Новая рибонуклеаза Bacillus altitudinis: структурные особенности и биологические свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Дудкина, Елена Владимировна

• Дудкина, Елена Владимировна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Дудкина, Елена Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Рибонуклеазы различного происхождения и их биологические эффекты

1.2 Онконаза - РНКаза Ranapipiens с противоопухолевой активностью

1.3 а-Сарцин - высокотоксичная РНКаза гриба

1.4 BS -РНКаза - природный димер

1.5 Барназа и ее применение в биотехнологии

1.6 Биназа - РНКаза c противоопухолевой и противовирусной активностью

1.6.1 Характеристика фермента

1.6.2 Биосинтез биназы

1.6.3 Противоопухолевые свойства биназы

1.6.4 Противовирусная активность биназы

1.7 Бальназа - РНКаза Bacillus altitudinis

1.8 Молекулярные детерминанты, определяющие цитотоксичность 31 РНКаз

1.9 Димеризация белков и ее роль в их биологической активности

1.10 Димеризация рибонуклеаз 42 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46 2.1. Штаммы бактерий 46 2.1.1. Условия культивирования бактерий

2.2 Выделение и очистка гомологичных РНКаз B. altitudinis и B. pumilus

2.2.1 Ионообменная хроматография на колонке с использованием ДЭАЭ- 46 целлюлозы КМ-32 и фосфоцеллюлозы Р-11

2.2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.3 Рибонуклеазная активность

2.4 Определение концентрации белков

2.5 БББ-электрофорез в ПААГ 49 2.5.1 Окрашивание гелей серебром

2.6 Определение РНКазной активности методом зимографии

2.7 Вестерн-блот

2.8 Масс-спектрометрический анализ

2.9 Нативный электрофорез

2.10 Гель-фильтрация

2.11 Оценка противоопухолевого потенциала ферментов 53 2.11.1 Клетки 53 2.11.2. Определение цитотоксичности РНКаз с использованием реагента 53 WST

2.12 Иммунопреципитация

2.13 Биоинформационный анализ

2.14 Статистическая обработка результатов 56 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Выделение и очистка внеклеточных РНКаз (биназы и бальназы) из 57 культуральной жидкости бацилл с использованием методов ионообменной хроматографии

3.1.1 Исследование динамики роста Bacillus altitudinis и биосинтеза 57 бальназы

3.1.2 Идентификация и оценка гомогенности полученных белковых 62 препаратов РНКаз методами масс-спектрометрического анализа

3.2 Исследование структурных особенностей гомологичных РНКаз

3.3 30-моделирование молекул РНКаз и их димерных структур

3.4 Оценка цитотоксического потенциала полученных препаратов РНКаз: 80 биназы и бальназы

3.5 Белок-белковое взаимодействие биназы с ГТФазой K-Ras 81 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 84 4.1 Методы выделения и очистки гомологичных РНКаз из природных

штаммов-продуцентов

4.2 Структурная организация бальназы и биназы

4.2.1 Стабильность димерных структур

4.2.2 Моделирование структур димеров гомологичных РНКаз

4.3 Цитотоксичность РНКаз

4.4 Ингибирование МАРК/БЯК сигнального пути биназой при связывании 94 с К-ЯаБ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новая рибонуклеаза Bacillus altitudinis: структурные особенности и биологические свойства»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

Каждый год во всем мире растет число онкологических больных. Несмотря на огромное количество проводимых в области противоопухолевой терапии исследований смертность от онкологии непрерывно растет [Чиссов и др., 2012]. В Татарстане каждый 48-ой житель республики болен раком. Высокая смертность больных злокачественными образованиями связана с низкой эффективностью и отсутствием селективности у применяемых сегодня препаратов для лечения онкологических болезней [Чиссов и др., 2012]. Проблема низкой клинической эффективности лекарственных средств, главным образом связана с отсутствием избирательного действия и высокой токсичностью применяемых препаратов. В настоящее время важнейшей задачей является поиск принципиально новых противоопухолевых агентов, отличающихся направленностью действия, селективностью в отношении раковых клеток и низкой иммуногенностью [Mitkevich et al., 2015]. В связи с этим особое внимание исследователей привлекают ферменты класса гидролаз - рибонуклеазы (РНКазы). РНКазы играют ключевую роль в метаболизме РНК, гидролизуя полинуклеотидные цепи РНК по двух стадийному пути с образованием олигонуклеотид-2',3'-циклофосфатов в качестве промежуточных продуктов и последующим их расщеплением до соответствующих производных 3' - фосфорной кислоты [Kumar, Walz, 2001]. На сегодняшний день известно значительное количество РНКаз, обладающих селективным цитотоксическим действием по отношению к раковым клеткам [Ardelt et al., 2009]. Ранее считалось, что биологические эффекты РНКаз обусловлены их каталитической активностью, однако недавно показано, что снижение уровня тотальной РНК не фатально для клетки, а является лишь пусковым механизмом в каскаде клеточных регуляторных механизмов, приводящих к запуску апоптоза [Mitkevich et al., 2010].

Механизм действия РНКаз, а главное, природа их селективности до сих пор до конца не изучены. В отличие от РНКаз млекопитающих, РНКазы

микроорганизмов не подвергаются действию ингибитора РНКаз, присутствующего в организмах животных и человека [Leland, Raines, 2001]. Широкие возможности для биоинженерии этих ферментов делают их весьма привлекательными для разработки новых щадящих терапевтических средств, не повреждающих ДНК. Для бактериальных РНКаз, секретируемых родом Bacillus, установлено противоопухолевое [Makarov et al., 2008; Ulyanova et al., 2011] и противовирусное [Shah-Mahmud, Ilinskaya, 2013] действие. Особого внимания заслуживает избирательность действия РНКаз бацилл по отношению к опухолевым клеткам, экспрессирующим определенные онкогены: ras, kit, AML/ETO [Mitkevich et al., 2015]. Молекулярный механизм действия РНКаз не обязательно включает проникновение фермента в клетку эукариот; более того, при интернализации нормальными эпителиальными клетками последние не погибают [Cabrera-Fuentes et al., 2012]. Вероятно, решающее значение в поражении опухолевых клеток имеет первичное взаимодействие экзогенных РНКаз с поверхностью клетки и их доступ к мембранным белкам сигнальных путей, в связи с чем особенно важно детально исследовать молекулярную организацию РНКаз.

Способность образовывать димеры обнаружена у многих представителей РНКаз: панкреатической РНКазы А [Liu et. al., 2001], рибонуклеазы семенников быка (BS-РНКазы) [Gotte et. al., 2012], РНКазы L [Garvie et al., 2013] и других. Известно, что димеризация РНКазы T E. coli необходима для эффективного гидролиза РНК [Zuo, Deutscher, 2002], а активация РНКазы L, участвующей в иммунном ответе клеток на вирусную инфекцию, происходит путем образования димеров [Garvie et al., 2013]. Показано, что димерная BS-РНКаза представлена двумя типами димеров различной стабильности, причем только высокостабильные димеры обладают цитотоксическими свойствами [Gotte et. al., 2012].

Для бактериальной РНКазы Bacillus pumilis 7Р (биназы) показана возможность образования димеров в кристаллах, данных о димеризации фермента в растворе в литературе не представлено [Polyakov et al., 2010].

Биназа селективно ингибирует рост клеток, экспрессирующих специфические онкогены: ras, kit, AML1/ETO и FLT3, при этом, не оказывая значимого токсического влияния на нормальные клетки организма [Ilinskaya et al., 2007; Mitkevich et al., 2010; Mitkevich et al., 2013; Mitkevich et al., 2015]. Исследование биологических свойств биназы позволяет рассматривать ее в качестве перспективной альтернативы традиционным химиотерапевтическим средствам в щадящей терапии злокачественных новообразований. Биназа не обладает свойствами суперантигена, введение фермента в живой организм не приводит к индукции поликлонального Т-клеточного ответа, что говорит о низкой иммуногенности белка [Ilinskaya et al., 2007]. Кроме того, действие фермента не блокируется ингибитором РНКаз млекопитающих (ИР) ввиду отсутствия сродства ИР к филогенетически отдаленной РНКазе [Sevcik et al., 2002].

Естественным аналогом биназы является рибонуклеаза Bacillus altitudinis - бальназа, которая отличается по первичной последовательности от биназы лишь одной заменой аминокислоты: аланина в положении 106 (Ala106) на треонин (Thr106) [Дементьев и др., 1993] . Высокая степень гомологии новой РНКазы с биназой предполагает наличие у нее схожих цитотоксических свойств и структурных особенностей, которые на сегодняшний день остаются не изученными.

Таким образом, определение цитотоксического потенциала новой РНКазы, а также оценка ее структурных особенностей в сравнении с известной биназой позволят внести вклад в понимание механизма образования димеров у РНКаз и роли димеризации в проявлении цитотоксичности этих ферментов. Кроме того, станет возможным оценить влияние единственной аминокислотной замены аланина на треонин на структуру и функции фермента. Выявление цитотоксических свойств новой РНКазы и возможного селективного действия в отношении опухолевых клеток внесет вклад в развитие противоопухолевых терапевтических средств нового поколения.

В связи с этим целью настоящей работы является характеристика структурных особенностей и биологического действия экстрацеллюлярных бациллярных РНКаз: новой РНКазы B. altitudinis и ее гомолога - РНКазы B. pumilus.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Разработать универсальный метод выделения и очистки гомологичных рибонуклеаз B. pumilus (биназы) и B. altitudinis (бальназы) на основе природных продуцентов.

2) Провести сравнительную характеристику структурных и биологических свойств новой РНКазы B. altitudinis и ее гомолога - РНКазы B. pumilus.

3) Доказать существование природных димеров гомологичных бациллярных РНКаз биназы и бальназы, установить принципы их структурной организации, оценить стабильность димерных структур и вклад в проявление противоопухолевой активности.

4) Оценить возможность белок-белкового взаимодействия биназы с рецепторной ГТФазой Ras в трансформированных SV-40 клетках эпителия легких MLE-12 и определить вклад этого взаимодействия в апоптоз-индуцирующее действие биназы.

Научная новизна. Разработан универсальный метод выделения и очистки низкомолекулярных РНКаз: бальназы и биназы из природных-продуцентов B. altitudinis В-388 и B. pumilus 7P, позволяющий получить гомогенные препараты ферментов в три этапа. Впервые получен гомогенный препарат новой РНКазы - бальназы с удельной активностью 1.2х106 ед./А280, оценен ее цитотоксический потенциал, показано, что фермент обладает избирательной цитотоксичностью в отношении линии опухолевых клеток аденокарциномы легких человека (A549) и не снижает жизнеспособность нормальных клеток эпителия легких. Уровень цитотоксичности гомологичных бациллярных РНКаз биназы и бальназы в первые 24 ч совпадает, ферменты снижают жизнеспособность опухолевых клеток на 28-

30%, через 48 ч токсический потенциал бальназы остается на прежнем уровне, а биназы увеличивается на 14%. Впервые установлено, что гомологичные РНКазы представляют собой природные димеры, различающиеся способом образования и стабильностью димерных структур. Показано, что высокая стабильность димеров биназы обусловлена возможностью обмена доменами между мономерами белка; димеры бальназы не способны к обмену участками по swаpping-механизму, в связи с чем ее димерные структуры обладают более низкой стабильностью. Обнаружена корреляция между цитотоксичностью РНКаз и стабильностью их димеров. Впервые получены доказательства того, что избирательная цитотоксичность биназы на га^-экспрессирующие клетки обусловлена прямым взаимодействием биназы с ГТФазой Ras, что приводит к блокированию MAPK/ERK - сигнального пути и индукции апоптоза в опухолевых клетках.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в рамках диссертационной работы данные могут быть использованы в биотехнологии в качестве методологии для получения гомогенных препаратов РНКаз. Обнаруженные в ходе работы структурные особенности РНКаз важны для общего понимания механизма образования димеров у белков и их роли в жизнедеятельности клетки. Различия в стабильности димеров гомологичных РНКаз позволяют оценить вклад димерных структур в проявление каталитических и биологических эффектов РНКаз.

Концепция гибели опухолевых клеток за счет селективного каталитического расщепления мРНК онкогенов впервые дополнена новыми данными: доказано, что бациллярная РНКаза биназа впрямую связывается с онкогенным белком Ras, что приводит к блокированию MAPK/ERK сигнального пути и апоптозу опухолевых клеток. Близкая гомология двух ферментов опосредует их использование в качестве моделей для исследования роли и функций аминокислотной замены аланина на треонин в формировании пространственной структуры белков и ее влияние на их функциональную активность. Полученные результаты о прямом

взаимодействии биназы и белка Ras могут лечь в основу разработки нового подхода в таргетной терапии опухолевых заболеваний.

Методология и методы исследования. Задачи исследования решены с применением микробиологических, физико-химических и молекулярно-биологических методов исследования (ионообменная хроматография, SDS-электрофорез, эксклюзионная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрические и иммунохимические анализы). Использованы также методы моделирования структур белков в программах ClusPro и I-Tasser, оптимизированы возможные взаимодействия мономеров РНКаз в процессе их димеризации. Для оценки потенциального противоопухолевого действия исследуемых РНКаз применены методы анализа активности митохондриальных дегидрогеназ в культурах раковых и нормальных эпителиальных клеток. Полученные результаты обработаны стандартными математическими методами статистики.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Разработан универсальный метод выделения и очистки гомологичных РНКаз B. pumilus (биназы) и B. altitudinis (бальназы) из культуральной жидкости бацилл-продуцентов, позволяющий с высокой эффективностью получить гомогенные препараты ферментов;

2) Бальназа и биназа представляют собой природные димеры с открытыми каталитическими центрами мономеров. Стабильность бальназы снижена ввиду неспособности мономеров к обмену доменами, что связано с единственной аминокислотной заменой (Thr106 -Ala106) в ее молекуле по сравнению с биназой;

3) Цитотоксическое действие бактериальных РНКаз по отношению к опухолевым клеткам коррелирует со стабильностью их димеров, которая связана с соотношением стабильных swapping-димеров и менее стабильных форм, образованных нековалентными связями;

4) Противоопухолевое действие биназы связано с ее прямым взаимодействием с ГТФазой K-Ras на поверхности опухолевых пневмоцитов

MLE-12, приводящим к блокированию MAPK/ERK - сигнального пути и индукции апоптоза в опухолевых клетках.

Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается высокотехнологичной современной экспериментальной базой, в основу которой легли многократные эксперименты, выполненные на высокоточном оборудовании; полученные данные представлены в виде статистически достоверных результатов, опубликованных в международных и отечественных научных журналах.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Всероссийской заочной научно - практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине» (Казань, 2013), Второй ежегодной заочной научно-практической конференции, приуроченной к 200 - летию Казанского государственного медицинского университета «Микробиология в современной медицине» (Казань, 2014), XXI Международной научной конференции «ЛОМОНОСОВ - 2014» (Москва, 2014), IV Международной научно-пратической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине" (Казань, 2014), симпозиуме «Биомедицина», посвященному 25-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха (Гиссен, 2014), 7-й Республиканской конференции молодых ученых «Молодежь и инновации Татарстана» (Казань, 2015).

Место выполнения работы и личный вклад соискателя. Представленная работа выполнена лично автором на кафедре микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета. Научным руководителем совместно с диссертантом определена основная цель исследования, поставлены задачи исследовательской работы, сформулированы выводы. Автором диссертации лично проанализированы и обработаны данные литературы, выполнены лабораторные исследования, проведены анализ и

статистическая обработка полученных результатов. Материалы публикаций готовились и оформлялись диссертантом под контролем научного руководителя. Масс-спектрометрические исследования проведены на базе междисциплинарного центра геномных и протеомных исследований Казанского Федерального Университета. Эксперименты по взаимодействию биназы и ГТФазы Ras выполнены в рамках стажировки в лаборатории Института исследований сердца и легких им. Макса-Планка, г. Бад-Наухайм, Германия.

Связь работы с научными программами. Исследования выполнены в рамках Российской Правительственной Программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета среди ведущих мировых научно-исследовательских центров и поддержаны грантом правительства Республики Татарстан (2015 г.), грантами РФФИ 16-34-00448мол_а «Сравнительный анализ геномов бацилл для определения генетических детерминант, обусловливающих сверхсинтез внеклеточных гуанилпредпочитающих РНКаз» (руководитель), РФФИ 15-04-07864_а «Секретируемые рибонуклеазы как фактор конкурентоспособности бацилл» (исполнитель), а также грантом Российского Научного Фонда № 14 -14-00522 «Природные димеры микробных рибонуклеаз: выявление и свойства» (исполнитель).

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, среди которых 3 публикации в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации и 6 публикаций в научных журналах, входящих в перечень базы данных Scopus.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов, заключения и списка цитированной литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 19 рисунков. Библиография включает 176 наименований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Рибонуклеазы различного происхождения и их биологические эффекты

Согласно данным ВОЗ онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности во всем мире. В 2012 году более 8 млн. человек умерло от рака; по прогнозам в ближайшие 20 лет заболеваемость онкологией возрастет еще на 70% [Чиссов и др., 2012]. Столь удручающая ситуация, возникшая с опухолевыми заболеваниями, говорит о неэффективности применяемых сегодня методов лечения рака, а также отсутствия государственной стратегии, позволяющей диагностировать злокачественные заболевания на ранних этапах развития. Традиционные неинвазивные методы борьбы с онкологией оказывают комплексное негативное воздействие на организм человека в целом [Чиссов и др., 2012]. В связи с этим, в настоящее время одним из основных направлений в лечении злокачественных новообразований является поиск новых терапевтических средств, обладающих селективным токсическим действием по отношению к опухолевым клеткам.

К таким перспективным объектам относятся ферменты нуклеинового обмена, участвующие в метаболизме РНК - рибонуклеазы. Ферменты этого типа относятся к классу гидролаз и осуществляют деградацию определенных видов РНК, продукцию малых регуляторных РНК, а также превращение предшественников РНК в зрелые формы [Зеленихин, 2012]. РНКазы регулируют экспрессию генов, рост и дифференцировку клеток, принимают участие в иммунном ответе и путях физиологической гибели клеток [Шуапоуа е1 а1., 2011]. Среди функционального разнообразия РНКаз особый интерес вызывают биологические эффекты этих ферментов, такие как контроль роста кровеносных сосудов, а также противоопухолевая и противовирусная активности [Зеленихин и др., 2012].

В клетке содержится около 20 видов экзо- и эндорибонуклеаз, проявляющих высокую специфичность к определенным нуклеотидным последовательностям и структурам [Zuo, Deutscher, 2002]. РНКазы про- и эукариот отличаются по каталитическим, физико-химическим свойствам, а также структурной организации и субстратной специфичности [Дементьев и др., 1993].

При изучении цитотоксичности РНКаз по отношению к раковым клеткам исследователи уделяли особое внимание РНКазам животного происхождения ввиду отсутствия предполагаемых нежелательных иммунных реакций организма в ответ на введение филогенетически близкородственного фермента. Однако, как оказалось, РНКазы млекопитающих не способны проявлять свою ферментативную активность и тем самым вызывать гибель опухолевых клеток, поскольку их действие блокируется ингибитором РНКаз млекопитающих (ИР) [Ильинская, Макаров, 2005].

Ингибитор РНКаз млекопитающих - 50 кДа белок, присутствующий в цитозоле клеток млекопитающих [Hartley, Rogerson, 1972] и способный образовывать чрезвычайно жесткие комплексы с большинством РНКаз животного происхождения, и тем самым, ингибировать их каталитическую активность [Leland, Raines, 2001]. ИР образует с РНКазой А самый сильный комплекс, известный в биологии (Kd =2.9 * 10-16M) [Johnson et al., 2007]. Некоторые цитотоксические РНКазы устойчивы к действию этого ингибитора [Leland, Raines, 2001]. Считается, что нечувствительность к действию ИР является одним из признаков проявления цитотоксичности рибонуклеаз [Ильинская, Макаров, 2005]. Среди РНКаз животного происхождения особый интерес представляет фермент, выделенный из ооцитов леопардовой лягушки Rana pipiens - онконаза, который в настоящее время проходит III стадию клинических испытаний против мезотелиомы легких человека [Ardelt et al., 2009].

Нечувствительность к блокирующему действию ингибитора млекопитающих, а также широкие возможности биоинженерии обратили

внимание исследователей на РНКазы микробного происхождения [Sevcik et al., 2002].

Бактериальные РНКазы относятся к семейству N1/T1 (ЕС 3.1.27.3) и представляют собой маленькие внеклеточные ферменты, катализирующие расщепление одноцепочечной РНК предпочтительно с гуанозиновых остатков [Yoshida, 2001]. Гидролиз нуклеиновой кислоты у этих ферментов проходит по двухстадийному пути: трансэтерификация 5'-фосфоэфирной связи приводит к образованию гуанозин 2'3'-циклофосфатов, как промежуточных продуктов гидролиза, которые затем расщепляются до 3' -фосфатов [Kumar, Walz, 2001]. Структурные исследования выявили схожие вторичную структуру и организацию активных центров среди представителей микробных РНКаз [Sevcik et al., 1991]. Связывание 3'-ГМФ происходит в петле, распознающей субстрат («узнающей петли»), образованной аминокислотными остатками 55-61, при этом фосфатная группа фиксирована в каталитическом центре около трех инвариантных остатков в молекуле бактериальных РНКаз: Glu72, Arg86 и His101 [Sevcik et al., 1990] . Наиболее изученными представителями семейства микробных РНКаз являются рибонуклеазы, секретируемые видами Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus pumilus.

1.2 Онконаза - РНКаза Rana pipiens с противоопухолевой активностью

Онконаза принадлежит к суперсемейству РНКаз А и состоит из 104 аминокислотных остатков. Молекулярная масса белка - 11820 Да, изоэлектрическая точка 9.7 [Ardelt et al., 1991]. N-концевой остаток в молекуле онконазы представлен пироглутаминовой кислотой, которая является неотъемлемой частью активного центра фермента, включая, также пять аминокислотных остатков: His10, Lys31, His97, Thr35 и Phe98 [Ardelt et al., 1991]. Пироглутаминовая кислота и дисульфидный мостик на С-конце делают онконазу чрезвычайно стабильным белком [Notomista et al., 2001],

устойчивым к протеолизу [Arnold et al., 2006]. Ингибитор РНКаз млекопитающих не действует на онконазу, поскольку в последовательности фермента отсутствуют аминокислоты, ответственные за взаимодействие с ИР [Sevcik et al., 2002].

Онконаза связывается с плазматической мембраной клетки электростатически [Johnson et al., 2007] и проникает внутрь путем энергозависимого эндоцитоза [Haigis, Raines, 2003], опосредованного АР-2/клатрином [Rodriguez et al., 2007]. В цитозоле онконаза разрушает 28 S и 18S рРНК, а также тРНК, что приводит к ингибированию трансляции [Wu et al., 1993]. РНКаза расщепляет тРНК между двумя гуаниновыми основаниями в последовательности UGG, присутствующие в структурно важных регионах: вариабельной петли или D-руки [Suhasini, Sirdeshmukh, 2007]. Небольшое количество расщеплений происходит также в GU и CU последовательностях. Кроме того, одной из мишеней онконазы является некодирующая РНК, которая участвует в контроле экспрессии генов путем РНК интерференции [Ardelt et al., 2003]. Показано, что обработка клеток онконазой останавливает сайленсинг глицеральдегид 3-фосфат-дегидрогеназного гена в клетках аденокарциномы легких человека А549, опосредованный миРНК [Zhao et al., 2008]. В клетках Hela индуцированная онконазой цитотоксичность инициирует каскад реакций, активирующих c-Jun N-концевую киназу (JNK), каспазу-9 и далее каспазы-3 и -7. Каспаза-8, или опухолевый супрессор р53, не участвуют в этом процессе [Lee, Raines, 2008]. In vitro, онконаза проявляет цитотоксичность по отношению к широкому спектру опухолевых клеточных линий, таких как: клетки глиомы крыс 9L, лейкемии человека К-562, аденокарциномы толстой кишки человека Colo 320 СМ, лейкемии человека HL-60, рака предстательной железы человека LNCaP и JCA-1, ободочной кишки человека НТ-29 и клетки лимфомы человека U937 [Ardelt et al., 2009]. В настоящее время, онконаза совместно с доксорубицином проходит III стадию клинических испытаний против злокачественной мезотелиомы легких человека [Ardelt et al., 2009].

1.3 а-Сарцин - высокотоксичная РНКаза гриба

Среди грибных риботоксинов особый интерес представляет токсин Aspergillus giganteus MDH 18894 - а-сарцин. Риботоксин состоит из 150 аминокислотных остатков и принадлежит к группе 1 рибосом-инактивирующих белков [Olson et al., 1965]. Это наиболее значимый член семейства грибных риботоксинов, обладающий РНКазной активностью и классифицирующийся как циклизующая РНКаза. Аминокислотные остатки: His50, Glu96 и His137 участвуют в катализе [Lacadena et al., 1999]. а-Сарцин проникает в клетки путем эндоцитоза и ингибирует биосинтез белка за счет расщепления фосфодиэфирной связи 28 S рРНК, образуя так называемый а-фрагмент, размером 0.4 кБ [Correll et al., 2004]. а-Сарцин вызывает гибель клеток рабдомиосаркомы человека путем индукции апоптоза. Инкубация опухолевых клеток с а-сарцином приводила к фрагментации ДНК, активации каспазы-3 и расщеплении поли(АДФ-рибозы)-полимеразы [Olmo et al., 2001].

1.4 BS-РНКаза - природный димер

Рибонуклеаза семенников быка - фермент с молекулярной массой 27218 Да и изоэлектрической точкой 10.3, представляет собой природный димер двух типов [Gotte et al., 2013]. В первом случае димеризация белка происходит за счет ковалентных взаимодействий между аминокислотными остатками Cys31 и Cys32, димеры второго типа образованы путем обмена N-концов а-спиралей фермента [Gotte et al., 2012]. Олигомеризация BS-РНКазы опосредует цитотоксичность этого фермента, - лишь димеры, образованные за счет «swapping^-взаимодействий способны убивать опухолевые клетки [Gotte et al., 2013].

Апоптоз, запускаемый BS-РНКазой, связан с активацией каспаз-8 и -9 и подавлением экспрессии Bcl-2 в некоторых линиях карцином [Kotchetkov et al., 2001]. Показано, что фермент проникает как в нормальные, так и в малигнизированные клетки щитовидной железы и фибробласты [Bracale et al., 2002], а также проявляет цитотоксические свойства по отношению к

раковым клеткам щитовидной железы [Antignani et al., 2002]. BS-РНКаза индуцирует апоптоз миелоидных клеток ML-2 и NB-1, NB-2 клеток нейробластомы [Marinov, Soucek, 2000]. Ввиду высокой селективности РНКазы к опухолевым клеткам тироидного происхождения in vitro, этот фермент был выбран в качестве лечебного средства против агрессивного тироидного рака [Spalletti-Cernia et al., 2003].

1.5 Барназа и ее применение в биотехнологии

Рибонуклеаза Bacillus amyloliquefaciens - барназа, была впервые описана в 1958 году, японскими исследователями Нишимурой и Номурой [Nishimura, Nomura, 1958]. Фермент представляет собой катионный белок с изоэлектрической точкой (pI) 9.2 и состоит из 110 аминокислотных остатков [Hartley, Barker, 1972]. Молекулярная масса белка 12213 Да, температура плавления 50°С в широком диапазоне рН от 5 - 8.5 [Hartley, Barker, 1972]. Барназа расщепляет молекулу РНК предпочтительно после пуриновых остатков с образованием в качестве конечных продуктов гидролиза 3'-мононуклеотидов и 2'-динуклеотидов [Kumar, Walz, 2001]. Оптимум температуры гидролиза составляет 37°С, рН 8.5. Для проявления каталитической активности фермент не нуждается в ионах металлов и в кофакторах [Ulyanova et al., 2011]. Молекула белка состоит из одного домена, основными компонентами которого являются антипараллельный ß-лист и а-спираль. Конформация центральной жилы ß-листа высоко консервативна для всех членов барназного семейства [Hartley, 1989]. В клетке барназа синтезируется как профермент, процессинг которого происходит путем отщепления сигнального пептида, зрелый белок секретируется во внеклеточное пространство [Edelweiss et al., 2008].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дудкина, Елена Владимировна, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Грибенча, С.В. Защитная активность РНКазы Bacillus intermedius у морских свинок и кроликов, зараженных уличным вирусом бешенства / С.В. Грибенча, Л.А. Поцелуева, И.Ф. Баринский, Т.Г. Баландин, С.М. Деев, И.Б. Лещинская // Вопросы вирусологии. - 2004. - Т. 49. - С. 38-41.

2. Дементьев, А.А. Внеклеточная щелочная РНКаза Bacillus thuringiensis var Subtoxicus / А.А. Дементьев, Н.Ф. Рябченко, И.И. Протасевич, П.Н. Голышин, А.И. Степанов, В.Н. Орлов, В.Н. Пустобаев, А.А. Макаров, Г.И. Моисеев, М.Я. Карпейский, С.В. Шляпников, М.П. Кирпичников // Мол. биол. - 1992. - Т. 26. - С. 1338-1348.

3. Дементьев, А.А. Полная первичная структура внеклеточной рибонуклеазы бактерии Bacillus thuringiensis / А.А. Дементьев, В.М. Орлов, С.В. Шляпников // Биоорг. хим. - 1993. - Т. 19. - С. 853-861.

4. Зеленихин, П.В. Цитофлуориметрическая характеристика влияния РНКаз на клетки про- и эукариот / П.В. Зеленихин, К.Р. Мамедзаде, О.Н. Ильинская // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2012. - Т.7. - C. 62-65.

5. Знаменская, Л. В. Оптимизация условий культивирования Bacillus intermedius для повышения биосинтеза щелочной внеклкточной РНКазы / Л. В. Знаменская, Г. И. Клейнер, Б. Я. Паэгле и др. // Микробиология. - 1980. - Т. 49. - C. 722-726.

6. Знаменская, Л. В. Биосинтез внеклеточной рибонуклеазы Bacillus pumilus / Л. В. Знаменская, В. Л. Ивайловский, Е. И. Иванова и др. // Микробиология. -1994. - Т. 63. - C. 986-992.

7. Ильинская, O. Н. Почему рибонуклеазы вызывают гибель раковых клеток / O. Н. Ильинская, A. A. Макаров // Мол. Биол. - 2005. - Т. 39. - С. 3-13.

8. Сапрыкин, Л.В. Практика и методические основы высокоэффективной жидкостной хроматографии / Учебное пособие. - 2006. - С. 151.

9. Сокуренко Ю. В. Идентификация 2',3'-cGMP как интермедиата каталитического расщепления РНК биназой и оценка его биологического

действия / Ю. В. Сокуренко, П. В. Зеленихин, В. В. Ульянова, А. И. Колпаков, Д. Мюллер, О. Н. Ильинская // Биоорг. хим. - 2015. - Т. 41. - С. 37-43.

10. Ульянова, В. В. Влияние SpoOA и AbrB белков на экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus intermedius и Bacillus pumilus в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis / В. В. Ульянова, В. И. Вершинина, М. А. Харитонова, М. Р. Шарипова // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - С. 639-644.

11. Чепурнова, Н.К. Внеклеточная рибонуклеаза из Bacillus thuringiensis / Н.К. Чепурнова, Д.Л. Ляхов, В.О. Речинский, М.Я. Карпейский // Биохим. - 1988. - Т. 53. - С. 609-612.

12. Чиссов, В.И. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность) / В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова // М. ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. -2012. - 260 с.

13. Adjei, A.A. Ras signaling pathway proteins as therapeutic targets / A.A. Adjei // Curr. Pharm. Des. - 2001. - V. 7. - P. 1581-1594.

14. Agre, P. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases / P. Agre, D. Kozono // FEBS Lett. - 2003. - V. 555. - P. 72-78.

15. Allenby, N. E. Genome-wide transcriptional analysis of the phosphate starvation stimulon of Bacillus subtilis / N. E. Allenby, N. E. O'Connor, Z. Pragai, A. Ward, A. Wipat, C.R. Harwood // J. Bacteriol. - 2005. - V. 187. - P. 8063-8080.

16. Anfinsen, C.B. Studies of cross structure, cross-linkage and terminal sequences in ribonuclease / C.B. Anfinsen, R.R. Redfield, W.I. Choate Page, W.R. Carrol // J. Biol. Chem. - 1954. -V. 207. - P. 201-210.

17. Antignani, A. Antitumor action of seminal ribonuclease, its dimeric structure, and its resistance to the ribonuclease inhibitor / A. Antignani, M. Naddo, M.V. Cubellis, A. Russo, G. D' Alessio // Biochemistry. - 2002. - V. 40. - P. 34923496.

18. Aphanasenko, G.A. Primary structure of ribonuclease from Bacillus intermedius 7P / G.A. Aphanasenko, S.M. Dudkin, L.B. Kaminir, I.B. Leshchinskaya, E.S. Severin // FEBS Lett. - 1979. - V. 97. - P. 77-80.

19. Ardelt, W. Amino acid sequence of an anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. Homology to pancreatic ribonucleases / W. Ardelt, S.M. Mikulski, K. Shogen // J Biol Chem. - 1991. - V. 26. - P. 245-251.

20. Ardelt, B. Cytotoxic ribonucleases and RNA interference (RNAi) / B. Ardelt, W. Ardelt, Z. Darzynkiewicz // Cell Cycle. - 2003. - V. 2. - P. 22-24.

21. Ardelt, W. Ribonucleases as potential modalities in anticancer therapy / W. Ardelt, B. Ardelt, Z. Darzynkiewicz // Eur J Pharmacol. - 2009. - V. 625. - P. 181-189.

22. Arnold, U. Contribution of structural peculiarities of Onconase to its high stability and folding kinetics / U. Arnold, C. Schulenburg, D. Schmidt, R. Ulbrich-Hofmann // Biochemistry. - 2006. - V. 45. - P. 3580-3587.

23. Balandin, T.G. Antitumor activity and toxicity of anti-HER2 immunoRNase scFv 4D5-dibarnase in mice bearing human breast cancer xenografts / T.G. Balandin, E. Edelweiss, N.V. Andronova, E.M. Treshalina, A.M. Sapozhnikov, S.M. Deyev // Invest. New Drugs. - 2011. - V. 29. - P. 22-32.

24. Beckett, D. Regulated assembly of transcription factors and control of transcription initiation / D. Beckett // J. Mol. Biol. - 2001. - V. 314. - P. 335-352.

25. Benito, A. The structural determinants that lead to the formation of particular oligomeric structures in the pancreatic-type ribonuclease family / A. Benito, D.V. Laurents, M. Ribo, M. Vilanova // Curr. Protein Pept. Sci. - 2008. - V. 9. - P. 370393.

26. Betts, M.J. Amino-acid properties and consequences of substitutions / M.J. Betts, R.B. Russel // Heidelberg. - 2007. - P. 311-342.

27. Blaszczyk, J. Noncatalytic assembly of ribonuclease III with double-stranded RNA / J. Blaszczyk, J. Gan, J.E. Tropea, D.L.Court, D.S. Waugh // Structure. - 2004. -V. 12. - P. 457-466.

28. Blum, H. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in Polyacrylamide gels / H. Blum, H. Beier, H.J. Gross // Electrophoresis. - 1987. -V. 8. - P. 93-99.

29. Bos, J.L. Ras oncogenes in human cancer: a review / J.L. Bos // Cancer Res. -1989. - V. 49. - P. 4682-4689.

30. Bracale, A. Essential stations in the intracellular pathway of cytotoxic bovine seminal ribonuclease / A. Bracale, D. Spalletti-Cernia, M. Mastronicola, F. Castaldi, R. Mannucci, L. Nitsch, G. D'Alessio // The Biochemical Journal. -2002. - V. 362. - P. 553-560.

31. Breitwieser, G.E. G protein-coupled receptor oligomerization: implications for G protein activation and cell signaling / G.E. Breitwieser // Circ Res. - 2004. - V. 94. - P. 17-27.

32. Buckle, A.M. Protein-protein recognition: crystal structural analysis of a barnasebarstar complex at 2.0-A° resolution / A.M. Buckle, G. Schreiber, A.R. Fersht // Biochemistry. - 1994. - V. 33. - P. 8878-8889.

33. Cabrera-Fuentes, H.A. Comparative toxicity of binase towards tumor and normal cells / H.A. Cabrera-Fuentes, P.V. Zelenikhin, A.I. Kolpakov, K.T. Preissner, O.N. Ilinskaya // Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Natural Sciences Series. -2010. - V. 152. - P. 143-148.

34. Cabrera-Fuentes, H.A. Binase Penetration into Alveolar Epithelial Cells Does not Induce Cell Death / H.A. Cabrera-Fuentes, N.V. Kalacheva, R.T. Mukhametshina, P.V. Zelenichin, A.I. Kolpakov, G. Barreto, K.T. Praissner, O.N. Ilinskaya // Biomed Khim. - 2012. - V. 58. - P. 272-280.

35. Cabrera-Fuentes, H.A. Internalization of Bacillus intermedius ribonuclease (BINASE) induces human alveolar adenocarcinoma cell death / H.A. Cabrera-Fuentes, M. Aslam, M. Saffarzadeh, A. Kolpakov, P. Zelenichin, K.T. Praissner, O.N. Ilinskaya // Toxicon. - 2013. - V. 69. - P. 219-226.

36. Chen, M. The roles of signal peptide and mature protein in RNase (barnase) export from Bacillus subtilis / M. Chen, V. Nagarajan // Mol Gen Genet. - 1993. - V. 239. - P. 409-415.

37. Chi, X. Potassium channel openers prevent beta-amyloid toxicity in bovine vascular endothelial cells / X. Chi, E.T. Sutton, G. Hellermann, J.M. Prince // Neurosci. Lett. - 2000. - V. 290. - P. 9-12.

38. Correll, C.C. RNA recognition and base flipping by the toxin sarcin / C.C. Correll, X. Yang, T. Gerczei, J. Beneken, M.J. Plantinga // J. Synchrotron Radiat. - 2004. -V. 11. - P. 93-96.

39. Crestfield, A.M. On the aggregation of bovine pancreatic ribonuclease / A.M. Crestfield, W.H. Stein, S. Moore // Arch. Biochem. Biophys. - 1962. - V. 1. - P. 217-222.

40. D'Alessio, G. Evolution of oligomeric proteins / G. D'Alessio // Eur. J. Biochem.

- 1999. - V. 266. - P. 699-708.

41. Dixit, R. Folate supplementation in people with sickle cell disease / R. Dixit, S. Nettem, S.S. Madan, H.H. Soe, A.B. Abas, L.D. Vance, P.J. Stover // Cochrane Database Syst. Rev. - 2016. -V. 16. doi: 10.1002/14651858.

42. Dudkina E. Three-step procedure for preparation of pure Bacillus altitudinis ribonuclease / E. Dudkina, V. Ulyanova, R. Shah Mahmud, V. Khodzhaeva, L. Dao, V. Vershinina, A. Kolpakov, O. Ilinskaya // FEBS Open Bio. - 2016. - V. 6.

- P. 24-32.

43. Edelweiss, E. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells / E. Edelweiss, T. G. Balandin, J. L. Ivanova, G.V. Lutsenko, O.G. Leonova, V.I. Popenko, A.M. Sapozhnikov, S.M. Deyev // PLoS ONE. - 2008. -V. 3. - P. e2434.

44. Engelberg-Kulka, H. Bacterial programmed cell death and multicellular behavior in bacteria / H. Engelberg-Kulka, S. Amitai, I. Kolodkin-Gal, R. Hazan // PLoS Genet. - 2006. - V. 2. - P. e135.

45. Ermakova, E. Brownian dynamics simulation of the competitive reactions: binase dimerization and the association of binase and barstar / E. Ermakova // Biophys. Chem. - 2007. - V. 130. - P. 26-31.

46. Francis, D.M. Strategies to optimize protein expression in E. coli / D.M. Francis, R. Page // Curr. Protoc. Protein Sci. - 2010. - V.24. - P. 1-29.

47. Fruchter, R.G. Preparation and properties of two active forms of ribonuclease dimer / R.G. Fruchter, A.M. Crestfield // J. Biol. Chem. - 1965. - V. 240. - P. 3868-3874.

48. Futami, J. Preparation of potent cytotoxic ribonuclease by cationization: Enhanced cellular uptake and decreased interaction with ribonuclease inhibitor by chemical modification of carboxyl groups / J. Futami, T. Maeda, M. Kitazoe, E. Nukui, H. Tada, M. Seno, M. Kosaka, H. Yamada // Biochemistry. - 2001. - V. 40. - P. 7518-7524.

49. Gardner, N. Production of male- and female-sterile plants through reproductive tissue ablation / N. Gardner, R. Felsheim, A.G. Smith // J. Plant Physiol. - 2009. -V. 166. - P. 871-881.

50. Garvie, C.W. Mechanistic insights into RNase L through use of an MDMX-derived multi-functional protein domain / C.W. Garvie, K. Vasanthavada, Q. Xiang // Biochim. Biophys. Acta. - 2013. - V. 1834. - P. 1562-1571.

51. Giraldo, R.A conformational switch between transcriptional repression and replication initiation in the RepA dimerization domain / R. Giraldo, C. Fernandez-Tornero, P.R. Evans, R. Diaz-Orejas, A. Romero / Nat. Struct. Biol. - 2003. - V. 10. - P. 565-571.

52. Golubenko, I.A. Ribonuclease of Bacillus intermedius 7P: purification by chromatography on phosphocellulose and some properties of the homogeneous enzyme / I.A. Golubenko, N.P. Balaban, I.B. Leshchinskaya, T.I. Volkova, G.I. Kleiner, N.K. Chepurnova, G.A. Afanasenko, S.M. Dudkin // Biokh. - 1979. - V. 44. - P. 640-648.

53. Gotte, G. Oligomerization of ribonuclease A: two novel three-dimensional domain-swapped tetramers / G. Gotte, M. Libonati // J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279. - P. 36670-36679.

54. Gotte, G. Three-dimensional domain-swapped oligomers of ribonuclease A: identification of a fifth tetramer, pentamers and hexamers, and detection of trace heptameric, octameric and nonameric species / G. Gotte, D.V. Laurents, M. Libonati // Biochim. Biophys. Acta. - 2006. - V. 1764. - P. 44-54.

55. Gotte, G. Double domain swapping in bovine seminal RNase: formation of distinct N- and C-swapped tetramers and multimers with increasing biological activities / G. Gotte, A. Mahmoud Helmy, C. Ercole, R. Spadaccini, D.V. Laurents, M. Donadelli, D. Picone // PloS One. - 2012. - V. 7. doi: 10.1371/journal.pone.0046804.

56. Gotte, G. Structural and functional relationships of natural and artificial dimeric bovine ribonucleases: new scaffolds for potential antitumor drugs / G. Gotte, D.V. Laurents, A. Merlino, D. Picone, R. Spadaccini // FEBS Lett. - 2013. - V. 587. -P. 3601-3608.

57. Hahnen, E. A novel secreted ribonuclease from Bacillus intermedius: gene structure and regulatory control / E. Hahnen, L. Znamenskaya, D. Koczan, I. Leshchinskaya, G. Hobom // Mol. Gen. Genet. - 2000. - V. 263. - P. 571-580.

58. Haigis, M.C. Secretory ribonucleases are internalized by a dynamin- independent endocytic pathway / M.C. Haigis, R.T. Raines // J. Cell Sci. - 2003. - V. 116. - P. 313-324.

59. Hartley, R.W. Amino-acid sequence of extracellular ribonuclease (barnase) of Bacillus amyloliquefaciens / R. W. Hartley, E. A. Barker // Nature: New biology. -1972. - V. 235. - P. 15-16.

60. Hartley, R.W. Production and purification of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloquefaciens (barnase) and its inhibitor (barstar) / R. W. Hartley, D. L. Rogerson // Preparatine Biochem. - 1972. - V. 2. - P. 229-242.

61. Hartley, R.W. Barnase and barstar: two small proteins to fold and fit together / R. W. Hartley // Trends Biochem. Sci. - 1989. - Vol. 14. - P. 450-454.

62. Hebert, T.E. Structural and functional aspects of G protein-coupled receptor oligomerization / T.E. Hebert, M. Bouvier / Biochem. Cell Biol. - 1998. - V. 76. -P. 1-11.

63. Hoefling, M. Barnase-barstar: from first encounter to final complex / M. Hoefling, K.E. Gottschalk // J. Struct. Biol. - 2010. - V. 171. - P. 52-63.

64. Hulett, F.M. The signal-transduction network for Pho regulation in Bacillus subtilis / F.M. Hulett // Mol. Microbiol. - 1996. - V. 19. - P. 933-939.

65. Ilinskaya, O.N. Effect of exogenous RNase on the cell of lower eukaryotes / O.N. Ilinskaya, N.I. Krylova // PriU bioWim mikrobiol. - 1993. - V. 29. - P. 280-285.

66. Ilinskaya, O.N. SOS-inducing ability of native and mutant microbial ribonucleases / O.N. Ilinskaya, N.S. Karamova, O.B. Ivanchenko, L.V. Kipenskaya // Mutat Res.

- 1996. - V. 354. - P. 203-209.

67. Ilinskaya, O.N. Nephrotoxic effects of bacterial ribonucleases in the isolated perfused rat kidney / O.N. Ilinskaya, S. Vamvakas // Toxicology. - 1997. - V. 120.

- P. 55-63.

68. Ilinskaya, O. Bacillus intermedius ribonuclease as inhibitor of cell proliferation and membrane current / O. Ilinskaya, K. Decker, A. Koschinski, F. Dreyer, H. Repp // Toxicology. - 2001. - V. 156. - P. 101-107.

69. Ilinskaya, O.N. Changing the net charge from negative to positive makes ribonuclease Sa cytotoxic / O.N. Ilinskaya, F. Dreyer, V.A. Mitkevich, K.L. Shaw, C.N. Pace // Protein Sci. - 2002. - V. 11. - P. 2522-2525.

70. Ilinskaya, O.N. Cytotoxicity of RNases is increased by cationization and counteracted by KCa channels / O.N. Ilinskaya, A. Koschinski, V.A. Mitkevich, H. Repp, F. Dreyer, C.N. Pace, A. A. Makarov // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2004. - V. 314. - P. 550-554.

71. Ilinskaya, O.N. Binase induces apoptosis of transformed myeloid cells and does not induce T-cell immune response / O. N. Ilinskaya, P. V. Zelenikhin, I. Yu. Petrushanko, V.A. Mitkevich, V.S. Prassolov, A.A. Makarov // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2007. - V. 361. - P. 1000-1005.

72. Ilinskaya, O.N. RNase-induced apoptosis: Fate of calcium-activated potassium channels / O. N. Ilinskayaa, A. Koschinski, H. Repp, V.A. Mitkevich, F. Dreyer, J.M. Scholtz, C.N. Pace, A.A. Makarov // Biochimie. - 2008. - V. 90. - P. 717725.

73. Ilinskaya, O.N. Direct inhibition of oncogenic KRAS by Bacillus pumilus ribonuclease (binase) / O.N. Ilinskaya, I. Singh, E.V. Dudkina, V.V. Ulyanova, A. Kayumov, G. Barreto // Biochimica et Biophysica Acta. - 2016. - V.1863. -P.1559-1567.

74. Jensen, B. The Ca2+ activated K+ channel of intermediate conductance: a possible target for immune suppression / B. Jensen, M. Hertz, P. Christophersen, L. Madsen // Expert Opin Ther Targets. - 2002. - V. 6. - P. 623-636.

75. Jiang, G. Receptor-like protein tyrosine phosphatase a homodimerizes on the cell surface / G. Jiang, J. den Hertog, T. Hunter // Mol. Cell Biol. - 2000. - V. 20. - P. 5917-5929

76. Jin, X. Isolation and identification of Bacillus altitudinis ZJ 186 from Marine Soil Samples and its Antifungal Activity against Magnaporthe oryzae / X. Jin, R. Sun, J. Zhu, Z. Xu, Z. Liu, Q. Wang, X. Ye // Curr. Research in Bact. - 2012. - V. 5. -P. 13-23.

77. Johnson, R.J. Cytotoxic ribonucleases: the dichotomy of Coulombic forces / R.J. Johnson, T.Y. Chao, L.D. Lavis, R.T. Raines // Biochemistry. - 2007. - V. 46. - P. 10308-10316.

78. Johnson, R.J. Inhibition of human pancreatic ribonuclease by the human ribonuclease inhibitor protein / R.J. Johnson, J.G. McCoy, C.A. Bingman, G.N. Phillips, R.T. Raines // J. Mol. Biol. - 2007. - V. 367. - P. 434-449.

79. Kim, J.S. Catalytic activity of bovine seminal ribonuclease is essential for its immunosuppressive and other biological activities / J.S. Kim, J. Soucek, J. Matousek, R.T. Raines // Biochem. J. - 1995. - V. 308. - P. 547-550.

80. Klink, T.A. Conformational stability is a determinant of ribonuclease A cytotoxicity / T.A. Klink, R.T. Raines // J. Biol. Chem. - 2000. - V. 275. - P. 17463-17467.

81. Kotchetkov, R. Selective activity of BS-RNase against anaplastic thyroid cancer / R. Kotchetkov, J. Cinatl, A.A. Krivtchik, J.U. Vogel, J. Matousek, P. Pouckova, B. Kornhuber, D. Schwabe, J. Cinatl Jr. // Anticancer Res. - 2001. - V. 21. - P. 10351042.

82. Kourie, J.I. Mechanisms of amyloid beta protein-induced modification in ion transport systems: implications for neurodegenerative diseases / J.I. Kourie // Cell Mol. Neurobiol. - 2001. - V. 21. - P.173-213.

83. Kourie, J.I. Mechanisms of prion-induced modifications in membrane transport properties: implications for signal transduction and neurotoxicity / J.I. Kourie // Chem. Biol. Interact. - 2001. - V.138. - P. 1-26.

84. Kozakov, D. How good is automated protein docking? / D. Kozakov, D. Beglov, T. Bohnuud, S.E. Mottarella, B. Xia, D.R. Hall, S. Vajda // Proteins. - 2013. - V. 81. - P. 2159-2166.

85. Kumar, K. Probing functional perfection in substructures of ribonuclease T1: double combinatorial random mutagenesis involving Asn43, Asn44, and Glu46 in the guanine binding loop / K. Kumar, F.G. Walz // Biochemistry. - 2001. - V.40. -P. 3748-3757.

86. Kumar, E.V. Biodegradation of poultry feathers by a novel bacterial isolate Bacillus altitudinis GVC11 / E.V. Kumar, M. Srijana, K. Chaitanya, Y. H. K. Reddy, G. Reddy // IJBT. - 2011. - V. 10. - P. 502-507.

87. Lacadena, J. Role of histidine-50, glutamic acid-96 and histidine-137 in the ribonucleolytic mechanism of the ribotoxin a-sarcin / J. Lacadena, A. MartöAnez del Pozo, A. MartöAnez-Ruiz, J.M. PeArez-CanAadillas, M. Bruix, J.M. ManchenÄo, M. OnÄaderra, J.G. Gavilanes // Proteins. - 1999. - V. 37. - P. 474484.

88. Laccetti, P. Seminal ribonuclease inhibits tumor growth and reduces the metastatic potential of Lewis lung carcinoma / P. Laccetti, D. Spalletti-Cernia, G. Portella, P. De Corato, G. D'Alessio, G. Vecchio // Cancer Res. - 1994. - V. 54. - P. 42534256.

89. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

90. Lang, F. Ion channels and cell volume in regulation of cell proliferation and apoptotic cell death / F. Lang, E. Shumilina, M. Ritter, E. Gulbins, A. Vereninov // Contrib. Nephrol. - 2006. - V. 152. - P. 142-160.

91. Lee, I. Tumoricidal effects of onconase on various tumors / I. Lee, Y.H. Lee, S.M. Mikulski, J. Lee, K. Covone, K. Shogen // J. Surg. Oncol. - 2000. - V. 73. - P. 164-171.

92. Lee, J.E. Contribution of active-site residues to the function of onconase, a ribonuclease with antitumoral activity / J.E. Lee, R.T. Raines // Biochemistry. -2003. - V. 42. - P. 11443-11450.

93. Lee, S. Seeded conversion of recombinant prion protein to a disulfide-bonded oligomer by a reduction-oxidation process / S. Lee, D. Eisenberg // Nat. Struct. Biol. - 2003. - V. 10. - P. 725-730

94. Lee, J.E. Ribonucleases as Novel Chemotherapeutics: The Ranpirnase Example / J.E. Lee, R.T. Raines // BioDrugs. - 2008. - V. 22. - P. 53-58.

95. Lee, Y.H. Rana catesbeiana ribonuclease inhibits Japanese encephalitis virus (JEV) replication and enhances apoptosis of JEV-infected BHK-21 cells / Y.H. Lee, C.W.Wei, J.J. Wang, C.T. Chiou // Antiviral. Res. - 2011. - V. 89. - P. 193-198.

96. Leland, P.A. Cancer chemotherapy: ribonucleases to the rescue / P.A. Leland, R.T. Raines // Chem. Biol. - 2001. - V. 8. - P. 405-413.

97. Leshchinskaia, I.B. Molecular mechanisms of growth stimulating effects of Bacillus intermedius RNase / I.B. Leshchinskaia, F.G. Kupriyanova, G.I. Yakovlev, L.V. Kipenskaya, O.N. Ilinskaya // Karadeniz J. Med. Sci. - 1995. - V. 8. - P. 218-219.

98. Liang, S.L. RNase L: its biological roles and regulation / S.L. Liang, D. Quirk, A. Zhou // IUBMB Life. - 2006. - V. 58. - P. 508-514.

99. Lin, R.J. MCPIP-1 ribonuclease exhibits broad-spectrum antiviral effects through viral RNA binding and degradation / R.J. Lin, H.L. Chien, S.Y. Lin, B.L. Chang, H.P. Yu // Nucleic Acids Res. - 2013. - V. 41. - P. 3314-3326.

100. Liu, Y. 3D domain swapping: as domains continue to swap / Y. Liu, D. Eisenberg // Protein Sci. - 2002. - V. 11. - P. 1285-1299.

101. Liu, Y. A domain-swapped RNase A dimer with implications for amyloid formation / Y. Liu, G. Gotte, M. Libonati, D. Eisenberg // Nat Struct Biol. - 2001. - V. 8. - P. 211-214.

102. Mack, L. Endotoxin depletion of recombinant protein preparations through their preferential binding to histidine tags / L. Mack, B. Brill, N. Delis, B. Groner // Analyt Biochem. - 2014. - V. 466. - P. 83-88.

103. Maeda, T. RNase 3 (ECP) is an extraordinarily stable protein among human pancreatic-type RNases / T. Maeda, K. Mahara, M. Kitazoe, J. Futami, A. Takidini, M. Kosaka, H. Tada, M. Seno, H. Yamada // J Biochem. - 2002. - V. 132. - P. 737-742.

104. Makarov, A. A. Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets / A. A. Makarov, O. N. Ilinskaya // FEBS Lett. - 2003. - V. 540. - P. 15-20.

105. Makarov, A.A. Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents / A.A. Makarov, A. Kolchinsky, O.N. Ilinskaya // Bioessays. - 2008. - V. 8. - P. 781-790.

106. Marianayagam, N.J. The power of two: protein dimerization in biology / N.J. Marianayagam, M. Sunde, J.M. Matthews // Trends Biochem. Sci. - 2004. - V. 29. - P. 618-625.

107. Marinov, I. Bovine seminal ribonuclease induces in vitro concentration dependent apoptosis in stimulated human lymphocytes and cells from human tumor cell lines / I. Marinov, J. Soucek // Neoplasma. - 2000. - V. 47. - P. 294-298.

108. Mathy, N. Bacillus subtilis ribonucleases J1 and J2 form a complex with altered enzyme behavior / N. Mathy, A. Hebert, P. Mervelet, L. Benard, A. Dorleans, I.L. Sierra-Gallay, P. Noirot, H. Putzer, C. Condon // Mol. Microbiol. - 2010. - V. 75. -P. 489-498.

109. Merlino, A. The buried diversity of bovine seminal ribonuclease: shape and cytotoxicity of the swapped non-covalent form of the enzyme / A. Merlino, C. Ercole, D. Picone, E. Pizzo, L. Mazzarella, F. Sica // J. Mol. Biol. - 2008. - V. 376. - P. 427-437.

110. Mironova, N.L. Ribonuclease binase inhibits primary tumor growth and metastases via apoptosis induction in tumor cells / N.L. Mironova, I.Y. Petrushanko, O.A. Patutina, A.V. Sen'kova, O.V. Simonenko, V.A. Mitkevich, O.V. Markov, M.A. Zenkova, A.A. Makarov // Cell Cycle. - 2013. - V. 13. - P. 2130-2131.

111. Mitkevich, V.A. Thermodynamics of denaturation of complexes of barnase and binase with barstar / V.A. Mitkevich, A.A. Schulga, Y.S. Ermolyuk, V.M. Lobachov, V.O. Chekhov, G.I. Yakovlev, R.W. Hartley, C. Nick Pace, M.P. Kirpichnikov, A.A. Makarov // Biophys Chem. - 2003. - V. 105. - P. 383-390.

112. Mitkevich, V.A. Binase cleaves cellular noncoding RNAs and affects coding mRNAs / V.A. Mitkevich, N.A. Tchurikov, P.V. Zelenikhin, I.Y. Petrushanko, A.A. Makarov, O.N. Ilinskaya // FEBS J. - 2010. - V. 277. - P. 186-196.

113. Mitkevich, V.A. Sensitivity of acute myeloid leukemia Kasumi-1 cells to binase toxic action depends on the expression of KIT and AML1-ETO oncogenes / V.A. Mitkevich, I.Y. Petrushanko, P.V. Spirin, T.V. Fedorova, O.V. Kretova, et al. // Cell Cycle. - 2011. - V. 10. - P. 4090-4097.

114. Mitkevich, V.A. Structure and functional studies of the ribonuclease binase Glu43Ala/Phe81Ala mutant / V.A. Mitkevich, A.A. Schulga, A.A. Trofimov, P.V. Dorovatovskii, D.A. Goncharuk et al. // Acta Cryst. D Biol. Crystallogr. - 2013. -V. 69. - P. 991-996.

115. Mitkevich, V.A. Cellular targets of antitumor ribonucleases / V.A. Mitkevich, A.A. Makarov, O.N. Ilinskaya // Mol. Biol. - 2014. - V. 48. - P. 181-188.

116. Mitkevich, V.A. Cytotoxicity of RNase Sa to the acute myeloid leukemia Kasumi-1 cells depends on the net charge / V.A. Mitkevich, K.M. Burnysheva, O.N. Ilinskaya, C.N. Pace, A.A. Makarov // Oncoscience. - 2014. - V. 11. - P. 738-744.

117. Mitkevich, V.A. Antitumor RNases: killer's secrets / V.A. Mitkevich, O.N. Ilinskaya, A.A. Makarov // Cell Cycle. - 2015. - V. 14. - P. 931-932.

118. Morimoto, T. Cell-cycledependent regulation of Ca2ro-activated Kro channel in Jurkat T-lymphocyte / T. Morimoto, S. Ohya, H. Hayashi, K. Onozaki, Y. Imaizumi // J. Pharmacol. Sci. - 2007. - V. 104. - P. 94-98.

119. Navarro, S. The cytotoxicity of eosinophil cationic protein/ribonuclease 3 on eukaryotic cell lines takes place through its aggregation on the cell membrane / S. Navarro, J. Aleu, M. Jimenez, E. Boix, C.M. Cuchillo, M.V. Nogues // Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. - 2008. - V. 65. - P. 324-337.

120. Nishimura, S. Ribonuclease of Bacillus subtilis / S. Nishimura, M. Nomura // Biochim Biophys Acta. - 1958. - V. 30. - P. 430-431.

121. Notomista, E. Contribution of chain termini to the conformational stability and biological activity of onconase / E. Notomista, F. Catanzano, G. Graziano, S. Di Gaetano, G. Barone, A. Di Donato // Biochemistry. - 2001. - V. 40. - P. 90979103.

122. O'Donnell, K.A. c-Myc regulated microRNAs modulate E2F1 expression / K.A. O'Donnell, E.A. Wentzel, K.I. Zeller, C.V. Dang, J.T. Mendell // Nature. - 2005. -V. 435. - P. 839-843.

123. Okorokov, A. L. RNA cleavage without hydrolysis. Splitting the catalytic activities of binase with Asn101 and Thr101 mutations / A. L. Okorokov, K. I. Panov, W. A. Offen, V. G. Mukhortov, A. A. Antson, M. Ya. Karpeisky, A. J. Wilkinson, G. G. Dodson // Protein Eng. - 1997. - Vol. 10. -P. 273-278.

124. Olmo, N. Cytotoxic mechanism of the ribotoxin a-sarcin / N. Olmo, J. Turnay, G. Gonzalez de Buitrago, I. Lopez de Silanes, J. G. Gavilanes, M.A. Lizarbe // Eur. J. Biochem. - 2001. - V. 268. - P. 2113-2123.

125. Olson, B.H. a-Sarcin, a new antitumor agent. II. Fermentation and antitumor spectrum / B.H. Olson, J.C. Jennings, V. Roga, A.J. Junek, D.M. Schurmans // Appl. Microbiol. - 1965. - V. 13. - P. 322-326.

126. Piccoli, R. Relationships between nonhyperbolic kinetics and dimeric structure in ribonucleases / R. Piccoli, G. D'Alessio // J. Biol. Chem. - 1984. - V. 259. - P. 693-695.

127. Podoly, E. Alanine-to-threonine substitutions and amyloid diseases: Butyrylcholinesterase as a case study / E. Podoly, G. Hanina, H. Soreqa // Chem. Biol. Interact. - 2010. - V. 187. - P. 64-71.

128. Polyakov, K.M. The structure of substrate-free microbial ribonuclease binase and of its complexes with 3'-GMP and sulfate ions / K.M. Polyakov, A.A. Lebedev, A.L. Okorokov, K.I. Panov, A.A. Shulga, et al. // Acta Cryst. D Biol. Crystallogr. - 2002. - V. 58. - P. 744-750.

129. Poliakov, K.M. X-ray diffraction and biochemical studies of W34F mutant ribonuclease binase / K.M. Poliakov, D.A. Goncharuk, A.A. Trofimov, T.N. Safonova, V.A. Mit'kevich et al. // Mol. Biol. - 2010. - V. 44. - P. 922-928.

130. Ramos, H.J.O. Antibiosis by Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease barnase expressed in Escherichia coli against symbiotic and endophytic nitrogen-fixing bacteria / H.J.O. Ramos, E.M. Souza, J.R.L. Soares-Ramos, F.O. Pedrosa // J. Biotechnol. - 2006. - V. 126. - P. 291-294.

131. Ran, S. Increased exposure of anionic phospholipids on the surface of tumor blood vessels / S. Ran, A. Downes, P.E. Thorpe // Cancer Res. - 2002. - V. 62. - P. 6132-6140.

132. Renatus, M. Dimer formation drives the activation of the cell death protease caspase 9 / M. Renatus, H.R. Stennicke, F.L. Scott, R.C. Liddington, G.S. Salvesen // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2001. - V. 98. - P. 14250-14255.

133. Rios, C.D. G-protein-coupled receptor dimerization: modulation of receptor function / C.D. Rios, B.A. Jordan, I. Gomes, L.A. Devi // Pharmacol. Ther. - 2001.

- V. 92. - P. 71-87.

134. Rodriguez, M. Intracellular pathway of Onconase that enables its delivery to the cytosol / M. Rodriguez, G. Torrent, M. Bosch, J.F. Dubremetz, M. Ribo, A. Benito, M. Vilanova, B. Beaumelle // J. Cell Sci. - 2007. - V. 120. - P. 14051411.

135. Rosenberg, H.F. Recombinant human eosinophil cationic protein. Ribonuclease activity is not essential for cytotoxicity / H.F. Rosenberg // J. Biol. Chem. - 1995.

- V. 270. - P. 7876-7881.

136. Salvesen, G.S. Programmed cell death and the caspases / G.S. Salvesen // APMIS.

- 1999. - V. 107. - P. 73-79.

137. Sanders, A. Cystatin forms a tetramer through structural rearrangement of domain-swapped dimers prior to amyloidogenesis / A. Sanders, C. Jeremy Craven, L.D. Hiqqins, S. Giannini, M.J. Conroy, A.M. Hounslow, J.P. Waltho, R.A. Staniforth // J. Mol. Biol. - 2004. - V. 336. - P. 165-178

138. Saxena, A. Effect of onconase on double-stranded RNA in vitro / A. Saxena, S.K. Saxena, K. Shogen // Anticancer Res. - 2009. - V. 29. - P. 1067-1071.

139. Schirrmann, T. Targeted therapeutic RNases (ImmunoRNases) / T. Schirrmann, J. Krauss, M.A. Arndt, S.M. Rybak, S. Dubel // Expert Opin. Biol. Ther. - 2009. - V. 9. - P. 79-95.

140. Schivaji, S. Bacillus aerius sp. nov., Bacillus aerophilus sp. nov., Bacillus stratosphericus sp. nov. and Bacillus altitudinis sp. nov., isolated from cryogenic tubes used for collecting air samples from high altitudes / S. Schivaji, P. Chaturvedi, K. Suresh, G. S. N. Reddy, C.B.S. Dutt, M. Wainwright, J.V. Narlikar, P.M. Bhargava // Int. J. Evol. Microbiol. - 2006. - V. 56. - P. 1465-1473.

141. Schreiber, G. Methods for studying the interaction of barnase with its inhibitor barstar / G. Schreiber // Methods Mol. Biol. - 2001. - V. 160. - P. 213-226.

142. Schulga, A. Comparative study of binase and barnase: experience in chimeric ribonucleases / A. Schulga, F. Kurbanov, M. Kirpichnikov, I. Protasevich, V. Lobachov, B. Ranjbar, V. Chekhov, K. Polyakov, Y. Engelborghs, A. Makarov // Protein Eng. -1998. - V. 11. - P. 775-782.

143. Schweisguth, D.C. Structural characterization of a ribonuclease III processing signal / D.C. Schweisguth, B.S. Chelladurai, A.W. Nicholson, P.B. Moore // Nucleic Acids Res. - 1994. - V. 22. - P. 604-612.

144. Sevcik, J. Comparison of active sites of some microbial ribonucleases: structural basis for guanylic specificity / J. Sevcik, R.G. Sanishvili, A.G. Pavlovsky, K. M. Polyakov // Trends Biochem. Sci. - 1990. - V. 15. - P. 158-162.

145. Sevcik, J. Determination and restrained least-squares refinement of the structures of ribonuclease Sa and its complex with with 3'-guanylic acid at 1.8 A resolution / J. Sevcik, E.J. Dodson, G.G. Dodson // Acta Crystallogr. - 1991. - V. 47. - P. 240253.

146. Sevcik, J. X-Ray structure of two crystalline forms of a Streptomycete ribonuclease with cytotoxic activity / J. Sevcik, L. Urbanikova, P.A. Leland, R.T. Raines // J. Biol. Chem. - 2002. - V. 277. - P. 47325-47330.

147. Shah Mahmud, R. Antiviral activity of binase against the pandemic influenza A (H1N1) virus / R. Shah Mahmud, O.N. Ilinskaya //Acta Naturae. - 2013. - V. 5. -P. 44-51.

148. Sharipova, M.R. Some secretion characteristics of bacterial ribonucleases / M.R. Sharipova, L.V. Lopukhov, O.A. Vershinina, I.B. Leshchinskaya // Microbiology.

- 2005. - V. 74. - P. 27-31.

149. Shima, F. Current status of the development of Ras inhibitors / F. Shima, S. Matsumoto, Y. Yoshikawa, T.Kawamura, M. Isa, T. Kataoka // J Biochem. - 2015.

- V. 158. - P. 91-99.

150. Shima, F. Discovery of small-molecule Ras inhibitors that display antitumor activity by interfering with RasGTP-effector interaction / F. Shima, Y. Yoshikawa, S. Matsumoto, T. Kataoka // Proc Natl Acad Sci. - 2013. - V. 34. - P. 1-23.

151. Shulga, A.A. Ribonuclease from Bacillus thuringiensis var. subtoxicus: Gene Structure and Regulation of Biosynthesis / A.A. Shulga, L.V. Znamenskaya, O.V. Morozova, I.B. Leshchinskaya, M.P. Kirpichnikov // Russ J. Bioorganic. Chem. -2000. - V. 26. - P. 672-678.

152. Smith, M.R. Cell cyclerelated differences in susceptibility of NIH/3T3 cells to ribonucleases / M.R. Smith, D.L. Newton, S.M. Mikulski, S.M. Rybak // Exper. Cell Res. - 1999. - V. 247. - P. 220-232.

153. Sorrentino, S. Degradation of double-stranded RNA by human pancreatic ribonuclease: Crucial role of noncatalytic basic amino acid residues / S. Sorrentino, M. Naddeo, A. Russo, G. D'Alessio // Biochem. - 2003. - V. 42. - P. 1018219190.

154. Spalletti-Cernia, D. Antineoplastic ribonucleases selectively kill thyroid carcinoma cells via caspase-mediated induction of apoptosis / D. Spalletti-Cernia, R. Sorrentino, S. Di Gaetano, A. Arciello, C. Garbi, R. Piccoli, G. D'Alessio, G. Vecchio, P. Laccetti, M. Santoro // J Clin Endocrinol Metab. - 2003. - V. 88. - P. 2900-2907.

155. Strittmatter, G. Inhibition of fungal disease development in plants by engineering controlled cell death / G. Strittmatter, J. Jansses, C. Opsomer, J. Botterma // Nat. Biotechnol. - 1995. - V. 13. - P. 1085-1089.

156. Suhasini, A.N. Transfer RNA cleavages by onconase reveal unusual cleavage sites / A.N. Suhasini, R. Sirdeshmukh // J. Biol. Chem. - 2006. - V. 281. - P. 1220112209.

157. Suhasini, A.N. Onconase action on tRNA(Lys3), the primer for HIV-1 reverse transcription / A.N. Suhasini, R. Sirdeshmukh // Biophys. Res. Commun. - 2007. -V. 363. - P. 304-309.

158. Ulyanova, V. Barnase and binase: twins with distinct fates / V. Ulyanova, V. Vershinina, O. Ilinskaya // FEBS J. - 2011. - V. 278. - P. 3633-3643.

159. Ulyanova V. Phylogenetic distribution of extracellular guanyl-preferring ribonucleases renews taxonomic status of two Bacillus strains / V. Ulyanova, R. Shah Mahmud, E. Dudkina, V. Vershinina, Eu. Domann, O. Ilinskaya // J Gen Appl Microbiol. - 2016. - V. 62 - P. 181-188.

160. Verhamme, D.T. DegU and Spo0A jointly control transcription of two loci required for complex colony development by Bacillus subtilis / D.T. Verhamme, E.J. Murray, N.R. Stanley-Wall // J. Bacteriol. - 2009. - V. 191. - P. 100-108.

161. Voss, C. Production of recombinant RNase Ba and its application in downstream processing of plasmid DNA for pharmaceutical use / C. Voss, D. Lindau, E. Flaschel // Biotechnol. Prog. - 2006. - V. 22. - P. 737-744.

162. Wang, L. Downhill binding energy surface of the barnase-barstar complex / L. Wang, S.W. Siu, W. Gu, V. Helms // Biopolymers. - 2010. - V. 93. - P. 977-985.

163. Wang, Y. Targeting mutant KRAS for anticancer therapeutics: a review of novel small molecule modulators / Y. Wang, C.E. Kaiser, B. Frett, H.Y. Li // J. Med. Chem. - 2013. - V. 56. - P. 5219-5230.

164. Wu, Y. A cytotoxic ribonuclease. Study of the mechanism of onconase cytotoxicity / Y. Wu, S.M. Mikulski, W. Ardelt, S.M. Rybak, R.J. Youle // J. Biol. Chem. - 1993. - V. 268. - P. 10686-10693.

165. Yang, D. RNA interference (RNAi) with RNase III-prepared siRNAs / D. Yang, A. Goga, J.M. Bishop // Methods Mol. Biol. - 2004. - V. 252. - P. 471-482.

166. Yonehara, M. Heat-induced chaperone activity of HSP90 / M. Yonehara, Y. Minami, Y. Kawata, J. Nagai, I. Yahara // J. Biol. Chem. - 1996. - V. 271. - P. 2641-2645.

167. Yoshida, H. The ribonuclease T1 family / H. Yoshida // Methods Enzymol. - 2001.

- V. 341. P. 28-41.

168. You, L. A novel vector for direct cloning PCR fragments by positive selection based on the lethal barnase / L. You, H. Weng, Z. Chen, A. Wang, W. Xu, M. Wang, Z. Dong // Mol. Biol. Rep. - 2009. - V. 36. - P. - 1793-1798.

169. Youle, R.J. RNase inhibition of human immunodeficiency virus infection of H9 cells / R.J. Youle, Y.N. Wu, S.M. Mikulski, K. Shogen, R.S. Hamilton, D. Newton, G. D'Alessio, M. Gravell // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1994. - V. 91. - P. 6012-6016.

170. Zhang, X. Machinery of protein folding and unfolding / X. Zhang, F. Beuron, P.S. Freemont // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2001. - V. 12. - P. 231-238.

171. Zhang, W. MicroRNAs in tumorigenesis: a primer / W. Zhang, J.E. Dahlberg, W. Tam // Am. J. Pathol. - 2007. - V. 171. - P. 728-738.

172. Zhao, H. The cytotoxic ribonuclease Onconase targets RNA interference (siRNA) / H. Zhao, B. Ardelt, W. Ardelt, K. Shogen, Z. Darzynkiewicz // Cell Cycle. - 2008.

- V. 7. - P. 3258-3261.

173. Zhao, Y. Structural insights into catalysis and dimerization enhanced exonuclease activity of RNase J / Y. Zhao, M. Lu, H. Zhang, J. Hu, C. Zhou, Q. Xu, A.M. H. Shah, H. Xu, L. Wang, Y. Hua // Nucleic Acids Res. - 2015. - V. 43. - P. 55505559.

174. Znamenskaya, L. V. Phosphate regulation of biosynthesis of extracellular RNases of endospore-forming bacteria / L. V. Znamenskaya, L. A. Gabdrakhmanova, E. B. Chernokalskaya, I.B. Leshchinskaya, R.W. Hartley // FEBS Letters. - 1995. - V. 375. - P. 16-18.

175. Znamenskaya, L.V. Expression of the genes for guanyl-specific ribonucleases from Bacillus intermedius and Bacillus pumilus is regulated by the two component signal transduction system PhoP-PhoR in B. subtilis / L.V. Znamenskaya, O.A. Vershinina, V.I. Vershinina, I.B. Leshchinskaya, R.W. Hartley // FEMS let. -1999. - V. 173. - P. 217-222.

176. Zuo, Y. Mechanism of action of RNase T. II. A structural and functional model of the enzyme / Y. Zuo, M.P. Deutscher // J. Biol. Chem. - 2002. - V. 277. - P. 50160-50164.