P.A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene // Curr Opin Microbiol. 2009. № 11. P. 442-446.

134. Tringe S.G., von Mering C., Kobayashi A., Salamov A.A., Chen K., Chang H.W., Podar M., Short J.M., Mathur E.J., Detter J.C., Bork P., Hugenholtz P., Rubin E.M.Comparative metagenomics of microbial communities // Science. 2005. № 308. P. 554-557.

135. Tsai S., Selvam A., Chang Y., Yang S. Soil bacterial community composition across different topographic sites characterized by 16S rRNA gene clones in the Fushan Forest of Taiwan// Botanical Studies. 2009. № 50. P. 57-68.

136. Tsuchiya D., Taga M. Application of fibre-FISH (fluorescence in ¿■//¿/hybridization) to filamentous fungi: visualization of the rRNA gene cluster of the ascomycete Cochliobolus heterostrophus II Microbiology. 2001. № 147. P. 1183-1187.

137. Turnbaugh P.J., Hamady M., Yatsunenko T., Cantarel B.L., Duncan A., Ley R.E., Sogin M.L., Jones W.J., Roe B.A., Affourtit J.P., Egholm M., Henrissat B., Heath A.C., Knight R., Gordon J.I.A core gut microbiome in obese and lean twins //Nature. 2009. № 457. P. 480-484.

138. Tyson G.W., Banfield J.F. Cultivating the uncultivated: a community genomics perspective // TRENDS in Microbiology. 2005.V. 9. № 13. P. 411-415.

139. Valenzuela-Encinas C., Neria-Gonza'lez I., Alca'ntara-Herna'ndez I. Changes in the bacterial populations of the highly alkaline saline soil of the former

lake Texcoco (Mexico) following flooding // Extremophiles. 2009. V. 13.P. 609621.

140. Vogel T.M., Simonet P., Jansson J.K., Hirsh P.R., Tiedje J.M., Van Elsas J.D., Bailey M.J., Nalin R., Philippot L. TerraGenome: a consortium for the sequencing of a soil metagenome // Nat Rev Microbiol. 2009. № 7. P. 252.

141. Voroney R.P. The Soil Habitat. In: Paul E.A. (Ed) Soil Microbiology, Ecology, and Biochemistry, 3rd edn. 2010.

142. Wackernagel W.The Various Sources and the Fate of Nucleic Acids in Soil. In: Nannipieri P., Smalla K. (Eds) Nucleic Acids and Proteins in Soil. 2006. P. 117-139.

143. Wagner D. Microbial Communities and Processes in Arctic Permafrost Environments. In: Dion P., Nautiyal C.S. (Eds) Microbiology of Extreme Soils. 2008. P. 133-154.

144. Walsh D.A., Papke R.T., Doolittle F.W. Archaeal diversity along a soil salinity gradient prone to disturbance // Environmental Microbiology. 2005. V. 7. № 10. P.1655-1666.

145. Wendland J., Phlmann R., Dietrich F., Steiner S., Mohr C., Philippsen P. Compact organization of rRNA genes in the filamentous fungus Ashbya gossypii // Current Genetics. V. 35. № 6. P. 618-625.

146. Westram R., Bader K., Prübe E., Kumar Y., Meier H., Glöckner F.O., and Ludwig W. ARB: a software environment for sequence data. In: de BruijnF.J. (Ed.) Handbook of Molecular Microbial Ecology I: Metagenomics and Complementary Approaches. 2011. P.1363-1371.

147. Wexler M., Johnston A.W.B. Wide Host-Range Cloning for Functional Metagenomics. In: Streit W.R., Daniel R. (Eds) Metagenomics. Methods and Protocols. 2010. P. 77-96.

148. White J.R., Navlakha S., Nagarajan N. et al. Alignment and clustering of phylogenetic markers - implications for microbial diversity studies // BMC Bioinformatics. 2010. V. 11. P. 152.

149. Will C., Thürmer A., Wollherr A., Nacke H., Herold N.. Schrumpf M., Gutknecht J., Wubet T., Buscot F., Daniel R. Horizon-specific bacterial community composition of german grassland soils, as revealed by

pyrosequencing-based analysis of 16S rRNA genes // Appl Environ Microbiol. 2010. V. 20. № 76. P. 6751-6759.

150. Wooley J.C., Ye Y. Metagenomics: facts and artifacts, and computational challenges // J Comp Sci Technol. 2009. № 25. P. 71-81.

151. Young I.M., Crawford J.W. Interactions and selforganization in the soil-microbe complex // Science. 2004. № 304. P. 1634-1637.

152. Yu Y., Lee Ch., Kim J., Hwang S. Group-specific primer and probe sets to detect methanogenic communities using quantitative real-time polymerase chain reaction // Biotechnology and Bioengineering. 2005. V. 89. № 6. P. 670-679.

153. Zengler K., Toledo G., Rappe M., Elkins J., Mathur E.J., Short J.M., Keller M.Cultivating the uncultured // P Natl Acad Sci USA. 2002. № 99. P. 1568115686.

154. Zenova G.M., Oborotov G.V., Norovsuren Zh. et al. Halophilic and Alkaliphilic Streptomycetes in Salt-Affected Soils // Eurasian Soil Science.2007. V. 40. №11. P. 1203-1207.

Благодарности

Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность своему научному руководителю — Андронову Евгению Евгеньевичу за создание творческой атмосферы научного поиска, ценные советы по обработке экспериментального материала и помощь при подготовке текста рукописи.

Автор благодарит своих рецензентов - доктора биологических наук Прово-рова Николая Александровича и доктора биологических наук Белимова Андрея Алексеевича за внимательное прочтение текста рукописи и ценные советы по его доработке, выражает признательность организаторам и участникам экспедиции по сбору почвенных образцов из района природного засоления: Андронову Е.Е., Пи-наеву А.Г., Сергалиеву Н.Х., Рахимгалиевой С.Ж., Ахмеденову K.M. и Горобец А.В, а также благодарит Дольника A.C. и Тамазяна Г.С. за помощь в разработке используемых в диссертации математических моделей и проведении математических расчетов в многомерном пространстве.

Особую благодарность автор выражает доктору биологических наук Прово-рову Николаю Александровичу за справедливую критику, многократный внимательный анализ текста рукописи с внесением ценных исправлений по структуре и идейному содержанию диссертации, а также доценту кафедры микробиологии СПбГУ, кандидату биологических наук Дмитриевой Елене Юрьевне за ценные указания по осмыслению данных, полученных в диссертации в контексте классической почвенной микробиологии.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ, ГК№ 16.512.11.2132 и грантом РФФИ 12-04-01371-а.