Новая психрофильная протеиназа Serratia proteamaculans тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Хайруллин, Рафиль Фидаилевич

• Хайруллин, Рафиль Фидаилевич
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Хайруллин, Рафиль Фидаилевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Serratia proteamaculans — представитель психротолерантных 7 грамотрицательных бактерий

1.2. Адаптация психрофильных ферментов к катализу при низкой 8 температуре

1.3. Олигопептидазы В. Структура, функция

1.3.1. Классификация

1.3.2. Распространение в природе

1.3.3. Структура олигопептидазы В

1.3.4. Каталитический домен

1.3.5. (З-Пропеллерный домен

1.3.6. Энзимологическая характеристика олигопептидазы В. 25 Особенности олигопептидазного катализа

1.3.7 рН-Зависимость; рН- и температурная стабильность OpdB

1.3.8. Субстратная специфичность олигопептидаз В

1.3.9. Ингибиторы олигопептидазы В

1.3.10. Влияние реагентов на SH-группы на активность олигопептидаз В

1.3.11. Физиологическая функция олигопептидаз В и роль в патогенезе

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Выделение и очистка трипсиноподобной протеиназы из 50 психротолерантного грамотрицательного микроорганизма S. proteamaculans.

2.2 Первичная структура PSP. Сравнение аминокислотных 57 последовательностей OpdB из различных источников.

2.3. Получение рекомбинантного PSP (His6-PSP)

2.4. Исследование рН-и температурной зависимости активности PSP

2.5. Субстратный анализ

2.6. Ингибиторный анализ

Ill ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

3.2. МЕТОДЫ

3.2.1. Определение концентрации белка

3.2.2. Электрофорез

3.2.3. Приготовление образцов для масс-спектрометрии

3.2.4. Определение активности препаратов PSP

3.2.5. Титрование активных центров

3.2.6. Определение химотрипсиновой активности

3.2.7. ВЭЖХ

3.2.8. Получение BPTI-сефарозы

3.2.9. Процедуры, использованные при работе с клетками

3.2.10. Выделение и очистка трипсиноподобной протеиназы из психротолерантного грамотрицательного микроорганизма S. proteamaculans

3.2.11. Выделение и очистка рекомбинантного His6-PSP

3.2.12. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов PSP

3.2.13. Определение температурной и рН-стабильности PSP

3.2.14. Определение рН-зависимости

3.2.15. Определение температурного оптимума PSP

3.2.16. Гидролиз мелиттина

3.2.17. Определение содержания Zn2+ в PSP ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новая психрофильная протеиназа Serratia proteamaculans»

В последнее время психрофилы и их ферменты привлекают к себе все большее внимание исследователей вследствие своей специфической особенности функционировать в условиях низкой температуры окружающей среды. Организмы, способные выживать и успешно развиваться в условиях постоянно пониженной температуры, называются психрофильными. В настоящее время к истинными психрофилам относятся организмы, для которых оптимальными условиями их функционирования является температура ниже 15 °С. Психрофилы широко представлены в живом мире и встречаются как среди про-, так и эукариот. На сегодняшний день в эту группу включены многие бактерии, грибы, растения и некоторые виды животных (насекомые и позвоночные) [1-4]. Несмотря на чрезвычайно широкое распространение и разнообразие, психрофилы к настоящему времени сравнительно мало изучены.

Психрофильные организмы продуцируют специфические ферменты, которые способны компенсировать снижение скорости реакций, вызванное понижением температуры, повышением их ферментативной активности. Многочисленные работы по сравнительной характеристике гомологичных ферментов психрофильных, мезофильных и термофильных организмов показали, что их удельные активности в условиях температурного оптимума функционирования, как правило, близки. Таким образом, эффективность психрофильных ферментов весьма велика. Молекулярные основы данного явления в настоящее время неизвестны. Сравнение первичных последовательностей ферментов-гомологов показывает, что аминокислотные остатки их активных центров и субстрат-связывающих областей высоко консервативны. Этот факт, в совокупности с данными о том, что ферменты психрофилов, как правило, отличаются заметно сниженной термостабильностью, позволил выдвинуть гипотезу, объясняющую их высокую удельную активность повышенной подвижностью молекулы [1, 5-7]. Однако однозначно связь между стабильностью и активностью психрофильных ферментов не установлена, и более того в ряде случаев получены противоречащие этой гипотезе результаты.

В то же время наличие повышенной подвижности не всегда подтверждается кристаллографическими данными. Возможно, что определяющую роль играет не повышенная лабильность молекулы белка в целом, а лишь ее отдельных районов. В пользу этой гипотезы говорит тот факт, что сравнение аминокислотных последовательностей изученных психрофильных ферментов показывает наличие минимальных перестановок и изменений в первичной структуре по сравнению с мезофильными и термофильными гомологами. Предполагается, однако, что этих структурных факторов достаточно для усиления локальной подвижности за счет изменения слабых взаимодействий, участвующих в стабилизации структуры белка.

Чрезвычайно большой интерес для исследователей представляют адаптированные к пониженным температурам трипсины и трипсиноподобные ферменты. Трипсины позвоночных - одни из наиболее изученных представителей сериновых протеиназ, и поэтому сравнительный анализ аминокислотных последовательностей, третичной структуры и кинетических параметров мезофильных, психрофильных и мутантных ферментов может пролить свет на механизм адаптации к пониженным температурам.

В результате проведенного недавно широкомасштабного скрининга психрофильных микроорганизмов был обнаружен и идентифицирован штамм Serratia proteamaculans, продуцирующий разнообразные протеиназы, в том числе, активные при пониженной температуре [8]. Результаты проведенных медико-биологических испытаний показали, что данный штамм не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Объект данного исследования — трипсиноподобная протеиназа из S. proteamaculans, представляющая интерес не только как психрофильный фермент, но также как фермент бактериального происхождения. Мы показали, что этот фермент является олигопептидазой В, первым психрофильным представителем данного семейства.

В заключение следует отметить, что благодаря повышенной каталитической эффективности адаптированные к пониженным температурам ферменты рассматриваются в качестве ценных инструментов для биотехнологических целей, медицинской и пищевой промышленности. Помимо большого значения использования психрофильных ферментов в практических целях следует отметить важность проведения фундаментальных исследований, связанных с изучением структурных основ повышенной каталитической эффективности ферментов организмов, обитающих при пониженных температурах.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Хайруллин, Рафиль Фидаилевич

Выводы

1. Разработана методика выделения и очистки новой психрофильной протеиназы из S. proteamaculans (PSP).

2. Определена полная аминокислотная последовательности PSP и установлена принадлежность PSP к семейству олигопептидаз В. Обнаружена высокая гомология аминокислотной последовательности PSP с последовательностями олигопептидаз В патогенов человека и животных — Y. pestis, S. enterica, Trypanosoma cruzi, Klebsiella pneumoniae, Leishmania amazonensi, рыб и земноводных — Aeromonas hydrophila, растений — Erwinia carotovora.

3. На основе коммерческой экспрессионной системы, включающей штамм Е. coli BL-21 (DE3) и вектор рЕТ23Ь+ получен продуцент олигопептидазы В S. proteamaculans 94 — Е. coli BL-21 (DE3) [pOpdB]. Разработана методика выделения и очистки рекомбинантного фермента (His6-PSP), позволяющая получать до 150 мг гомогенного по электрофорезу препарата фермента из 100 г биомассы.

4. Проведен субстратно-ингибиторный анализ PSP. Показана принадлежность его к протеиназам трипсинового типа. Исследована вторичная специфичность фермента. Исследована температурная стабильность фермента; определены температурный и рН-оптимумы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Хайруллин, Рафиль Фидаилевич, 2009 год

1. D'amico S., Claverie P., Collins Т., Georlette D., Gratia E., Hoyonx A., Meuwis M.A., Feller G., Gerday C. Molecular basis of cold adaptation // Philos.Trans.R.Soc.Lond В Biol.Sci.— 2002.— V. 357 —Pp. 917-925.

2. Feller G., Gerday C. Psychrophilic enzymes: molecular basis of cold adaptation // Cell MoLLife Sci.— 1997,—V. 53,—Pp. 830-841.

3. Deegenaars M.L., Watson K. Heat shock response in psychrophilic and psychrotrophic yeast from Antarctica // Extremophiles.— 1998.— V. 2.— Pp. 41-49.

4. Leiros H.K., Willassen N.P., Smalas A.O. Structural comparison of psychrophilic and mesophilic trypsins. Elucidating the molecular basis of cold-adaptation// Eur.J.Biochem.— 2000.— V. 267.—Pp. 1039-1049.

5. Paine S.G.H.S. Studies in bacteriosis. A bacterial leaf spot disease of Protea cynaroides,exhibiting a host reaction of possibly bacteriolytic nature // Annals of Applied Biology.— 1919.— V. 6.— Pp. 27-39.

6. Grimont F G.P. The Genus Serratia // Proteobacteria: Gamma Subclass.— New York, 2006,—Pp. 219-244.

7. Janda J., Abbot S. The Enterobacteria // Washington: ASM Press, 2006.— 138-142 p.

8. Bollet C., Grimont P., Gainnier M., Geissler A., Sainty J.M., De M.P. Fatal pneumonia due to Serratia proteamaculans subsp. quinovora // J.Clin.Microbiol.— 1993.— V. 31.— Pp. 444-445.

9. Grimont' F., Grimont P. Genus XXXIV. Serratia // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.—New York, 2005,— Pp. 799-811.

10. Fleisch F., Zimmermann-Baer U., Zbinden R., Bischoff G., Arlettaz R., Waldvogel K., Nadal D., Ruef C. Three consecutive outbreaks of Serratia marcescens in a neonatal intensive care unit // CIin.Infect.Dis — 2002.— V. 34.— Pp. 767-773.

11. Bennett J.W., Bentley R. Seeing red: the story of prodigiosin // Adv.Appl.Microbiol.— 2000.— V. 47:1-32.— Pp. 1 -32.

12. Zhang F., Dashti N., Hynes R., Smith D. Plant Growth Promoting Rhizobacteria and Soybean Glycine max (L.) Merr. Nodulation and Nitrogen Fixation at Suboptimal Root Zone Temperatures 11 Annals of Botany.— 1996,— V. 77.— Pp. 453-460.

13. Schmidt-Nielsen S. Ueber einige psychrophile Mikroorganismen und ihr Vorkommen // Zentr. Bakteriol. Parasitenkd Infektionsk .Hyg.Abt—1902.—V. 9.—Pp. 145-147.

14. Morita R.Y. Psychrophilic bacteria// Bacteriol.Rev.— 1975.—V. 39.—Pp. 144-167.19.22.