NO-зависимый механизм активации синтеза стресс-белков и его роль в адаптации к гипоксии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.16, кандидат биологических наук Зенина, Татьяна Алексеевна

• Зенина, Татьяна Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зенина, Татьяна Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ Н8Р70 И N0 И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ИХ СИНТЕЗА (обзор литературы)

1.1. Биологическая роль стресс-белков и механизмы их активации

1.1.1. Биологическая роль стресс-белков

1.1.2. Механизмы транскрипции и стресс-индуцированной активации синтеза НБР70

1.1.3. Механизмы нейрогуморального контроля НЭР70

1.2. N0 - важный регулятор физиологических функций организма

1.2.1. Структура монооксидов азота

1.2.2. Характеристика изоформ ЫО-синтазы

1.2.3. Ферментативный механизм действия 1М0-синтазы

1.2.4. Регуляция активности ЫО-синтазы

1.2.5. Мишени действия N0

ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К

ГИПОКСИИ (обзор литературы)

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Эксперименты на животных

3.1.1. Методика теплового шока

3.1.2. Методика измерения продукции оксида азота в органах и тканях

3.1.3. Введение донора N0 (динитрозильного комплекса железа -ДНКЖ) животным

3.1.4. Введение ингибитора ЫО-синтазы (1Т-нитро-1_-аргинин - 1_-ЫЫА) животным

3.1.5. Методика приготовления и введения «ловушки» N0 - Ыа-ДЭТК (СбНюИЗгИа) при оценке ее влияния на устойчивость организма к острой гипоксии

3.1.6. Методика перфузии изолированного сердца

3.2. Методика экспериментов на культуре клеток

3.2.1. Методика теплового шока на культуре клеток

3.2.2. Методика проведения ауторадиографии с помощью метода «меченых» аминокислот

3.2.3. Методика введения донора N0 (динитрозильного комплекса железа -ДНКЖ) в культуру клеток

3.2.4. Методика измерения продукции N0 в культуре клеток

3.3. Электрофорез и иммуноблотинг

3.4. Методика адаптации к гипоксии

3.5. Методика создания острой гипоксии

3.6. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 4. АКТИВАЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В ОРГАНИЗМЕ СВЯЗАНА С УВЕЛИЧЕНИЕМ ПРОДУКЦИИ N0 (результаты и обсуждение)

4.1. Влияние теплового шока на продукцию N0 в органах животных

4.2. Влияние ингибитора ЫО-синтазы (ЬЫЫА) на индуцированный синтез НЭР70

4.3. Влияние донора N0 (ДНКЖ) на накопление НБР70 в органах крыс

4.4. Обсуждение

ГЛАВА 5. МО-ЗАВИСИМАЯ АКТИВАЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА РЕАЛИЗУЕТСЯ НА КЛЕТОЧНОМ

УРОВНЕ(результаты и обсуждение)

5.1. Влияние теплового шока на продукцию N0 в культуре гепатоцитов (Н35)

5.2. Влияние донора N0 (ДНКЖ) на накопление белков из семейства НБР в культуре клеток

5.3. Обсуждение

ГЛАВА 6. МО-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИГРАЮТ ВАЖНУЮ РОЛЬ В АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА К ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ (результаты и обсуждение)

6.1. Обоснование выбора модели адаптации

6.2. Изменение продукции N0 при острой гипоксии и адаптации к гипоксии

6.3. Влияние донора N0 и блокатора ЫО-синтазы на развитие защитных эффектов адаптации к гипоксии

6.4. Роль Н8Р70 в антигипоксическом эффекте адаптации к гипоксии

6.5. Влияние донора N0, «ловушки» N0 и блокатора ЫО-синтазы на устойчивость организма к острой гипоксии

6.6. Обсуждение

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «NO-зависимый механизм активации синтеза стресс-белков и его роль в адаптации к гипоксии»

ВВЕДЕНИЕ.

Известно, что гипоксия является основным патогенетическим звеном большинства легочных, сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний. Острая гипоксия может возникнуть также и у здоровых людей, например, у летчиков и космонавтов при разгерметизации корабля, у альпинистов на высоте более 7000 м, у рабочих в результате действия оксидов углерода или шахтного метанного газа и т.д. Во всех этих ситуациях именно кислородная недостаточность может стать непосредственной причиной гибели организма.

Для повышения устойчивости организма к недостатку кислорода широко применяется адаптация к периодической кратковременной гипоксии (20). Однако, механизмы антигипоксического эффекта такой адаптации до конца не изучены. Это ограничивает возможности для повышения эффективности адаптационной защиты от острой гипоксии.

Адаптация к гипоксии обеспечивается изменением физиологической регуляции практически всех основных систем организма и активацией внутриклеточных защитных механизмов. Поэтому очевидно, что важную роль в адаптации к гипоксии играют наиболее универсальные регуляторы физиологических функций и защитных систем организма.

По современным представлениям, одним из таких регуляторов является оксид азота (II) (N0) (80, 126). N0 является универсальным физиологическим мессенджером и вовлечен в функционирование иммунной, сердечно-сосудистой, нервной, пищеварительной систем и т.д. Показано, что при острой гипоксии и адаптации к периодической гипоксии в органах и тканях происходит изменение экспрессии генов, кодирующих ЫО-синтазу (117, 151) и сосудистых ЫО-зависимых реакций (14, 146). Однако, сведения о направленности таких изменений достаточно противоречивы. В пользу роли N0 в защитных эффектах адаптации к гипок-

сии косвенно свидетельствуют данные о том, что такая адаптация может, как замедлить развитие гипертензии (19, 35), так и предупредить острую гипотензию при инфаркте миокарда (15), которые связаны с нарушениями продукции N0 (5, 79). Вместе с тем вопрос о том, какие конкретные МО-зависимые механизмы лежат в основе защитного действия адаптации к гипоксии, до сих пор остается нерешенным.

Предполагается, что важную роль в защите клеток от повреждающих эффектов дефицита кислорода играют стресс-белки из семейства белков теплового шока Н8Р70. Действительно, показано, что исходно высокая продукция НвР70 у трансгенных животных (112) повышает устойчивость органов к гипоксическим повреждениям. Защитное действие Н8Р70 обусловлено связыванием избытка жирных кислот (86), повышением мощности антиоксидантных систем (145), дисагрегацией аномальных белок-белковых комплексов (173), связыванием кальмоду-лина (119) и соответственно ограничением повреждающих эффектов внутриклеточного избытка кальция.

В настоящее время не вызывает сомнения, что Н8Р70 представляют собой важную внутриклеточную систему защиты организма от различных повреждающих воздействий. Наиболее общепринятым способом активации синтеза Н8Р70 является тепловой шок (64). Доказано, что стресс-белки участвуют в повышении устойчивости организма к высоким температурам (106, 162), защите миокарда от ишемических и реперфу-зионных повреждений (62, 71), а также в развитии защитных эффектов адаптации к стрессу (27) и физическим нагрузкам (112).

Однако, несмотря на исключительно важное значение этих стресс-белков в защите организма, механизмы активации их синтеза до сих пор остаются до конца неизученными. Анализ литературы и большое количество экспериментальных данных о сочетанном изменении синтеза Н8Р70 и N0 (63, 112) позволяет выдвинуть гипотезу о том, что N0 мо-

жет быть вовлечен в активацию синтеза этих белков. Соответственно, можно предположить, что МО-зависимая активация Н8Р70 играет важную роль в антигипоксическом эффекте адаптации.

Актуальность данной работы определяется тем, что она расширяет существующие представления о регуляторных свойствах оксида азота и посвящена изучению его роли в регуляции внутриклеточных систем защиты и возможностей повышения устойчивости организма к острой гипоксии с помощью воздействия на системы генерации N0.

Цель настоящей работы состояла в проверке гипотезы о существовании МО-зависимого механизма активации синтеза Н8Р70 и роли этого механизма в формировании защитного эффекта адаптации к периодической гипоксии.

В рамках этой общей цели решались следующие конкретные задачи:

1) изучение продукции N0 при тепловом шоке и сопоставление изменений продукции N0 с накоплением Н8Р70 в условиях целого организма;

2) исследование действия блокатора МО-синтазы (!_-ММА - Мш-нитро-1_-аргинин) на индуцированное тепловым шоком накопление Н8Р70;

3) изучение влияния донора оксида азота (ДНКЖ - динитрозильного комплекса железа) на синтез Н8Р70 в условиях культуры клеток, изолированного сердца и целого организма;

4) изучение продукции N0 при тепловом шоке и сопоставление изменений продукции N0 с накоплением Н8Р70 в условиях культуры клеток;

5) определение изменения продукции оксида азота в органах при острой гипоксии и в динамике формирования адаптации к гипоксии;

6) оценка влияния блокатора МО-синтазы, "ловушки" N0 (ДЭТК - ди-этилдитиокарбамат) и донора оксида азота на устойчивость организма к острой гипоксии и формирование адаптации к периодической гипоксии;

7) определение изменения содержания НБР70 в органах в процессе формирования адаптации к гипоксии и оценка влияния Ь-ЫЫА на адаптационное накопление Н8Р70.

Работа выполнена в лаборатории генетических механизмов адаптации НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. Эксперименты на культуре клеток проведены на кафедре молекулярно-клеточной биологии Утрехтского университета (Утрехт, Голландия). Эксперименты по оценке продукции N0 с помощью ЭПР метода проводились совместно с лабораторией физхимии биополимеров РАН.

Научная новизна исследования определяется следующими его основными результатами:

Установлено, что тепловой шок приводит к транзиторному увеличению синтеза N0 в культуре клеткок и органах животных. При этом увеличение синтеза N0 предшествует активации синтеза Н8Р70.

Впервые установлено, что блокатор синтеза N0 ограничивает ин-дуцирванное тепловым шоком накопление Н8Р70

Впервые обнаружено, что донор N0 в отсутствии теплового шока, активирует синтез Н8Р70 в культуре клеток и изолированном сердце.

Показано, что острая гипоксия приводит к выраженной гиперпродукции N0 в головном мозгу.

Выяснилось, что однократное введение блокатора синтеза N0 или «ловушки» N0 увеличивают, а донора N0, напротив, снижает устойчивость организма к острой гипоксии.

Установленно, что адаптация к гипоксии приводит к снижению продукции N0 в разных органах и предупреждает гиперпродукцию N0 при острой гипоксии.

Продемонстрировано, что адаптация к гипоксии сопровождается накоплением Н8Р70 в головном мозгу и печени. Блокатор синтеза N0

предупреждал как накопление HSP70, так и развитие защитного антиги-поксического эффекта адаптации к гипоксии.

Теоретическое значение работы состоит в том, что показана важная роль оксида азота в активации синтеза стресс-белков и значение этого механизма в антигипоксическом эффекте адаптации к гипоксии. Таким образом, впервые продемонстрирована взаимосвязь между оксидом азота - ключевым физиологическим регулятором и одной из важных эндогенных систем организма - белками теплового шока.

Практическое значение работы определяется тем, что полученные результаты показывают возможность эффективного повышения устойчивости организма к острой гипоксии и управления процессом адаптации с помощью направленного воздействия на системы генерации N0. В перспективе это позволит разработать новые методы профилактики заболеваний, связанных с кислородной недостаточностью.

Положения выносимые на защиту :

1.Оксид азота активирует синтез белков теплового шока и таким образом регулирует активность одной из важных внутриклеточных систем защиты.

2.Повреждающее действие острой гипоксии связано с гиперпродукцией NO в мозге, и соответственно ограничение продукции NO с помощью однократного введения ингибитора NO-синтазы или «ловушки» N0 повышает устойчивость организма к недостатку кислорода.

3.NO-зависимая активация синтеза HSP70 играет важную роль в адаптационном повышении устойчивости организма к острой гипоксии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на 2-ой международной конференции "Гипоксия в медицине" (Москва, 1996 год), на международной конференции " Molecular mechanisms and pathophysiological consequences of damage in membranes and lipoproteins" (Австрия, 1996 год), на 2-ой международной конференции "Bio-

chemistry and molecular biology of nitric oxide" (США, 1996 год), на 5-ом всемирном конгрессе "International society for adaptive medicine" (США, 1997 год), на 3-ем международном симпозиуме "Free radicals in biology and medicine" (Болгария, 1997 год), на конференции молодых ученых 1996 года (ВГПУ, Владимир, 1997 год), на 8-ом международном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 1998 год), на 3-ем международном конгрессе по патофизиологии ( Лахти, Финляндия, 1998 год) и на межлабораторной конференции в Институте общей патологии и патофизиологии РАМН (Москва, 1998).

ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ HSP70 И N0 И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ИХ СИНТЕЗА.

1.1. Биологическая роль стресс-белков и механизмы их активации.

1.1.1. Биологическая роль стресс-белков.

Все известные организмы от простейших прокариотов, дрожжей, растений до высших эукариотов разнообразными способами реагируют на стрессорные воздействия окружающей среды. Вместе с тем характерной общей чертой клеточного ответа является быстрый синтез так называемых белков теплового шока (обозначаются аббревиатурой HSP от англ. heat shock protein) и снижение продукции большинства других клеточных пептидов (57, 64, 106, 169). Своим названием белки теплового шока обязаны тому случайному обстоятельству, что впервые они были обнаружены в клетках, подвергнутых острому тепловому воздейсвию (48, 147). В сущности, термин «белки теплового шока» неточен, так как еще в 1984 году Elwood и Craig (76) показали, что синтез этих белков стимулируется Холодовыми воздействиями. Поэтому этот класс пептидов в равной мере можно было бы назвать «белками холодового шока». Далее было показано, что синтез белков теплового шока увеличивается при разных стрессорных воздействиях: при обработке клеток арсенатом натрия или аналогом пролина (169), острой ишемии миокарда (122, 124), остром гипоксическом воздейсвии (67), аноксии (149). Показано также, что эти белки накапливаются в клетках сосудов, пораженных атеросклерозом (50), культуре нервных клеток, зараженных вирусом герпеса (98) и т.д. Поэтому более компромиссным обозначением для этих белков является название «стресс-белки». Хотя сейчас очевидно, что и этот термин не отражает всей сути клеточной роли данных пептидов, так как в целом ряде исследований было показано, что белки из этого класса с молекулярным весом около 70 кДа (HSP70) играют важную роль в фор-

мировании таких адаптивных реакций, как термотолерантность (57, 106, 107, 108, 162, 169), ранняя стадия компенсаторной гипертрофии миокарда (62, 71, 125, 140). Соответственно их можно было бы назвать «белками адаптации». Однако название «белки теплового шока» уже получило широкое распространение и, поэтому в дальнейшем будет использоваться именно этот термин.

В эволюционном отношении HSP являются высоко консервативными белками. Это свидетельствует о том, что они выполняют фундаментальные клеточные функции (50, 70, 85, 138, 148, 150, 162, 163). HSP70 присоединяются к другим белкам, вызывая их разворачивание и препятствуя их агрегации, которая помешала бы белку приобрести на-тивную конформацию, необходимую для его функциональной активности (34). Разворачивание белков с помощью HSP70 необходимо для их проникновения через мембрану хлоропластов, митохондрий и эндо-плазматического ретикулума.

Агрегация белков резко увеличивается при повышении температуры и других воздействиях. Активация синтеза HSP70 в этих условиях должна защищать клеточные белки от необратимого повреждения. Поскольку HSP70 влияют на конформационное состояние других белков, их относят к группе шаперонов (от англ. chaperon, обозначающего провожатого, наставника при молодой особе) (11,72). HSP70 способствуют прохождению синтезированных в цитоплазме предшественников белков через мембрану митохондрий, играя тем самым важную роль в митохон-дриальном биогенезе(11).

Самая большая гомология в аминокислотной последовательности HSP разных видов обнаружена в NH2- терминалях. Показано, что этот регион имеет АТФ-азную активность(59). Взаимодействие HSP с другими белками АТФ/АДФ зависимо: постулируется, что HSP в комплексе с АДФ удерживает на себе расплетенный белок, а замена АДФ на АТФ

приводит к освобождению этого белка из комплекса с HSP. Замена связанной с HSP АТФ на АДФ происходит за счет АТФ-азной активности HSP. Предполагается, что HSP совершают АТФ-зависимый цикл работы по протаскиванию белков через мембрану, в основе которого лежит изменение конформации HSP в зависимости от связи с АТФ или АДФ (34).

СООН-конец, напротив вариабелен и контролирует субстратную специфичность, т.е. узнавание определенных белков, с которыми связывается HSP (59, 106). Наличие АТФ-азной активности в NH2 - терми-нали и субстратной специфичности в вариабельной СООН - терминали и позволяет белкам теплового шока функционировать как АТФ - аза на множестве субстратов (59). Кроме того наличие неконсервативной -СООН -области определяет некоторое различие в функциях белков теплового шока в разных клетках у разных видов (51, 106).

В настоящее время обнаружены HSP с молекулярным весом 16, 22, 28, 32, 60, 72, 73, 80, 90, 100, 110 кДа. Важно отметить, что полипептиды, относящиеся к этим классам, присутствуют и в нестрессированных клетках и называются конституитивными. Они играют важную роль во многих клеточных процессах: в росте и дифференцировке (65, 75, 142, 161), свертывании белков и образовании олигомерных структур (138), АТФ-зависимом раскрывании клатрин-клеточных везикул (144), функционировании стероидных рецепторов и тирозиновых киназ (58, 89, 123, 145), процессах ДНК-репликации (74), переносе секреторных и орга-нельных белков через мембраны митохондрий, микросом и эндоплазма-тического ретикулума (60, 73, 137). Однако в соответствии с целями нашего исследования, основное внимание мы сосредоточим на HSP, синтез которых резко увеличивается при стрессе, т.е. на стресс-индуцибельной фракции белков теплового шока.

Для того, чтобы более строго определить эту фракцию белков, в отличие от конституитивных HSP, синтез которых при стрессе не увели-

чивается мы будем принимать во внимание определение Schlesinger (148): « Индуцибельные HSP - это белки, синтез которых стимулируется стрессом окружающей среды, а их гены содержат одну или более маркерных последовательностей heat shock consensus element (HSE), HSE для эукариотов является CT-GAA- - TTC-AG».

1.1.2. Механизмы транскрипции и стресс-индуцированной активации синтеза HSP70.

Вместе с пониманием ключевой роли HSP70 в процессах клеточной репарации и защите клеток от стрессорных повреждений возникла и одна из самых важных проблем: каковы механизмы стресс-опосредованной инициации синтеза HSP70.

К настоящему времени показано, что активация синтеза HSP может происходить по трансляционному механизму, т.е. за счет ускорения синтеза полипептидов на предшествующих м-РНК или по транскрипционному механизму, т.е. за счет синтеза новых м-РНК (116, 122, 133, 141, 159, 170).

Эти данные были получены в экспериментах McCanahon et al (117) и Viviano et al. (169),показавших, что после стрессорного повреждения ДНК или после теплового шока у Saccharomyces cerevisiae увеличение синтеза HSP происходит как за счет образования новых м-РНК, так и за счет активации синтеза полипептидной цепи на предшествующих м-РНК (116, 141, 170).

Исследования проведенные на млекопитающих с использованием Northen и Dot-Blot анализа(122), показали, что ишемия миокарда вызывает в сердце собаки и кролика увеличение содержание м-РНК, кодирующей HSP70 в 6 и 18 раз соответственно. Аналогичные данные о транскрипционной активации синтеза HSP70 получены в опытах in vitro на человеческих и крысиных фибробластах (56), подвергнутых теплово-

му шоку. Кроме того, на лейкоцитах человека было показано, что известный блокатор транскрипции акгиномицин-Д в концентрации 20 мкг / мл эффективно блокирует накопление HSP при тепловом шоке (69).

Совокупность этих данных позволяет предположить, что в клетках млекопитающих синтез HSP происходит главным образом за счет накопления новых м-РНК, т.е. по транскрипционному типу. Поэтому особый интерес представляет рассмотрение механизмов транскрипции HSP гена.

Как и все гены HSP70, ген содержит два основных участка: промо-торную область и кодирующую последовательность ( рис. 1).

ААТААА

TATA

I - ■ 1 . ORF ГГ -

ATG ТАА

Рис.1. РНК НЗР70-гена.Транслируемые области указаны открытыми, а нетранслируемые - закрашенными зонами. HSE - регуляторный элемент промотора, где происходит связывание факторов транскрипции; TATA -участок связывания РНК полимеразы; ORF - кодирующая последовательность; ААТААА - полиадениловый сайт.

Промотор содержит ТАТА-бокс и маркерную для HSP гена регуля-торную нуклеотидную последовательность, обозначаемую как heat shock consensus element (HSE): ТАТА-бокс - это область, богатая аденином и тимином, функция которой состоит в связывании РНК-полимеразы. Эта часть промотора является неспецифической и присутствует во всех известных генах. HSE - это специфический элемент промотора HSP гена,

состоящий из нескольких нуклеотидов: С- - GAA -TTG-G (101). Впервые он был описан Pelham (140) в 1982 г. HSE локализован на кодирующем тяже ДНК недалеко от ТАТА-бокса. Он необходим для стресс-опосредованной транскрипции HSP гена, так как именно с HSE связываются белковые факторы, активирующие транскрипцию при стрессе (156). В самое последнее время обнаружено, что промотор человеческого HSP70 гена содержит также и другие регуляторные последовательности, ответственные за активацию гена при действии солей тяжелых металлов, сывороточных факторов и белка аденовируса EIA (147).

HSP ген экспрессируется как первичный транскрипт (первичная м-РНК) (164), состоящий из 2241 нуклеотида и содержащий постоянную считываемую рамку - кодирующую часть - из 2025 нуклеотидов (94). Кодирующая область начинается с ATG-стартового кодона и заканчиватся стоп-кодоном-ТАА. Слева и справа от кодирующей части находятся ин-троны - нуклеотидные последовательности, которые не несут информации для синтеза полипептида и вырезаются при дальнейшей модификации м-РНК (147). Существенно, что м-РНК белков теплового шока содержит не более двух коротких интронов, в то время как для большинства м-РНК других клеточных белков количество интронов достигает 17 и более (40). Эта особенность чрезвычайно важна, так как не только свидетельствует об эволюционном консерватизме HSP гена, но и позволяет предположить, что на вырезание малого количества интронов тратится значительно меньше времени и энергии.

Регуляция транскрипции HSP гена связана по меньшей мере с двумя важными элементами: HSE и факторами транскрипции HSP гена (heat shock transkription factors, HSTF) (139, 158, 178).

Все известные HSP-гены разных видов содержат в промоторной области один или более HSE, функция которых, состоит в связывании HSTF. Как оказалось, активация транскрипции HSP гена сильно зависит

как от количества HSE в промотере, так и от расстояния между этим ре-гуляторным элементом и ТАТА-боксом. Так, Kay et al. (97) установили, что активность транскрипции HSP16 гена Caenorhabditis elegants с одной HSE в 10 раз меньше транскрипционной активности дикого гена, содержащего две HSE. Генная конструкция, содержащая четыре HSE, индуцировалась еще сильнее, чем дикий ген. Это само по себе наводило на мысль о том, что количество HSE является одним из параметров, детерминирующих силу промотора. Аналогичные данные были получены для HSP70 дрозофилы (45, 180).

Другим важным фактором регуляции транскрипции HSP генов являются HSTF-белковые факторы, активирующие транскрипцию. Основные характеристики HSTF описаны сравнительно недавно (154, 172, 179). Так, у дрозофилы их обнаружено два типа с молекулярным весом 70 и 110 кДа. У дрожжей, также есть два типа HSTF, но с молекулярным весом 70 и 150 кДа. У человека и мышей имеется по два HSTF, которые содержат 529 и 503 аминокислотных остатка соответственно ( данные для HSTF 2) (173). Сродство HSTF к HSE очень высоко, константа дис-

-12

социации составляет 4x10 М. Количество молекул HSTF в ядре очень мало и в зависимости от вида и внешних условий может варьировать от 2 до 4000 молекул на ядро. HSTF активирует синтез HSP гена дозозави-симым образом (46). Механизм вовлечения этих белковых факторов в активацию транскрипции до конца еще не ясен, однако ряд некоторых закономерностей уже известен.

На бактериях было показано (147), что HSTF является 8-субъединицей РНК-полимеразы. Основное функциональное значение HSTF заключается в том, что при стрессе они связываются с HSE, вызывая активацию РНК-полимеразы и соответственно транскрипцию HSP гена (158, 177). Впервые этот факт был установлен Wu (178) для HSP70 и HSP 83 генов с помощью метода картирования с экзонуклеазой 3. Да-

лее Parker и Topol (136) установили, что в HSP70 гене дрозофилы, содержащем три HSE, связывание HSTF с ними происходит последовательно: сначала белковый фактор транскрипции связывается с самым близким к ТАТА-боксу HSE, затем с более дистальным и т.д. Для человеческого HSP70 гена был также обнаружен белковый фактор транскрипции, который связывается с HSE в ответ на стресс, при этом количество HSTF в экстрактах стрессированных клеток может увеличиваться в 5-7 раз (96). Рисунок 2 иллюстрирует основную модель, объясняющую участие HSTF в активации транскрипции HSP-гена (174).

HSTF (неактивный)

Стресс / HSP

I HSP * (Защитный

HSE ДНК HSE

ДНК

Денат

HSP

Рис. 2. Схема взаимодействия между защитным белком HSP и HSTF (heat shock transcription factor).

Схема показывает активацию фактора транскрипции HSTF (74).

В отсутствии стресса HSP и связывающие белки HSTF встречаются в клетках в виде комплекса. Защитные белки HSP требуются в случае повреждения других белковых молекул в результате различных стрес-сорных воздействий. При этом происходит диссоциация комплекса HSP - HSTF, что является причиной высвобождения HSP и HSTF. После диссоциации комплекса HSP-HSTF HSTF легко проникает в клеточное ядро. Здесь происходит тримеризация HSTF. Этот тример присоединяется к промоторному участку (HSE) ДНК. Затем происходит фосфорилирова-ние HSTF, что обеспечивает высокую транскрипционную активность в ДНК. В результате процесса транскрипции осуществляется синтез м-РНК HSP. Таким образом «открывается» процесс синтеза новых HSP.

Молекулы HSP присоединяются к поврежденным (денатурированным) в результате стресса белкам. Далее комплекс HSP-денатурированный белок утилизируется в лизосомах и протеосомах, где происходит разрушение поврежденного белка.

Таким образом, процесс активации HSP связан с двумя основными стадиями : тримеризацией и фосфорилированием.

1.1.3. Механизмы нейрогуморального контроля синтеза HSP.

Большинство исследований по изучению экпрессии HSP70 генов и роли HSP70 в постстрессорном восстановлении структуры и функции клеток были выполнены in vitro на культурах клеток. На определенном этапе этот выбор был оправдан, так как имел ряд несомненных преимуществ, а именно: возможность строго стандартизировать или изменять условия внешней среды, проводить эксперименты на монокультурах клеток, вводить HSP непосредственно в клетки с помощью микроинъекций и т.д. Исследования in vitro весьма информативны, благодаря им было выдвинуто несколько предположений о механизме защитного эффекта этих белков; стал более ясен механизм транскрипции HSP70 ге-

нов, роль специфических последовательностей в промоторной зоне HSP генов и значение белковых факторов, связывающихся с этими участками.

Другое направление исследований состояло в том, что экспрессия HSP70 генов изучалась in vivo, т.е. когда стрессорным воздействиям подвергался весь организм в целом. Сравнительный анализ результатов, полученных при реализации этих двух подходов (in vitro и in vivo) наиболее последовательно был проведен в работах группы Holbrook (52, 53, 78). Данные такого изучения представлены ниже.

Минимальная температура, при которой начинается индукция HSP70 генов, в условиях in vivo ниже, чем in vitro (49, 52). Увеличение экспрессии HSP70 генов in vivo и накопление соответствующих м-РНК в отличие от in vitro может происходить уже при температуре 39°С, т.е. в условиях, когда денатурация белков, по-видимому, еще не происходит и этот фактор не может играть роли в активации синтеза HSP70.

Второй факт, заслуживающий внимания, состоит в том, что в условиях in vivo в отличие от in vitro в клетках исходно до каких-либо стрес-сорных воздействий присутствуют в небольших количествах м-РНК ин-дуцибельных HSP70. Для того, чтобы проанализировать это различие необходимо учитывать данные исследований Gibbs (82) и Blake et al.(52), в которых было установлено, что при действии на организм животных высокой температуры происходит выброс в кровь нескольких стресс-гормонов, включая адреналин, норадреналин, адренокортико-тропные гормоны и пролактин. Эти данные позволяют предположить участие нейрогуморальных факторов в активации синтеза HSP70 и соответственно понять, почему in vivo исходно в клетках обнаруживаются м-РНК, a in vitro, где влияние гормонов и нейротрансмиттеров отсутствует, нет в клетках и индуцибельных HSP70.

Предположение о физиологическом нейрогуморальном контроле активности генов, кодирующих белки теплового шока стало еще более убедительным после экспериментов Moalic et al. (125), в которых установлено, что агонисты Са2+-мобилизующих рецепторов при нормальной температуре приводят к активации синтеза и накоплению в клетках индуцибельных HSP.

Известно, что при стрессорном воздействии возникает активация высших вегетативных центров, детерминирующих стрессорную реакцию, которая приводит к многократному увеличению действующей на органы-мишени концентрации катехоламинов и кортикостероидов (18, 22). В результате возникает по меньшей мере три цепи явлений, конечным звеном которых может быть увеличение содержания клеточных HSP.

Во-первых, известно, что активация Са2+-мобилизующих рецепторов и связанное с этим увеличение концентрации диацилглицеридов через активацию протеинкиназы С и изменение внутриклеточного рН приводит к активации генов (132, 143). Moalic et al. на изолированных сердцах крысы показали, что введение а-агониста фенилэфрина вызывало быстрое транзиторное накопление м-РНК HSP70 как в желудочках, так и в аорте (125).

Таким образом, стресс-индуцированная инициация синтеза белков теплового шока может быть связана с активацией Са2+-мобилизующих рецепторов.

Во-вторых, активация p-адренорецепторов и последующее увеличение концентрации цАМФ и Са2+ в клетке приводит к активации соответствующих протеинкиназ. Показано, что одной из внутриклеточных мишеней этих протеинкиназ является фактор транскрипции гена белков теплового шока (158). Следовательно, результатом активации (3-адренорецепторов при стрессе может стать индукция генов теплового шока и накопление HSP70.

И, наконец, в-третьих, стероидные гормоны, проникая в цитоплазму, связываются там со своим рецептором. Активированный таким образом рецептор приобретает высокое сродство к ДНК и связывается с генетической матрицей. Результатом такого взаимодействия является продукция специфических белков, которые влияют на рост и дифферен-цировку клетки (89, 123, 162). Как показали Kasambalides и Lanks (96), одним из таких белков является HSP68. Они установили, что синтетический глюкокортикоид дексаметазон снимает супрессию с гена HSP68 и таким образом вызывает увеличение синтеза этого белка.

Несмотря на то, что HSP70 являются эволюционно высококонсервативными белками, а белки, выделенные из разных органов одного и того же организма, вообще не отличаются по аминокислотному составу друг от друга, механизмы стрессорной активации синтеза белков теплового шока характеризуется высокой тканевой специфичностью. Так, в исследованиях in vivo установлено (52), что в мозге, легких и коже крыс индукция HSP70 зависит от продолжительности и температуры теплового шока, а в печени синтез HSP70 м-РНК не связан прямо с продолжительностью и температурой теплового шока. Кроме того, максимальный синтез м-РНК HSP70 в мозге, коже и легких наблюдается примерно через 1 ч. после теплового шока, а в печени через 6. При этом количественно наиболее интенсивное накопление м-РНК HSP70 происходило в мозге и легких, а в печени и коже было в несколько раз меньше (52). В исследованиях in vitro тканевые особенности в экспрессии HSP70 генов сохранялись (78).

В чем причина тканеспецифичности и стресс-активации синтеза HSP70 ? Ясно, что определенную роль в этом могут играть различия в кровоснабжении и иннервации разных органов. Вместе с тем сохранение различий в экспрессии HSP70 генов в культурах клеток, выделенных из этих органов, позволяет заключить, что тканевая специфичность в

стресс-активации этих генов может определяться не только нейрогумо-ральными факторами, но и клеточными механизмами, а именно: различием в рецепторном составе, концентрации ферментов и т.д.

Механизмы транскрипции Н8Р70 генов и нейрогуморального контроля синтеза НЭР70 при стрессе в дальнейшем будут дополнены и уточнены. Однако уже сейчас можно сформулировать несколько основных положений.

1. Ключевую роль в транскрипции НвР гена играет уникальный ре-гуляторный элемент - НБЕ. Активация гена прямо связана с количеством НЭЕ и его локализацией в промоторной области: чем больше количество НЭЕ и чем ближе они к ТАТА-боксу, тем сильнее будет экспрессиро-ваться НЭР-ген при стрессорном воздействии.

2. Другое важное звено регуляции транскрипции НБР гена связано с НБТЯ, который является 8-субъединицей РНК-полимеразы, обладающей очень высоким сродством к НБЕ. Взаимодействие НЭЕ с НБТР приводит к дозозависимому увеличению экспрессии НЭР гена.

3. Инициирование синтеза НЭР происходит после тримеризации фактора транскрипции (НвТР), его присоединения к промоторной части ДНК, фосфорилирования для обеспечения высокой транскрипционной активности. Таким образом происходит индукция синтеза НБР м-РНК.

4. В условиях целого организма инициация синтеза НЭР при стрессе связана с активацией по меньшей мере трех рецепторных систем :Са2+-мобилизующих и (3-адренорецепторов и рецепторов стероидных гормонов (68).

5. Механизмы стресс-индуцированной активации синтеза белков теплового шока являются тканеспецифичными. Вероятно, это связано с различием в нейрогуморальной регуляции разных органов и может также зависеть от клеточных механизмов.

Анализ литературы и большое количество экспериментальных данных позволяют сделать вывод о сочетанном изменении синтеза HSP70 и оксида азота (N0). Так показано, что липополиасхариды (классические индукторы синтеза N0) активируют и синтез HSP70 (113). Тепловой шок, при котором возрастает синтез HSP70, сопровождается увеличением содержания нитрозогема (комплекс NO - гем) в крови (134). Далее, в экспериментах показано, что при адаптации организма к стрессу значительно активируется синтез HSP70 в органах (112) и усиливается образование N0 в тех же органах (111). Это позволило нам выдвинуть гипотезу о том, что оксид азота вовлечен в активацию синтеза белков теплового шока. Однако, прежде чем перейти к обсуждению данного вопроса, необходимо сказать о том, что представляет собой молекула N0, как она синтезируется и каким образом действует в организме.

1.2. N0 - важный регулятор физиологических функций организма.

До 1981 года биосинтез оксида азота (N0) - восстановительный (нитрификация) или окислительный (динитрификация) изучался только у микроорганизмов. В 1981 году Tannenbaum (83, 84) и Witter et al. (176) с помощью метода стабильных изотопов (16N) показали, что у млекопитающих оксиды азота входят в состав многочисленных метаболитов. В 1985 году Steueher и Marietta (158) показали, что активация макрофагов in vitro с помощью липополисахаридов увеличивает активность фермента NO-синтазы и продукцию нитратов и нитритов. Последующее изучение этого процесса показало, что нитриты и нитраты в макрофагах образуются в результате ферментативного окисления азота гуанидиновой группы L-аргинина и, что продуктом является N0 и цитруллин (127).

В дальнейшем было показано, что N0 принадлежит ключевая роль в регуляции кровяного давления, нейротрансмиссии и механизмах клеточной защиты (84). После первых исследований Furchgott (80) был ин-

дентифицирован эндотелий-зависимый фактор расслабления (ЕйРР) кровеносных сосудов, который высвобождается из стимулированных эн-дотелиальных клеток и вызывает расслабление гладких мышц. В 19871988 году было показано, что функции ЕРРР выполняет N0 (92). Кроме того было доказано, что N0 выделяется при воспалении и обеспечивает цитотоксическое действие макрофагов (87, 135, 181). В пищеварительной системе N0, действуя как вторичный мессенджер, регулирует моторику желудочно-кишечного тракта (55). В центральной и периферической нервных системах N0 участвует в синаптической передаче нервного импульса. При этом функции N0 оказались тесно связанными с ней-ромедиатором глутаматом и вторичными мессенджерами сОМР и Са2+ (37).

Таким образом, вышеизложенные факты позволяют сделать вывод о том, что оксид азота играет важную роль в осуществлении нормальных функций многих систем организма.

1.2.1. Структура монооксидов азота.

Нейтральный оксид азота (N0 ) - это липофильный парамагнитный газ, «время жизни» которого составляет около 10 с. Он имеет один не-спаренный электрон на 2р-л разрыхляющей орбитали (:Ы=0:). Было показано, что N0' свободно диффундирует в водной среде и сквозь клеточные мембраны (93). Наиболее важными его реакциями являются взаимодействие с кислородом в большинстве окислительно-восстановительных процессов и с ионами переходных металлов (157).

Кроме того, он способен реагировать с другими свободными радикалами. В этом радикальном состоянии оксид азота вступает в реакцию с металлопротеинами: 1) Ре-Э-белки; 2) белки, вовлеченные в митохон-дриальный транспорт электронов; 3) аконитаза и т.д.

Потеря электрона приводит к образованию ЫО+ и, наоборот, присоединение одного электрона к нейтральному оксиду азота на п-

орбиталь дает N0".

Некоторые свойства монооксидов азота представлены в таблице 1. Таблица 1. Свойства монооксидов азота.

Электронное состояние Степень окисления Длина связи (А )

Ион нитрозония N0+ 3+ 0,95

Оксид азота N0 2+ 1,15

Нитроксил анион N0" 1 + 1,26

1.2.2 Характеристика изоформ NO-синтазы.

Семейство NO-синтаз можно разделить на 2 основные группы: конституитивные (NOS-I, III), которые активируются Са2+/СаМ-комплексом, и индуцибельную (NOS-II), активность которой возрастает за счет увеличения экспрессии соответствующего гена (таблица 2).

Впервые NOS-I и NOS-III были описаны соответственно в нейронах и эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, и поэтому их обозначили как нейрональную и эндотелиальную NOS. NOS-II была выделена из макрофагов мыши (134), стимулированных у-интерфероном (IFNy) (96) и липополисахаридами (LPS) (102), поэтому ее называют еще мак-рофагальным типом NOS.

Фундаментальные различия между изоформами касаются их активности in situ. Конституитивные NOS активируются очень быстро (от 5с до1ч) и дают небольшое количество N0, который играет регулятор-ную роль. NO, синтезированный NOS-I ведет, себя как нейромедиатор, в то время как оксид азота, продуцированный NOS-III, действует как EDRF

(129), регулирует агрегацию тромбоцитов , и предотвращающий адгезию лейкоцитов (175).

Са2+-независимый, СаМ-содержащий фермент синтезируется за достаточно длительный период времени (от 1ч до 1 дня). N0, синтезированный этим энзимом, выполняет физиологические функции в качестве антибактериального, антипаразитического, антиопухолевого и антивирусного агента (81, 131). N0 также вовлечен в апоптоз, иммуносу-прессию и образование канцерогенных нитрозоаминов (37).

Таблица 2. Сходства и различия между тремя основными классами N0-

синтаз.

Эндотелиальная конституитивная (тип III) Нейрональная Конституитивная (тип 1) Индуцибельная (тип II)

133 кДа 161 кДа 131 кДа

NADPH-зависимая гемопротеин Р-450 типа ингибируется аналогами L-аргинина ЫАОРН-зависимая Гемопротеин Р-450 типа ингибируется аналогами 1_-аргинина NADPH-зависимая Гемопротеин Р-450 типа Ингибируется аналогами L-аргинина

Са 2+/ кальмодулин-зависимая Са2+/ кальмодулин-зависимая Са^+-независимая Кал ьмодул и н-субъед и н ица

реагирует на ацетилхолин, брадикинин, глутамат и т.д. реагирует на ацетилхолин, брадикинин, глутамат и т.д. Индуцируется Эндотоксинами (LPS, BCG) или цитокинами (IFN y.TNFa, IL-1)

Ответственна за EDRF-эффект в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, тромбоцитах Открыта в цнс, Периферической нервной системе, аст-роцитах, Скелетных мышцах Открыта в печени, легких, аорте, перитониальных макрофагах, гепатоцитах, остеокластах, Т-лимфоцитах, Фибробластах, раковых клетках

NOS-I (конституитивная нейрональная изоформа) имеет молекулярную массу 161 кДа, NOS-III (конституитивная эндотелиальная изоформа) - 133 кДа, NOS-II (индуцибельная) - 131кДа. NOS-III человека и

быка гомологичны на 93%, NOS-II макрофагов мыши и гепатоцитов человека на 80%. На С-терминальном конце обнаружены консенсус-последовательности для связывания NADPH, FAD и FMN (55). Этот С-терминальный домен имеет большое сходство с P-450-редуктазой млекопитающих (131). N-терминальный конец содержит участки связывания для кальмодулина между редуктазным и оксигеназным доменами. N-терминальная часть полипептидной цепи также содержит участки фос-фолирлирования треонина и серина и сайты для связывания гема (82). Участки связывания для ВН4 и L-аргинина определены еще не достаточно точно. N-терминальный конец NOS-III несет участки меристоилирова-ния, которые могут объяснить взаимодействие с мембраной (55).

1.2.3 Ферментативный механизм действия NO-синтазы.

Механизм синтеза N0 состоит из 2-х «шагов» (рис. 3).

HsN^^^^^^^ К|Н3+ Рисунок 3.

"02С N L-аргинин

1NADP* О

I Н NH

I о2

+ !

H3N

NHOH

Н

0,5NADPH i 02

+ NO

Н

L-цитруллин

Схема (рис. 3) демонстрирует превращение аргинина в цитрулин с образованием N0. С использованием изотопов 1802 было показано, что атом кислорода вовлекается в образование NO и L-цитруллина из молекулярного 02, а не из воды (55).

Первый «шаг» реакции представляет собой классическое Р-450-зависимое N-гидроксилирование, которое приводит к образованию N®-гидрокси-1_-аргинина (NOHA) (37). В этом процессе потребляется 1 моль кислорода и 1 моль NADPH, и образуется 1моль воды.

Второй «шаг» включает окислительное расщепление С=1ЧОН-связи промежуточного продукта NOHA и образование N0 и L-цитруллина. Для этого трехэлектронного окисления требуется 2 моль кислорода и 0,5 моль NADPH. Механизм реакции пока еще остается до конца не выясненным, но предполагается, что образуются промежуточные пироксо-соединения железа NOS-Fe-O-O, которые генерируются в Р-450-редокс-цикпе (55).

1.2.4 Регуляция активности NO-синтазы.

Регуляция активности NOS может осуществляться на различных уровнях: кофакторами (флавины, ВН4, Са2+/СаМ и гем) и на посттранскрипционной стадии (фосфорилирование), а также непосредственно регулироваться уровнем содержания продуктов и субстратов. Наконец, активность энзима может регулироваться на транскрипционном уровне.

Активные формы NOS представляют собой димер. Steuehr et al. (158) показали, что 2 мономера, содержащих СаМ, FAD и FMN взаимодействуют с двумя молекулами гема и тетрагидробиоптерина и образуют активный димер (102). Тетрагидробиоптерин вовлечен в образование и стабилизацию активной NOS.

Кальмодулин, по-видимому, регулирует поток электронов от NADPH к гему и может действовать как «электрический выключатель»

между редуктазным и оксигеназным доменами (55). NOS-I и NOS-III обратимо связывают СаМ Са2+-зависимым способом, и, следовательно, они чувствительны к действию агонистов, которые увеличивают внутриклеточную концентрацию Са2+. NOS-II, наоборот, прочно связывает СаМ и не чувствительна к изменению концентрации Са2+ (171).

Электронный поток (с потреблением NADPH) остается таким же высоким и в отсутствии субстрата аргинина, и в этом случае NOS I и III проявляет NADPH-оксидазную активность (образуется 02 "), которая регулируется концентрацией Са2+.

СаМ можно считать постоянно связанной субъединицей NOS-II (102). В этом случае в отсутствии аргинина наблюдается очень низкий электронный поток (низкое потребление NADPH), которое приводит к небольшой продукции 02".

Все изоформы NOS могут блокироваться ингибиторами флавопро-теинов (55). Конституитивные NOS могут быть заингибированы антагонистами кальмодулина.

Фосфорилирование конституитивных NOS по аминокислотным остаткам серина или треонина может служить негативным регулятором активности данных ферментов.

Исследования показывают, что большинство аналогов аргинина являются изоформ-специфичными ингибиторами NOS. Первым из таких соединений был исследован ^-монометил-Ьаргинин (NMMA). Он является хорошим ингибитором для всех изоформ NOS, в то время как N®-нитро-Ьаргинин (LNNA) относительно избирателен для конституитивных изоформ. В последнее время синтетическим путем созданы новые аналоги аргинина - тиоцитруллин и S-алкил-изоцитруллин, имеющие в своем составе атом серы. Данные соединения и LNNA ингибируют перенос электронов от флавинов к гему.

Кроме аминокислотных ингибиторов имеются соединения другого происхождения, которые могут блокировать активность NOS (например, аминогуанидин, S-этил-изомочевина и т.д.) (63). Кроме того, ингибитором конституитивных (13) и индуцибельной NOS (93) может выступать сам N0.

NOS-III (эндотелиальная) в промоторной части содержит консенсус-последовательности для связывания эстрогенов, поэтому экспрессия гена NOS-III может возрастать при действии эстрадиола (129).

У мышей и грызунов наиболее сильными сигналами для усиления транскрипции являются цитокины: интерферон-у, tumor necrosis factor-a, интерлейкин-1, интерлейкин-2 (54) и молекулы «бактериального» происхождения: липополисахариды, фосфотидилинозитолманнозид (161) и токсины, вызывающие синдром токсического шока (182). Индукция данных ферментов ингибируется другими цитокинами, такими как: интер-лейкин-4 (52, 55), интерлейкин-10 (133), интерлейкин-8 в нейтрофилах (115), гликокортикоиды , простагландин Е2 (114).

1.2.5. Мишени действия N0.

Оксид азота может взаимодействовать с большинством макромолекул, включая белки.

N0 активирует гуанилатциклазу (GC) путем связывания с железом гема. В результате этого образуется нитрозогем - энзимный комплекс, представляющий собой активированное состояние GC (66). Это взаимодействие изменяет конформацию фермента, вызывая немедленное и глубокое усиление каталитической активности, приводящее к 50 - 200 -кратному увеличению скорости превращения магний-гуанозин-б7-трифосфата (Mg-GTP) в гуанозин -3', 51 - монофосфат (cGMP), который играет роль вторичного мессенджера.

NO может связывать негемовое железо (Fe) большинства ферментов, таких как NADH-убихинон-оксидоредуктаза, NADH-сукцинатредуктаза и цис-аконитаза. Возможно, что ингибирование цис-аконитазы осуществляется не самим оксидом азота, а скорее всего взаимодействием фермента с пироксинитритами (ONOO "). Известно, что N0 инактивирует Fe - S - кластеры энзимов, подобно взаимодействию с ферментом цикла лимонной кислоты - цис-аконитазой. N0 способен присоединяться к железу ферритина, что может стать причиной пе-рекисного окисления липидов (55).

Оксид азота подобно другим свободным радикалам может повреждать ДНК в процессе дезаминирования. Эти повреждения стимулируют активность фермента поли - (ADP-рибозо) - синтазы (PARS). PARS - это ядерный энзим, который утилизирует NAD в качестве субстрата для осуществления катализа процесса присоединения 50 - 100 единиц ADP -рибозы к ядерным белкам, таким как гистоны (175).

Кроме того, оксид азота связывается с негемовым железом рибо-нуклеотидредуктазы, взаимодействует с остатками тирозина, сульфгид-рильными остатками данного фермента и ингибирует синтез ДНК (55). Такая легкость связывания N0 с железом оказывает влияние на метаболизм Fe.

Оксид азота может стимулировать S - нитрозилирование свободных SH - групп цистеина большинства белков и таким образом их инак-тивировать (168). N0 способствует присоединению NAD к глицеральде-гид-3-фосфат-дегидрогеназе, что приводит к мощной депрессии процесса гликолиза(37).

Кроме того, оксид азота способен индуцировать высвобождение ионов Zn2+ из Zn-S-кпастеров белков через S-нитрозилирование с последующим образованием дисульфидных связей и таким образом спо-

собствовать потере ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора «цинк-фингер» типа.

N0 также ингибирует Zn^-содержащую алкоголь-дегидрогеназу, индуцируя высвобождение ионов Zn2+ из белка.

В нейронах оксид азота блокирует посттранскрипционное соединение длинноцепочечных жирных кислот с цистеином тиолов во множестве белков. Нитрозилирование остатков цистеина внутри а-субъединицы G0-белков, которые являются мишенью токсинов коклюша, может оказывать влияние на функционирование G-белков, соединяющих синаптиче-ские Са2+ и К^-каналы (102).

В настоящее время известно, что оксид азота (NO) участвует в регуляции внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в организме млекопитающих . Один из механизмов регуляции связан с активацией синтеза N0, увеличением внутриклеточной концентрации cGMP и активацией через систему G-киназ Са2+-насосов эндоплазматического ретикулума. Другим механизмом может быть регуляция высвобождения Са2+ из пула этих ионов, не чувствительного к lnsP3 (инозитол-3-фосфату), но чувствительного к самим ионам Са2+ и ADP-рибозилтрансферазы (ADPR). Активация ADPR при участии N0 также может влиять на высвобождение ионов Са2+ из этого пула (37).

Реакция N0 с супероксидным анионом (02 ~), еще одним продуктом активированных макрофагов, приводит к образованию пироксинитритов, которые опосредуют оксидативные повреждения (157).

Кроме того, в последнее время показано, что обработка гладко-мышечных клеток сосудов донорами N0 (химические соединения, способные высвобождать оксид азота), стимулирование интерлейкином-p и tumor necrorsis factor-a, которые в свою очередь стимулируют синтез N0, приводит к увеличению содержания в данных клетках м-РНК гемоксиге-назы-1 (HSP32) и самого фермента (77). Вероятно, что NO-зависимая

активация Н8Р32 представляет лишь частный случай более общей проблемы ЫО-зависимой активации синтеза стресс белков. В данном диссертационном исследовании мы проверили эту гипотезу в отношении синтеза НЭР70 и других членов семейства НЭР при стрессорных воздействиях и адаптации к гипоксии.

ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К ГИПОКСИИ.

В биологии под адаптацией понимают процесс приспособления организма к внешней среде или к изменениям, совершающимся в самом организме. Выделяют 2 типа адаптации: генотипическую, в результате которой на основе наследственной изменчивости, мутаций и естественного отбора сформировались современные виды животных и растений, и фенотипическую - процесс, в результате которого организм приобретает отсутствовавшую ранее устойчивость к определенному фактору внешней среды и таким образом получает возможность жить в условиях, ранее не совместимых с жизнью.

В развитии индивидуальной адаптации прослеживается 2 основных этапа: срочный и долговременный. Срочная и долговременная адаптация являются последовательными этапами одного и того же процесса - адаптационного повышения устойчивости организма к повреждающим факторам (13). Тем не менее, эти этапы вовлекают разные механизмы и имеют различную биологическую значимость.

Срочная адаптация обеспечивается предшествующими механизмами. На этом этапе происходит активация стресс-лимитирующих систем, мобилизация энергетических и структурных ресурсов (38) и их направленная передача в функциональную систему, осуществляющую адаптационную реакцию, быстрые изменения активности основных ли-пидзависимых мембранных белков, ферментов, рецепторов и каналов ионного транспорта, увеличения синтеза вторичных мессенджеров и активация клеточного метаболизма (13).

Вслед за мобилизацией этих механизмов реализуется фаза активации генов, которая играет ключевую роль в переходе от срочного этапа адаптации к долговременному.

В ходе адаптации происходит последовательная координированная активация вначале ранних регуляторных генов, кодирующая прото-онкогены и стресс-белки Н8Р70, а затем поздних структурных генов, кодирующих структурные белки, такие как миозин, Са2+АТФ-аза, антиокси-дантные ферменты (39, 41) и т.д.

Активация ранних генов и увеличение синтеза НЭР70 и протоон-когенов является неспецифическим звеном адаптации, так как происходит при адаптации к разным факторам (18).

В отношении Н8Р70 показано, что они вовлечены в три наиболее важных неспецифических механизма генетического обеспечения адаптации и ее защитных эффектов (28).

Первый механизм такого рода состоит в том, что Н8Р70 могут действовать как ядерные сигналы в активации экспрессии поздних структурных генов. Второй механизм связан с участием НБР70 в регуляции свертывания и внутриклеточного транспорта вновь синтезированных белков (13). Это особенно важно в условиях значительного усиления синтеза белков в процессе адаптации. Третий механизм связан с защитными свойствами самих Н8Р70. Они могут ограничивать стрессорные повреждения за счет дезагрегации аномальных белковых агрегатов, участия в утилизации поврежденных белков (28) и увеличения мощности антиоксидантных систем (125).

Последующая активация поздних структурных генов является специфической, так как активируются гены, которые могут обеспечить адаптацию к конкретному фактору. Например, при адаптации к гипоксии активируются гены, кодирующие белки, вовлеченные в транспорт кислорода, рост коронарных сосудов и эритропоэз (18, 22, 99) и т.д.

Активация генетического аппарата в процессе адаптации обеспечивает более высокий уровень активности стресс-лимитирующих систем. Это постепенно приводит к практически полному угасанию стресс-

реакции в ответ на очередное действие фактора среды в адаптированном организме (13). Именно это состояние отличает долговременную адаптацию от срочной.

В качестве адаптирующих могут использоваться различные факторы. В данной работе использовалась адаптация к гипоксии. Прежде, чем приступить к описанию особенностей адаптации к гипоксии необходимо дать определение понятия «гипоксия»

В течение многих лет термин «аноксия» использовался для обозначения состояния кислородного голодания организма. Он происходит от греческих слов (ан - лишение, оксиген - кислород и емия - кровь). Однако есть условия, при которых организм испытывает кислородное голодание без недостатка содержания кислорода в крови.

Наиболее удачным термином является «гипоксия». Он также происходит от греческих слов (гипо - под или суб и оксиген - кислород) и обозначает недостаточное количество кислорода.

Согласно последней и наиболее полной классификации выделяют следующие виды гипоксии (4):

1) гипоксическая гипоксия (гипоксемия), при которой отмечается недостаточное содержание кислорода в артериальной крови;

2) анемическая гипоксия (гемическая гипоксия), в случае которой напряжение кислорода в артериальной крови нормальное, но имеет место недостаток гемоглобина;

3) застойная гипоксия (циркуляторная гипоксия) - имеется достаточное количество кислорода в артериальной крови при нормальном его напряжении, но он не поступает к тканям в достаточном количестве;

4) гистотоксическая гипоксия, при которой клетки тканей отравлены и поэтому не в состоянии в полной мере использовать кислород. В настоящее время этот тип гипоксии определяют как тканевой или био-энергитический и понимают под ним не только не только поавление

ядами окислительной способности дыхательной цепи, но и ее инактивацию под влиянием эндогенных факторов. Термин биоэнергитиче-ской гипоксии раскрывает механизм происхождения тканевой гипоксии, связанный с представлением о том: что в терминальной стадии гипоксии цитохромоксидаза лимитирует энергосинтезирующую функцию митохондрий в условиях кислородной недостаточности (12);

5) острая гипоксия, которую можно разделить на тяжелую, острую и умеренную, или медленно нарастающую. Первая форма - очень быстро возникающий вид гипоксии, которая может быть вызвана вдыханием таких инертных газов, как азот, метан или гелий. При умеренно острой гипоксии симптомы кислородного голодания возникают не так быстро. В экспериментальных условиях эту форму гипоксии можно вызвать несколькими способами: а) помещая исследуемого в барокамеру, откуда выкачан воздух; б) с помощью ререспиратора; в) при вдыхании испытуемым смеси кислорода с инертным газом;

6) хроническая гипоксия, симптомы которой возникают после длительного пребывания в горах или под влиянием неоднократного пребывания в условиях недостаточного снабжения кислородом.

Важной особенностью реакции организма на гипоксическое воздействие является их высокая индивидуальность. Это определяется генетическими и фенотипическими свойствами организма: характером его метаболизма, степенью совершенства регуляторных механизмов, их способностью перестраиваться в гипоксических условиях в целях сохранения жизнеспособности особи. Индивидуальные особенности реакции организма на гипоксию играют существенную роль в развитии, течении и исходе возникающего при этом патологического состояния. При этом индивидуальные различия в реакции на гипоксию, оцениваемые по изменениям их функциональной активности, сохраняются на тканевом и клеточном уровнях (10, 11, 14, 46).

Адаптацию к гипоксии изучают уже несколько десятков лет, однако процесс этот во многом остается не совсем ясен.

Для понимания многообразных защитных эффектов адаптации решающее значение имеет концепция об архитектуре системного структурного следа (19, 20, 22, 120).

Схема на рис. 4 характеризует пять основных компонентов системного структурного следа адаптации к гипоксии и ее главные защитные эффекты.

На схеме показано, что первый компонент системного структурного следа формируется в системе захвата и транспорта кислорода, которая отвечает гиперфункцией на его дефицит в окружающей среде. В первые дни после начала действия гипоксии формирование системного структурного следа проявляется активацией синтеза РНК и белка в легких (3), сердце (25), костном мозге (2), сосудах коронарного русла (21), а также в симпатических нейронах, иннервирующих сердце (36).

Итогом такой активации является рост органов, ответственных за захват и транспорт кислорода, а именно увеличение массы легких, их дыхательной поверхности и количества альвеол (1, 17), умеренная гипертрофия и увеличение функциональных возможностей сердца (91, 120), увеличение в 1,5 - 2 раза емкости коронарного русла (88, 128), по-лицетемия и увеличение кислородной емкости крови (95, 129, 131).

Одновременно происходит возрастание мощности системы энергообеспечения на уровне клеток сердца и других органов, что проявляется в увеличении количества митохондрий и активности ферментов гликолиза. Параллельно развиваются изменения нервной регуляции сердца: наблюдается гипертрофия симпатических нейронов звездчатых узлов, увеличение содержания норадреналина в надпочечниках при одновременном сбалансированном увеличении активности фосфодиэсте-разы в сердце (21, 28). Эти изменения увеличивают мощность и эконо-

Компоненты системного структурного следа Защитные эффекты

Рис. 4. Основные компоненты системного структурного следа и защитные эффекты адаптации к гипоксии.

мизируют функцию аппарата дыхания и кровообращения, а в месте с тем его возможность адренергической мобилизации. Они повышают резистентность не только к самой гипоксии, но и обладает хорошо известным экспериментально доказанным перекрестным эффектом, а именно повышает резистентность организма к физической нагрузке и потенции-руют развитие тренированности к этому фактору (21).

Второй компонент системного структурного следа при адаптации к периодической гипоксии реализуется на уровне нейроэндокринной и клеточной регуляции.

*

Это выражается в активации синтеза белка и рибонуклеиновых кислот в головном мозге. В больших полушариях этот процесс достигает наибольшей выраженности в коре головного мозга, где концентрация РНК увеличена на 50%, а синтез белка, оцениваемый по включению меченых аминокислот - в 2 раза. В нижележащих отделах мозга, менее чувствительных к дефициту кислорода, активация выражена существенно меньше, а в области вегетативных центров продолговатого мозга вновь оказывается значительной (26). При этом в пирамидных нейронах коры цитологически определяется значительное увеличение диаметра клеточных ядер, а в глиальных клетках - уменьшение этого параметра, т.е. происходит сдвиг нейроглиальных отношений, возможно, связанный с донорскими функциями глии.

Одновременно в мозге происходит накопление серотонина и дофамина при некотором снижении содержания норадреналина, а в надпочечниках - многократное увеличение содержания опиоидных пептидов, и прежде всего (3-эндорфина в 4 - 5 раз (121). В крови при этом отмечается снижение содержания гистамина и серотонина (33).

Третий компонент системного структурного следа при адаптации к гипоксии выражается определенными, достаточно стабильными сдвигами регуляции водно-солевого обмена. При этом в процессе адаптации происходит частичная атрофия супраоптического ядра гипоталамуса (10, 24) и клубочковой зоны надпочечников (152), т.е. структур, которые посредством альдостерона и антидиуретического гормона обеспечивают удержание в организме определенного резерва воды и хлорида натрия (153). Это сопровождается адаптивным снижением миогенного компонента сосудистого тонуса (29).

Четвертый компонент системного структурного следа при адаптации к гипоксии реализуется в системе иммунитета, где развивается изменение соотношения Т и В лимфоцитов в сторону преобладания В-

лимфоцитов иммунокомпетентных органов, например в селезенке. Важное следствие этого сдвига - частичная депрессия иммунных реакций, опосредуемых Т-клеточными механизмами, при одновременном усилении гуморального иммунного ответа, оцениваемого по количеству анти-телобразующих клеток и содержанию антител в крови (30). Эти адаптивные изменения в иммунной системе служат причиной определенных модулирующих защитных эффектов адаптации, а именно адаптационного подавления такого аллергического по своей природе феномена, как адьювантный артрит (31), ограничения индуцированного стрессом увеличения гиперчувствительности замедленного типа у животных (42) и предупреждения стрессорной депрессии нормальных киллеров, составляющих важное звено противоопухолевого иммунитета (41).

Пятый компонент структурного следа состоит в том, что адаптация к периодической гипоксии действует подобно химическим индукторам, почти вдвое увеличивая содержание цитохрома Р450 в печени (31). Этот факт означает, что дезинтоксикационные возможности печени при адаптации к гипоксии должны возрастать и хорошо согласуется с ранее опубликованными данными о том, что под влиянием этой адаптации значительно повышается резистентность организма к галлюциногенам и эпилептогенам (21).

Существенно, что наряду с общим увеличением содержания цитохрома Р450 под влиянием адаптации в печени возрастает активность 7-а-гидроксилазы холестерина - фермента, ответственного за окисление холестерина в желчные кислоты. Этот фактор обеспечивает адаптационное предупреждение стрессорного повреждения печени, а вместе с тем и стрессорной атерогенной дислипидемии (32), которая может играть важную роль в развитии коронарного атеросклероза (61). Таким образом, исходя из вышеизложенного можно сделать вывод о том, что в процесс адаптации к гипоксии вовлечены многие механизмы. Понятно,

что после того как в эксперименте были продемонстрированы защитные эффекты адаптации к гипоксии эта проблема быстро перешла из фундаментальной области в область практического использования в клинической медицине. Показана высокая терапевтическая эффективность интервальной гипоксической тренировки (8, 9, 43) и гипобарической ба-ракамерной адаптации к гипоксии (31).

В последнее десятилетие достигнут существенный прогресс в понимании молекулярных основ чувствительности клеток к недостатку кислорода и транскрипциональной регуляции генов, вовлеченных в ответ клетки на гипоксию (118). Показано, что гипоксия активирует гены, кодирующие эритропоэтин, эндотелиальный фактор роста сосудов, тирози-новые гидроксилазы, индуцибельную NO-синтазу и гликолитические ферменты. Индукция этих генов обеспечивает поддержание гомеостаза кислорода в условиях гипоксии. Важно, что уровень транскрипции этих разных генов контролируется индуцируемым гипоксией фактором транскрипции (hypoxia-inducible factor 1, HIF-1).

HIF-1 является гетеродимером, каждая из субъединиц которого принадлежит к PAS семейству транскрипционных факторов. Основной путь активации HIF-1 связан со стабилизацией гетеродимерного комплекса и его фосфорилированием (90) в условиях недостатка кислорода.

На сегодняшний день постулируется, что в цитотоксическом действии гипоксии важную роль играют прямые эффекты NO, такие как пе-рекисное окисление липидов, нитрозилирование белков и продукция супероксидных радикалов. Кроме того, Sogawa et al.(155) показали, что N0 блокирует активацию HIF-1 и таким образом препятствует развитию адаптивного клеточного ответа на гипоксию (155). Вместе с тем вопрос о роли систем генерации NO в реализации клеточного ответа на гипоксию до последнего времени остается открытым. Выше мы уже говорили о

том, что N0 вовлечен в регуляцию многих физиологических функций организма. Однако, его роль в адаптации к гипоксии также практически не изучалась. В своем исследовании мы решили изучить поведение систем генерации N0 в этом процессе. Это и стало одной из целей диссертационной работы.

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Зенина, Татьяна Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Тепловой шок вызывает транзиторное увеличение продукции N0 как в органах крыс, так и в культуре клеток. В обоих случаях максимальное увеличение продукции N0 предшествует накоплению белков Н8Р70.

2. Ингибитор ЫО-синтазы (ЬША - [^Г-нитро-Ь-аргинин) ограничивает индуцированное тепловым шоком накопление НЭР70 в печени на 75%, а в сердце на 45%.

3. Донор N0 (ДНКЖ - динитрозильный комплекс железа) активирует синтез белков семейства НБР (28, 60, 70, 90 и 100) в культуре клеток. ДНКЖ активирует синтез НЭР70 в изолированном сердце при введение в перфузионный раствор, но практически не влияет на синтез этих белков при введении в организм животных.

4. Влияние острой гипоксии (11000 м над уровнем моря) на продукцию N0 является органоспецифичным: в мозге продукция N0 увеличивается в 2 раза по сравнению с контролем, а в печени продукция N0 не изменяется.

5. После курса адаптации к периодической гипоксии (8 дней) происходит уменьшение продукции N0 в органах. При этом, однократное гипок-сическое воздействие (10 минут, 5000 м над уровнем моря), используемое в курсе адаптации, сначала приводит к увеличению продукции N0 в мозге, а затем, при последующей реоксигенации - к ее снижению в мозге и печени. Адаптация к гипоксии ограничивает гиперпродукцию N0, вызванную острой гипоксией.

6. Ограничение гиперпродукции N0 с помощью экзогенных факторов повышает устойчивость организма к острой гипоксии: после однократного введения ингибитора МО-синтазы (ЬЫЫА - 1Мю-нитро-1-аргинин) или "ловушки" N0 (Ре-ДЭТК - диэтидитиокарбамат) происходит увеличение времени жизни животных в условиях острой гипоксии в 1,3 и 1.8 раза соответственно. Курсовое введение донора N0 (ДНКЖ) воспроизводит антигипоксический эффект адаптации.

7. Ингибитор ЫО-синтазы (ЬММА) ограничивает накопление Н8Р70 в органах при адаптации к гипоксии и полностью предотвращает развитие адаптационного антигипоксического эффекта.

8. В целом результаты работы впервые показывают существование N0-зависимой активации НЗР70 и важную роль этого механизма в защитном эффекте адаптации к гипоксии.

87

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зенина, Татьяна Алексеевна, 1998 год

ЛИТЕРАТУРА.

1. Ахмедов К.Ю. О некоторых изменениях внешнего дыхания при высокогорной гипоксемии. // Здравохранение Таджикистана.-1967,- №1,- С. 34-38.

2. Благовестова Н.П., Логинова Е.В., Симонов Е.Е. Продолжительность реакции костного мозга на акклиматизацию к гипоксии. // Пробл. косм. Биологии. -1968.-Т. 8.-С. 148-201.

3. Богомолов А.Ф. Динамика содержания и синтеза нуклеиновых кислот и белков в легких при адаптации к гипоксии. // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1975 .-№3 .-С. 33-35.

4. Ван Лир Э., Стикней К. Гипоксия. // М. : Медицина.-1967.

5. Ванин А.Ф., Манухина Е.Б., Лапшин A.B., Меерсон Ф.З. Усиление синтеза оксида азота в стенке аорты при экспериментальном инфаркте миокарда. // Бюлл. экспер. биол. и мед. -1993.- N 8.- С. 142-144.

6. Галаган М.Е., Орановская Е.В., Мордвинцев П.И., Медведев О.С., Ванин А.Ф. Гипотензивный эффект ДНКЖ в опытах на бодрствующих животных. // Бюлл. ВКНЦ АМН СССР. -1988.- вып. 2.- С. 75-80.

7. Досон Р., Эллиот Д., ЭллиотУ., Джонс К. Справочник биохимика. // М.: Мир. -1991.-С. 466.

8. Дудоров O.E., Шкатов И.В., Чижов А.Я. Мониторинг амплитудно-фазовых характеристик сердечно-сосудистой системы и кинетики кислородного метаболизма при гипокситерапии. // Тез. конф. - М., БЭБиМ.-1997.-С. 36.

9. Кан A.M., Авакян Г.Н., Островская Р.У., Чижов А.Я. Использование прерывистой нормобарической гипокситерапии в комплексном лечении эпилепсии. //Тез. конф. -М., БЭБиМ.- 1997.-С. 50.

10. Красновская Н.А. Изменения гипоталамогипофизарной нейросекре-торной системы крыс в условиях длительной гипоксии. // Проблемы эндокринологии. -1974,- Т. 20.- №2,- С. 53-57.

11. Кулаеваа О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу. // Соросовский Образовательный Журнал.-1997.- №2.- С. 5-3.

12. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции // Бюлл. экспер. биол. и мед.- 1997,- Т. 124.- N 9,- С. 244-254.

13. Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. Стресс, адаптация и оксид азота. // Биохимия. -1998.- №7.-т.63.-вып. 7.-С. 992-1006.

14. Манухина Е.Б., Лапшин А.В., Машина С.Ю., Меерсон Ф.З., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф. Функциональное состояние эндотелия и продукция окиси азота в организме крыс, адаптированных к периодической гипоксии // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1995.- №11.- С. 495-498.

15. Манухина Е.Б., Лапшин А.В., Меерсон Ф.З. Адаптация к периодической гипоксии предупреждает нарушения эндотелий-зависимого расслабления и падение давления при экспериментальном инфаркте миокарда // Hypoxia Medical J. -1994.- № 1. -P. 15-8.

16. Манухина Е.Б., Покидышев Д.А., Маленюк Е.Б. и др. Защитный эффект окиси азота при тепловом шоке. // Изв. РАН. Сер. биол,- 1997,-№1.-С. 54-58.

17. Маргария Р., Церетели П. Физиологические аспекты жизни на больших высотах. // Избр. Тр. II Международного конгресса биоклимотоло-гии.-Л.-1965.-С. 8-12.

18. Меерсон Ф.З. Адаптация к стрессорным ситуациям и стресс-лимитирующие системы организма // Руководство по физиологии адаптационных процессов. М.: Наука.-1986.- 640 С.

19. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука.-1981.

20. Меерсон Ф.З. Защитные эффекты адаптации и некоторые перспективы развития адаптационной медицины //Успехи физиол. наук,- 1991.Т. 22. № 2.- С. 52-89.

21. Меерсон Ф.З. Общий механизм адаптации и профилактики. М.: Наука,- 1981,- 278С.

22. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М.: Медицина-1984.- 269 С.

23. Меерсон Ф.З., Архипенко Ю.В., Рожицкая И.И., Каган В.Е. Повреждение Са2+-транспортирующей системы саркоплазматического ретикулума сердца при эмоционально-болевом стрессе. // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1981,-№4,-С. 405.

24. Меерсон Ф.З., Барабаш H.A., Шорин Ю.П. О механизме профилактического влияния адаптации к гипоксии на развитие гипертонии. // Кардиология. -1977,- №12.- С. 71-79.

25. Меерсон Ф.З., Майзелис М.Я., Малкин А.Б. и др. Активация синтеза РНК и белков в мозге как фактор адаптации к высотной гипоксии. // Докл. АН СССР,- 1969,- Т. 187,- №3. -С. 227-230.

26. Меерсон Ф.З., Майзелис М.Я., Малкин А.Б. и др. Роль синтеза нуклеиновых кислот и белков в миокарде в адаптации сердца к длительному действию высотной гипоксии и использование этой адаптации для предотвращения острой сердечной недостаточности. // Докл. АН СССР.-1968. -Т. 184,- №2.- С. 500-506.

27. Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца. // М.: Наука.-1993.

28. Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., Краузе Е.Г. и др. Влияние адаптации к высотной гипоксии на адренореактивность сердца и состояние его аденилатциклазной системы. // Физиол. журн. СССР.- 1976.- Т. 65.- №5,-С. 727-732.

29. Меерсон Ф.З., Салтыкова В.А. Влияние адаптации к высотной гипоксии на сопротивление резистивных сосудов. // Кардиология. -1977.- №5.-С. 83-87.

30. Меерсон Ф.З., Сухих Г.Т., Фролов Б.А. Влияние адаптации к периодическому действию гипоксии на некоторые показатели иммунологической реактивности. // Патолог. Физиология и эксперим. Терапия. -1981.-№4,- С. 73-77.

31. Меерсон Ф.З., Твердохлиб В.П., Боев В.М., Фролов Б.А. Адаптация к пероидической гипоксии в терапии и профилактике .// М.: Наука. -1989.

32. Меерсон Ф.З., Твердохлиб В.П., Никоноров A.A. и др. Роль подавления активности 7-а-гидроксилазы холестерина в печени в возникновении атерогенной стрессорной дислипидемии. // Кардиология. -1987.- №9,- С. 85-87.

33. Меерсон Ф.З., Фролов Б.А., Афинина С.Н. и др. Механизм защитного действия адаптации к гипоксии на развитие аллергического артрита. // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1986 № 10.- С. 403-405.

34. Наградова Н.К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков. // Соросовский Образовательный Журнал,- 1996,- №7,- С. 970-979.

35. Обрезчикова М.Н., Харченко И.Б., Тарасова О.С., Кошелев В.Б. Прерывистая гипоксическая тренировка в барокамере замедляет, но не предотвращает развитие генетически детерминированной артериальной гипертензии у крыс. // Hypoxia Medical J.- 1997.- Vol.5.-№ 2.- P. 3-7.

36. Пшенникова М.Г. Синтез белка в нейронах и клетках глии звездчатых узлов у крыс при адаптации к действию высотной гипоксии. // Физиол. журн. СССР. -1973.- Т. 59,- №3.- С. 421-428.

37. Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих. // Успехи биолог. Медицины.-1995.-Т.35.-С. 189-228.

38. Рябов Г. А. Гипоксия критических состояний. М. : Медицина.- 1989-. 287 С.

39. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В., Меерсон Ф.З. Увеличеник активности антиоксидантных ферментов сердца при адаптации крыс к кратковременным стрессорным воздействиям. // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1987 .- № 10.-С.422-413.

40. Страйер Л. Биохимия: В 3-х т. Т.З. М.: Мир.-1985.-400С.

41. Сухих Г.Т., Меерсон Ф.З. Предупреждение депрессии активности нормальных киллеров при стрессе с помощью адаптации к периодическому действию высотной гипоксии. // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1985. -№4,-С. 458-461.

42. Фролов Б.А., Филиппов В.К., Меерсон Ф.З. Активирующее влияние стрессорных воздействий на формирование гиперчувствительности замедленного типа у мышей. // Иммунология. -1985.- № 2.- С. 39-41.

43. Чижов А.Я. Настоящее и будущее прерывистой нормобарической ги-покситерапии. //Тез. конф. - М., БЭБиМ.- 1997.-С. 133.

44. Шепелев А.П. Влияние острого физического перегревания животных на процессы перекисного окисления липидов. // Вопросы мед. химии.-1976.-Т.22.-Вып. 1 .-С.47.

45. Amin J. Mestril R., Schiller P. et al. organization of the Drosophila mela-nogaster hsp70 heat shock regulation unit.// Mol. and Cell. biol.-1987. -Vol. 7,- P. 1055-1062.

46. Ananthan J., Goldbery A.L. Voelmy R. Abnormal proteins serve as eukaryotyc stress signals and trigger the activation of heat shock genes // Science.- 1986.- Vol. 232,- P. 522-524.

47. Amelle D.R., Day B.J., Stamler J.S. Diethyl dithiocarbamate-induced decomposition of S-nitrosothiols. // Nitric Oxide: Biology and Chemistry.-1997.-Vol.1.- P.56-64.

48. Ashburner M. Bonner J.J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock // Cell.-1979.- Vol. 17,- P. 241-254.

49. Barbe M.F., Tytell M. Gower D.J., Welch W.J. Hypertermia protects against light damage in the rat retina. // Science.-1988.- Vol. 242.-P. 18171820.

50. Benjamin I.J., McMillan D.R. Molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. // Circ Res.- 1998.-Vol. 83.- P. 117-132.

51. Berberian P.A., Myers W., Tytell M. et all. Immunohistochemical localization of heat shock protein - 70 in normal appearing and atherosclerotic spe-ciemns of human arteries //Amer. J. Pathol.-1990.- Vol. 136.- P. 71 - 80.

52. Blake M.J., Gershon D., Fargnoli J., Holbrook N.J. Comcominant decline in heat - inducet hypertermia and hsp70 mRNA expression in aged rats // Amer. J. Physiol.-1991. Vol.- 260.- P. 663 - 667.

53. Blake M.J., Gershon D., Fargnoli J., Holbrook N.J. Discordantexpression of heat shock protein mRNK in tissues of heat - stressed rats // J. Biol. Chem.-1990. -Vol. 265,- P. 328 - 333.

54. Bogdan C., Vodovotz Y., Paik J. et al. Mechanism of supression of nitric oxide synthase expression by interleukin-4 in primary mouse macrophages. // J. Leuk. Biol.-1994.- Vol. 55,- P. 227-233.

55. Bredt D.S., Snider S.H. Nitric oxide : a physiologic messenger molecule. // Annu. Rev. Biochem.-1994.-Vol. 63.-P. 175-195.

56. Cairo G., Schiaffonati L., Rappocciolo E. et all. Expression of different members of heat shock protein 70 gene family in liver and hepatomes // Hepatology.-1989.- Vol. 9,- P. 740 - 746.

57. Carper S.W., Duffy J.J., Gerner E.W. Heat - shock proteins in thermotol-erance and other cellular processes // Cancer Res.-1987.- Vol. 47,- P. 5249 -5255.

58. Catelli M.G. Binart N., Jung-Testas I. er all. The common 90kDa protein component of non-transformed "8S" steroid receptors is a heat schock protein // Europ. Mol. Biol. Organ. J.-1985.- Vol. 4,- P. 3131 - 3135.

59. Chappel T.G., Welch W.J., Schlossman D.M. et all. Uncoating ATP-ase is a member of the 70 kDa family of stress proteins // Cell.-1986.- Vol. 45.- P. 3 -13.

60. Chirico W.J., Waters M.G., Blobel G. 70 kDa heat shock related proteins stimulate protein translocation into microsomes // Nature.-1988.- Vol. 332.- P. 805-810.

61. Clarkson T.B., Kaplan J.R., Adans M.R., Manuck S.B. Psychsocial influence on the patho genesis of atherosclerosis among nonhuman primates. // Circulation.-1987.- Vol.76.- Pt. 2.- Suppl.- P. 1-29.

62. Contard F., Samuel J.L., Marotte F., Rappaport L Distribution of fibronec-tin and HSP70 whithin rat myocadium early after imposition of pressure overload //J. Mol. and Cell. Cardiol.-1989.- Vol. 21.-Suppl. 3.P.- S5.

63. Corbett J.A., Michael a., Shimizu J. et al. Nitric oxide production in islets from nonobese diabetic mice : Amminoguanidine-sensitive and -resistant stages in the immunological diabetic process. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-1993.-Vol. 90,- P. 8992-8995.

64. Craig E.A. The heat shock response // CRC Crit. Rev. Biochem.- 1985.-Vol. 18. P.-239-280.

65. Craig E.A., Jacobsen K. Mutations in cognate genes of Sachoromyces cerevisiae hsp70 result in reduced growth rates at low temperatures // Mol. and Cell. Biol.-1985.- Vol.5.- P.3517 - 3524.

66. Craven P.A., Derubertis F.R. Reatotation of the responsiveness of purifed guanylate cyclase to nitrosoguanidine, nitric oxide and related activators by heme and heme proteins : evidence for the involvement of the paramagnetic nitrosyl-heme complex in enzyme activation. II J. Biol. Chem.-1978.- Vol. 253,- P.8433-8443.

67. Curie R.W., Whate F.P. Trauma - induced protein in rat tissues: A physiological role for a heat shock protein? // Science.-1981. -Vol. 214,- P. 72-73.

68. Glick B.S. Can HSP70 proteins as forse - generating motors? // Cell.-1995. Vol. 80.- P. 11 -14.

69. Dedutchi Y., Negoro S., Kishimoto S. Heat shock protein synthesis by human peripheral mononuclear cells from SLE patiens // ldid.-1987.- Vol. 148,- P. 762-767.

70. Delcayre C., Bercovici J., Mouas C. et all. Synthesis of total proteins, contractile proteins and stress proteins in cardiac overload: influence of the perfusion pressure and the cardiac contraction in the isolated heart // J. Mol. and Cell. Cardiol.-1989,- Vol.21. Suppl.3. -Abstr.14.-P.S5.

71. Delcayre C., Samuel J.L., Marotte F. et all. Syntesis of stress proteins in rat cardiac myocytes 2-4 days after imposition of hemodynamic overload // J. Clin. Invest.-1988.- Vol.82.- P. 460 - 468.

72. Dishaiers R.J. Koch E.D., Werner-Washburne M. et all. A subfamyli of stress proteins faciliates translocation of secretory and mitochondrial precursor polypeptides // Nature.-1988,- Vol. 322.- P. 800-805.

73. Dobson M., Roberts J., McMacken R., Echols H. Specialized nucleopro-tein structures at the origin of replication of bacteriophage lambda: Complexes with lambda O protein and with lambda O, lambda P and E. Coli DNA B protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985.- Vol. 82.- P.4678-4682.

74. Dudler R., Travers A. Upstream elements necessary for optimal function of the hsp70 promoter in transformed flies // Cell.-1984.- Vol.38.- P.392-398.

75. Dura J. Stage dependent synthesis of heat shock induced proteins in early embryos of Drosophila melanogaster // Mol. and Gen. Genet.-1981.-Vol. 184,- P.381-385.

76. Elwood M.S., Craig E.A. Differential regulation of the hsp70 gene and related genes genes in Sachoromyces cerevisiae // Mol. and Cell. Biol.-1984,-Vol.4.№8. P. 1454-1459.

77. Eving I.F., Raju V.C., Maines M.D. Induction of heart heme oxygenase-1 (HSP32) by hypertermia: possible role in stress-mediated elevation of cyclic S^-guanosine monophosphate. // J. Pharmacol. Exp. Ther.-1994. Vol. 271(1).- P. 408-414.

78. Fargnoli J., Blake M.J., Holbrook N.J. In vivo and in vitro studies on the heat shock response and aging // Mol. Biol. Aging.-1990.- Vol.2.- P. 379-390.

79. Ferro C.J., Webb D.J. Endothelial dysfunction and hypertension. // Drugs.-1997.-Vol. 53. Suppl 1.- P.30-41.

80. Furchgott R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. // Nature.-1980.-Vol. 288.-P. 373-376.

81. Geller D.A., Nussler A.K., DiSilvio M. et al. Cytokines, endotoxin and glucocorticoids regulate the expression of inducible nitric oxide synthase in hepatocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993,-Vol. 90,- P. 552-526.

82. Gibbs D.M. Hypotalamic epinephrine is released into hypophysial portal blood during stress // Brain Res. Cardiol.-1987.- Vol. 82.- P. 233-240.

83. Green L.C., De Luzuriaga K.R., Wagner D.A., Rand W. et al. Nitrate biosynthesis in man. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1981.-Vol. 78,- P. 77647768.

84. Green L.C., Tannenbaum S.R. and Goldman P. Nitrate synthesis and reduction in the germ-free and conventional rat. // Science.-1981.- Vol. 212.- P. 56-58.

85. Guidon P.T., Hightower C.E. Purification initial characterization of the 71 kDa rat heat shock protein and its cognate as fatty acid binding proteins. // Biochemystry.-1986.-Vol. 25.-P. 3231-3239.

86. Hauser G.J., Dayao E.K., Wasserloose K., Pitt B.R., Wong H.R. HSP induction inhibits iNOS RNA expression and attenuates hypotension in endotoxin-challenged rats. // Amer. J. Physiol.-1996.- Vol. 271,- P. H2529-H2535.

87. Hibbs J.B.,Taintor R.R., Vavrin Z. Macrophage cytotoxicity : role for L-arginine deiminase and imino nitrogen oxidation to nitrite. // Science.-1987.-Vol. 235,- P. 473-476.

88. Hobbs A.J., Fucuto J.M., Ignarro L.J. Formation of free nitric oxide from L-arginine by nitric oxide synthase : Direct enhancement of generation by superoxide dismutase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.-Vol. 90,- P. 1099210996.

89. Howard K.J., Distelhorst C.W. Evidence for intracellular association of the glucocorticoid receptor with the 90-kDa heat shock protein // J. Biol. Chem.-1988,-Vol. 263.- P.3474-3481.

90. Hugang L.E., Gu J., Schau M., Bunn H.F. Regulation of hypoxia-inducible factor 1a is mediated by an 02-dependent degradation domain via the ubiq-uitin-proteasome pathway. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.-Vol. 95,- P. 7987-7992.

91. Hultgren N.H., Marticorena E., Miller H. Right ventricular hypertrophy in animals at hing altitude. // J. Appl. Physiol.-1963.- Vol. 18.- P. 913-918.

92. Ignarro L.J. Endotelin-derived nitric oxide : actions and properties. // FASEB J.-1989.-Vol. 3,- P. 31.

93. Iyengar R., Steuer D.J., Marietta M.A. Macrophage synthesis of nitrite, nitrate and N-nitrosoamines : precursors and role of the respiratory burst. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1987.-Vol. 84,- P. 6369-6373.

94. Judelson H.S., Michelmore R.W. Structure and expression of a gene encoding heat-shock protein hsp70 from Oomycete fungus Bremia lactucal // Gene. -1989,-Vol.79.- №2.- P.207-217.

95. Kaneko S. Hypoxic policytemia. // Osaka Diag. Jgaku Lac.-1958.- Vol. 10.- P. 2155.

96. Kasambalides E.J., Lanks K.W. Antagonistic effects of insulin and dexa-methasone on glucose-regulated and heat shock protein synthesis // J.Cell. Physiol.-1985.- Vol. 123,- P.283-287.

97. Kay R.J., Boissy R.J., Russnak R.H., Candido E.P.R. Efficient transcription of a Caenorhabditis elegans heat shock gene pair in mouse fibroblasts is dependent on pultiple promoter elements whick can function bidirectionally // Mol. and Cell. Biol.-1986.-Vol.6.- P3134-3143.

98. Kennedy P.G., La Thangue N.B., Chan W.L., Clements G.B. Cultured human neural cells accumulate a heat shock protein during acute herpes simplex virus infection // Neurosci. Lett.-1985.- Vol. 61.- P.841-842.

99. Kerr A., Diasio R.B., Bommer W.J. Effect of altitude (hypoxia) on coronary artery size in white rat. // Amer. Heart. J.-1965. -Vol. 69.- P. 8-11.

100. Kim Y.M., De Vera M.E. et al. Nitric oxide protects culturea rat hepato-cytes from tumor necrosis factor-a-induced apoptosis by inducing heat shock protein 70 expression // J. of Biol, and Mol. Biology.-1997.-Vol. 272.-P. 14021411.

101. Kingston R.E., Schurtz T.J., Larin Z. Heat inducible human shock factor that binds to a human hsp70 promoter // Mol. and Cell. Biol.-1987.- Vol.7.- P. 1530-1534.

102. Kroncke K.-D., Fehsei K., Kolb-Bachofen V. Inducible nitric oxide synthase: a small molecule with complex biological activities // Biol. Chem. Hoppe-Seyler.-1995.- Vol. 376.- P.327-343.

103. Laemmli U.K. Cleavage of the structural protein during the assembly of the head of the bacteriophage T4. // Nature.-1970.- Vol.227.- P. 680-686.

104. Langendorff O. Untersuchungen am uberlebenden Saugetierherzen. // Pflugers Arch.-1885.-Vol. 61.-P. 291-332.

105. Leppa S., Sistonen L. Heat shock response - pathophysiological implications // Ann. Med.-1997,- Vol. 29.- P. 73 - 78.

106. Li G.C., Werb A. Correlation between synhesis of heat shock proteins and development of thermotolerance in Chinese hamster fibroblasts // Proc Natl. Acad. Sci. USA.-1982. -Vol. 79. -P.3218 - 3222.

107. Linguist S. Heat shock a comparison of Drosophila and yeast // J. Em-bryol. and Exp. Morphol.-1984.-Vol. 83.- P. 147-161.

108. Linguist S. The heat shock response // Annu. Rev. Biochem.-1986.- Vol. 55,- P. 1151 -1191.

109. Locke M., Noble E. et al. Activation of the heat shock transcription factor in the rat heart following heat shock and exercise. // Amer. J. Physiol.-1995.-Vol. 266,- P. 1387.

110. Lubbe W.F., Daries D.S., Opie L.N. Ventricular arrythmias associated with coronary artery occlusion and reperfusion in the isolated perfused rat heart: a model for assesment of antifibrillatory action of antiarrythmic agents. //Cardiovasc. Res.-1978.-Vol. 12.-P. 212-218.

111. Malyshev I.Yu., Malugin A.V., Golubeva L.Yu, Zenina T.A., Manukhina E.B., Mikoyan V.D., Vanin A.F. Nitric oxide donor induces HSP70 accumulation in the heart and in cultured cells.// FEBS Lett.-1996.- Vol.391.-P.21.

112. Malyshev I.Yu., Malugin A.V., Manukhina E.B. et al. Is HSP70 involved in nitric oxide-induced protection of the heart? // Physiol. Res.-1996.- Vol.45.-P.267-272.

113. Malyshev I.Yu., Manukhina E.B., Mikoyan V.D., Kubrina L.N., Vanin A.F. . Nitric oxide is involved in heat-induced HSP70 accumulation. // FEBS Lett.-1995. -Vol.370. -P.159-162.

114. Marber M.S., Mestril R., Chi S.-H., Sayen M., Yellon D.M., Dillmann W. Overexpression of the rat inducible 70-kD heat stress protein in a transgenic

mouse increases the resistance of the heart to ischemic injury // J. Clin. Invest.- 1995.-Vol. 95,- P.1446-1456.

115. Marotta P., Sautelin L., DiRosa M. Modulation of the induction of nitric oxide synthase by eicosanoids in the murine macrophage cell line J 774. // J. Pharmacol.-1992.- Vol. 107.- P. 640-647.

116. McCall T.B., Palmer R.M.J., Moncada S. lnterleukin-8 inhibits the induction of nitric oxide synthase in rat peritoneal neutrophiles. // Biochem. Biohpys. Res. Commun.-1992.-Vol. 186.-P. 680-685.

117. McCanahan T., McEnteek K. DNA damage and heat shock daiiy regulate genes in Sacchoromyces cerevisiae // Mol. and Cell. Biol.-1986.- Vol. 6.-P. 90 - 96.

118. McClelland B.G., Hochachka P.W., Weber J. M. Carbohydrate utilisation during exercise after high-altitude accumulation: A new perspective. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.-Vol. 95.- P. 10288-10393.

119. Mcquillan I.P., Leung G.K., Marsden P.A., Kostyk S.K., Kourenbanas S. Hypoxia inhibits expression of eNOS via transcriptional and posttranscriptional mechanisms // Amer. J. Physiol.-1994.- Vol. 36.- P. H1921-1927.

120. Meerson F.Z., Malyshev I.Yu., Zamotrinsky A.V. Differences in adaptive stabilization of structures in response to stress and hypoxia relate with the accumulation of hsp70 isoforms // Mol. Cell. Bioshem.-1992.- Vol. Ill.-P. 8795.

121. Meerson F.Z., Pshennikova M.G. Effect of adaptation to high altitude hypoxia on the contractile function and adrenoreactivity of the heart. // Basic res. Cardiol.-1979.- Vol. 74.- P. 141-145.

122. Meerson F.Z., Ustinova E.E., Orlova E.H. Prevention and elimination of heart arrhytmias by adaptation to intermittent hypoxia. // Clin. Cardiol.-1987.-Vol. 10.- P. 783-789.

123. Mendel D.B., Orti E. Isoform composition and stoichiometry of the 90-kDa heat shock protein associated with glucocorticoid receptors // J. Biol. Chem.- 1988.- Vol. 263,- P. 6695 - 6702.

124. Metha H.B., Popovich B.K., Dillmann W.H. Ischemia induces changes in the level of mRNAs coding for stress protein 71 and creatine kinase M II Circ. Res. 1988. -Vol. 63.- P. 512 - 517.

125. Moalic J.M., Bauters C., Himbert D. et all. Phenylephrine, vasopressin and angiotensin 2 as determinants of proto-oncogene and heat shock protein gene expression in adult rat heart and aorta // J.Hypertens.-1989.- Vol. 7,-№3.- P.201.

126. Moalic J.M., Moazami - Goudarzi K., Mouas C. et all. Mechanical factors and hypertensive agenta as determinants of proto-oncogene and heat shock protein gene expression in adult rat heart. // J. Mol. and Cell. Cardiol.-1989,-Vol. 21.- Suppl. 3,- Abstr 55.-P. S20.

127. Moncada S. Nitric oxide. // J. Hypertension.-1994.- Vol. 12.-Suppl.10,- P. 35.

128. Monge C. Les arythmics de l altitude. // Paris.-1929.

129. Moravek J. Cappilary supply and utilization of intracellular oxygen in the left ventricular myocardium from rats, adapted to high altitude. // Adv. Exp. Med. Biol.-1983.-Vol. 159.- P. 243-252.

130. Mulsch A., Mordvincev P. et al. The potent vasodilating and guanylyl cyclase activating dinitrosyl iron (II) complex is stored in a protein-bound form in vascular tissue and is released by thiols. // FEBS Lett.-1991.-Vol. 294.-P. 252.

131. Nadaud S., Bonnardeaux A., Lathrop M. et al. Gene structure, polimor-phism and and mapping of the human endothelial nitric oxide synthase gene. //Biochem. Biohpys. Res. Commun.-1994.-Vol. 198.-P.1027-1033.

132. Naets J.P., Wittek M. Erythropoetic activity of marrow and disappearance rate of erythropoetin in the rat. //Amer. J. Physiol.-1969.- 297.

133. Nichizuka Y. The role of protein kinase С in cell surface signal transduction and tumor promotion // Nature.-1984.- Vol. 308.- P. 693 - 698.

134. Nunoshiba Т., deRojas-Walker Т., Wishnok J.S., Tannebaum S.R., Demple B. Activation by nitric oxide of an oxidative-stress response that defends Escherichia coli against activated macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1993,-Vol.90.- P.9993-9997.

135. Oswald I.P., Wynn T.A.,Sher A. et al. lnterleukin-10 inhibits macrophage microbicidal activity by blocking the endogenous production of TNF-a required as a costimulatory factor for IFN-y induced activation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992.-Vol. 89,- P. 8676-8680.

136. Parker C.S., Topol J. A Drosophila RNA polymerase 2 transcription factor binds to the regulatory site of an hsp70 gene. // Cell.-1984.- Vol.37.- P. 273 - 283.

137. Pauli D., Spierer A., Tissieres A. Several hundred base pairs upstream of Drosophila hsp23.genes are required for their heat induction in transformed flies // Europ. Mol. Biol. Organ. J.-1986.- Vol. 5,- P. 755 - 761.

138. Pelham H.R.B. Coming in from the cold // Nature.-1988.-Vol. 332,-P.776.

139. Pelham H.R.B. Speculation on the major heat shock and Glucose-regulated proteins // Cell.-1986,- Vol. 46,- P. 959 - 961.

140. Pelham H.R.B., Brenz M. A synthetic heat-shock promoter element confers heat-inducibility on the herpes syplex virus thymidine kinase gene //Ibid. 1982. Vol.1. P.1473 -1477.

141. Rappaport L., Conatrd F., Marotte F. et all. Regional distribution os growth signals, contractile and extracellular matrix proteins whithin myocardium the imposition of a sudden pressure // J. Mol. and Cell. Cardiol.-1989. Vol. 21 .-Suppl.3. Abstr.63.- P. S22.

142. Reiter Т., Penman S. Promt heat shock proteins: Traslationally regulated synhesis of new proteins associated with the nuclear matrix-ittermediate fila-

ments as a early reaponse to heat shock // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1983.-Vol. 80. -P. 4737-4741.

143. Roccheri M.C., Di Bernardo M.G., Guidice G. Synhesis heat shock proteins in developing sea urchins // Develop. Biol.-1981.-Vol. 83.- P. 173 -177.

144. Rodland K. D., Jue S.F., Magun B.E. Regulation of VL30 gene expression by activators of protein kinase C. // J. Biol. Chem.- 1986.-Vol. 261.- P. 5029 - 5033.

145. Rothman J.E., Schmid S.L. Enzymatic recycling of clathrin from coated vesicles // Cell.-1986.- Vol. 46.- P. 5 - 9.

146. Rudic R.D., Shesely E.G., Maeda N. et al. Direct evidence for the importance of endothelium-derived nitric oxide in vascular remodeling // J. Clin. Invest.- 1998.-Vol. 101.- P. 731-736.

147. Sanchez E.R., Toft D.O., Schlesinger M.J., Pratt W.B. Evidence that the 90 kDa phosphoprotein associated with the untransformed L-cell glucocorteid receptor is a murine heat shock protein // J. Biol. Chem.-1985.-Vol. 260.- P. 12398- 12401.

148. Schlesinger M.J. Heat shock proteins // J. Biol. Chem.-1990. -Vol. 265.-P. 12111 -12114.

149. Schlesinger M.J. Heat shock proteins: The search for function // J. Cell. Biol.-1986.- Vol. 260,- P. 321 - 325.

150. Schlesinger M.J., Ashburner M. Heat shock: from bacteria to man. N.Y. : Cold Spring Harbor Lab.-1982,- 440p.

151. Schwarz P., Diem R., Dun N.J., Forstermann U. Endogenous and exogenous nitric oxide inhibits norepinephrine release from rat heart sympathetic nerves // Circ. Res.-1995.- Vol.75.- P.841-848.

152. Shaul P.W., North A.J., Brannon T.S., Ujiie K., Wells L.B., Nisen P.A., Lowenstein C.J., Snyder S.H., Star R.A. Prolonged in vivo hypoxia enhances nitric oxide synthase type I and type III gene expression in adult rat lung. // Amer. J. Resp. Cell and Mol. Biol.-1995.-Vol.13.- P.167-174.

153. Slater J.D., Tuffley R.E., Williams E.S. Control of aldosterone secretion during accumulation to hypoxia in man. // Clin. Sci.-1969.- Vol. 37,- P. 327.

154. Slater M.R., Craig E.A. Transcriptional regulation of an hsp70 heat shock gene in the yeast Sacchoromyces cerevisiae // Mol. and Cell. Biol.-1987.-Vol. 7.-P. 1906-1616.

155. Sogava K., et al. Inhibition of hypoxia-inducible factor 1 activity by nitric oxide donors in hypoxia. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998,-Vol. 95.- P. 7368-7373.

156. Sorger P.K., Pelham H.R.B. Purification and characterization of a heat-shock element binding protein from yeast// Europ. Mol. Biol. Organ. J.-1987.-Vol. 6,-P. 3035-3041.

157. Squadrito L.G., Pryor W.A. Oxidative chemistry of nirtric oxide: the roles of superoxide, peroxynitrite, and dioxide // Free Radical Biology and Medicine.- 1998,-Vol. 25,- P. 382-403.

158. Steuer D.J., Marietta M.A. Mammalian nitrate biosynthesis : mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipo-polysaccharide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985.-Vol. 82,- P. 7738-7742.

159. Tanquay R.M. Transcriptional activation of heat-shock genes in eukariotes // Beochem. Cell. Biol.-1988.- Vol. 66.- P. 584 - 593.

160. Teng G., Barer G. In vitro responses of lung arteries to acute hypoxia after NO-synthase blockade or chronic hypoxia.// J. Appl. Phisiol.-1995.-Vol.79.- P.763.

161. Tenu J.P., Sekkai D., Yapo A. et al. Phosphatidylinositolmannoside-based liposomes induce NO synthase in primed mouse peritoneal macrophages. // Biochem. Biohpys. Res. Commun.-1995.-Vol. 208.-P. 295-301.

162. Thomas S.P., Lengyel J.A. Ecolysteroid-regulated heat shock gene expression in eukariotes during Drosophila melanogaster development // Develop. Biol.-1988.- Vol. 66,- P. 584 - 593.

163. Tomasovic S.P. Functional aspects of the mammalian heat-stress protein response // Life Chem. Rep.-1989.- Vol. 1,- P. 33 - 63.

164. Topol J., Ruden D.M.,Parker C.S. Sequences required for in vitro transcriptional activation of a Drosophila hsp70 gene. // Cell.- 1985.- Vol. 42,- P. 527 - 537.

165. Torres M., Ceballos G., Rubio R. Possible role of nitric oxide in catecholamine secretion by chromaffin cells in the presence and absence of cultured endothelial cells // J. Neurochem.-1994.- Vol. 63.- P. 988-996.

166. Van Liere E.J., Kramer B.B., Northup D.M. Differences in cardiac hypertrophy in exercise and in hypoxia. // Circulât. Res.-1965.- Vol. 16.- P. 244249.

167. Vanhatalo S., Soinila S. Nitric oxide synthase in the hypothalamo-pituitary pathway//J. Chem. Neuroanat.-1995. -Vol. 8.- P.165-173.

168. Vanin A.F., Mordvintcev P.I., Kleshev A.L. Appearance of nitric oxide in animal tissues in vivo. // Studia Biophys.-1984.- Vol.102.- P. 135.

169. Vivino A.F., Smith M.D., Minton K.W. A DNA damage - responsive Drosophila melanogaster gene is also induced by heat shock // Mol. and Cell. Biol.-1986,-Vol.247.- P. 4767-4769.

170. Wagner D.A.,Yong V.R., Tannenbaum S.R. Mammalian nitrate biosynthesis : incorporation of [15N]ammonia into nitrate is enhanced by endotoxin treatment. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1983,-Vol. 80.- P. 4518-4521.

171. Weiner C.P., Lizasoain I., Bayles S.A. et ai. Induction of calcium-dependet nitric oxide synthase by sex hormones. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1994.-Vol. 91.- P. 5212-5316.

172. Welch W.J., Suhan J.P. Cellular and biochemical events in mammalian cells during and after recovery from physiological stress // J. Cell. Biol.-1986,-Vol.103.- P.2035 - 2052.

173. Wiederrecht G., Shuey D.J., Kibbe W.A., Parker C.S. The Sacchoromy-ces and Drosophila heat shock transcription factors are identical in size and DNA binding properties // Cell.-1987.- Vol. 48.- P. 507 - 515.

174. Wiegant F.A.C., van Wijk R. Self-recovery and the similia principle: an experimental model // Complementary Therapies in Medicine.-1996.- Vol. 4,-P. 90 -97.

175. Wink D.A., Mitchell I.B. Chemical biology of nitric oxide intights into regulatory, cytotocxic and cytoprotective mechanisms of nitric oxide // Free Radical Biology and Medicine.- 1998.-Vol. 25.- P. 434-456.

176. Witter J., Gatley S.J., Balish E. Evaluation of nitrate synthesis by intestinal microorganisms in vivo. // Science.-1981.- Vol. 213.- P.449-450.

177. Wolff D.J., Lubeskie A. Amminoguanidine is an isoform-selective, mechanism-based inactivator of nitric oxide synthase. // Arch. Biochem. Biohpys.- 1995.-Vol. 316.-P. 290-301.

178. Wu C. An exonuclease protection assay reveals heat-shock element and TATA box DNA-binding in grude nuclear extracts. // lbid.-1985.- Vol. 317.- P. 84 - 87.

179. Wu C. Two protein-binding site a in chromatin implicated in the activation of heat-shock genes // Nature.-1984.- Vol. 309.- P. 229 - 234.

180. Wu C., Wilson S., Walker B. et all. Purification and properties of Drosophila heat shock activator protein // Science.-1987.- Vol. 238.- P. 1247 -1253.

181. Xie Q., Nathan C. The high-output nitric oxide pathway. // J. Leuk. Biol.-1994.-Vol. 56,- P. 576.

182. Xue C., Rengasamy A., Lecras T.D., Koberna P.A., Dailey G.C., Johns R.A. Distribution of NOS in normoxic vs hypoxic rat lung: Upregulation of NOS by chronic hypoxia //Am. J. Physiol. -1994,-Vol.11.- P. L667-L-678.

183. Zembowicz A., Vane J.R. Induction of nitric oxide synthase activity by toxic shock syndrome toxin-1 in a macrophage-monocyte cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992,-Vol. 89,- P. 2051-2055.