Новые методические приемы разделения высокополярных соединений в практике ВЭЖХ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.11.11, кандидат химических наук Сапрыкина, Лидия Викторовна

• Сапрыкина, Лидия Викторовна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сапрыкина, Лидия Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

1. ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Бетаины.

1.1.1. Строение бетаинов.

1.1.2. Биологическая роль бетаинов.

1.2. Состояние вопроса.

1.3. Основные проблемы хроматографического анализа бетаинов.

1.3.1. Детектирование.

1.3.2. Выбор метода разделения.

1.4. Динамическое модифицирование в ВЭЖХ.

1.4.1. Общие положения.

1.4.2. Ион-парный режим.

1.4.3.Модифицирование ВЭЖХ-системы солями.

1.4.4. Гидрофильный режим в ВЭЖХ.

1.5. Подготовка биологических проб к анализу.

1.5.1. Твердофазная экстракция.

1.5.2. Методология твердофазной экстракции.

1.5.3. Подбор типа картриджа.

1.5.4. Кондиционирование картриджа.

1.5.5. Подготовка пробы.

1.5.6.Нанесение пробы на сорбент.

1.5.7.Промывка картриджа.

1.5.8. Элюирование.'.

1.5.9.Последующая обработка пробы.

1.5.10. Дополнительные рекомендации.

2. ГЛАВА 2 ПОДГОТОВКА И ХОД ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РАБОТ

2.1 Оборудование.

2.2 Материалы и реактивы.

2.3 Пробоподготовка.

2.4 Синтез гетероноверхностных сорбентов

2.5 Проведение хроматографического эксперимента.

3. ГЛАВА 3. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Применение ион-парного режима ВЭЖХ.

3.2 Применение гидрофильной хроматографии.

3.2.1 Методические подходы к оптимизации хроматографического разделения 56 3.2.2. Влияние природы органического растворителя.593.2.3. Влияние содержания модификатора в элюенте на хроматографическую систему.

3.2.4. Нормально-фазовый вариант ДИРФ.

3.3 Проявления режима ДИРФ нри анализе различных объектов.

4. ДИНАМИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ В ПРАКТИКЕ ТСХ. 93 ВЫВОДЫ

Методика определения бетаинов и милдроната в плазме крови с использованием, ТФЭ-очисткн и концентрирования (I).

Экспресс-методика одновременного определения четырех бетаинов и милдроната в плазме крови на гетероиоверхностиом сорбенте (И).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые методические приемы разделения высокополярных соединений в практике ВЭЖХ»

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), интенсивно развиваясь несколько последних десятилетий, зарекомендовала себя в качестве одного из самых универсальных методов разделения и анализа веществ, что и обусловило ее необычайную популярность у исследователей в самых различных областях науки и техники [1-3].

Без использования ВЭЖХ сейчас невозможно представить практически ни одну отрасль промышленности и науки. А динамичное развитие таких направлений как экология, здравоохранение, фармакология и токсикология в наибольшей мере обязано именно аналитическим приложениям жидкостной хроматографии [4, 5].

В то же время, решая все более сложные аналитические: и препаративные задачи, сам метод непрерывно развивается как в-аппаратурном, так и в методическом плане.

Безусловно, в практическом плане для развития ВЭЖХ наиболее актуально появление новых хроматографических материалов, обладающих улучшенными разделительными характеристиками. Также весьма перспективны разработка и изучение новых методических приемов и режимов проведения хроматографического эксперимента. Особенно это значимо при разработке хроматографических методов разделения высокополярных веществ, в том числе - ионогенных. Необходимость анализа такого рода соединений в различных объектах появляется довольно часто при решении самых разнообразных научно-технических и технологических задач. Эти сорбаты являются традиционно сложными для разделения посредством классических режимов ВЭЖХ и предъявляют повышенные требования к качеству сорбентов и хроматографической аппаратуре [6-8].

Чаще всего используемые для осуществления таких анализов методические приемы, среди которых можно выделить реализацию ионпарного механизма разделения и предколоночную дериватизацию полярных компонентов пробы - далеко не всегда применимы [9-11].

Тем не менее, существует достаточно большое количество методов воздействия на хроматографическую систему, использующих динамическое (адсорбционное) модифицирование (ДМ), применение которого позволяет получать хорошие результаты на морально устаревших и относительно t дешевых сорбентах. К сожалению, среди многообразных приемов динамического модифицирования используются лишь некоторые, да и то бессистемно и неоправданно редко [12, 14, 15].

В последние годы все.чаще стали появляться публикации с описанием разделений веществ в режиме гидрофильной хроматографии так называемый HILIC-режим (аббревиатура от Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography), который предусматривает применение в хроматографической практике немодифицированного силикагеля вместе с полярными элюентами и значительно расширяет возможности ВЭЖХ [16].

Следует отметить, что применение этого весьма перспективного вида хроматографии также пока весьма ограничено, что обусловлено малой изученностью закономерностей процессов, протекающих на границе раздела фаз [17].

Одной из насущных проблем, представляющих значительные трудности при реализации ВЭЖХ-анализа, является определение органических оснований и амфолитов. Большинство этих веществ имеют исключительно важное значение для жизнедеятельности живых организмов любого уровня организации, поскольку либо являются биологически активными, либо непосредственно участвуют в биоэнергетических циклах.

Этот аспект делает задачу их надежного определения в биологических объектах очень актуальной применительно к таким важным отраслям, как биология, медицина, спорт, фармакология, токсикология и валеология.

В первую очередь из таких веществ стоит отметить такой довольно обширный класс органических амфолитов, как бетаины.

Задача их экспрессного и точного определения на достаточно низком уровне концентраций (нанограммы на миллилитр) в биологических объектах до сих пор не может считаться решенной.

Целью работы являлась разработка и изучение новых видов воздействия на нормально-фазовые и обращенно-фазовые хроматографических системы в режиме динамического модифицирования и создание на этой основе методик анализа органических оснований в сложных аналитических объектах.

В соответствии с поставленной целыо основными задачами работы являлись:

1. Выбор режимов работы на немодифицированных силикагелях с водно-органическими элюентами.

2. Изучение влияния на хроматографическое поведение полярных веществ добавок в элюент в качестве динамического модификатора значительного количества неорганических солей.

3. Разработка и экспериментальная проверка модели реализации режима с динамически индуцированным разделом фаз на примере разделения некоторых органических ионов.

4. Разработка методики ВЭЖХ анализа нативных бетаинов в биологических объектах.

5. Изучение возможности переноса некоторых приемов динамического модифицирования из ВЭЖХ в тонкослойную хроматографию (ТСХ).

Научная новизна. Изучены основные закономерности удерживания полярных соединений на немодифицированном силикагеле в водно-ацетонитрильных элюентах, содержащих неорганические соли.

Для объяснения этих закономерностей предложена и обоснована физическая модель раздела фаз у поверхности сорбента за счет высаливающего действия солей, присутствующих в элюенте в значительных концентрациях.

Рассмотрены перспективные варианты динамического модифицирования поверхности полярных сорбентов.

Впервые для анализа биологических проб разработан и успешно применен гетероповерхностный (RAM) сорбент на основе силикагеля с немодифицированной поверхностью мезопор.

Изучена возможность и выявлены особенности динамического модифицирования сорбента в практике ТСХ хроматографии и показана перспективность такого подхода для изменения основного механизма сорбции.

Практическая значимость работы. Выявленные закономерности позволили разработать ряд новых приемов ВЭЖХ для анализа и препаративного разделения высокополярных соединений, потенциально востребованных в медицине, фармакологии, экологии и в аналитическом контроле промышленной продукции.

Разработаны 2 методики анализа четырех нативных бетаинов и лекарственного препарата с бетаиноподобной структурой в плазме крови.

Найден и опробован режим динамического модифицирования для проведения скрининговых исследований содержания ПАУ на ТСХ пластинах в режиме эмуляции обращенной фазы.

На защиту выносятся:

- критерии подбора режимов работы на немодифицированных силикагелях с водно-органическими элюентами;

- некоторые закономерности влияния на хроматографические свойства системы добавок значительного количества неорганических солей в качестве динамического модификатора;

-физическая модель реализации режима с динамически индуцированным разделом фаз;

-методика ВЭЖХ анализа нативных бетаинов в биологических объектах; -отдельные приемы динамического модифицирования в практике ТСХ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы». (г. Москва, 2004 г.); Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии».(г. Самара, 2005 г.); X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии», (г. Москва (Клязьма), 2006 г.); Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях, (г. Москва (Клязьма), 2007 г.)

Заключение диссертации по теме «Хроматография и хроматографические приборы», Сапрыкина, Лидия Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Обнаружен новый режим модифицирования силикагеля в колоночной и тонкослойной жидкостной хроматографии, названный нами динамически индуцированным разделом фаз (ДИРФ), проявляющийся в виде разделения* фаз элюента в результате добавления в него значительного количества неорганических солей.

2. Предложена модель ДИРФ и изучены основные закономерности этого явления. Показано, что оно наблюдается в водно-ацетонитрильных подвижных фазах при концентрации фосфатов, начиная с 0,05 М, причем величина концентрации соли однозначно определяет пороговое содержание ацетонитрила в элюенте, выше которого наблюдается разделение фаз.

3. Исследовано хроматографическое поведение сильнополярных веществ, на колонках с силикагелем в подвижных водно-ацетонитрильных фазах с различной концентрацией дигидрофосфата калия при разных значениях рН Найдено, что для хроматографирования бетаинов оптимальной является подвижная фаза вода-ацетонитрйл (30:70), содержащая 0,1 М КН2РО4 (рН 6,2).

4. Разработаны ВЭЖХ-методики определения бетаинов в крови на колонке с силикагелем со стадией концентрирования бетаинов на картриджах с силикагелем в режиме ДИРФ и прямого определения бетаинов в крови на колонке с гетероповерхностным сорбентом, внутренняя поверхность которого представляет собой немодифицированный силикагель. При УФ-детектировании при длине волны 198 нм предел обнаружения бетаинов в крови составил не менее 0,2 мкг/мл. Погрешность определения концентрации бетаинов в крови на уровне 0,8 мкг/мл составила около 6%.

5. Изучены возможности и ограничения использования динамического модифицирования в практике ТСХ. Показана применимость этого методического приема для практических целей.

Методика определения бетаинов и милдроната в плазме крови с использованием ТФЭ-очистки и концентрирования (I).

Настоящая рекомендация устанавливает методику выполнения совместного определения массовой концентрации четырех бетаинов и синтетического бетаиноподобного лекарственного препарата - милдроната в плазме крови и других биологических жидкостях (моча, лимфа, слюна и т.п.) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в диапазонах концентраций каждого бетаина от 0,05 до 50 мкг/ см3, милдроната - от 0,1 до 200 мкг/см3.

Определяемые по данной методике бетаины с химической точки зрения представляют собой производные аминокислот, гриметилзамещенпые внутренние соли, образующиеся в организме в результате метаболизма некоторых белков. Это нелетучие термолабильные твердые вещества хорошо растворимы в воде и несколько хуже - в некоторых полярных органических растворителях (спирты, кетоны, нитрилы). Как правило, их концентрация в биологических жидкостях составляет 1-10 мг/л. Бетаиновые производные: 1) глицина — бетаин, (М,14,М-триметиламино)ацетат, 2) (3-аланина -аланинбетаин, 3-(1^,К,14-триметиламино)пропионат, 3) у-треонина - (N,N,14-триметиламино)-2-оксибутират, 4) у-аминомасляной кислоты - 4-(М,К,М— триметиламино)бутират, 5) синтетическое бетаиноподобное соединение, являющееся действующим веществом ряда лекарственных препаратов - 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата дигидрат.

1. Нормы погрешности измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей 6%.

2. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

2.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф «Милихром 4»с УФ -детектором или аналогичный ему по параметрам, оснащенный: насосной системой с возможностью градиентной подачи элюента, системой автоматического дозирования и спектрофотометрическим УФ-детектором с изменяемой длиной волны или с мультиволновой регистрацией сигнала, хроматографическая колонка: 2x80 мм, или 2x60 мм, заполненная силикагелевым сорбентом Separon SGX 5 мкм или аналогичным ему по параметрам, аппаратно-программным комплексом.

Весы аналитические, класс точности 1

Механические микродозаторы переменного объема 2-20; 20-200; 200-1000; 1000-5000 мкл

Колбы мерные, 2-100-2, 2-200-2, 2-500-2, 2-1000-2

Пипетки градуированные 5-1-1, 5-2-10, 5-2-25 рН-метр-милливольтметр или иономер

Стандарты индивидуальных бетаинов и милдроната SIGMA-ALDRICH Chemie.

ГОСТ 2410488

ВЮНГГ PROLINE, Финляндия ГОСТ 177074

ГОСТ 2029274

ТУ 25-051181-76 «analytical grade»

2.2. Вспомогательные устройства

Колбы конические с притертыми пробками объемом ГОСТ 25336-82 10, 50 и 100 мл

Химические стаканы емкостью 100, 500 и 1000 мл ГОСТ 25336-82

Сушильный шкаф лабораторный ГОСТ 13474-79

ТФЭ-картриджи «Диапак С16», «Диапак Sil» ЗАО «БиоХимМак

CT»

Вакуумный ротационный испаритель Микроцентрифуга

2.3. Реактивы и материалы

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «сорт 0» или "Криохром", С.-Петербург,

HPLC Grade» «Merk»

Вода дистиллированная ГОСТ 6709—77

Кислота ортофосфорная, (d=l,70 кг/л), «хч» ГОСТ 6552-80

Кислота серная, (d=l ,84 кг/л), "хч" ГОСТ 4204-77 Кислота хлорная «хч» Карбонат магния «хч»

Калий двухромовокислый (бихромат), «хч» ГОСТ 4220-75

Калий фосфорнокислый, однозамещенный, ГОСТ 4198-75 «хч» или «осч»

Калия гидроокись, «хч» ГОСТ 9285-78

Метиловый спирт, «хч» ГОСТ 6995-77

Примечание: Допускается использование средств измерений, оборудования, материалов и реактивов, отличающихся от указанных, но не уступающих им по характеристикам.

3. Метод измерения

Измерения массовой концентрации бетаинов в плазме крови и в водном растворе выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Перед проведением хроматографического анализа проводят пробоподготовку исследуемого образца твердофазной экстракцией бетаинов и милдроната из биопробы, а затем вводят в хроматограф, где бетаины разделяются на хроматографической колонке.

Перед выполнением измерений хроматограф градуируют по градуировочным растворам, приготовленным из стандартных веществ по п.7.3.3, для расчета концентрации бетаинов устанавливается зависимость между концентрациями определяемых бетаинов и площадями их пиков при соответствующей длине волны, и времени выхода.

При проведении измерений полученные величины времени выхода (фактора удерживания) используют для идентификации бетаинов, а площади пиков на хроматограммах для расчета массовых концентраций бетаинов. Примеры получаемых хроматограмм приведены в Приложениях 1 к методике.

4. Требования безопасности

При выполнении измерений по настоящей методике соблюдают требования безопасности, регламентированные:

- руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа;

- инструкциями предприятия по технике безопасности по выполняемым видам работ (работа с концентрированными кислотами, ядовитыми веществами, растворителями);

Все действия с кислотами, ядовитыми веществами, растворителями и работы по очистке реактивов должны проводиться в вытяжном шкафу.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже лаборанта-химика, навыки и опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение хроматографическим методам анализа, стажировку на жидкостном хроматографе данного типа и изучившие настоящую методику.

6. Условия выполнения измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- температура воздуха от 15 до 35°С;

- атмосферное давление 84-107 кПа (630-800 мм рт.ст.);

- относительная влажность воздуха от 30 до 80%;

- напряжение переменного тока, питающего хроматограф (220±22) В; частота питающей сети (50±1) Гц.

Место установки хроматографа должно быть удалено от источников тепла и прямых потоков воздуха (сквозняков), во время проведения анализов должна быть исключена возможность попадания прямого солнечного света на хроматограф.

7. Подготовка к выполнению измерений

7.1. Перед выполнением измерений по настоящей методике проводят следующие работы: подготовку (очистку) посуды, растворителей и реактивов; приготовление рабочих растворов; приготовление растворов для градуировки хроматографа; градуировку.

7.2. Подготовка посуды. Используемую при анализе стеклянную посуду моют, последовательно ополаскивают хромовой смесыо, водопроводной, дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу при температуре 120-150°С. Посуду из полипропилена обрабатывают аналогичным образом и сушат в сушильном шкафу при температуре 60°С.

7.3. Приготовление рабочих растворов

Вода для приготовления всех растворов и элюента используется дважды перегнанная (бидистиллированная), дополнительно очищенная пропусканием через картридж- для ТФЭ с обращено-фазовым сорбентом («Диапак С16» или подобный). Допускается применение воды, полученной на специальных установках очистки воды для ВЭЖХ.

7.3.1. Приготовление буферного раствора

Для приготовления буферного раствора дигидрофосфата калия концентрацией 0,5 М, берут навеску массой 68 г и растворяют бидистиллятом в мерной колбе на 1 литр. Приготовленный раствор хранят в холодильнике не более двух недель.

7.3.2. Приготовление элюента

60 мл буферного раствора переносят в мерный цилиндр объемом 1 л, добавляют 340 мл бидистиллята и 600 мл ацетонитрила. Полученный раствор перемешивают, фильтруют через стеклянный фильтр и дегазируют при перемешивании под вакуумом в стеклянной толстостенной колбе (Бунзена).

1 литра элюента достаточно для 9 ч непрерывной работы на микроколоночном хроматографе. Готовый элюент хранить не более суток.

7.3.3. Приготовление модельных(градуировочных) растворов.

На аналитических весах взвешивают по 2,50 мг каждого бетаина и переносят каждую навеску в соответствующую мерную колбу на 25 мл, растворяют и доводят до метки элюентом. Концентрация полученных растворов соответствует 0,1 г/л.

7.4. Пробоподготовка

Пробу объемом 25 мл плазмы в 20 раз разбавляют ацетонитрилом (т.е. доводят объем пробы до 500 мл) и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 4-х минут. Центрифугат прокачивают через концентрирующий картридж с помощью медицинского шприца или под вакуумом. Затем промывают патрон 500 мкл 0,5 М раствора хлорной кислоты в бидистиллированной воде и нейтрализуют элюат избытком (примерно 5 мг) карбоната магния. После растворения карбоната магния проба готова к: анализу.

Полученный раствор в случае необходимости можно упарить в вакууме и перерастворить в стартовом элюенте.

Для концентрирования бетаинов из меньших объемов плазмы используют картриджи с силикагелем фирмы Fluka объемом 0,1 мл. Процедура концентрирования полностью аналогична приведенной выше: пробу плазмы объемом 1 мл разбавляют до 20 мл ацетонитрилом. Раствор наносят шприцом на картридж. Элюирование проводят без предварительной промывки картриджа 150 мкл смывающего раствора (0,5М водный раствор хлорной кислоты). Затем нейтрализуют элюат небольшим избытком карбоната магния (до прекращения реакции).

7.5. Градуировка хроматографа

7.5.1. Градуировочную характеристику устанавливают по модельному раствору для градуировки, приготовленному по п.7.3.3

7.5.2.В колонку дозируют по 10 мкл модельного раствора каждого бетаина и записывают хроматограммы.

7.5.3. Для каждого модельного раствора проводят два параллельных измерения по п.8.1.1.

7.5.4. Каждую хроматограмму обрабатывают в соответствии с компьютерной программой, определяя времена удерживания, и площади пиков.

7.5.5. Рассчитывают среднее значение площади пика для каждого бетаина.

Рассчитывают коэффициент корреляции г. В случае, если г<0,92, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, устраняют их и повторяют эксперимент.

8. Выполнение измерений

8.1. Измерение массовой концентрации бетаинов в исследуемом образце выполняют следующим образом:

8.1.1. 15-20 мкл исследуемого раствора вводят в подготовленный к работе жидкостный хроматограф и записывают хроматограмму в следующих условиях:

8.1.2. Проводят идентификацию хроматографических пиков.

8.1.3. В случае положительного результата идентификации грубо оценивают концентрацию бетаинов в исследуемом растворе

Скорость подачи элюента: Объем предпробы (буферного раствора): Длины волн детектора: Время интегрирования:

0,1 мл/мин. 10 мкл 200 нм. 0,8 с.

9. Обработка результатов измерений

9.1. Обработку и запись результатов измерений проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации к компьютерной программе.

9.2. Массовую концентрацию бетаина в растворе рассчитывают по формуле:

50хК0 ' где: С — концентрация данного бетаина в элюате, г/ л;

Со - концентрация данного бетаина в модельном растворе, г/ л; Б — площадь пика бетаина в элюате; Бо - площадь пика бетаина в модельном растворе; У0 - объем элюата, мл V - объем пробы плазмы, мл

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сапрыкина, Лидия Викторовна, 2008 год

1. Стыскин E.JL, Ициксон JI.B., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. 288 с.

2. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига, 1988.390 с.3. 100 лет хроматографии / Отв. ред. Б.А. Руденко. -М.: Наука, 2003. 739 с.

3. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: Пер. с англ. / Под ред. А.Хеншен и др. М.: Мир, 1988. 688 с.

4. Хроматография на благо России. М.: Издательская группа «Граница», 2007. 688 с.

5. Петере Д., Хайес Дж., Хифтье Г. Химическое разделение и измерение. Теория и практика аналитической химии. Кн.2. Пер. с англ. / Под ред. П.К.Агасяна.- М.:Химия, 1978. 816 с.

6. Л.Физер, М.Физер. Органическая химия. Углубленный курс. Т. 2. М.: Химия, 1970. 800с.

7. Киселев А.В., Пошкус Д.П., Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия, 1986. 272 с.

8. Gloor R., Johansson E.L. Practical aspect of reverse-phase ion-pair chromatography// J. Chromatogr. 1977. Vol.15. N 9. P. 413-423.I

9. Exborg S., Lagerstrom P.-O., Modin R., Shill G. Ion-pair chromatography of organic compounds // J. Chromatogr. 1973. Vol.83. N 1. P.305-312.

10. Deelder R.S., Linssen A.J., Konijnenijk A.P. Van de Venne J.L. Retention mechanism in reversed-phase ion-pair chromatography of amines and amino acids on bonded phases // Chromatogr. 1979. Vol.185. N 1. P.241-257.

11. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шатц В.Д. Аналитическая хроматография. М.: Химия. 1993. 464 с.

12. Sahartova, V. Shatz, I. KalvinS. HPLC analysis of mildronate and its analogues in plasma // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, V. 11. No. 10. 1993. P. 1045-1047.

13. JI.B. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина. Некоторые аспекты практического применения динамического модифицирования в ВЭЖХ на силикагелевых сорбентах. // «Сорбциопные и хроматографические процессы». Т.6, Вып. 2, 2006. С. 284-301.

14. JI.B. Сапрыкин, JI.B. Сапрыкина. Динамическое модифицирование хроматографических систем в практике ВЭЖХ // Тез. докл. Всеросс. конференции «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии», г. Самара, 2005г. С. 43.

15. J. Pesek, М.Т. Matyska. A Comparison of Two Separation Modes: HELIC and Aqueous Normal Phase Chromatography // LCGC. North America. May 1, 2007.

16. Сычев K.C. Практические рекомендации по выбору неподвижных фаз и оптимизации условий разделения в хиральной ВЭЖХ. // Сборник «Хроматография на благо России», Москва, «ИД Граница», 2007г. стр. 314-329.

17. Effect of L-carnitine and L-aminocarnitine on calcium transport, notility and enzime release from ejaculated bovine spermatozoa // Biol. Repred. 1989. V. 41. N 5. P. 949-955.

18. Broerick T.L., Poirier P., Tremblau A., Catellier C., Naeau A. Effect of exogenous insulin on plasma free carnitine levels during exersise in normal man // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1989. V. 67. N 12. P.1598-1560.

19. Chrisnensen M.L., Helms R.A., Mauer E.G., Strom M.C. Plasma carnitineconcentration and lipid metabolism in infant parenteral nutrition // J.Pediatr. 1989. V. 115. No. 5. Pt. 1. P.794-798.

20. Shima Y. Effect of L-carnitine on lipid and hepatic energy metabolism in septic rats // Geka to Taisha, Eigo. 1989. V. 23. No. 1. P.55-56.

21. Kolodziej M.P., Zammit V.A. Réévaluation of the interection of malonil-CoA with the rat liver mitochondrial carnitine palmitoyltransferase system by using purified outer membranes //Biochem. J. 1990. V. 267. No. 1. P.85-90.

22. Yun-Feng Lv, Xin Hu and Kai-Shun Bi Determination of mildronate in human plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry//Journal of Chromatography B, Volume 852, No. 1-2, 2007, P. 35-39.

23. Minkler P.E., Ingolls St.T., Hoppel Ch.L. HPLC separation of acylcarnitines following derivatisation with 4'-bromphen-acyltrifluoromethanesulphonata// Anal.Biochem. 1990. V. 185 No. 1. P. 29-35.

24. Gorcham J., McDonnel E., Wyn Jones R.G. Determination of betains as ultraviolet-absorbing esters // Anal. Chim. Acta. 1982. V. 138. P. 277-283.

25. Martin J.J., Finlcelstein J.D. Enzymatic determination of betaine in rat tissues. Anal.Biochem. 1981. V.l 11. P. 72-76.

26. Sandor A., Cseko J., Alkonyi I. Use of anion-exchange resinin fluoride form in sample processing for determination of carnitine // J.Chromatogr. 1989. V. 497. P. 250-257.

27. Lowes St., Rose M.E. Analytical prosidures for determing acilcarnitine in biological fluids // Trends Anal. Chem. 1989. V. 8. No. 5. P. 184-188.

28. Kodo N., Millington D.S., Norwood D.L., Roe Ch.R. Quantitative assay of free and total carnitine using tandem mass-spectrometry and liquid chromatography // Clin. Chem. Acta. 1990. V. 186. No. 3. P. 383-90.

29. Arakava N., Ha Tae Youl, Otsuka M. An improved HPLC assay for the determination of free and asterified carnitine in animal tissues // J.Nutr.Sci.Vitaminol.1989. V. 35. No. 5. P. 475-479.

30. De Sousa C., English N.R., Stacey Т.Е., Chalmers R.A. Measurement of L-carnitine and acylcarnitines in body fluids in children and adults // Clin. Chem. Acta.1990. V. 187. No. 3. P. 317-328.

31. Maeda J., Yamakava M., Mimura J., Furuga K., Oohara Т., Dudrick S.J., Nippon

32. J. Specific determination of plasma carnitine concentration and refrence study // Keicho Eigo Kenkyukaishi. 1989. No. 4. P. 316-318.

33. Schaefer J., Reichmann H. A spectrophotometric method for the determination of free and esterified carnitine // Clin, j Chem. Acta. 1989. V. 182. No. 1. P. 87-93.

34. Sekas G., Paul H.S. Inhibition of carnitine actyltransferase by bile acids: implication for carnitine analysis // Anal. Biochem. 1989. V. 179. No. 2. P .262-267.

35. Lingeman H., Van Munster H.A., Beynen J.H. et al. High performance liquid chromatographic analysis of basic compounds on nonmodified silica gel and aluminium oxide with aqueouse solvent mixtures // J.Chromatography. 1986. V. 352. No. l.P. 261-274.

36. Сапрыкин JT.B. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Монография / Под. ред. В.В. Болотова. Харьков.: Оригинал, 2007. 228 с.

37. Warhlund K.-G., Sokolowski A. Revesd-phase ion-pair chromatography of antidepressive and neuroleptic amines and related quaternary ammonium compounds //J.Chromatogr. 1978. V. 151. P. 299-310.

38. Warhlund K.-G. Separation of acidic drugs in the fig/ml range in untreated blood plasma by direct injection liquid chromatographic columns // J. Chromatogr. 1981. V. 218. P. 671-679.

39. Bidlingmeyer B.A. Separation of ionic compounds by reversedphase liquid chromatography: An update of ion-pairing technique // .^Chromatography Sci. 1980. V. 18. No. 10. P. 525-539.

40. Сычев C.H. Методы совершенствования хроматографических систем и механизмы удерживания в ВЭЖХ.: Орел, 2000. 212 с.

41. Bidlingmeyer В.A., Del Rios J.K., Korpl J. Separation of organic araine compaunds on silica gel with reversed phase eluents // Anal.Chem. 1982. V. 54. No. 3. P. 442-447.

42. Law В., Gill R., Moffat A.C. High-performance liquid chromatography retention data for 84 basic drugs of forensic interest on a silica column using an aqueous methanol eluent//J. Chroamtogr. 1984. V. 301. P. 165-172.

43. Flanagan R.J., Jane I. High performance liquid chromatographic analysis of basic drugs on silica columns using non-aqueous ionic eluents. I. Factors influensing retention, peak shape and detector response // J.Chromatogr. 1985. V. 323. P. 173189.

44. Сердан A.A. Гетероповерхностные сорбенты для ВЭЖХ // 100 лет хроматографии. М.: Наука, 2003. С. 570-601.

45. Айлер Р. // Химия кремнезема; Пер. англ. / Под редакцией Прянишникова. М.: Мир, 1982. Т. 1,2. 1127 с.

46. Неймарк И.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители катализаторов. Киев: Наукова думка, 1982. 216 с.

47. Unger К.К., Kinkel J.N., Anspach В., Giesch Н. // J. Cromatogr. 1984. Vol. 296. P. 3-14.

48. HILIC analysiert polare Verbindungen// LaborPraxis. LEBENSMITTELANALYTIK SPECIAL. 04.2006.http://www.laborpraxis.de:80/fachartikel/druck/lp fachartikel druck 3081986.html

49. Staroverov S.M., Kopylov R.V., Nesterenko P.N., Serdan A.A. // XXI Intern. Symp. on chromatography, Stuttgart, sept. 15-20, 1996: Book of Abstr. Stuttgart, 1996. S. 187.

50. Ю.Д.Коган ООО «Имид» и развитие современной количественной тонкослойной хроматографии// Сборник «Хроматография на благо России», Москва, «ИД Граница», 2007. С. 480-491.

51. Авторское свидетельство: А.А.Сердан, С.М.Староверов, С.Ю.Богословский, Г.В.Лисичкин, К.И.Сакодынский. Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей // АС СССР № 1788463 (1991).

52. Копылов Р.В., Нестеренко П.Н., Сердан А.А., Тюленина И.П. Синтез и исследование характеристик ряда новых гетероповерхностных сорбентов* // Вестн. Моск. ун-та. Сер.2 Химия. 1998, т.39, №4, с.280-284.

53. Азарова И.Н., Барам Г.И. Применение перхлората лития в обращенно-фазовой ВЭЖХ/ Тез. Всерос. конф. «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии». Самара. 2005. С. 36.

54. Melander W. R. Horvath Cs. Stationaiy-phase effects in reversed phasechromatography II Substituent selectivities for retention on various hydrocarbonaceous bonded phases // Cromatographia. 1982. V. 15, No. 2. P. 86-90.

55. Bradley L. Ackermann, Michael J. Berna, Anthony T. Murphy // Recent Advances in use of LC/MS/MS for Quantitative High-Throughput Bioanalytical Support of Drug Discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 2002, V. 2. P. 53-66.

56. Федорова Г. А., Кожанова JI. А. Применение микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа биологических жидкостей. // Сбориик «Хромато1рафия на благо России», Москва, «ИД Граница», 2007. С. 666-684.

57. А.А.Сердан, С.Ю.Богословский, П.Н.Нестеренко. Зависимость удерживания некоторых лекарств, препаратов на дифильном сорбенте от рН и ионной силы элюента//Ж.физич.химии, 1991, т.65, №10, с. 2638-2643.

58. Snyder L.R., Kirkland J.J. Introduction to modern liquid chromatography. 2nd ed. New York: Wiley-Intersci. 1979. 863 p.

59. Сапрыкин JI.B., Киселева H.B, Васильев В.Н. Хроматографический анализвитамина В6 и полупродуктов его синтеза // Заводск. лаборатория. 1990. Т. 56. №5. С. 16-18.

60. Сапрыкин JI.B., Текуцкая Е.Е. Использование тонкослойной хроматографии для моделирования процесса экстракции веществ из водных растворов // Тезисы IV Всес. конф. молодых ученых по прикладной хроматографии. Джубга. 1991. С.23.

61. Кожанова Л.А., Федорова Г.А., Барам Г.И. Определение водо- и жирорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // ЖАХ. 2002. т.57. №1. с.49-54.

62. Holecek М., Simek J., Zadak Z., Blaha V. Acceleration of the onset of liver regeneration by carnitine in partialy hepatectomized rats // Physiol.Bohemoslov. 1989. V. 38. No. 6. P. 503-508.

63. Kobayashi A., Watanabe H., Fudjisawa Sh., Yamaraoto N. Effect of L-carnitine and palraitoylcarnitine on membrane bluidity of human erythrocytes // Biochem. Biophys. Acta. 1989. V. 986. No. 1. P. 83-88.

64. Cederblad G., Carlin J.I., Constantin T.P., Harper P., Hultman E. Radioisotopic assays of CoASH and carnitine and their acetylated forms in human skeletal muscle // Anal. Biochem. 1990. V. 1985. No. 2. P. 274-278.

65. Smith R.M. Comparison of reversed phase liquid chromatography columns using "Rohrschneider" type constants // J. Cromatogr. 1982.V. 236, No. 2. P. 321-328.

66. Сапрыкин JI.B., Удалов A.B. Методические аспекты применениядинамически модифицированных сорбентов для анализа биологических объектов с помощью ВЭЖХ // Судебно-медицинская экспертиза. 1999. № 4. С.24-27

67. R. LoBrutto , A. Jones , Y.V. Kazakevicha „ H.M. McNairb Effect of the eluent pH and acidic modifiers in high-performance liquid chromatography retention of basic analytes // J. Chromatogr. A. 2001. V. 913 P. 173-187. www.elsevier.com/ locate /chroma.

68. R. LoBrutto, A. Jones, Y.V. Kazakevich. Effect of counter-anion concentration on retention in highperformance liquid chromatography of protonated basic analytes // J. Chromatogr. A. 2001. V. 913 P. 189-196 www.elsevier.com/ locate /chroma.

69. Yoshihiro Saito, Kiyokatsu Jinno,Tyge Greibrokk.l School of Materials Science Capillary columns in liquid chromatography: between conventional columns and microchips// J. Sep. Sci. 2004. V. 27. P. 1379-1390.

70. Лобачев A.JI., Колотвин A.A. Идентификация и количественное определение приоритетных анионных поверхностно-активных веществ в моющих средствах методами ТСХ и ВЭЖХ // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т.6. №. 1.С. 89-98.

71. Francesco Crea, Alessandro De Robertis., Concetta De Stefano. Modelling theseparation of amines by high performance liquid chromatography Linear diamines NH2(CH2)nNH2 (n = 2-10) // Analytica Chimica Acta. 2001. V. 436. P. 333-342.

72. Fedorova G.A., Baram G.I., Grachev M.A., et al. Application of Micro-Column HPLC to the Determination of Phénobarbital and Carbamazepine in Human Blood Serum // Chromatographia. 2001. V. 53, No. 9/10. P. 495-497.

73. Химия привитых поверхностных соединений. / Под ред. Г.В. Лисичкина. М.: Физматлит, 2003. 596 с.

74. Ланин С.Н. Адсорбционные модели удерживания в жидкостной хроматографии // В сб. 100 лет хроматографии / Отв. ред. Б.А.Руденко. М: Наука, 2003. С. 407.

75. Рудаков 0:Б., Селеменев В.Ф. Физико-химические системы сорбат-сорбент-элюент в жидкостной хроматографии. Воронеж, 2003. 240 с.

76. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина Современные аспекты- динамического модифицирования в ВЭЖХ. // Сборник «Хроматография на благо России», Москва, «ИД Граница», 2007. С. 282-298.

77. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина. Возможности и перспективы применения гидрофильной хроматографии в практике ВЭЖХ. // Тез. докл. X Международная конференция « Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии». Москва-Клязьма, 2006.

78. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина Гидрофильная хроматография как частный случай динамического модифицирования хроматографических систем в ВЭЖХ.

79. Тез. докл. Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физхико-химических исследованиях. Москва — Клязьма, 2007. С. 30.

80. Л.В. Сапрыкин, A.A. Сердан, Л.В. Сапрыкина. Прямой анализ бетаинов в биологических жидкостях методом, ВЭЖХ. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т.6. №. 1. С. 114-122.

81. Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии (иланарная хроматография). М. (в 2-х томах), 1999, 753 с.

82. Б.Г.Беленький, Е.А. Гурковсая, Ю.Д. Коган, В.Д. Красиков Тонкослойная хроматография в России // 100 лет хроматографии. М.: Наука, 2003. С.61-99.

83. Сапрыкин Л.В., Текуцкая Е.Е. Использование тонкослойной хроматографии для моделирования процесса экстракции веществ из водных растворов / Тезисы IV Всес. конф. молодых ученых по прикладной хроматографии. Джубга. 1991. С. 23

84. Е.В. Дектярев, Б.В. Тяглов, В.Д. Красиков, И.И. Малахова, A.B. Гаевский. Применение тонкослойной хроматографии в анализе биологически активных веществ // 100 лет хроматографии. М.: Наука, 2003. С. 233-268.

85. М. Шаршунова, В. Шварц, Ч. Михалец Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. М.: Мир, 1980. 4.2. С. 482-485.

86. Басова Е.М., Иванов В.М., Шпигун O.A. Мицеллярная жидкостная хроматография//Успехи химии. 1999. Т. 68. № 12. С. 1083-1101.

87. Л.В. Сапрыкин, Л.В. Сапрыкина. Динамическое модифицирование сорбентов в практике тонкослойной хроматографии. //Тез. докл.

88. Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы». Москва, 2004.

89. Новый справочник химика и технолога. Аналитическая химия. Ч. 1 С.-Пб.: АНО НПО «Мир и семья», 2002. 964 с.

90. L. Heather A., Oosthoek A.J.P., Busser F.J.M., Kraak M.H.S., I-Iermens J.L.M. Environ. Biomimetic solid-phase microextraction to predict body residues and toxicity of chemicals that act by narcosis. // Toxicol, and Chem. 2002. V. 21. № 2. P. 229-234.

91. Е. В. Дегтерев Анализ лекарственных средств в исследованиях, производстве и контроле качества // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2002, т. 46, № 4, с 43-51.