Некоторые цитологические и физико-биохимические особенности развития микроспор и пыльцевых зерен кориандра IN SITU и IN VITRO в связи с индукцией андрогенных гаплоидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.05, кандидат биологических наук Егорова, Наталья Алексеевна

• Егорова, Наталья Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Егорова, Наталья Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ЦИТОМОРООЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИВАЮЩИХСЯ МИКРОСПОР И ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН ИГ SITU И IN VITRO /ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ/.

1.1. Некоторые особенности дифференцировки мужского гаметофита in situ

1.2. Экспериментальное изучение развития микроспор и пыльцевых зерен in vitro

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗВИТИЯ МИКРОСПОР

И ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН КОРИАНДРА

3.1. Длительность стадий развития микроспор и пыльцевых зерен и их корреляция с размерами бутонов

3.2. Дифференцировка микроспор и пыльцевых зерен кориандра

ГЛАВА 4. ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ,БЕЛКОВ И ЗАПАСНЫХ ВЕЩЕСТВ В МИКРОСПОРАХ И ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРНАХ КОРИАНДРА.

4.1. Динамика содержания ДНК в ядрах микроспор и пыльцевых зерен в процессе их развития

4.2. Накопление РНК и общего белка в цитоплазме микроспор и пыльцевых зерен

4.3. Накопление запасных веществ в микроспорах и пыльцевых зернах

ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЕ ОБЪЕМОВ КЛЕТОК, ЯДЕР И ЯДРЫШЕК В

ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ МИКРОСПОР И ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН КОРИАНДРА

5.1. Изменение объема ядер в развивающихся микроспорах и пыльцевых зернах

5.2. Изменение объема клеток и ядерно-клеточного отношения в ходе дифференцировки микроспор и пыльцевых зерен

5,3. Динамика изменения объема ядрышка и ядрышко-ядерного отношения в процессе развития микроспор и пыльцевых зерен

ГЛАВА 6. КРИТИЧЕСКИЕ ПУНКТЫ РАЗВИТИЯ МИКРОСПОР И

ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН КОРИАНДРА

ГЛАВА 7. ИНДУКЦИЯ АНДРОГЕННОГО РАЗВИТИЯ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ПЫЛЬНИКОВ И ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР КОРИАНДРА

7.1. Цитологические особенности индукции и первых этапов андрогенного развития пыльцевых зерен кориандра

7.2. Исследование действия предобработки на индукцию андрогенного развития у кориандра.

7.3. Влияние состава питательной среды на андро-генное развитие пыльцевых зерен кориандра.

7.4. Влияние стадии развития пыльника,физиологического состояния и генотипических особенностей донорных растений на развитие андрогенных пыльцевых зерен кориандра

7.5. Влияние некоторых условий культивирования пыльников и изолированных микроспор на развитие андрогенных пыльцевых зерен

ОБСУЖДЕНИЕ.'.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Некоторые цитологические и физико-биохимические особенности развития микроспор и пыльцевых зерен кориандра IN SITU и IN VITRO в связи с индукцией андрогенных гаплоидов»

Актуальность темы. В настоящее время в селекции, помимо традиционных методов отбора и гибридизации, широко используют полиплоидию, искусственный мутагенез, ЦМС и гаплоидию. Широкое внедрение этих методов в селекционную практику требует их глубокого всестороннего исследования. На ХХУ1 съезде КПСС, а также майском /1982 г./ Пленуме ЦК КПСС подчеркивалась необходимость укрепления теоретической базы селекции для успешного выведения высокопродуктивных сортов растений.

Одним из новых методов, который интенсивно внедряется в селекционные программы, является метод экспериментального андрогене-за, то есть получение гаплоидов в культуре пыльников и изолированных микроспор. Возможность быстрого выявления мутаций на основе гаплоидных растений, а также получение в короткие сроки гомозиготных линий при их диплоидизации - делает этот метод чрезвычайно привлекательным для селекционеров. Кроме того, исследование ан:дро-генеза в культуре пыльников имеет важное теоретическое значение при решении многих вопросов генетики, цитологии, физиологии.

Метод экспериментального андрогенеза возник сравнительно недавно, начиная с работ Гуха и Махешвари / Guha, Mabeshwari, 1964,1967/. Однако он быстро развивается и в настоящее время гаплоидные растения в культуре пыльников получены более чем у 20 видов культурных растений и уже практически используются в аналитической селекции рапса, табака, тритикале, риса, ячменя и пшеницы /Ницше, Венцель,1980/. Вместе с тем у многих видов растений попытки получения андрогенных гаплоидов оказались безуспешны. Неудачи, с которыми сталкиваются исследователи при индукции андрогенеза, есть прежде всего результат недостаточного знания регуляторных систем, направляющих мифоспоры по пути андрогенного развития. Для разработки метода экспериментального андрогенеза необходимо исследовать закономерности индукции андрогенного развития и влияния на этот процесс различных факторов, действие которых очень видоспецифично, - предобработки, стадии эксплантации, времени года и условий выращивания донорных растений, питательной среды, условий культивирования пыльников и некоторых других. Выяснение механизмов индукции андрогенеза и разработка методов направленного влияния на метаболизм микроспор с целью получения андрогенных гаплоидов зависят от глубины познания закономерностей дифференцировки мужского гаметофита in situ . Это связано с тем, что необходимо установить тот критический период в развитии микроспоры, характеризующийся определенными физиолого-биохимическими событиями, когда возможно осуществить переключение ее развития на путь андрогенеза. В настоящее время многие вопросы развития мужского гаметофита, которые могут быть связаны с индукцией андрогенеза, изучены пока недостаточно и лишь на примере нескольких видов. Сюда следует отнести вопросы биохимической дифференцировки на уровне нуклеиновых кислот и белков, ядерно-цитоплазматических взаимоотношений и в особенности критических событий в развитии микроспор. Поэтому первый этап исследований, связанных с индукцией андрогенных гаплоидов, предполагает изучение особенностей нормального развития клеток мужского гаметофита в естественных условиях.

Объектом данной работы является Кориандр / Coriandrum sativum L. / - основная эфиромасличная культура в СССР. Сорта кориандра характеризуются высокой гетерозиготностью по основным хозяйственно-ценным признакам, обусловленной перекрестным способом опыления. Получение чистых линий путем самоопыления является довольно длительным и трудоемким процессом. Разработка метода получения андрогенных гаплоидов у кориандра диктуется необходимостью создания гомозиготных линий для гетерозисной селекции и ускорения процесса выведения сортов, отвечающих современным требованиям производства. Сведений о культивировании пыльников с целью индукции андрогенеза у этого вида и у других видов семейства зонтичных в литературе не имеется. Имеющиеся в литературе сведения о развитии микроспор и пыльцевых зерен кориандра ограничены морфологическими характеристиками, что недостаточно для изучения механизмов андро-генного развития. В связи с этим, для того, чтобы разработать метод получения гаплоидов у этого растения, необходимо изучить цитологические и физиолого-биохимические особенности развития микроспор и пыльцевых зерен in situ , а также первые этапы андроген-ного развития ,в культуре пыльников и изолированных микроспор.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований было: изучить особенности дифференцировки микроспор кориандра in situ и найти пути экспериментального воздействия на их развитие для индукции андрогенных гаплоидов. Предполагалось решить следующие задачи:

1. Выявить критические пункты в развитии микроспор и пыльцевых зерен, прохождение которых обусловливает их необратимую диф-ференцировку.

2. Выяснить закономерности накопления нуклеиновых кислот, белков и запасных веществ в микроспорах и пыльцевых зернах, связанные с прохождением критических пунктов.

3.Изучить цитоморфологические особенности развития микроспор и пыльцевых зерен in situ в связи с процессами дифференцировки мужского гаметофита.

4. Исследовать цитологические особенности пыльцевых зерен in vitro , а также влияние ряда факторов на индукцию и дальнейшее развитие андрогенных пыльцевых зерен: предобработки, стадии развития пыльника, времени года, условий выращивания и генотипа донорных растений, питательной среды, условий культивирования пыльников и разработать экспериментальные методы индукции андрогенного развития.

В процессе микроспоро- и гаметогенеза мы изучали те этапы развития мужского гаметофита, на которых в соответствии с существующими литературными данными может произойти индукция андрогенного развития. Этот период охватывает развитие спорогенных клеток, начиная с тетрад микроспор до сформировавшихся двуклеточных пыльцевых зерен. При этом, наряду с морфологической характеристикой развития микроспор и пыльцевых зерен, изучались особенности накопления нуклеиновых кислот и белков, а также цито- и кариометриче-ские параметры как показатели функциональной активности клеток мужского гаметофита. Для установления критических пунктов диффе-ренцировки микроспор применялся метод культуры изолированных пыльников и бутонов. Предпринята попытка индуцировать андрогенное развитие микроспор кориандра в культуре пыльников и изолированных микроспор.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе впервые выявлены биохимические и морфометрические особенности диффе-ренцировки микроспор и пыльцевых зерен двух сортов кориандра, а также критические пункты их развития. Установлена репликация ДНК в ядре вегетативной клетки и показано увеличение содержания цито-плазматической РНК и белков на определенных этапах развития пыльцевого зерна. Полученные результаты представляют интерес для понимания процесса микроспоро- и гаметогенеза у кориандра, а также у других растений, имеющих трехклеточный мужской гаметофит.

Показана возможность индукции андрогенного развития у кориандра и изучено влияние на него ряда факторов: условий выращивания растений-доноров, времени года, стадии развития пыльников, предобработки, генотипических особенностей растений, состава питательной среды и условий культивирования пыльников. Данное исследование расширяет представления об общих закономерностях и механизмах индукции андрогенеза у растений, а таюке является первым этапом разработки метода получения андрогенных гаплоидов у кориандра. На основании проведенной работы предлагается методика получения андрогенных эмбриоидовв культуре пыльников кориандра.

Основные положения диссертационной работы, вынесенные на защиту:

- Синтез ДНК в микроспорах кориандра имеет двухэтапный характер и в пыльцевых зернах осуществляется как в ядре генеративной, так и вегетативной клеток.

- в микроспорах кориандра максимальное содержание РНК, белков и липидов, а таюке объем ядра, ядрышка и ядрышко-ядерное отношение установлено в поздней интерфазе.

- Образование вегетативной и генеративной клеток детерминируется в поздней интерфазе микроспор, а программирование их дальнейшей постмитотической дифференцировки завершается на стадии молодых двуклеточных пыльцевых зерен.

- Оптимальной для индукции андрогенеза у кориандра является стадия поздней интерфазы микроспор, характеризующаяся нестабильностью дифференцировки и высокой метаболической активностью.

- На индукцию андрогенного развития у кориандра достоверно влияют генотипические особенности и условия выращивания донорных растений, холодовая предобработка, стадия изоляции, время года, состав питательной среды и условия культивирования пыльников и микроспор,

- Установлены оптимальные условия индукции и изучены первые этапы андрогенного развития кориандра.

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной биологии ВНИИЭМК /г.Симферополь/ в течение I978-I98I гг. в соответствии с планом научно-исследовательских работ института по теме 01.30 "Разработать методы и получить андрогенные гаплоиды эфиромаслич-ных 1огльтур /кориандра, шалфея, лаванды/ с целью создания генофонда и интенсификации селекционного процесса" / № госрегистрации 81095790/.

Заключение диссертации по теме «Ботаника», Егорова, Наталья Алексеевна

ВЫВОДЫ

Цитоэмбриологическое исследование развития микроспор и пыльцевых зерен Coriandrua sativum L. с применением цитометрии и методов количественной цитохимии в связи с проблемой индукции андрогенеза позволило выявить ряд ранее неизученных особенностей дифференцировки мужского гаметофита этого вида, касающихся накопления нуклеиновых кислот и белков, изменения объема клетки и основных ее структур - ядра и ядрышка. В исследованиях in vitro установлены критические пункты дифференцировки микроспор и пыльцевых зерен, а также индуцировано андрогенное развитие пыльцевых зерен.

1. Развитие мужского гаметофита у двух исследованных сортов кориандра протекает сходным образом и без существенных отклонений. Установлена длительность стадий микроспоро- и гаметогенеза и их корреляция с размерами бутонов.

2. Синтез ДНК в микроспорах проходит в 2 этапа и завершается в поздней интерфазе. В , двуклеточном пыльцевом зерне осуществляется репликация ДНК в ядре генеративной и вегетативной клеток, при этом в вегетативной клетке наблюдается отставание синтеза.

3. Содержание РНК и белков в цитоплазме увеличивается в ходе развития микроспор и достигает максимума на стадии поздней интерфазы; в вегетативной клетке двуклеточного пыльцевого зерна продолжается интенсивное накопление этих веществ.

4. В ходе дифференцировки микроспор кориандра выявлено два типа изменений объема ядер: связанное с удвоением содержания ДНК /в поздней интерфазе микроспор/ и функциональное увеличение /в молодых микроспорах с тонкой оболочкой/. В двуклеточном пыльцевом зерне объем ядер вегетативной и генеративной клеток уменьшен по отношению к содержанию в них ДНК.

5. Увеличение объема ядрышка и ядрышко-ядерного отношения наблюдается в микроспорах в поздней интерфазе и в вегетативной клетке пыльцевого зерна, что связано с повышенной метаболической активностью.

6. При использовании метода культуры пыльников установлены критические пункты развития микроспор и пыльцевых зерен. Образование вегетативной и генеративной клеток детерминируется в поздней интерфазе микроспор, а программирование их дальнейшей постмитоти-ческой дифференцировки завершается на стадии молодых двуклеточных пыльцевых зерен. Стадия поздней интерфазы микроспор характеризуется высокой нестабильностью дифференцировки.

7. Индукция андрогенного развития у кориандра получена в ходе предобработки соцветий низкой положительной температурой

15 дней при 7°С/, а также при эксплантации пыльников на питательные среды, содержащие определенное сочетание цитокининов и ауксинов.

8. Оптимальной для индукции андрогенеза у кориандра является стадия поздней интерфазы микроспор, характеризующаяся завершением репликации ДНК, высокой метаболической активностью и нестабильностью дифференцировки.

9. Андрогенное развитие пыльцевых зерен кориандра в культуре пыльников осуществляется как путем равного деления микроспоры /В-путь/, так и путем деления вегетативной клетки после формирования нормального двуклеточного пыльцевого зерна /А-путь/.

10. Оптимальное сочетание предобработки и состава питательной среды при последующем культивировании пыльников и изолированных пыльцевых зерен позволило получить многоклеточные эмбриоиды /до

12 клеток/, выходящие из оболочки пыльцевого зерна.

11. Наряду с предобработкой, составом питательной среды и стадией развития пыльника важная роль в индукции андрогенного развития у кориандра принадлежит также времени года, условиям выращивания и генотипическим особенностям растений-доноров и условиям культивирования пыльников. Выявлены оптимальные параметры всех указанных факторов, обеспечивающие образование наибольшего числа андрогенных пыльцевых зерен и эмбриоидов.

12. Установлено, что соматические ткани стенки пыльника благоприятно влияют на индукцию и первые этапы развития андрогенных пыльцевых зерен, однако они оказывают ингибирующее влияние на их дальнейшее развитие. В связи с этим предложено двухэтапное культивирование /пыльники - изолированные пыльцевые зерна/.

13. Разработана методика по индуцированию андрогенных гаплоидных эмбриоидов кориандра.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Егорова, Наталья Алексеевна, 1984 год

1. Основные направления экономического и социального развития СССР на 1981-1985 годы и на период до 1990 года. - В кн.: Материалы 26 съезда КПСС. М.: Политиздат,1981, с.131-206.

2. Продовольственная программа СССР на период до 1990 года и меры по ее реализации: Материалы майского Пленума ЦК КПСС 1982 г.-М.: Политиздат,1982. III с.

3. Алексеенко Л. Каллусообразование в культуре тканей in vitroу Solanum Laciniatum ait . Известия АН ЭССР, Сер.Биология, 1977, т.26, № 3, с.208-211.

4. Атанасов А.и., Бутенко Р.Г. Культура изолированных пыльников сахарной свеклы. Физиология и биохимия культурных растений, 1980, т.12, № I, с.49-56.

5. Банникова В.П.,Овсянникова 0.В.,Заславский В.А.,Хведынич О.А. Цитохимическое исследование содержания ДНК в развивающихся пыльцевых зернах лилии королевской. В кн.: ХП Междунар. ботан.конгресс: Тез.докл. Л.,1975, с.243.

6. Банникова В.П., Хведынич О.А.,Овсянникова 0.В.,Заславский В.А. Цитофотометрическое исследование синтеза ДнК в ядрах пыльцевых зерен некоторых покрытосеменных. ДАН УССР, Сер. Б., 1976, №6, с.528-531.

7. Банникова в.П., Хведынич О.А.,Овсянникова О.В. Морфологическая и цитохимическая характеристика ядер пыльцевых зерен некоторых Angiospermae . Укр.оот.журн.,197V, т.34, № 6, С.568-571.

8. Банникова В.П., Хведынич О.А. Основы эмбриологии растений. -Киев: Наукова думка,1982. 164 с.

9. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы. Л.:Колос /Ленингр.отд./, 1974. - 206 с.

10. Батыгина Т.Е. Пыльник как модель изучения морфогенетических потенций и путей морфогенеза. Б кн.: Развитие мужской генеративной сферы растений /морфо-физиологические аспекты/: Тез. докл.Всес. симпозиума. Симферополь, 1983,с.9-10.

11. Болховских З.В. Динамика нуклеиновых кислот в дифференциальном митозе микроспоры Lilium . В кн.: Материалы П науч. конференции по нуклеиновым кислотам растений. Уфа, 1962,с.25-26.

12. Болховских З.В. Динамика нуклеиновых кислот при формировании генеративной и вегетативной клеток пыльцевого зерна лилии. -Цитология, 1965, т.7, № 6, с.745-748.

13. Болховских З.В. Исследование развития пыльцевого зерна методом авторадиографии. В кн.: Мат-лы Всес.симпозиума по эмбриологии растений: Тез.докл. Киев: Hayк.думка,1968, с.37-38.

14. Болховских З.В. Морфологическое и цитофотометрическое исследование формирования пыльцевого зерна Najas major All. .

15. В кн.: Половой процесс и эмбриогенез растений: Мат-лы Всес. симпозиума. М. ,1973, с.24-26.

16. Боннер Дж.Молекулярная биология развития. М.: Мир,1967. -180 с.

17. Браше Ж. Биохимическая эмбриология. М.:ИЛ,1961. - 327 с.

18. Бродский В.Я. Неделящееся ядро. В кн.: Руководство по цитологии. М.-Л.: Наука,1965, с.269-332.

19. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272 с.

20. Бахтин Ю.Б. Генетика соматических клеток. Л.: Наука,1974.-258 с.

21. Вермель Е.М. Учение о клеточных размерах. Ученые записки Московского педагогического ин-та, 1940, т.25, № I, с.3-131.

22. Внучкова В.А. Получение гаплоидов из пыльников тритикале и их цитологическая характеристика. Докл.ВАСХНИЛ, 1979, № 10, с.8-10.

23. Гельцер Ф.Ю. Новые продуценты стимулирующих веществ для растений. Докл.ВАСХНИЛ, 1975, № 5, с.16-18.

24. Герасимова-Навашина Е.Н. Пыльцевое зерно, гаметы и половой процесс у покрытосеменных растений. Тр.Ботан.ин-та АН СССР, 195I, в.2, с.7, с.294-355.

25. Дейч А. Цитофотометрия белков. В кн.: Введение в количественную цитохимию. М.:Мир, 1969, с.359-372.

26. Дженсен У. Ботаническая гистохимия. М.:Мир,1965. - 374 с.

27. Ельцина Н.В. Роль негистоновых белков хроматина в регуляции генетической активности. Усп.совр.биол.,1979, т.87, № I, с.3-15.

28. Епифанова О.И. Изучение регуляторных механизмов митотического цикла с помощью ингибиторов процессов транскрипции и трансляции. В сб.: Клеточный цикл. М.:Наука,1973, с.72-103.

29. Ерохина А.И., Резникова С.А. Особенности репликации ДНК и состояния хроматина в генеративной и вегетативной клетках развивающегося пыльцевого зерна лилии. Цитология и генетика, 1982, т.16, № 2, с.29-34.

30. Закс Л. Статистическое оценивание. М.:Статистика,1976.-598 с.31