Новая эталонная тест-культура "НВ" для стандартизации активности различных антибиотиков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, Вакуленко, Н. А.

• Вакуленко, Н. А.
• 1958

Оглавление диссертации Вакуленко, Н. А.

Введение

Обзор литературы

Глава 1 Биологическая активность антибиотических веществ и ее значение

Глава П Единицы активности и стандарты антибиотиков

Глава Ш Нувсгвжтеяьность шкробовк антибиотикам

Глава 1У Современные микробиологические методы определения активности антибиотиков

Глава У Изменчивость микробов в различных условиях существования.

Собственные исследования

Часть

Микроб "НВ" в качестве теста для определения активности нескольких антибиотиков

Глава 1 Чувствительность микроба НВ к различным антибиотикам

1. Чувствительность микроба НВ к различным антибиотикам на жидких средах.

2. Чувствительность микроба НВ к различным антибиотикам на агаре

3. Чувствительность микроба НВ к различным антибиотикам по величине диаметров зон задержки роста

Глава П Тест-микроб НВ и условия опыта при определении активности различных антибиотиков методом дифЗузии в агар.

1. Питательные среды и растворители,рн, температура выращивания

2. Приготовление взвесей спор нультуры

НВ и их хранение

3. Сравнительные данные определения активности различных антибиотиков с различными тест-микробами.

4. Ориентировочный рабочий стандарт для контроля активности антибиотических препаратов

Глава 1. Тест-микроб НВ для скоростного определения активности пенициллина и стрептомицина

1. Скорость роста тест-микроба НВ при влиянии различных факторов

2. Скоростное определение активности пенициллина и стрептомицина при применении тест-микроба НВ, золотистого стафилококка и Bocmyeoides

Часть П Свойства микроба НВ

Глава 1 Морфологические и культурально-биохимиче-ские свойства исходного штамма культуры НВ

Глава П Изменчивость исходного штамма НВ

1. Морфологические,культуральные, биохимические и серологические свойства вновь выделенных вариантов гладкой и шероховатой форм культуры НВ

2. Идентификация культуры НВ.

Глава Ш Антибактериальные свойства культуры НВ

1.Некоторые антибиотики,выделенные из различных спорообразующих бактерий (Краткие литературные данные)

2. Штамм НВ как микроб-антагонист.

3. Концентрация и свойства антибактериального вещества,образуемого культурой НВ

4. Изучение антимикробного спекта активности НВ

5. Количественное определение активности

6. Предварительные данные о безвредности концентратов НВ.

3 а к л ю ч е н и е

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новая эталонная тест-культура "НВ" для стандартизации активности различных антибиотиков»

1

ВВЕДЕНИЕ

Садним из самых значительных и важных открытий в борьбе с инфекционными заболеваниями за последние 10-15 лет является получение и применение антибиотиков. Весьма высокая активность антибиотиков в отношении патогенных микробов в организме, их малая токсичность для больного обеспечили им главенствующее место среди других химиотерапевтических веществ. Поэтому антибиотики за последнее время являются объектом глубокого интереса и изучения.

Успешное применение таких антибиотиков как пенициллин, стрептомицин, тетрациклины открыло новую страницу в истории лечебной медицины и привело к созданию новой отрасли медицинской промышленности - производству антибиотических препаратов, что обеспечило лечение таких инфекционных заболеваний, как туберкулез, менингит, пневмония и другие, для успешной терапии которых до этого не было средств. Руднев отмечает: "Антибиотики позволили осуществить врачу вековую мечту о победе над так называемыми особо опасными инфекциями, принеся закономерное и стойкое излечение даже при первичной легочной чуме" (88).

После открытия пенициллина и стрептомицина развернулись обширные исследования по изысканию новых антибиотических веществ. Основным источником получения новых антибиотиков являются микроорганизмы, и способ изыскания новых антибиотиков основывается, прежде всего, на явлении антагонизма у микробов. За сравнительно короткий срок - несколько лет - было выделено и описано около 500 антибиотиков, однако широко применяются в практике для лечения заболеваний только около 20 препаратов / Красильников (56) /.

Современное учение об антибиотиках неразрывно связано с учением о микробном антагонизме, отмеченном еще в трудах Мечникова и Пастера (80).

На предположении об успешном использовании молочнокислых палочек болгарской простокваши, подавляющих гнилостных микробов кишечника, Мечников (64) создал теорию оздоровления человеческого организма и продления жизни.

Со времен Пастера и Мечникова вопросы микробного антагонизма не переставали привлекать к себе внимание исследователей. в этой области русские ученые проводили много исследований еще задолго до того, как появился широкий интерес к антибиотикам, как к лечебным препаратам. Общеизвестно,что за много лет до открытия пенициллина Флемингом^Полотебнов (82) и Манассеин (62) исследовали зеленый кистевик и не только показали его антибактериальную активность, но и использовали это действие в терапии кожных заболеваний и сш|илиса. Тарта-ковский (93) первый применял культуру пеницижзга для лечения инфекционных болезней животных. Высоцкий (16) в 1889 г. в работе и0 синем нагноении" сообщил о лечении различных форм дифтерических поражений чистыми культурами синегнойной палочки.

Изучению антагонизма среди почвенной микрофлоры,особенно среди лучистых грибков, посвящены работы Бородулиной (10), Нахимовской (76), Новогрудского (78). Красильников и Кореня-ко (55) в 1939 г. получили первый антибиотик из актиномице-тов - мицетин и ряд новых антибиотиков, таких как аспергил-лин, лонгиспорин и др. Советским специалистам, как указывает в своих работах Ваксман, принадлежит приоритет получения антибиотиков из актиномицетов (56).

Исследование микробов-антагонистов - спороносных и неспороносных бактерий, грибов показали, что актиномицеты являются наиболее активными антагонистами и самой перспективной группой микробов, продуцентов антибиотических веществ. При изыскании новых продуцентов антибиотиков среди почвенных микроорганизмов советскими учеными выявлена зависимость распространения микробов-антагонистов от окружающей среды / Гаузе (22) /. В ряде работ, посвященных экологии и географическому распространению почвенных актиномицетов,бактерий и плесневых грибов, образующих антибиотики, показано, что более активными являются микробы-антагонисты из южных почв.

Спектр антибактериального действия антагонистов южных почв более универсален и сами микробы более разнообразны в видовом отношении, чем микробы антагонисты из северных почв.

За прошедшие 15 лет в Советском Союэе исследовано огромное количество культур и получены многие антибиотические вещества (56): пенициллин-крустозин (Ермольева); грамицидине, альбомицин, колимицин, кристалломицин, церуломицин, гелио-мицин (Гаузе с сотрудниками); микроцид (Пидопличко); глоби-спорин, мицерш, гризиш, лонгиспорин, аспергилшн, (Красильников с сотрудниками); аурантин, секазин, мицерин (Планельес). Кроме антибиотиков минробного происхождения,получены антибиотики из тканей животных. Зильбер и Якобсон получили препарат эритрин, Ермольева - экмолин.

Иссяедования антимикробных свойств у растений привели к выделению фитонцидов (Токин) и имманина (Дроботько).

Под руководством Ермольевой много лет назад в ЕИЭМ"е были предприняты изыскания по получению активных штаммов плесени. Было испытано 93 штамма, из которых P.crustоsum оказался наиболее активным. С выделенным штаммом был разработан метод получения первого советского пенициллина, который был назван пенициллин-крустозин ВЙЭМ / Ермольева (32) /.

В настоящее время в Советском Союзе освоено массовое производство пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов и других антибиотиков с новыми высокоактивными штаммами,полученными путем селекции.

Все внимание исследователей в последние годы направлено на изыскание антибиотиков, обладающих противораковым и противовирусным действием, а также препаратов против грибковых инфекций.

Параллельно с получением новых антибиотиков разрабатывалась и уточнялась методическая система изг всестороннего исследования. В такой системе особенно нуждаются те препараты антибиотиков, которые используются в лечении или про(|и-лактике заболеваний.

Поэтому закономерно, что основными свойствами, которые должны были характеризовать антибиотики, являлись и являются биологическая антимикробная активность и безвредность" / Якобсон (110) /.

Принципы стандартизации антибиотиков были разработаны еще в 1944 г. Основным методом, определяющим активность антибиотиков, был и остается метод диффузии в агар.

Различными авторами внесено и вносится в этот метод много деталей, позволяющих его уточнить и упростить. Большая работа была проведена по отбору тест-микробов, применяемых для стандартизации антибиотиков.

В настоящее время в контрольных лабораториях заводов антибиотической промышленности при выпуске готовой продукции антибиотиков пользуются, в основном, советскими тест-культурами. Опытами установлено, что один микробный тест может быть заменен другим соответствующим тестом, не вызывая изменения показателя биологической активности, в связи с тем, что за последнее время был получен ряд новых антибиотиков, которые нашли себе широкое применение в практике,и учитывая трудоемкость условий контроля различных.антибиотиков, мы поставили перед собой задачу найти тест-микроб, пригодный для стандартизации активности не одного, а нескольких антибиотиков.

Работая над упрощением, усовершенствованием и стандартизацией методов контроля активности, мы стремились найти не только соответствующий тест-микроб, но, по возможности, одни и те же среды и условия растворения для таких различных по своей химической природе антибиотиков, как пенициллин, стрептомицин, биомицин, террамицин и эритромицин. Применяя метод направленной изменчивости и искусственного отбора, мы получили гладкий вариант неидентифицированной спорообразую-щей палочки НВ, который оказался тест-микробом, высокочувствительным к указанным выше антибиотикам, полностью пригодным для стандартизации активности этих антибиотиков методом диффузии в агар. Эта культура была также применена для скоростного определения активности пенициллина и стрептомицина (в течение 3,5-4 часов).

При апробации в Государственном контрольном институте, на заводах антибиотической промышленности им. Карпова, мед-препаратов № 1, 2, в экспериментальных лабораториях клиник предложенного варианта культуры НВ-2 и метода проведения исследования активности указанных антибиотиков были представлены заключения о целесообразности практического применения культуры.

Культура в виде взвеси спор, заготовленная на большой срок,сохраняла свою чувствительность к антибиотикам в течение многих месяцев / до 3-х лет

Изучение свойств культуры НВ позволило установить, что гладкий вариант ее / НН-2 / обладает антагонистическими свойствами и является продуцентом вещества, биологически активного в отношении различных видов грамположи-тельных микробов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Г Д А В А 1. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИБИОТИЧЕСКИХ

ВЕЩЕСТВ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ

Антибиотические препараты применяют при лечении многих инфекционных заболеваний, возбудителями которых являются микробы и вирусы. В последние годы делается много попыток применения антибиотиков против злокачественных опухолей.

В настоящее время известно большое количество антибиотиков, в основном образуемых в процессе обмена веществ актино-мицетов - лучистых грибков, нормального населения почвы.

Основным критерием для оценки антибиотиков служит их биологическая активность в отношении различных видов микробов. Отлдругих препаратов, используемых в терапии различных заболеваний, антибиотики отличаются резко выраженным антимикробзаболеваний ным действием. При применении антибиотиков в терапийлюдей, животных, а в последнее время и растений, имеющих промышленное значение, высокая степень этой активности благоприятно решает исход многих инфекционных заболеваний. препаратов

Правильная оценка величины антимикробной активности/Целиком зависит от того, насколько точны примененные методы исследования. Поэтому определение активности антибиотических препаратов по праву занимает первое место во всей системе их контроля.

ГЛАВА П. ЕДИНИЦЫ АКТИВНОСТИ И СТАНДАРТЫ АНТИБИОТИКОВ

В первых исследованиях пенициллина его биологическая активность определялась методом серийных разведений на бульоне / Флеминг - Fleming (139), Ермольева (31), Валезина (7) /.

Выражением активности при этом методе исследования являлась величина максимального разведения, при котором еще наблюдалась задержка роста данного тест-микроба.

В 1941 г. Абрагам и Чейн / Abraham a. Chain (Ц1) / впервые ввели в практику понятие об "единице" активности пенициллина и о рабочем стандарте. Авторы использовали частично очищенный препарат пенициллина в качестве рабочего стандарта. За единицу биологической активности была принята такая постоянная концентрация этого препарата, которая при диффузии в засеянный тест-микробом золотистым ста<|илококком агар образовала зону задержки роста диаметром в 24 мм.Позднее ©гори и Дженингс / Horey, Jennings (140) / для измерения активности пенициллина ввели понятие "оксфордская единица" или то количество пенициллина, которое полностью задерживает рост золотистого ста(£илококка в 50 мл бульона в постоянных условиях опыта. до 1944 г. активность пенициллина определялась согласно эталону в "оксфордских единицах" / <$остер и Вудрафф Poster, Woodruff (144) /.

В октябре 1944 г. на международной конференции по пенициллину была проведена стандартизация методов анализа пенициллина и принят международный стандарт пенициллина,состоящий из чистой кристаллической натриевой соли пенициллина "0

На этой конференции понятие "оксфордская единица активности пенициллина" было заменено точной международной единицей (МЕ) , имеющей строгую весовую величину /Веяьди, Геруик и Когилл - Veldi, Herwick, Goghill (206) /. Международная единица (ME) пенициллина по биологическому действию эквивалентна была "оксфордской единице" и представляла собой 0,6 микрограмма химически чистой кристаллической натриевой соли пенициллина.

Международный стандарт кристаллической натриевой соли пенициллина содержал 1667 МЕ/мг и имел следующий типовой состав: 99,75$ пенициллина " & " и 0,25% пенициллина "X".

Однако последующий анализ установил,что международный стандарт содержал 99,1% пенициллина "в ", 0,1% пенициллина "X" и 0,8% пенициллина " * " / Бонд - Bond (цд) /.международный стандарт пенициллина предназначается для контроля и периодической проверки национальных стандартов.В 1945 г. коллективным трудом многих лабораторий был разработан и выпущен международный рабочий стандарт - кальциевая соль пенициллина с активностью 370 МЕ/мг или 2,7 микрограмма на ME.

Таким образом была внесена четкая стандартизация в методы исследования активности пенициллина,что являлось совершенно необходимым как для исследовательских работ, так и при производстве пенициллина на заводах. Первый советский рабочий стандарт пенициллина был приготовлен во ВНИИП в 1947 г. в виде аморфной кальциевой соли /Жиллабо (33) /. Этот препарат был тщательно изучен и оттитрован по отношению к международному стандарту лабораториями контроля ШИИП, ГКЙ и заводов / Якобсон (108) /. Рабочий стандарт кальциевой соли содержал 370 МЕ/мг и был утвержден в качестве рабочего эталона для стандартизации товарного пенициллина. Постепенно советские рабочие стандарты пенициллина заменялись с соответственным повышением актишости. В 1949 году активность рабочего стандарта была равна 385 ед/мг; в 1950 году - 500 ед/мг в 1951 году - 1150 ед/мг и т.д.

При исследовании стандарта кальциевой соли с активностью 1150 ед/мг лабораторией химии ВЕША оказалось,что вес единицы активности в мг этого образца рабочего стандарта ра вен 0,86 микрограмма, а содержание балластных веществ состав ляет 31%. Такой рабочий стандарт значительно уступал по каче ству кристаллическому препарату пенициллина, выпускаемому ан тибиотической промышленностью.

Лабораторией химии ВГОША был изготовлен соответствующий препарат кальциевой соли пенициллина, который оказался и более стабильным, чем стандарт аморфной кальциевой соли.

Активность этой кальциевой соли была установлена по меж дународному рабочему стандарту в 1300 ед/мг.

Вес одной единицы был равен 0,77 микрограмма. Содержание пенициллина " G и было равно 79,7% (см.рис. 1)

Птциялин J9'

Рис.!

Следует отметить, что представление о международной единице активности чистого вещества пенициллина, равной 0,6 микрограмма, несколько отличается от представлений об единице активности других препаратов, так как для стрептомицина,биомицина, террамицина, эритромицина и подавляющего большинства других антибиотиков такой единицей считают 1 микрограмм химически чистого вещества, что значительно уточняет расчеты при стандартизации препаратов.

В последние годы в связи с получением и внедрением в практику типов пенициллина "0й и "V и созданы и применяются для стандартизации соответствующие эталоны чистых препаратов, так же как и рабочие стандарты. Активность таких стандартов учитывается в отношении тех же тест-культур,что и активность бензил-пенициллина.

Стрептомицин является органическим основанием. Описаны многими авторами стрептомицин "А" (см.рис.2) и стрептомицин "Ви (см.рис.3), которые отличаются по своему составу тем,что в состав стрептомицина "В", помимо стрептидина и стрептобиоз-амина, входит манноза.

Лн jpbfh dhc^NHOH но»

Стрептомицин Л м JfH<-Mx чи

НОНС/С^СНОН н* I сн—о Ц—0 онс-с-он

Н I I

CHj^HC-H неон -с-н I с-и

СНзРН

-И с-н р llfcj

ГГу-1

CHjOH

Стрептомицин В.

Рис. 1

Рис. 4

Активность маннозидострептомицина (стрептомицин В) в три раза слабее активности стрептомицина А (54).

Как было указано выше, для определения активности стрептомицина, за единицу принят один микрограмм его химически чистого основания. В ранних работах Ваксмана и Грина /Green , Waksman (152) / было дано предварительное определение единицы активности стрептомицина, когда за единицу активности ими было принято количество стрептомицина,вызывающее задержку роста стандартного тест-микроба кишечной палочки в одном миллилитре мясопептонного бульона или агара.

Первым временным советским рабочим стандартом служил препарат стрептомицина, выпущенный в 1949 г. ЦИЭМ"ом и изученный ВНИИП. Этот временный рабочий стандарт стрептомицина обладал активностью 165 ед/мг. В 1950 г. во ВНИИА он был заменен новым стандартом в виде хлоркальциевого комплекса стрептомицина с активностью 280 ед/мг, в 1951 г. - 630 ед/мг, в 1952 г. - 600 ед/мг, в 1955 г. - 630 ед/мг. Кристаллический препарат хлоркальциевого комплекса стрептомицина не содержит маннозидострептомицина и является препаратом наиболее точного типового состава. Сернокислая соль стрептомицина более устойчива при хранении. Поэтому рабочие стандарты стрептомицина готовят,избирая одно из этих двух соединений.

Биомицин-хдо рте трациклин известен своим широким анти -микробным спектром (см.рис.4). Он активен в отношении грамбионицин - Хлорттрациклин

Рис. k положительных и грамотрицательных микробов, риккетсий, спирохет, а также некоторых крупных вирусов. Ценным свойством биомицина является также его высокая активность при заболеваниях, вызванных пенициллино- и стрептомициноустойчивыми формами микробов.

Советским рабочим стандартом сяужит биомицин солянокислый -кристаллический порошок золотисто-желтого цвета. Одна единица биологической активности биомицина соответствует активности 1 микрограмма его химически чистого основания.

При стандартизации активности ауреомицина, аналога советского биомицина, в качестве стандарта применяется кристаллический препарат ауреомицина основания с активностью 1000 ед/мг. Первый советский рабочий стандарт биомицина в виде солянокислой соли был выпущен и утвержден УМС Министерства здравоохранения СССР в апреле 1953 г. В 1 мг этого препарата биомицина содержалось 900 ед.

В 1955 г. проверка по международному стандарту показала, что в нем и в новой партии советского рабочего стандарта в 1 мг содержалось также 900 ед. Последней партией рабочего стандарта пользуются в лабораториях антибиотической промышленности для выпуска товарного биомицина.

Террамицин-окситетрациклин очень близко стоит к биомицину по своей химической структуре и биологическому действию (см. рис. 5).

Шеррамицин - Опиттрациклин.

Рис. 5

Единица действия террамицина определена равной одному микрограмму его химически чистого основания. Первый временный советский рабочий стандарт в 1953 г. представлял собой кристаллический солянокислый террамицин с активностью 820 ед/мг, в 1954 г. замененный препаратом того же состава с активностью 850 ед/мг. В 1956 г. и он заменен рабочим стандартом с активностью 870 ед/мг.

ГЛАВА ffl. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МИКРОБОВ К АНТИБИОТИКАМ

При испытании антибактериального действия антибиотиков на различные виды микробов in vitro оказалось,что их действие строго избирательно. Различные бактерии обладают неодинаковой чувствительностью к различным антибиотикам. Известно, что один и тот же микроорганизм реагирует на разные антибиотики в неодинаковой степени: к одним веществам он может быть очень чувствителен и его развитие задерживается ничтожно малыми дозами их, к другим он более стоек и для задержки его роста требуютсягбольшие дозы (208). Например, стафило-кокк штамм 209 перестает расти: в среде с стрептомицином в концентрации 100 ед/мл -"- с мицетином 10 и

-"- с лонгиспорином 0,1 "

-и- с гризеином -"- 30 "

Также хорошо известно,что у разных видов бактерий чувствительность к одному и тому же антибиотику неодинакова. Понятие "чувствительность" определяет способность живой клетки реагировать на воздействие какого-нибудь из факторов внешней среды.

Если таким фактором воздействия на микробную клетку является антибиотик, то показателем степени чувствительности микроба к антибиотику является наименьшая концентрация последнего, которая оказывает бактериостатическое действие на этот микроб. Показатель чувствительности микробов различных штаммов и даже одного и того же штамма в значительной мере зависит от состава питательной среды, количества микробных тел при посеве и времени действия антибиотика на микробную клетку / Гольдфарб (24), Сочилова (92), Дртемова (3), Дер-кач (27), Вакуленко (13) и др. /.

Первые исследователи пенициллина - Ермольева (31), Бале-зина (7), Гобби, Мейер /ЖоЪЪу , Meyer (159) /, испытывая его действие в отношении различных видов микробов, разделили их по чувствительности на 2 группы: на чувствительные и не чувствительные к пенициллину. Позднее Африкян (6) предложил разделить все микробы на 3 группы по их чувствительности к пенициллину: к группе чувствительных микроорганизмов относятся микробы, для которых бактериосяатическая доза пенициллина составляет 0,008 - 0,1 ед/мл; сюда относятся стас^илококки, стрептококки, гонококки, менингококки, спирохеты и др. Для группы малочувствительных микробов эта минимальная задерживающая рост концентрация равна 5-50 ед/мл. К этой группе принадлежат палочки тифа, дизентерии и др. К группе нечувствительных микробов предложено отнести таких микробов, как палочки синезеленого гноя, туберкулезную палочку, на которые пенициллин оказывает аналогичное действие лишь в концентрации 200-500 ед/мл. .[Изучением чувствительности микробов к антибиотикам с различной целью занимались многие авторы.

Исследования чувствительности споровыя и не образующих спор микроорганизмов к стрептомицину, проведенные Шотц , Ваксманом и др. /Sehatz a* Waksman (195) / , показали колебания показателей чувствительности различных штаммов одного и того же вида в 10 и больше раз. Шеришорина (106) при изучении действия пенициллина на стафилококков установила большую разницу в чувствительности к пенициллину для различных штаммов. Барская и Комраз (8) описывают 94 штамма ста<|илокков, испытанных ими в отношении чувствительности к пенициллину, из которых только 5% были мало чувствительны к пенициллину.

В диссертации фурер (100) описывается вццеленный автором штаммВ&О* subtilis Н-33, высокая чувствительность которого к пенициллину превосходит в 3 раза чувствительность стафилококка.

Используя различную чувствительность микробов к одному и тому же антибиотику, Ваксман (208) предлагает для дифференциации стрептомицина и стрептотрицина пользоваться культурами^0 . subtilis K£aQmycoide8.

Сенная палочка обладает высокой чувствительностью к стрептотрицину, тогда как почвенные бактерии совершенно не j чувствительны к действию этого вещества, а высокочувствительны к действию стрептомицина. Определяя биологическую активность пенициллина на одной среде с тест-микробом золотистым CTaiJswiOKOKKOM HBace8ubtilis 720, Фостер и Вудрафф (144) установили,что размер зон задержки роста на одну и ту же концентрацию антибиотика неодинаковый. Меньший диаметр зоны задержки роста Вас. subtilis 720 свидетельствует о его меньшей чувствительности к пенициллину.

Шмидт и др. / Schmidt a.other (197) / отмечают различную чувствительность ^subtilis ,полученных из глад/ ких и шероховатых форм колоний, к различным типам пенициллина. Это различие в чувствительности было использовано авторами для определения типов пенициллина в смесях. Микробиологический метод определения типов пенициллина, разработанный Хигуши и Петерсоном / Higuehi a.Peterson (157) / основан также на принципе дифференциальной чувствительности трех различных тест-микробов - золотистого стафилококка,®^9Ьгвт1в и микроба ИЕ? Каждый из этих микробов имеет свои специ<|иче-ские константы чувствительности, по которым можно судить о присутствии того или иного типа пенициллина.

Как указывалось выше, при определении чувствительности существенное значение имеют условия проведения опыта- - некоторые из них оказывают большое влияние на результаты исследования / Германова (23) /. Шабер / Chabbert (124, 125) / указывает, что чувствительность определенного бактериального штамма по отношению к какому-либо антибиотику не является постоянной, а зависит от состава среды, рН, количества посевного материала, длительности инкубации и способа чтения результатов. Для получения сравнимых результатов в различных лабораториях необходимо пользоваться при стандартных условиях одним и тем же тест-штаммом.

Согласно данным Гетли / Heatley(155) /, при определении чувствительности к антибиотикам наиболее важным моментом является количество вводимых микробных тел. Автор считает,что разноречивые результаты степени чувствительности одних и тех же штаммов микроорганизмов, получаемых различными исследователями, возникают от того,что они в своих исследованиях пользуются неодинаковым количеством микробов (от одной петли до 1 мл неразведенной микробной взвеси). Гольдфарб (24),изучая изменения золотистого стафилококка под влиянием пенициллина, определяла показатель чувствительности и нашла следующую зависимость между количеством засеваемых микробных тел и бакте-риостатической дозой пенициллина для стафилококка № 209 на МПБ.

Показатели чувствительности стафилококка к пенициллину в зависимости от количества засева микробов

Количество микробов в 1 мл среды Минимальн.задержив.рост концентрац. в ед/ мл

500 - 1000 0,02

10 ООО - 50 ООО 0,03 - 0,04

5 ООО ООО 0,06

Время воздействия антибиотика на мирробную клетку также сказывается на результатах исследования. По данным Хинчук (103), в результате действия пенициллина на гемолитический стрептококк в течение 2-х часов процент высеваемых клеток составлял г применением

57%, а через 24 часа - 0,006%^Щшод"^У^лЕ,Фрафйльтров,предложенный Сочиловой (92), удобен для изучения действия антибиотиков различной концентрации на микробные клетки во времени.

Качественное определение чувствительности микробов методом диффузии в агар предложено Флемингом (139) еще в 1929 г. Согласно этому методу, в агаровой пластинке чашки Петри вырезается по диаметру канал. Затем канал заполняют агаром,смешанным с пенициллином, и перпендикулярно каналу на агар высеваются параллельными штрихами различные микробы. Пенициллин диффундирует через агар и угнетает рост различных бактерий в зависимости от чувствительности последних к пенициллину, вследствие чего наиболее чувствительные микробы растут в наибольшем отдалении от канала. Нечувствительные микробы растут по всей длине штриха посева.

Для количественного определения степени чувствительности приемлемо большинство методов определения биологической активности антибиотиков. В зависимости от задачи экспериментатора, можно пользоваться методом серийного разведения в бульоне, серийными разведениями в агаре, методом диффузии в агар. Чувствительность в последнем случае определяется по размеру зон задержки роста тест-микроба. Метод разведения в агаре, описанный фшером (99), состоит в том,что на агар,содержащий различные концентрации пенициллина, рассевают испытуемые микробы и определяют, пр отсутствию роста микроба, наименьшую задерживающую рост концентрацию. Этим методом можно испытывать одновременно на одной чашке несколько микроорганизмов.

Более точным является метод, модифицированный Дмитриевой (2В) и описанный нами в экспериментальной части работы.

При стандартизации активности антибиотиков выбор высокочувствительной тест-культуры в сочетании со средой,обеспечивающей хорошую диффузию данного антибиотика, способствует повышению чувствительности метода, а следовательно, уточняет конечный результат активности.

В этих случаях чувствительность различных испытуемых образуемой тест-микробов определяют по диаметру зоны задержки ростгУ"оп-ределенной концентрацией антибиотика. Буяновская (11), изучая антибактериальное действие стрептомицина на различных грамотрицательных и грамположительных (в том числе и споровых) микробах, для выяснения их чувствительности к стрептомицину использовала 16-часовой метод диффузии стрептомицина в агар. Путем сравнения размеров диаметров зон задержки роста трех спорообразующих микробов было показано,что наибольшей чувствительностью обладает-^ ♦sublitie ,а наименьшей -Вас •lickeniformis.

Модификацией метода диффузии в агар для количественного определения чувствительности является метод, предложенный Бонди / Bondi (120) /, с использованием дисков из фильтровальной бумаги, пропитанных антибиотиком определенной концентрации. Показателем чувствительности является диаметр зоны задержки роста вокруг кружка фильтровальной бумаги, пропитанного наименьшей концентрацией. Важное значение имеет определение показателей чувствительности возбудителей различных заболеваний для наиболее рационального применения антибиотиков в терапии этих заболеваний, В клинических целях испытание чувствительности возбудителей заболевания к антибиотикам производится чаще всего методом диффузии в агар с применением дисков, пропитанных антибиотиками,а также методом серийных разведений. Однако некоторые авторы по разному оценивают возможность использования того или иного метода. Повидимому, эти разноречивые данные зависят от характера микроорганизма, который испытывается, а также от природы антибиотика. Так, например, Бушби / Busbfcy (123) /,сравнивая диффузионный метод (с дисками) определения чувствительности микробов кишечной палочки, синегнойной палочки, золотистого стафилококка и других к полимиксину с методом раз$* ведений в агаре, указывает,что результаты этих методов не совпадают.

Автор считает,что дифс^узионный метод непригоден для определения чувствительности к полимиксину и объясняет, что это может быть связано с медленной диффузией антибиотика в агаре, зависимостью диаметра зоны угнетения от скорости роста тест-микроба, адсорбцией полимиксина убитыми клетками.

Хьетта, Раш и др. / Thjotta, lasah (202) /, сравнивая чувствительность стафилококков к различным концентрациям ауреомицина при определении пробирочным методом и методом бумажных дисков, пришли к заклвчению, что последний способ дает более грубые результаты. Пробирочным методом удается обнаружить задержку развития стафилококка при концентрации ауреомицина 0,08 ед/мл, а бумажными дисками только при 1,25 ед/мл.

Для пенициллина, террамицина и хлоромицетина в отличие от ауреомицина оба метода дают близкие результаты. По-видимо-му, благодаря удлиненной лаг-фазе роста JT бактерий на плотной среде и нестабильной активности ауреомицина, возникают ошибки при определении этого антибиотика методом бумажных дисков.

В литературе имеются также сообщения о том,что сравнительные испытания чувствительности различными методами дают благоприятные результаты.

Коллинз и др. f Collins another (128) / ироводили сравнительное испытание 25 штаммов 7 различных , видов патогенных бактерий по отношению к 8 антибиотикам: хлорамфениколу, полимиксину, бацитрацину, эритромицину, пенициллину и другим антибиотикам методом серийных разведений и методом диффузии в агар (с дисками).

Хорошее совпадение между двумя методами было получено в 91,3% испытаний.

Аналогичные совпадающие результаты сравнительных испытаний чувствительности микробов методом серийных разведений и методом диффузии в агар быяи получены Хольтерманн / Holtermarm (161) /, Патрик /Patrick (181) /, Шаттен Schatten (194) /, Клаппер / clapper (127) /. Родерс и др. /Roders a. ether (191) /, отмечая наилучшую пригодность для определения чувствительности бактерий к химиоте-рапевтическим препаратам метода диффузии в агар с применением дисков, пропитанных антибиотиками, считают недостатком этого метода его длитещьность.

Авторы предлагают новый метод бызтрого определения чувствительности бактерий к антибиотикам, основанный на способности антибиотиков подавлять ферментативную активность бактерий. Длительность определения -2,5 часа. Испытание ведут на среде, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт и индикатор фенол-рот.

Недостаток метода в том, что он не дает возможности С идентифицировать возбудителя заболевания.

Заключение диссертации по теме «Другие cпециальности», Вакуленко, Н. А.

ВЫВОДЫ:

1. В процессе изменчивости исходного штамма НВ при искусственном отборе была получена культура спороносной палочки НВ-2, образующая колонии гладкой формы. Эта культура обладает новыми свойствами, которые стойко передаются по наследству.

2.Гладкий вариант культуры НВ обладает высокой чувствительностью в отношении пяти антибиотиков: пенициллина, стрептомицина, биомицина, террамицина и эритромицина.

Культура имеет преимущества перед другими культурами, в частности, перед золотистым стафилококком не только более высокой чувствительностью к пенициллину, но и способностью образовать споры, взвесь которых может долвое время сохраняться без изменения свойств.

3. Гладкая форма культуры НВ применялась в качестве тест-микроба при стандартизации активности пяти указанных выше антибиотиков, что подтверждено опытами многих перечисленных лабораторий.

4. Разработан метод определения биологической активности пенициллина, стрептомицина, биомицина, террамицина и эритромицина с применением взвеси спор НВ-2.

5# Для контроля активности эритромицина культура НВ-2 является стандартным тест-микробом, узаконенным инструкцией по контролю активности.

6. Разработан метод скоростного определения активности пенициллина и стрептомицина (в течение 3,5-4 часов)с тест-культурой НВ-2.

7. Определена чувствительность тест-культуры НВ-2 к трем антибиотикам: стрептомицину, биомицину и террамицину в отношении пенициллина,принятого за стандарт активности.

В условиях проведенных опытов оказалось вполне допустимым применение одного антибиотика, принятого за стандарт, для ориентировочных исследований активности неизвестных препаратов.

8. Культура НВ гладкой формы обладает антагонистическими свойствами в отношении грамположительных микробов и продуцирует антимикробное вещество, ввделяя частично его в среду, а также"сохраняя его внутриклеточно.

9. Определены условия биосинтеза активного вещества,ио-лучены спиртовые экстракты антибиотика НВ, биологически активного в отношении разных грамположительных микробов,в том числе стафилококков, устойчивых к пенициллину, биомицину, стрептомицину,террамицину и антибиотику типа стрецтотрицина.

10. культура НВ (гладкий и шероховатый вариант) идентифицирована как штамм НВ- вида Вас., myeoides.

Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю, доктору биологических наук, профессору Лидии Михайловне ЯКОБСОН за постоянную помощь и систематическое руководство.

Благодарю заведующую лабораторией биоконтроля Анну Е(|имовну ТЕБЯКИНУ за указания и предоставленную возможность выполнения данной работы, а также старших научных сотрудников Иду Самуиловну БУЯНОВСКУЮ и Веру Сергеевну ДМИТРИЕВУ за советы,данные в процессе работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В итоге проведенных исследований культуры НВ были выявлены ее свойства для соответствующей иденти(|икации и практического использования этого микроба, который был выделен из воздуха в 1950 г.

Практическое использование культуры НВ оказалось возможным в двух различных направлениях.

Первым из них является применение НВ (гладкого варианта) в качестве тест-микроба при определениях активности пяти различных препаратов-антибиотиков.

Такая возможность применения НВ была подтверждена в нескольких лабораториях ВНИИА (число только наших исследований 680), лабораториями других институтов и лабораториями заводов, производящих антибиотики для массового потребления.

Положительный результат испытаний культуры НВ в различных учреждениях см. стр. 211 приложений.

Тщательное исследование свойств НВ выявило ряд его индивидуальных особенностей, благодаря чему его следует сштать особым ттаммомйаС.муео1йев.

Одна из особенностей культуры НВ, например, в том,что иS "-вариант проявляет, несомненно, меньшую устойчивость против действия антибиотиков, чем " К ".

Так как в опытах по определению чувствительности и S и и " й н вариантов НВ изучалось влияние препаратов с различным механизмом действия, как пенициллин и биомицин, отличия между вариантами НВ могут быть вызваны различными причинами.

Имеет значение в таких случаях большее или меньшее число клеточных реактивных групп, степень адсорбционных способностей поверхности кяеток, характер их дыхания и многое другое.

Очень заметным показателем отличий между вариантами " 8 " и " В п послужил результат опытов с сыворотками, обработанными по Кастеллани,когда определилась специфичность получаемых антител, в соответствии с применением антигена " s " или " R " в процессе иммунизации кроликов.

Культуры НВ, полученные в "s "и "-форме,оказались закономерно дифференцированными к разным препаратам. В опытах 1 горизонтальной диффузии в агар высшую чувствительность к стрептомицину наблюдали у НВ " В- "-формы. Возможно,что это явление вызвано характером дыхания "В. "-варианта - строгого аэроба, растущего пленкой на поверхности жидкой среды и не дающего диффузного роста. Известно,что антимикробное действие стрептомицина наиболее активно при доступе кислорода воздуха.Поэтому есть основания предполагать,что чувствительность к нему микробов будет тем заметней,чем больше они нуждаются, для своего развития, в кислороде. Выраженная чувстштельность к стрептомицину " R "-формы НВ не противоречит этому положению. Привлекает внимание выявленная у "s "-варианта НВ биологическая активность, обладающая антимикробными свойствами.

Известно,что такого рода активность встречается у B&C.myeoides в " В "-форме.

Штамм НВ оказался активным в форме " s ",прояЕившёй одновременно и высокую чувствительность к нескольким антибиотическим препаратам.

Антимикробная активность " s "-формц нуждается в специальном длительном исследовании и явилась объектом нашего изучения в данной работе при идентификации выделенной нами культуры,когда потребовалась ее подробная характеристика.

Ориентировочные данные при извлечении активной фракции из культуральной жидкости, а далее из клеточной биомассы свидетельствуют об антимикробном действии этой фракции на грам-положительные микробы и ее невысокой токсичности для мышей.

Можно предполагать, что дальнейшая очистка и концентрация активного агента позволила бы поставить вопрос о проверке его активности и безвредности в более широких опытах.

Таким образом могли бы быть значительно расширены возможные пределы практического применения разнообразных свойств исходной культуры НВ, ее " S » и "В "-вариантов, изучение которых позволило сделать нижеследующие выводы.