Нерепликативная гомологичная рекомбинация между фрагментами РНК полиовируса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Коршенко, Сергей Анатольевич

• Коршенко, Сергей Анатольевич
• кандидат физико-математических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Коршенко, Сергей Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения о полиовирусс.

2.2. Модели генетической рекомбинации.

2.3. Доказательства существования репликативной рекомбинации между молекулами РНК.

2.4. Возможные механизмы репликативной рекомбинации.

2.5. Возможные механизмы расщепления и лигирования молекул РНК.

2.6. Доказательства существования нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Ферменты и реактивы.

3.2. Плазмида.

3.3. Бактериальный штамм.

3.4. Синтетические олигонуклеотиды.

3.5. Базовые методы молекулярного клонирования.

3.6. Получение плазмидных конструкций, содержащих кДНК фрагментов.

3.7. Получение полноразмерных транскриптов.

3.8. Модификации концевых нуклеотидов транскриптов.

3.9. Анализ вирусных клонов.

3.10. Определение нуклеотидной последовательности ЯТ РСЯ-фрагмептов и плазмидной ДНК.

3.11. Моделирование вторичной структуры РНК.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Конструирование 5'- и З'-фрагмептов РНК полиовируса, точно дополняющих друг друга.

4.2. Образование рекомбинантов между 5'- и З'-фрагмептами РНК полиовируса, точно дополняющими друг друга.

4.3. Конструирование 5'- и З'-фрагментов РНК полиовируса, имеющих область перекрывания.

4.4. Образование рекомбинантов между 5'- и З'-фрагментами РНК полиовируса, имеющих область перекрывания.

4.5. Отклонение от точности при образовании рекомбинантов между фрагментами РНК полиовируса.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Доказательство существования нсрспликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса.

5.2. Лигировапие фрагментов РНК полиовируса.

5.3. Рекомбинация между перекрывающимися фрагментами РНК полиовируса.

5.4. Точность при образовании рекомбинантов между фрагментами РНК полиовируса.

5.5. Репликативпая и нерспликативная рекомбинация у РНК-содержащих вирусов.

5.6. Биологическая значимость нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Нерепликативная гомологичная рекомбинация между фрагментами РНК полиовируса»

Под генетической рекомбинацией в общем смысле слова поинмают возникновение новой дочерней молекулы ДНК (РНК) из двух или более родительских молекул ДНК (РНК). До 60х годов считалось, что генетическая рекомбинация присуща только молекулам ДНК, открытие же рекомбинации между молекулами РНК заставило пересмотреть устоявшиеся взгляды на это явление. Впервые рекомбинацию между молекулами РНК наблюдали у полиовируса Hirst (1962) и Ledinko (1963). При совместной инфекции клеток HeLa двумя штаммами полиовируса типа 1, проявляющими разные фспотипическис признаки (устойчивость к малым концентрациям гуанидина или ингибиторов, присутствующих в некоторых партиях лошадиных или бычьих сывороток), они получали рекомбинантные вирусы, которые экспрессировали фенотипичсские маркеры от обоих родительских штаммов одновременно. Немногим позже Pringle (1965), используя подобный подход, наблюдал генетическую рекомбинацию между штаммами, относящимися к разным серотипам вируса ящура. Первые биохимические доказательства наследования генетической информации от двух родительских молекул РНК были получены на примере вируса полиомиелита (Romanova et al., 1980; Tolskaya et al., 1983). Используя частичный протеолиз и изоэлектрическое фокусирование, авторы показали, что вирусный РНК-геном может кодировать белки, принадлежащие разным родителям. Окончательное доказательство существования рекомбинации РНК было получено после определения нуклеотидпой последовательности мест перекреста между геномными сегментами, произошедших от разных родителей (Romanova et al., 1986; Kirkegaard and Baltimore, 1986). На сегодняшний день известно, что рекомбинация между молекулами РНК - широко распространенное явление, присущее многим РНК-содержащим вирусам животных, растений и бактерий (см. обзоры Lai, 1992; Agol, 1997; Aaziz and Tepfer, 1999; Worobey and Holmes, 1999).

Открытие явления рекомбинации между молекулами РНК позволило с новой точки зрения взглянуть па эволюцию РНК-содержащих вирусов, поскольку рекомбинация может приводить к возникновению новых вирусных вариантов, лучше приспособленных для выживания. При этом предполагается, что образование вирусов с новыми фенотипическими признаками может идти по блочному принципу, за счет передачи друг другу функционально значимых модулей (Lai, 1992; Dolja and Carrington, 1992). Таким образом, был сделан вывод, что рекомбинация может ускорять эволюцию РНК-геномов (Worobey and Holmes, 1999). С другой стороны, рекомбинация может быть одним из способов исправления ошибок (вредные точечные мутации, делеции и др.), которые накапливаются в процессе синтеза РНК. Как известно, ни одна из вирусных РНК-зависимых PI IK-полимераз не обладает корректирующей активностью, что обуславливает относительно высокий уровень частоты спонтанных мутаций при репликации геномной РНК (Lai, 1992; Агол, 2002). В результате замены участков генома па гомологичные последовательности РНК-рекомбинация может устранять функционально значимые ошибки. Таким образом, с этой точки зрения, она играет важную роль в сохранении постоянства генома (Carpenter and Simon, 1996). Кроме этого, рекомбинация между молекулами РНК является важным фактором и с практической точки зрения. Так, рекомбинацию РНК следует учитывать при рассмотрении вакцинации аттспуированными вирусами, так как она может приводить к образованию новых вирусов среди вакцинных штаммов.

При этом у этих вирусов степень аттенуации может быть значительно ниже, чем у их родителей (Lipskaya et al., 1991; Georgescu et al., 1994). В результате появление в организме вирусов с усиленными вирулентными свойствами может привести к заболеванию. В связи с этим интерес к рекомбинации между молекулами РНК не ослабевает, и, как следствие, эта тема становится содержанием все большего числа работ.

Так как рекомбинация происходит редко и случайно, то рекомбинантные молекулы РНК могут быть обнаружены, только если их удается избирательно амплифицировать, чтобы отличить от большого фона родительских молекул РНК. По этой причине почти все описанные случаи рекомбинации РНК были обнаружены ш vivo на вирусах или на их дефектных интерферирующих геномах (DI-гепомах). В то же время у систем ш vivo есть свои недостатки. Эти системы позволяют обнаружить только те случаи рекомбинации между молекулами РНК, которые приводят к жизнеспособным геномам. В связи с этим, большая часть сообщений о рекомбинации между молекулами РНК касается гомологичной рекомбинации, то есть рекомбинации между подобными участками родительских молекул РНК. Детектирование случаев негомологичной рекомбинации затруднено тем фактом, что такого рода рекомбинация приводит к делении или вставке участка(ов) вирусиого генома. Однако если это серьезным образом не сказывается на вирусной жизнеспособности, то рекомбинаит также может быть амплифицирован и исследован. Другим недостатком является то, что большинство экспериментов на живых системах не отвечают на основные вопросы, касающиеся механизма рекомбинации. Так, например, остается невыясненным, участвуют ли в этом процессе белки вирусного рспликативного комплекса, белки клетки-хозяина.

Гомологичная рекомбинация между молекулами РНК, также как, впрочем, и негомологичная рекомбинация, может быть объяснена с помощью репликативной модели «смена матрицы», которая постулирует, что незаконченная рождающаяся молекула РНК оставляет матрицу и присоединяется к другой матрице, где происходит возобновление синтеза (Адо1, 1997). До недавнего времени репликативная модель была общепринятой, и с ее помощью объяснялось большинство полученных рекомбинантных молекул. Однако в последнее время появились первые указания на существование иерепликативной рекомбинации между молекулами РНК (СЬе^епп е1 а1., 1997; Сту1 е1 а!., 1999). Согласно перепликативпой модели рекомбинация происходит не в процессе синтеза повой цепи, а в результате разрыва и воссоединения предварительно синтезированных молекул РНК.

Поскольку представленные свидетельства в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК имеют уязвимые места (СЬеП'епп с1 а!., 1997; Сту1 е1 а!., 1999), получение неоспоримых доказательств возможности молекул РНК нереиликативпо рекомбинировать между собой является важной задачей. Данная работа посвящена исследованию нерепликативпой рекомбинации между молекулами РНК вируса полиомиелита. Цель и задачи исследования

Первое свидетельство в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК было получено А. Б. Четверимым с соавторами в бесклеточной системе репликации фага С?р (СЬе^епп е1 а!., 1997). В системе использовались (23 репликаза, гЫТР и неспособные к экспоненциальной репликации перекрывающиеся фрагменты одной из сателлитных РНК. Способные к репликации молекулы РНК появлялись в результате пегомологичной рекомбинации, которая зависела от присутствия З'-ОН группы у 5'-фрагмента. На основании полученных результатов авторы предположили, что рекомбинация идет по перепликативному механизму, напоминающему вторую стадию вырезания самосплайсирующихся иптропов. Второе свидетельство в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК было получено в нашей лаборатории в системе in vivo вируса полиомиелита (Gmyl et al., 1999). В системе использовались неспособные к репликации и трансляции перекрывающиеся фрагменты вирусной РНК. При совместной трапсфекции восприимчивой к полиовирусу культуры клеток такими фрагментами образовывалось жизнеспособное вирусное потомство. Было показано, что вирусные геномы являются рекомбинантами между 5'- и З'-фрагментами. Часть рекомбинантов включала целый 5'-фрагмснт. Такие рекомбиианты образовывались только в том случае, если 5'-фрагмент содержал З'-концевой фосфат. На основании полученных результатов и в связи с тем, что образование вирусной РНК-полимеразы до акта рекомбинации было блокировано, авторы сделали вывод, что рекомбинация идет по нерепликативному механизму. Однако, принимая во внимание, что в первом случае рекомбинация, видимо, зависит от присутствия вирусной PIIK-полимеразы, а во втором - этот фермент мог образоваться (хотя и маловероятно) в результате трансляции одного из фрагментов, полностью исключить возможность образования рекомбинантов репликативным путем было нельзя. Поэтому мы поставили перед собой цель неоспоримо доказать, что рекомбинация между молекулами РНК полиовируса может происходить без участия РНК-полимеразы, и, если это будет выполнено, то определить необходимые условия этого процесса. В частности, были поставлены и решались следующие задачи:

1) определение возможной роли вторичной структуры в образовании рекомбипантных молекул РНК;

2) определение необходимых условий для эффективного лигирования молекул РНК в зависимости от химической структуры концевых нуклеотидов. Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе выполнения настоящей работы были сконструированы четыре пары неинфекционных 5'- и З'-фрагментов РНК полиовируса. Любая пара фрагментов представляла собой взаимодополняющие части вирусного генома, разорванного в участке, кодирующем вирусную РНК-полимеразу. При этом фрагментам трех пар не хватало только одной фосфодиэфирной связи для образования целого генома, а фрагменты четвертой пары содержали перекрывающиеся гомологичные последовательности. Было показано, что при совместной трансфекции восприимчивой к полиовирусу культуры клеток неинфекционными 5'- и 3'-фрагментами полиовирусной РНК образовывалось жизнеспособное вирусное потомство, которое было представлено рекомбинантами между этими фрагментами. Поскольку образование вирусной РНК-полимеразы до акта рекомбинации было невозможно, полученные данные иеоспоримо свидетельствуют в пользу того, что рекомбинация между молекулами РНК полиовируса может идти по нерепликативному пути. Впервые было продемонстрировано существование гомологичной нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса. Было показано, что 5'- и З'-фрагменты могут объединяться путем (1) лигирования конец-в-коиец, (2 и 3) взаимодействия между 3'- или 5'-концевыми нуклеотидами одной молекулы и вн>тренним нуклеотидом другой молекулы и (4) взаимодействия между ви>тренними нуклеотидами двух молекул. Вставка целого 5'- или З'-фрагмента в рекомбипантную РНК активировалась присутствием З'-фосфата и 5'-ОН группы, соответственно.

Существование нерепликативной рекомбинации РНК предоставляет дополнительную возможность для объяснения эволюции вирусных и, возможно, клеточных геномов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Коршенко, Сергей Анатольевич

выводы

1. Доказана прннципиальиая возможность рекомбинации между фрагментами РНК вируса полиомиелита по перепликативному пути с образованием полноценных вирусных геномов.

2. Впервые показана возможность точной (гомологичной) нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса. Продемонстрировано, что 5'- и З'-фрагменты могут объединяться с образованием жизнеспособного вируса путем (1) лигирования конец-в-консц, (2 и 3) взаимодействия между 3'- или 5'-концевыми нуклеотидами одной молекулы с внутренним нуклеотидом другой молекулы и (4) взаимодействия между внутренними нуклеотидами двух молекул.

3. Показано, что для эффективного лигирования двух фрагментов РНК необходимо наличие у З'-фрагмента 5'-концевой ОН группы, а у 5'-фрагмента 3'-концевого фосфата или 2',3'-циклофосфата.

4. Показано, что включение целиком 5'- или З'-фрагмента во внутренний участок фрагмента-партнера происходит при наличии у 5'-фрагмента 3'-концевого фосфата, а у З'-фрагмента 5'-концевой ОН группы, соответственно.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко признателен моим научным руководителям, профессору Аголу В.И. и в.н.с. Гмылю А.П., за предложенную тему работы и возможность пройти настоящую научную школу. Я признателен также Белоусову Е.В. и Хитриной Е.В., в сотрудничестве с которыми была выполнена часть исследований. Большое спасибо всем сотрудникам лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова за оказанные поддержку и содействие при выполнении работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Коршенко, Сергей Анатольевич, 2003 год

1. Агол, В. И. (2002) Непостоянство генома пикорнавирусов. Молекулярная биология, том 36, №2, с. 286-295.

2. Грагеров, А. И. (1990) Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. Издательство «Высшая школа», с. 84-109.

3. Ленинджер, А. (1974) Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки. Издательство «Мир», с. 300-302.

4. Шапот, В. С. (1968) Нуклеазы. Издательство «Медицина», с. 9-135.

5. Aaziz, R., and Tepfer, М. (1999) Recombination in RNA viruses and in virus-resistant transgenic plants. J. Gen. Virol. 80, 1339-1346.

6. Abelson, J., Trotta, C.R., and Li, II. (1998) tRNA splicing. J. Biol. Chem. 273, 12685-12688.

7. Agol, V. I. (1991) The 5'-untranslated region of picornaviral genomes. Adv. Virus. Res. 40, 103-180.

8. Agol, V. I. (1997) Recombination and other genomic rearrangements in picornaviruses. Semin. Virol. 8, 1 -9.

9. Agol, V. I. (2002) Picornavirus genetics: An overview. In The molecular biology of picornaviruses (eds. B.L. Semler and E. Wimmer), pp. 269-284. ASM Press, Washington, DC.

10. Andino, R., Rieckhof, G. E., and Riesner, D. (1990) A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5' end of poliovirus RNA. Cell 63,369-380.

11. Arnold, J. J., and Cameron, С. E. (1999) Poliovirus RNA-dependent RNA polymerase (3Dpol) is sufficient for template switching in vitro. J. Biol. Chem. 274, 2706-2716.

12. Banner, L. R., Keck, J. G., and Lai, M. M. C. (1990) A clustering of RNA recombination sites adjacent to a hypcrvariable region of the peplomer gene of murine Coronavirus. Virology 175, 548-555.

13. Banner, L. R., and Lai, M. M. C. (1991) Random nature of Coronavirus RNA recombination in the absence of selection pressure. Virology 185,441-445.

14. Belov, G. A., Evstafieva, A. G., Rubtsov, Yu. P., Mikitas, O. V., Vartapetian, A. B., and Agol, V. I. (2000). Early alteration of nucleocytoplasmic traffic induced by some RNA viruses. Virology 275, 244-248

15. Billy, E., Hess, D., Hofsteenge, J., and Filipowicz, W. (1999) Characterization of the adenylation site in the RNA 3'-terminal phosphate cyclase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274,34955-34960.

16. Borman, A. M., Deliat, F. G., and Kean, K. M. (1994) Sequences within the poliovirus internal ribosome entry segment control viral RNA synthesis. EMBO J. 13,3149-3157.

17. Branch, A. D., Robertson, H. D., Greer, C., Gegenheimer, P., Peebles, C., and Abelson, J. (1982) Cell-free circularization of viroid progeny RNA by an RNA ligase from wheat germ. Science 217, 1147-1149.

18. Butcher, S. E. (2001) Structure and function of the small ribozymes. Structural Biology 11,315-320.

19. Carpenter, C. D., and Simon, A. E. (1996) In vivo restoration of biologically active 3' ends of virus-associatcd RNAs by nonhomologous RNA recombination and replacement of a terminal motif. J. Virol. 70,478-486.

20. Cascone, P. J., Carpenter, C. D., Li, X. H., and Simon A. E. (1990) Recombination between satellite RNAs of turnip crinkle virus. EMBOJ. 9, 1709-1715.

21. Cascone, P. J., Ilaydar, T. F., and Simon A. E. (1993) Sequences and structures required for recombination between virus-associated RNAs. Science 260, 801-805.

22. Cech, T. R., and Bass, B. L. (1986) Biological catalysis by RNA. Annu. Rev. Biochem. 55, 599-629.

23. Charini, W. A., Todd, S., Gutman, G. A., and Semler, B. L. (1994) Transduction of a human RNA sequence by poliovirus. J. Virol. 68, 6547-6552.

24. Chetverin, A. B., Chetverina, H. V., Demidenko, A. A., and Ugarov, V. I. (1997) Nonhomologous RNA Recombination in Cell-Free System: Evidence for a Transesterification Mechanism Guided by Secondary Structure. Cell 88,503-513.

25. Chetverina, H. V., and Chetverin, A. B. (1993) Cloning of RNA molecules in vitro. Nucleic Acids Res. 21, 2349-2353.

26. Chetverina, H. V., Demidenko, A. A., Ugarov, V. I., and Chetverin, A. B. (1999) Spontaneous rearrangements in RNA sequences. FEBS Lett. 450, 89-94.

27. Cooper, P. D. (1977) Genetics of picornaviruses. Comp. Virol. 9, 133-207.

28. Cruz-Reyes, J., Zhelonkina, A.G., Huang, C.E., and Sollner-Webb, B. (2002) Distinct functions of two RNA ligases in active Trypanosoma brucei RNA editing complexes. Mol. Cell Biol. 22,4652-4660.

29. Diaz, L., and DeStefano, J. J. (1996) Strand transfer is enhanced by mismatched nucleotides at the 3' primer terminus: A possible link between HIV reverse transcriptase fidelity and recombination. Nucleic Acids Res. 24, 3086-3092.

30. Diencr, T. O. (2001) The viroid: biological oddity or evolutionary fossil? Adv. Virus Res. 57, 137-184.

31. Dolja, V. V., and Carrington, J. C. (1992) Evolution of positive-strand RNA viruses. Semin. Virol. 3,315-326.

32. Doudna, J. A., and Cech, T. R. (2002) The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature 418, 222-228.

33. Duggal, R., Cuconati, A., Gromeier, M., and Wimmer, E. (1997) Genetic recombination of poliovirus in a cell-free system. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94, 13786-13791.

34. Duggal, R., and Wimmer, E. (1999) Genetic recombination of poliovirus in vitro and in vivo: temperature-dependent alteration of crossover sites. Virology 258(1), 30-41.

35. Egger, D., and Bienz, K. (2002) Recombination of poliovirus RNA proceeds in mixed replication complexes originating from distinct replication start sites. J. Virol. 76,10960-10971.

36. Fedor, M. J. (2000) Structure and function of the hairpin ribozyme. J. Mol. Biol. 297, 269-291.

37. Figlerowicz, M., Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1997) A mutation in the putative RNA polymerase gene inhibits nonhomologous, but not homologous, genetic recombination in RNA virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2073-2078.

38. Figlerowicz, M., Nagy, P. D., Tang, N., Kao, C. C., and Bujarski, J. J. (1998) Mutations in the N terminus of the brome mosaic virus polymerase affect genetic RNA-RNA recombination./. Virol. 72,9192-9200.

39. Figlerowicz, M. (2000) Role RNA structure in non-homologous recombination between genomic molecules of brome mosaic virus. Nucleic Acids Res. 28, 17141723.

40. Filipowicz, W., and Shatkin, A. J. (1983) Origin of splice junction phosphate in tRNAs processed by HeLa cell extract. Cell 32, 547-557.

41. Filipowicz, W., Billy, E., Drabikowski, K., and Genschik, P. (1998) Cyclases of the 3'-terminal phoshate in RNA: A new family of RNA processing enzymes conserved in Eucarya, Bacteria and Archaea. Acta Biochimica Polonica 45, 895-906.

42. Filipowicz, W., Konarska, M., Gross, H. J., and Shatkin, A. J. (1983) RNA 3'-terminal phosphate cyclase activity and RNA ligation in HeLa cell extract. Nucleic Acids Res. 11, 1405-1418.

43. Filipowicz, W., Strugala, K., Konarska, M., and Shatkin, A. J. (1985) Cyclization of RNA 3'-terminal phosphate by cyclase from HeLa cells proceeds via formation of N(3')pp(S')A activated intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1316-1320.

44. Frohman, M. A., and Martin, G. R. (1990) PCR protocols. Ed Innis M.A.N.Y.: Academic Press 228-236.

45. Gal-on, A., Meiri, E., Raccah, B., and Gaba, V. (1998) Recombination of engineered defective RNA species produces infective potyvirus in planta. J. Virol. 72, 52685270.

46. Genschik, P., Billy, E., Swianiewicz, M., and Filipowicz, W. (1997) The human RNA 3'-terminal phosphate cyclase is a member of a new family of proteins conserved in Eucarya, Bacteria and Archaea. EMBOJ. 16, 2955-2967.

47. Genschik, P., Drabikowski, K., and Filipowicz, W. (1998) Characterization of the Escherichia coli RNA 3'-terminal phoshate cyclase and Its a54-regulated operon, J. Biol. Chem. 273,25516-25526.

48. Gmyl, A. P., Belousov, E. V., Maslova, S. V., Khitrina, E. V., Chetverin, A. B., and Agol, V. I. (1999) Nonreplicative RNA recombination in poliovirus. J. Virol. 73, 8958-8965.

49. Gorbalenya, A. E. (1992) Host-related sequences in RNA viral genomes. Semin. Virol. 3, 359-371.

50. Hajjou, M., Hill, K. R., Subramaniam, S. V., Hu, J. Y., Raju, R. (1996) Nonhomologous RNA-RNA recombination events at the 3' nontranslated region of Sindbis virus genome: hot spots and utilisation of nonviral sequences. J. Virol. 70, 5153-5164.

51. Hirst, G. K. (1962) Genetic recombination with Newcastle disease virus, polioviruses, and influenza Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 27,303-309.

52. Jarvis, T. C., and Kirkegaard, K. (1991) The polymerase in its labyrinth: Mechanisms and implications of RNA recombination. Trends Genet. 7, 16-191.

53. Jarvis, T. C., and Kirkegaard, K. (1992) Poliovirus RNA recombination: mechanistic studies in the absence of selection. EMBOJ. 11,3135-3145.

54. Jeong, Y. S., and Makino, S. (1992) Mechanism of coronavirus transcription: duration of primary transcription initiation activity and effects of subgcnomic transcription on RNA replication. J. Virol. 66,3339-3346.

55. Kandel, E.S., and Nudler, E. (2002) Template switching by RNA polymerase II in vivo. Evidence and implications from a retroviral system. Mol. Cell 10, 1495-502.

56. Kassavetis, G. A., and Geiduschek, E. P. (1993) RNA polymerase marching backward. Science 259, 944-945.

57. Kirkegaard, K., and Baltimore, D. (1986) The mechanism of recombination in poliovirus. Cell 47,433-443.

58. Khatchikian, D., Orlich, M., and Rott, R. (1989) Increased viral pathogenicity after insertion of a 28S ribosomal RNA sequence into the haemagglutinin gene of an influenza virus. Nature 340, 156-157.

59. King, A. M. Q., McCahon, D., Saunders, K., Newman, J. W. I., and Slade, W. R. (1985) Multiple sites of recombination within the RNA genome of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 3,373-384.

60. King, A. M. Q. (1988) Preferred sites of recombination in polivirus RNA: An analysis of 40 intertypic cross-over sequences. Nucleic Acids Res. 16, 11705-11723.

61. Konarska, M., Filipowicz, W., Domdey, H., and Gross, H. J. (1981) Formation of a 2'-phosphomonoester, 3'-, 5-phosphodiester linkage by a novel RNA Iigase in wheat germ. Nature 293, 112-116.

62. Koonin, E. V., and Dolja, V. V. (1993) Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28,375-430.

63. Mayo, M. A., and Jolly, C. A. (1991) The 5'-terminal sequence of potato leafroll virus RNA: evidence of recombination between virus and host RNA. J. Gen. Virol. 72,2591-2595.

64. Milligan, J.F., Groebe, D.R., Witherell, G.W., and Uhlenbeck, O.C. (1987) Oligoribonuclcotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res. 15, 8783-8798.

65. Modahl, L. E., Macnaughton, T. B., Zhu, N., Johnson, D. L., and Lai, M. M. C. (2000) RNA-dependent replication and transcription of hepatitis delta virus RNA involve distinct cellular RNA polymerases. Mol. Cell. Biol. 20, 6030-6039.

66. Monroe, S. S., and Schlesinger, S. (1983) RNAs from two independently isolated defective interfering particles of Sindbis virus contain a cellular tRNA sequence at their 5' ends. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80,3279-3283.

67. Munishkin, A.V., Voronin, L. A., and Chetverin, A. B. (1988) An in vivo recombinant RNA capable of autocatalytic synthesis by Q beta replicase. Nature 333, 473-475.

68. Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1995) Efficient system of homologous RNA recombination in brome mosaic virus: sequence and structure requirements and accuracy of crossovers. J. Virol. 69, 131-140.

69. Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1996) Homologous RNA recombination in brome mosaic virus: AU-rich sequences decrease the accuracy of crossovers. J. Virol. 70, 415-426.

70. Nagy, P. D., and Bujarski, J. J. (1997) Engineering of homologous recombination hotspots with AU-rich sequences in brome mosaic virus. J. Virol. 71, 3799-3810.

71. Nagy, P. D., Dzianott, A., Ahlquist, P., and Bujarski, J. J. (1995) Mutations in the helicase-like domain of protein la alter the sites of RNA-RNA recombination in brome mosaic virus. J. Virol. 69, 2547-2556.

72. Nagy, P. D., Zhang, C., and Simon, A. E. (1998) Dissecting RNA recombination in vitro: role of RNA sequences and the viral replicase. EMDOJ. 17, 2392-2403.

73. Nagy, P. D., Ogiela, C., Bujarski, J. J. (1999) Mapping sequences active in homologous RNA recombination in brome mosaic virus: prediction of recombination hot spots. Virology 254(1), 92-104.

74. Negroni, M., Riccheti, M., Nouvel, P., Buc, H. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 69716975.

75. Nishikura, K. (2001) A short primer on RNAi: RNA-direeted RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell 107,415-418.

76. Pelletier, J., and Sonenbcrg, N. (1989) Internal binding of eucaryotic ribosomes on poliovirus RNA: translation in HeLa cell extracts. J. Virol. 67, 4543-4548.

77. Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Svitkin, Y. V., Sinyakov, A. N., and Agol, V. I. (1992) Prokaryotic-Iike cis-element in the cap-independent internal initiation of tanslation on Picornavirus RNA. Cell 68, 119-131.

78. Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., and Agol, V. I. (1995) A model for rearrangements in RNA genomes. Nucleic Acids Res. 23, 1870-1875.

79. Pleiss, J.A., Derrick, M.L., and Uhlenbeck, O.C. (1998) T7 RNA polymerase produces 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA 4,1313-1317.

80. Pringle, C. R. (1965) Evidence of genetic recombination in foot-and-mouth disease virus. Virology 25,48-54.

81. Qiao, X., Qiao, J., and Mindich, L. (1997) An in vitro system for the investigation of heterologous RNA recombination. Virology 237, 103-110.

82. Raju, R., Subramaniam, S. V., Hajjou, M. (1995) Genesis of Sindbis virus by in vivo recombination of nonreplicative RNA precursors. J. Virol. 69, 7391-7401

83. Reed, R. (2000) Mechanisms of fidelity in pre-mRNA splicing. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 340-345.

84. Reid, C. E., and Lazinski, D. W. (2000) A host-specific function is required for ligation of a wide variety of ribozymc-processed RNAs. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97,424-429.

85. Romanova, L. I., Tolskaya, E. A., Kolesnicova, M. S., and Agol, V. I. (1980) Biochemical evidence for intertypic genetic recombination of polioviruses. FEBS Lett. 118, 109-112.

86. Romani, A., Guerra, E., Trerotola, M., and Alberti, S. (2003) Detection and analysis of spliced chimeric mRNAs in sequence databanks. Nucleic Acids Res. 31, el 7.

87. Salgia, S.R., Singh, S.K., Gurha, P., and Gupta, R. (2003) Two reactions of Haloferax volcanii RNA splicing enzymes: Joining of exons and circularization of introns. RNA 9, 319-330.

88. Schiebel, W., Pelissier, T., Riedel, L., Thalmeir, S., Schiebel, R., Kempe, D., Lottspeich, F., Sänger, H. L., and Wassenegger, M. (1998) Isolation of an RNA-dircctcd RNA polymerase -specific cDNA clone from tomato. Plant Cell 10, 20872102.

89. Shiroki, K., Ishii, T., Aoki, T., Kobashi, M., Ohka, S., Nomoto, A. (1995) A new cis-acting clement for RNA replication within the 5'-noncoding region of poliovirus type 1 RNA. J. Virol. 69, 6825-6832.

90. Sidrauski, C., and Walter, P. (1997) The transmembrane kinase Irelp is a site-specific endonuclease that initiates mRNA splicing in the unfolded protein response. Cell 90, 1031-1039.

91. Simon, A. E., and Nagy, P. D. (1996) RNA recombination in turnip crinkle virus: its role in formation of chimeric RNAs, multimers, and in 3'-end repair. Semin. Virol. 7, 373-379.

92. Simpson, L., Sbiccgo, S. and Aphasizhev, R. (2003) Uridine insertion/deletion RNA editing in trypanosomc mitochondria: A complex business. RNA 9,265-276.

93. Slobodskaya, O. R., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Tolskaya, E. A., Victorova, E. G., and Agol, V. I. (1996) Poliovirus neurovirulence depends on the presence of a cryptic AUG upstream of the initiator codon. Virology 221, 141-150.

94. Soukup and Breaker. (1999) Relationship between internuclcotide linkage geometry and the stability of RNA. RNA 5, 1308-1325.

95. Sugino, A., Goodman, H. M., Heyneker, H. L., Shine, J., Boyer, H. W., Cozzarelli, N. R. (1977) Interaction of bacteriophage T4 RNA and DNA ligases in joining of duplex DNA at base-paired ends. J. Biol. Chem. 252,3987.

96. Symons, R. H. (1992) Small catalytic RNAs. Annu. Rev. Biochem. 61, 641-671.

97. Tang, R. S., Barton, D. J., Flanegan, J. B., and Kirkegaard, K. (1997) Poliovirus RNA recombination in cell-free extracts. RNA 3, 624-633.

98. Temin, H. M. (1993) Retrovirus variation and reverse transcription: abnormal strand transfers result in retrovirus genetic variation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 69006903.

99. Tolskaya, E. A., Romanova, L. I., Kolesnicova, M. S., and Agol, V. I. (1983) Intertypic recombination in poliovirus: Genetic and biochemical studies. Virology 124, 121-132.

100. Triana-Alonso, F. J., Dabrowski, M., Wadzack, J., and Nierhaus, K.H. (1995) Self-coded 3'-extension of run-off transcripts produces aberrant products during in vitro transcription with T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem. 270, 6298-6307.

101. Van der Werf, S., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., and Dunn, J. J. (1986) Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83,2330-2324.

102. Westaway, S. K., and Abelson, J. (1995) Splicing of tRNA precursors. In (RNA: Structure, Biosynthesis and Function (eds. Soell, D., and RajBhandary, U.), pp. 7992. ASM Press, Washington, DC.

103. Westaway, S. K., Phizicky, E. M., and Abelson, J. (1988) Structure and function of the yeast tRNA ligase gene. J. Biol. Chem. 263, 3171-3176.

104. Wimmer, E., Hellen, C. U., and Cao, X. (1993) Genetics of poliovirus. Annu. Rev. Genet. 27, 353-436.

105. Worobey, M. and Holmes, E.C. (1999) Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. J. Gen. Virol 80,2535-2543.

106. Yogo, Y., and Wimmer, E. (1972) Polyadenylic acid at the 3'-terminus of poliovirus RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 1877-1882.

107. Zhang, X., and Lai, M. M. C. (1994) Unusual Heterogeneity of leader-mRNA fusion in a Murine Coronavirus: implications for the mechanism of RNA transcription and recombination. J. Virol. 68,6626-6633.