Некоторые аспекты репродуктивной биологии видов и сортов Lilium L.: полиплоидия, семенное размножение, пигменты околоцветников тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.01, кандидат биологических наук Лабунская, Наталия Александровна

• Лабунская, Наталия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лабунская, Наталия Александровна

содержание

введение

глава 1. проблемы увеличения биоразнообразия и размножения у lilium (обзор литературы)

1.1. Роль полилоидии в формировании ассортимента декоративных растений

1.2. Методы идентификации полиплоидов

1.3. Достижения экспериментальной полиплоидии у лилий

1.4. Культура лилий in vitro

1.5. Пигменты цветков лилий

глава 2. объекты, условия и методы исследований

2.1. Объекты исследований

2.2. Условия исследований

2.3. Методы исследований

глава 3. идентификация полиплоидов

3.1. Изучение признака длины замыкающих клеток устьиц

3.2. Определение числа хромосом на давленых препаратах

глава 4. митотическая полиплоидизация

4.1. Получение полиплоидов

4.2. Оценка полученного материала

глава 5. мейотическая полиплоидизация

5.1. Искусственная гибридизация: варианты скрещиваний и семенная продуктивность

5.2. Культивирование гибридных сеянцев

5.2.1. Стерилизация семян

5.2.2. Оценка питательной среды для культивирования сеянцев

5.2.3. Плоидностъ гибридных сеянцев

глава 6. пигменты околоцветников лилий

список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Некоторые аспекты репродуктивной биологии видов и сортов Lilium L.: полиплоидия, семенное размножение, пигменты околоцветников»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Лилии на протяжении многих веков почитались народами мира за нарядные, изящные и ароматные цветки. Лилии использовались как пищевые, лечебные и декоративные растения, украшавшие дворцы и храмы. О лилиях слагались легенды и песни, изображения лилий часто встречались в разнообразных произведениях искусства. Издавна известны целебные свойства лилий. Древнегреческий врач Диоскорид в своём знаменитом медицинском трактате "О лекарственных средствах" отметил, что лилии лесная и белая способствуют заживлению ран, ожогов, синяков и ссадин, успокаивают зубную боль, исцеляют сердечные болезни (Недялков, 2009). Использование лилий в цветоводстве растет с каждым годом. Самую большую популярность получили лилии на приусадебных и дачных участках. Разнообразие лилий по окраске, форме цветка, высоте растений, срокам цветения позволяет их использовать в самых различных сочетаниях между собой и другими многолетниками. Лилии пригодны для контейнерной культуры, что дает возможность размещать цветущие растения в самых неудобных местах - на асфальте, каменистых участках, балконах, внутренних двориках (Киреева, 1992). Лилии используются в медицине и косметике. Препараты из белой лилии используются как кровоостанавливающее, раноза-живляющее и болеутоляющее средство. Они тонизируют нервную систему, обладают отхаркивающим действием (Лойко, 2010).

В настоящее время известно около 100 видов лилий, в нашей стране и за рубежом создано свыше 10 тысяч сортов лилий, и каждый год этот список пополняется (The International ..., 2007).

Вопросами полиплоидизации лилий в мире занимаются исследователи более полувека. Весомый вклад в развитие отечественного лилиеводства внесли ученые ботаники и селекционеры - М.В.Баранова, Н.Г. Коршикова, Е.И. Шиповская, М.Ф. Киреева, а также цветоводы-любители, такие как -

A.B. Отрошко, B.M. Чучин (Баранова, 1977, 1990, 1999, 2000; Коршикова, 1980, 1981, 1988; Шиповская, 1972; Киреева, 1981, 1984, 1988, 1992, 2000, 2001; Отрошко, 1992, 1993; Чучин, 1999).

Известно, что растения рода Lilium L. не склонны к самопроизвольному умножению числа хромосом ни в природе, ни в культуре. Сорта-полиплоиды единичны в мировом сортименте этого рода, поэтому искусственная полиплоидизация имеет важное значение.

Многие виды и сорта лилий обладают крупными генеративными побегами и цветками, поэтому при получении полипоидов чаще хотят получить растения не столько с эффектом гигантизма, сколько с другими ценными признаками, такими как более плотные (толстые) листочки околоцветника и листьев, прочные, крепкие стебли, обуславливающие пряморослость цветоносного побега и более долгую сохранность в срезке, устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, в том числе к вирусным болезням, более высокая продуктивность. Тетраплоиды необходимы для получения триплоидов, а также очень перспективны в селекции при отдаленной гибридизации. Многие триплоиды, полученные в результате отдаленных скрещиваний и считавшиеся ранее неперспективными для селекции вследствие стерильности, оказались способными завязывать семена при опылении тетраплоидами (Schenk, 1987). В России работы по полиплоидизации лилий очень малочисленны, несмотря на их актуальность (Матвеева, 1980).

Так как многие виды и сорта лилий не имеют аромата, окраска их околоцветников играет большую роль в процессе опыления для привлечения насекомых, влияя на семенную продуктивность растений. Кроме того, пигменты околоцветников (антоцианы и каротиноиды) представляют значительный интерес для пищевой промышленности как потенциальное сырье для производства естественных красителей. Однако в настоящее время пигментный состав околоцветников изучен слабо. Известно, что околоцветники растений-полиплоидов имеют более интенсивную окраску (Матвеева, 1980). Поэтому актуален поиск перспективных видов и сортов лилий - источников

ценных пигментов в околоцветниках - для их полиплоидизации и использования в селекции.

Цель и задачи исследований. Цель работы - создание полиплоидов лилий и совершенствование методов их идентификации, выявление пигментного состава околоцветников у некоторых видов и сортов для пополнения ассортимента травянистых поликарпиков новыми хозяйственно-ценными формами.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- получить полиплоиды методами митотической и мейотической полиплоидизации с последующей их идентификацией;

- выявить информационно значимые метрические характеристики усть-ичного аппарата для косвенного метода оценки уровня плоидности у лилий;

- усовершенствовать методику подсчета хромосом на давленых препаратах из корешков лилий для определения уровня плоидности;

- оптимизировать методику проращивания ценных семян лилий in vitro;

- исследовать пигментный состав листочков околоцветника лилий.

Научная новизна. Получены полиплоидные формы и гибриды лилий

путем митотической и мейотической полиплоидизации. Впервые изучена вариабельность длины замыкающих клеток устьиц для прогноза и оценки уровня плоидности у лилий. Предложены новые методические подходы для оценки эффективности различных способов предфиксационной обработки растительного материала при приготовлении давленых препаратов для подсчета числа хромосом. Выявлены наиболее простые и эффективные способы предобработки корешков лилий для подсчета числа хромосом на давленых препаратах и усовершенствованы некоторые из них. Для повышения выхода ценных сеянцев оптимизирован способ проращивания гибридных семян на безгормональной питательной среде in vitro. Получены новые данные по

пигментному составу листочков околоцветника и выявлены наиболее ценные виды и сорта лилий по данному признаку.

Практическая значимость. Усовершенствованы методики получения и идентификации полиплоидов лилий на различных этапах. Выявлены ценные виды и сорта, являющиеся источниками капсантина и цианидин-3-рутинозида, перспективные для использования в качестве пищевых красителей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Мейотическая полиплоидизация с использованием сортов-тетраплоидов 'Foggia' и 'Nove Cento' с последующим проращиванием семян in vitro позволяют обогатить генофонд лилий ценными полиплоидными формами.

2. Метрические данные замыкающих клеток устьиц листьев лилий с учетом их вариабельности позволяют повысить эффективность работы по выявлению полиплоидов на начальных этапах исследований.

3. Для подсчета числа хромосом у гибридов и форм лилий оптимальна комбинированная предфиксационная обработка цитологического материала, сочетающая обработку растворами мутагенов и охлаждение.

4. Некоторые виды и сорта лилий с красными (L. buschianum и L. pumi-lum) и бордовыми ('Summer Night', 'Забава') околоцветниками являются ценным сырьем для получения каротиноидов (капсантина и капсорубина) и антоцианов (цианидин-3 -рутинозида).

Апробация результатов работы. Результаты исследований докладывались и публиковались на конференциях молодых ученых (Санкт-Петербург, 2006; Белгород, 2006; Владикавказ, 2007), межрегиональной конференции «Биоразнообразие - от идеи до реализации» (Тамбов, 2007), всероссийских научно-практических конференциях «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Белгород, 2008), «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар-Уфа, 2008), международных научных конеренциях «Цветоводство без границ»

(Харьков, 2006), «Биологические науки. Секция молодых ученых, студентов и специалистов» при РАЕ (Москва, 2007), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии» (Белгород, 2007).

По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, 3 из которых в изданиях, рекомендуемых Перечнем ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах текста, состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций, содержит 26 таблиц, 31 рисунок. Список используемой литературы включает 218 источников, в том числе 64 - иностранных.

глава 1. проблемы увеличения биоразнообразия и размножения у ыьшм (обзор литературы)

1.1. Роль полилоидии в формировании ассортимента декоративных

растений

В естественных условиях и в культуре полиплоидные формы могут возникать под влиянием различных факторов (физических, механических, химических и др.), способных воздействовать на процесс образования половых клеток (мейоз) и на механизм клеточного деления в соматических тканях (митоз). Под влиянием этих факторов происходит образование нередуцированных гамет в процессе мейоза или нарушается расхождение хромосом к полюсам делящейся клетки в процессе митоза. Такими факторами могут быть резкие смены температуры, крайние высокие или крайние низкие температуры, ионизирующие излучения, изменение светового режима, различные механические повреждения тканей растения, действие гербицидов и фунгицидов и других химических воздействий, бактериальные и грибковые инфекции, укусы насекомых, изменение содержания в почве минеральных веществ, нарушение нормального водоснабжения и т. д. (Наза-ренко, 1975; Матвеева, 1980; Современные, 1991; Седышева, 1994; Санкин 1997; Яшин и др., 2000).

Возникновение спонтанных полиплоидов может происходить тремя основными путями (Матвеева, 1980).

1. Полиплоиды появляются в результате нарушений мейоза и слияния гамет, из которых одна или обе нередуцированы. Соединение двух нередуцированных гамет дает зиготу с удвоенным числом хромосом, из которой развивается тетраплоидный организм (2п+2п=4п). Однако гораздо чаще нередуцированные гаметы сливаются в процессе оплодотворения с нормальными гаплоидными, давая начало триплоидному организму (2п+п=3п). В

обоих случаях спонтанные полиплоиды образуются в первом поколении

(Fi).

2. Увеличение числа хромосом происходит в результате образования во время мейоза нередуцированных гамет во втором или в последующих поколениях гибридов, а также при скрещивании этих гибридов с другими компонентами или в результате обратных скрещиваний.

3. Увеличение числа хромосом наблюдается в соматических тканях в период деления их клеток (митоза). Образование полиплоидных клеток связано с нарушениями, сущность которых сводится к подавлению функции веретена деления, обеспечивающего движение хромосом к полюсам. При этом в клетках идет нормальный митотический цикл, но хромосомы не расходятся к полюсам. В результате образуются клетки с удвоенным числом хромосом. Митотическое удвоение числа хромосом широко используется в практике экспериментального получения полиплоидных растений. В природе этот путь возникновения полиплоидии, по-видимому, встречается значительно реже мейотического. Достоверных случаев спонтанного соматического удвоения известно очень мало (Матвеева, 1980; Отдаленная..., 1989).

Частота возникновения спонтанных полиплоидов зависит от частоты появления нередуцированных гамет и их общего количества, а также от факторов, способствующих участию именно этих нередуцированных гамет в оплодотворении. Такими факторами могут быть различные, необычные для данного вида неблагоприятные условия окружающей среды. Функционирование нередуцированных гамет часто наблюдается и при отдаленных, экзотических скрещиваниях, значительно реже - при внутривидовой гибридизации (Матвеева, 1980; Васариетис, 1993).

Появление спонтанных полиплоидов в природе чаще всего наблюдается на границе распространения исходных диплоидных видов, где они встречаются с необычными для них условиями. Описан ряд случаев массо-

вого возникновения полиплоидных форм у некоторых культурных плодовых и кормовых растений под влиянием резких похолоданий, например, после необычной волны холода, распространившейся во время микроспоро-генеза в фазу бутонизации растений. Таким образом, возникновение спонтанных полиплоидов - сложный процесс, обусловленный взаимодействием ряда генетических, цитологических, эмбриологических и экологических факторов (Матвеева, 1980).

За рубежом широко используется искусственная полиплоидизация.

Преимущества полиплоидов у декоративных растений. У полиплоидов наблюдается увеличение размера растений и, соответственно, размера цветков. Изменяются не только размеры, но и структура тканей, текстура листочков околоцветника, что очень важно для успешной транспортировки растений. Цветок становится очень плотным, «восковым», медленнее увядает. Многие полиплоидные гибриды также обладают более интенсивной окраской листьев. Кроме того, способны лучше переносить суровые климатические условия (среди всех цветковых растений в арктических широтах полиплоиды составляют более 70%, на Памире - 86%, на Алтае - 65%) и лучше приспособлены к неблагоприятным местам обитания; они могут устоять перед более широким диапазоном температур и влажности, чем диплоиды (Клоц, 1998; Polyploidy, 2003; Жимулев, 2006).

Недостатки полиплоидов. У полиплоидов часто замедлено развитие растений. Цветение наступает позднее, как правило, с меньшим количеством цветков, хотя и более крупного размера. Кроме того, часто полиплоиды, в частности триплоиды, обладают низкой фертильностью. У растений завязывается относительно небольшое количество семян с низкой жизнеспособностью (Отрошко 1992; Жукова, 2008). Полиплоидия имеет тенденцию понижать осмотическое давление у растений. Это может быть неблагоприятной чертой, поскольку растение с более высоким осмотическим давле-

нием способно добывать больше воды из почвы, чем растение с низким осмотическим давлением (Клоц, 1998).

Методы получения полиплоидов. Выделяют несколько способов получения полиплоидов:

- преобразование в тетраплоидные уже существующих сортов, обрабатывая их диплоидные ткани колхицином или другим веществом, ин-гибирующим функции веретена клеточного деления (Трунин, 1976; Jaap М. van Tuyl и др., 1990; Отрошко, 1993; Ishikawa и др., 1997; Dabkeviciene,

1999);

- есть вероятность, что триплоиды и тетраплоиды появляются в нормальных диплоидных кроссах (например, скрещивания с видом Lilium pumilum Delile могут давать тетраплоидные сеянцы) (Отрошко, 1993; Lim Ki-Byung, 2004);

- скрещивания 2nx4n и 4nx2n для получения триплоидов (Jaap М. van Tuyl и др., 1990; Отрошко, 1993);

- опыление триплоидов пыльцой от тетраплоидов для получения тетраплоидных сеянцев (Васариетис, 1992);

- наиболее результативный способ получения тетраплоидов — скрещивание двух тетраплоидов между собой (Отрошко, 1993; Kazunori,

2000).

Есть мнение, что контроль роста клетки растяжением происходит на двух уровнях: под влиянием гормонов и таких внутриклеточных свойств, как способности стенки к растяжению и осмотического потенциала. Существует много работ, показавших, что размер клеток определяется балансом между эндогенными стимуляторами и ингибиторами роста. К первым относятся ауксины, гиббереллины и цитокинины, ко вторым - абсцизовая кислота (АБК), фенольные соединения и другие вещества.

Количество ДНК на геном уменьшается с увеличением плоидности ядра. Такая тенденция свойственна и животным и растениям (Бормотов, Лопатина, 1986).

Для искусственного индуцирования полиплоидии используются те же факторы, которые вызывают удвоение хромосом в природе: физические (температурные воздействия, ионизирующие излучения), механические (повреждение тканей, центрифугирование), химические (апиоль, аценафтен, ауранция, вератрин, гаммексан, глориозин, закись азота, колхицин, линдан, сангуинарин, фенилуретан, хлоралгидрат, хлороформ и многие другие); многие из таких веществ, называемых антимитотическими или митокласти-ческими, не нашли широкого распространения ввиду их большой токсичности или же малой эффективности (Матвеева, 1980; Бороевич, 1984; Химический..., 1993).

Алкалоид колхицин впервые применили А.Ф. Блексли, А.Дж. Эйвери и Б. Небел в 1937 г. Колхицином обрабатывают точки роста растений или инъецируют его животным в водном растворе (Жимулев, 2006). Поскольку колхицин действует только на делящиеся клетки, применять его следует на молодых тканях, клетки которых находятся в процессе интенсивного деления. Эффективность обработки зависит от количества митозов в момент воздействия. Поэтому для полиплоидизации обычно используют ювениль-ные онтогенетические состояния растений в период, когда их меристемати-ческие ткани обладают максимальным количеством делящихся клеток. Обычно действуют на прорастающие семена (Бакулин, 1974; Трунин, 1984; Дабкявичене, 1994; Dabkeviciene, 1995; Зеленцов, 2003), плоды и проростки, точки роста растений, пробуждающиеся почки (Бороевич, 1984; Kazunori и др., 2000), молодые бутоны; чешуи луковиц (Strasser, 1983; Andersen, 1989; Jaap M. van Tuyl и др., 1989; Jaap M. van Tuyl и др., 1990б); формирующиеся дочерние луковицы и клубни, листовые меристемы и другие меристематические очаги.

Чувствительность к колхицину неодинакова у разных растений и в различные периоды их развития. Корневая система более чувствительна к колхицину, чем верхушечные точки роста, и для ее обработки рекомендуют применять более низкие концентрации. Сравнительно низкие концентрации колхицина используют также при обработке молодых проростков, которые чувствительнее к его действию, чем взрослые растения. При воздействии через корни и при обработке проростков чаще всего применяют колхицин в концентрации 0,1-0,2% (Матвеева, 1980; ЕшБшеНег, 1988; Савченко, 1990), при обработке стеблевых точек роста - 0,5-2,5%. Оптимальные условия обработки колхицином следует в каждом конкретном случае определять сначала в опыте, испытывая различные варианты концентраций и экспозиций.

Применительно к различным объектам и в зависимости от концентрации колхицинирование проводят от нескольких часов до нескольких суток (Матвеева, 1980; Егш^уеПег, 1988). Рациональнее применять относительно высокие концентрации и непродолжительные экспозиции, так как длительные сроки обработки могут привести к появлению растений с высокими степенями плоидности, которые обычно вскоре погибают (Матвеева, 1980).

Г.И. Халипова утверждает, что наиболее эффективным действием, приводящим к полиплоидизации, обладает 0,1% водный раствор колхицина, действующий в течение 18-24 часов (Халипова, 1990).

Первые 3-4 недели после обработки колхицином растения находятся в угнетенном состоянии, приостанавливаются в росте, многие погибают. Особенно впервые недели после обработки колхицином необходимо тщательное наблюдение за растениями и строгое соблюдение режима температуры и влажности, причем следует содержать растения на рассеянном свете.

С помощью колхицина можно вызвать удвоение числа хромосом в любой меристематической ткани, находящейся в стадии интенсивных клеточных делений. Однако необходимо принимать во внимание биологиче-

ские особенности обрабатываемого растения, так как для успешного индуцирования полиплоидии далеко не безразлично, какая часть растения подвергается обработке. Только в очень редких случаях при обработке на самых ранних стадиях развития растений удается добиться, чтобы во всех его клетках удвоилось число хромосом. Чаще всего некоторая или значительная часть клеток (которые находились в покоящемся состоянии в момент воздействия колхицина) остаются диплоидными. В результате образуются химерные растения (Матвеева, 1980; БаЬкеу1с1епе, 1999), ткани которых имеют различные числа хромосом, что значительно затрудняет дальнейшую работу. Химерность (миксоплоидию) можно отчасти снизить путем предварительного помещения растений на холод. В результате этого у них задерживается митоз, а при последующем внесении растений в теплое помещение начинается бурное, синхронное деление всех клеток. Такой прием увеличивает количество клеток, становящихся полиплоидными под воздействием колхицина, и помогает значительно снизить химерность (Матвеева, 1980).

Г.И. Халиповой удалось получить полиплоидные формы у трех видов 8ес1ит Ь. и у АгаЫз саисайгса 8оЫесМ., поливая укорененные черенки слабым раствором колхицина (0,001% и 0,05%) (Халипова, 1990).

Для наибольшей устойчивости растений к мутагенам в растворы рекомендуют добавлять витамин С и гетероауксин. Такие комбинации со стимуляторами роста и витаминами повышают эффективность воздействия колхицином, благоприятно действуя на развитие растений, в известной мере снимают угнетающее действие колхицина и в то же время создают необходимые предпосылки для его полиплоидизирующего действия, ускоряя процесс деления клеток в обрабатываемых тканях растений. Кроме того, достаточно хорошо зарекомендовал метод добавления колхицина в питательную среду (Бутова, 1993; Зильберварг, 2001). Эксперименты по поли-плоидизации на перце показали неплохие результаты. Семена перца стери-

лизовали, затем помещали в раствор колхицина. Колхицинирование проводилось 1, 2 и 4 дня, затем семена помещали на питательную среду. В результате, было получено 24% тетраплоидов в вариантах при обработке семян 0,5% и 1% раствором колхицина в течение 4-х дней (ЬЫкадуа и др., 1997).

Комбинированной обработкой начали заниматься ученые около 60 лет назад: сочетание митотической полиплоидизации с одновременным воздействием лучистой энергии и других мутагенов с целью одновременного получения не только геномных, но также хромосомных и генных мутаций, которые могут обеспечить получение полиплоидных форм со структурно реорганизованными хромосомами и мутировавшими генами. Эти исследования имели своей целью стабилизацию мейоза и создание фертиль-ных полиплоидных растений (Матвеева, 1980).

При воздействии колхицина на чешую лилии обычно возникает очень мало тетраплоидов, кроме того, образуются еще анеуплоиды и миксоплои-ды (растения с изменчивым числом хромосом в различных тканях или частях растения). Если одно и то же растение имеет диплоидные и тетраплоид-ные клетки, то часть со временем возвращается на диплоидный уровень, т.к. диплоидные клетки растут и развиваются немного быстрее, чем тетрап-лоидные (Васариетис, 1992).

В конце 70-х годов эксперименты по скрещиванию три- и тетрапло-идных лилий начали Экарт Шмитцер и Виктор Штрасер. Они установили, что при скрещивании триплоидов с тетраплоидами потомство образуется, но его намного труднее получить при скрещивании триплоидов между собой. Выяснилось, что при скрещивании триплоидов с тетраплоидами в среднем появляется 80% триплоидов, 15% - тетраплоидов и 5% - анеуп-лоидов. Это было важным открытием, так как доказало, что путем скрещивания можно получить новые три- и тетраплоиды.

1.2. Методы идентификации полиплоидов

Полиплоидные растения характеризуются комплексом морфологических и анатомических признаков, которые в ряде случаев позволяют довольно легко отличать их от исходных диплоидных форм как в природных, так и в культурных популяциях. Особенно четко эти различия выражены у митотических автополиплоидных форм. Каждому онтогенетическому состоянию свойственны свои, в большей или меньшей степени выраженные отличия, которые позволяют проводить отбор полиплоидных форм в разные периоды развития растений. Кроме общих черт, присущих автополиплоидным формам большинства видов, некоторым видам присущи свои специфические особенности, возникающие при удвоении у них числа хромосом.

Для диагностики полиплоидного состояния могут служить различные морфологические особенности габитуса взрослых, молодых растений и проростков, их цветков, долей цветка, плодов, семян, листьев, стеблей, цветоносов, луковиц, клубнелуковиц и корней (Матвеева, 1980). Кроме того, для распознавания полиплоидов может быть использовано строение эпидермиса, длина замыкающих клеток устьиц в нижнем эпидермисе листьев среднего яруса в фазу цветения и длина полярной оси пыльцевого зерна, подсчет числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, подсчет числа хромосом (Панин и др., 1962; Раджабли, Рудь, 1972; Работягов, 1977; Тру-нин, 1978; Матвеева, 1980; Freeman, 1987; Былов, 1988; Бакулин, 1990; Ха-липова, 1990; Niraoka, 1998; Sari и др., 1999; Сорокопудова, 2002).

Габитус растений нередко бывает первым признаком, привлекающим внимание наблюдателя. Взрослые автополиплоидные растения характеризуются, как правило, более мощным развитием. Иногда наблюдается увеличение высоты растений. Стебли у полиплоидов, как правило, значительно толще, но их количество и степень ветвления нередко уменьшены по срав-

нению с диплоидами. Особенно часто это встречается у экспериментально полученных тетраплоидов, которые обычно характеризуются пониженным кущением. Естественные тетраплоидные формы обладают нередко таким же количеством побегов, как и исходные диплоиды. Своеобразным признаком некоторых полиплоидных форм является неполегаемость их стеблей и цветоносов при неблагоприятных погодных условиях, например у сортов Iris L., Fritillaria L. и Tulipa L. (Матвеева, 1980).

Очень характерным диагностическим признаком полиплоидного состояния является изменение формы органов, выражающееся в изменении соотношения длины и ширины, которое в различной степени бывает выражено у разных видов в разные периоды их развития (Матвеева, 1980).

Многочисленные сравнительные исследования тетраплоидов и дип-лоидов разных видов показали, что между диплоидами и экспериментально полученными от них автополиплоидами нет геометрического подобия. Листья, лепестки, стебли, корни, плоды, семена обычно оказываются у тетраплоидов не только более крупными, но и сравнительно более широкими, чем у исходных диплоидов. Это позволяет с первого взгляда находить автополиплоидные растения среди диплоидов. Хотя тетраплоиды состоят из вдвое более крупных клеток, объем их органов в среднем крупнее не вдвое, а только в 1,6 раза. Таким образом, эта, казавшаяся непонятной, характерная морфологическая особенность автополиплоидов обусловлена снижением темпа деления клеток в полиплоидных меристемах с одновременным увеличением их размеров (Матвеева, 1980).

Удвоение числа хромосом сказывается на толщине листьев, возрастающей в результате увеличения размера клеток губчатой и палисадной паренхимы. В связи с большей толщиной листовой пластинки листья полиплоидов обычно имеют более интенсивную окраску, а сеть жилок у них значительно более рельефная, и лист в целом становится более жестким. В

результате кусты полиплоидных растений принимают более эффектный вид благодаря прямостоячим, не полегающим побегам (Матвеева, 1980).

В большинстве случаев удвоение числа хромосом приводит к увеличению размера цветка и составляющих его частей - бутонов, долей околоцветника, тычинок, а также пестиков. Иногда это увеличение не сопровождается заметным изменением формы цветка - цветки полиплоидов становятся как бы увеличенной копией диплоидных. У некоторых видов изменяются не только размеры, но и самая форма цветка, причем доли околоцветника становятся значительно более широкими и налегают друг на друга. На разных уровнях плоидности, особенно при сочетании с анеуплоидией, у разных сортов одних и тех же декоративных растений цветки могут заметно отличаться по форме (Матвеева, 1980).

Морфологические признаки представляют большие удобства для предварительного отбора автополиплоидов в популяциях, но они не всегда выражены достаточно четко и поэтому не могут служить вполне достоверным критерием для распознавания полиплоидов. В тех же случаях, когда мы имеем дело с сегментными автополиплоидами и аллополиплоидами, эти признаки могут отсутствовать или быть менее отчетливо выражены. Кроме того, черты гигантизма могут возникать в некоторых случаях и без удвоения числа хромосом, как следствие генных мутаций, криптополиплоидии или других причин.

Диагностику полиплоидов можно осуществлять также на основании различных микроскопических признаков. С этой целью наиболее часто производят измерение клеток эпидермиса, устьичного аппарата листьев; особенно часто прибегают к исследованию пыльцевых зерен, размеры и другие особенности которых считаются наиболее удобным критерием для предварительного определения плоидности растений (Соколовская, 1962).

Размеры замыкающих клеток устьиц, число хлоропластов в них и количество устьиц на единицу площади заметным образом изменяются при

полиплоидии. Длина замыкающих клеток устьиц увеличивается в среднем в 1,5-1,6 раза. Однако размеры и количество устьиц варьируют в зависимости от возраста листа, его положения на растении и условий выращивания. Поэтому для измерения устьиц следует использовать эпидермис только с хорошо развитых листьев, взятых с побегов одного и того же порядка одинакового возраста; эпидермис необходимо снимать с одной и той же части листовой пластинки. У аллополиплоидов увеличение числа хромосом далеко не всегда сопровождается увеличением размеров клеток устьичного аппарата (Бреславец, 1963).

Между диплоидами и полиплоидами наблюдается заметное различие в количестве устьиц на единицу площади поверхности листа. У полиплоидных форм устьица располагаются более редко и их количество на единицу площади, как правило, меньше (Бреславец, 1963).

Разным видам свойственно определенное, характерное для них среднее число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, которое изменяется с изменением уровня плоидности. Это число представляет собой довольно надежный признак и им широко пользуются для идентификации полиплоидов (Юданова, 2004).

Многие исследователи отмечали увеличение размеров пыльцевых зерен у природных и индуцированных полиплоидных форм (Соколовская, 1962; Freeman, 1987). Для пыльцевых зерен природных и индуцированных растений характерно увеличение их размеров и числа пор на экзине. Обычно размер пыльцевых зерен увеличивается на 25-50%. У некоторых видов удвоение хромосом приводит к еще большему увеличению размеров пыльцевого зерна. У части видов число пор на экзине может служить более надежным критерием, чем размеры пыльцы. Достоинством этого критерия является то, что с его помощью можно осуществлять отбор полиплоидов еще до цветения, так как число пор не зависит от степени зрелости пыльцевых зерен. В некоторых случаях при удвоении числа хромосом изменяется и

форма пыльцевых зерен, приобретая вместо правильной округлой формы неправильную угольчатую, что особенно хорошо заметно при исследовании сухой пыльцы. Диагностика полиплоидов по особенностям устьичного аппарата и пыльцы более надежна, чем по морфологическим критериям, однако и эти признаки не могут служить достаточным критерием для достоверного суждения о плоидности.

Одним из современных методов идентификации уровня плоидности является цитометрический анализ (Eizenga и др., 1986; Cremonini и др., 1991; Ishikawa и др., 1997; Gamiette и др., 1999; Лучникова, Фролова, 2003). Окончательное определение уровня плоидности осуществляется на основании подсчета числа хромосом исследуемых растений (Кедров-Зихман, ТТТшт-ко, 1973, Загрекова, 1973; Матвеева, 1980; Freeman, 1987).

Первые подсчеты чисел хромосом у лилий были сделаны ещё в XIX веке Е. Страсбургером, Е. Саржент и Д.М. Коултером. В дальнейшем наиболее полные специальные исследования были предприняты А.Д. Холлом, Е.Р. Сансомом и Л.Ф. Лякуром, М. Сато и К. Мазером. Изучив значительное число видов, авторы установили, что большинство видов рода Liliurn диплоидны (Петрова, 1977).

Для хромосомного анализа пригодны интенсивно делящиеся клетки тканей с высоким митотическим индексом (меристематические ткани, эндосперм, микроспороциты и пыльцевые зерна), взятые у растений, находящихся в оптимальных условиях развития.

Для хромосомного анализа готовят давленые препараты, содержащие монослой неповрежденных клеток. Для изучения соматических хромосом на стадии митоза используется меристематическая ткань молодых, быстро растущих корней, стеблевая меристема конусов нарастания почек или меристема зачатков листьев.

Наиболее удобным материалом является меристема точки роста корня, имеющая ряд преимуществ по сравнению с другими перечисленными выше тканями. Клетки меристемы корня крупнее, чем в меристеме стебля и листа, и метафазные хромосомы располагаются более свободно, что облегчает их изучение и подсчет. Корешки не требуют препарирования, тогда как конус нарастания стебля нужно предварительно отпрепарировать (вычленить) из почки. Корешки легче получить в любое время года из проросших семян или тронувшихся в рост луковиц.

Изготовление давленых препаратов, содержащих монослой клеток, проводится в несколько этапов: 1) отбор и подготовка материала для исследования; 2) предфиксационная обработка (предобработка) - предварительная обработка живых объектов веществами, действующими на митоз; 3) фиксация; 4) мацерация; 5) окрашивание; 6) раздавливание (получение монослоя клеток); 7) перевод препаратов в постоянные (не обязательно) (Кед-ров-Зихман, Шилко, 1973; Дыленок, Каминская 1973; Горбунов и др., 1993; Першина, 2000а,б; Барыкина, 2004).

Приготовление препаратов из корневой меристемы. Лучше всего использовать кончики быстро растущих корешков взрослых растений, корешки проросших семян, а также тронувшихся в рост луковиц, клубней и корневищ (Паушева, 1980).

Менее удобный, но более доступный и чаще применяемый способ при подготовке материала для исследования - это проращивание семян в бактериологических чашках Петри (Барыкина, 2004).

Независимо от способа получения корней длина отрезаемого кончика корня не должна превышать 0,8-1 см. Для успеха в работе необходимо также учитывать суточный ритм митотической активности меристемы данного объекта, то есть, в какое время суток число митозов в изучаемой ткани достигает максимума. У многих растений максимум митозов приходится на 12 ч дня, у ячменя, напротив, на 18 ч., у ржи на 8-9 ч. Такой подход позволяет

иметь в результате большее число делящихся клеток на препаратах и, следовательно, ускорить подсчет числа хромосом (Кедров-Зихман, Шилко, 1973; Барыкина, 2004).

Предфиксационная обработка. Наиболее четко число и морфология хромосом выявляются на стадии метафазы митоза, когда хромосомы максимально укорочены и имеют вид цилиндрических тел, интенсивно окрашивающихся основными красителями. Цель предобработки материала перед фиксацией - задержка митоза в метафазе, а также физические изменения в цитоплазме и хромосомах объекта, способствующие в максимальной степени выявлению морфологии хромосом и лучшему разбросу хромосом в объеме клетки. В результате облегчается подсчет хромосом и изучение их морфологии.

Способы предобработки разнообразны и могут быть разделены на две группы - физические и химические (Савченко, 1984, 1986; Барыкина, 2004).

Физическое (температурное) воздействии. Охлаждение живых мери-стематических клеток до температуры 0°С вызывает общее изменение осмотического давления в клетках, влияя на вязкость цитоплазмы, что в свою очередь влечет за собой рассеивание (рассредоточение) метафазных хромосом в объеме клетки. Помимо эффекта рассеивания хромосом охлаждение до 0°С вызывает коагуляцию (признак фиксации) хроматина (дезоксирибо-нуклеопротеида) и как следствие - сильное сжатие (уменьшение объема) хромосом. Обработка холодом дает особенно хорошие результаты на объектах с длинными хромосомами, например у злаков (Кедров-Зихман, Шилко, 1973; Барыкина, 2004).

Способы химической предобработки. Чаще используют химическую предобработку. Большинство веществ, применяемых для предобработки, оказывает действие в очень малых концентрациях. Начальный эффект обработки проявляется в изменении вязкости цитоплазмы вследствие нарушения осмотического равновесия между внешней и внутриклеточной сре-

дой; далее происходит изменение взаимоотношений между хромосомами и нуклеоплазмой, а иногда и нарушение функции механизма веретена, распределяющего хромосомы во время деления. Наряду с этими влияниями все применяемые вещества обладают способностью вызывать коагуляцию белка (эффект фиксации).

Наиболее часто для предобработки применяют колхицин, он относится к группе алкалоидов - сильнодействующих ядовитых химических веществ, вырабатываемых растениями (Колесников, 1972; Кедров-Зихман, Шилко, 1973; Трунин, 1978; Schenk, 1987; Emsweller, 1988; Барыкина, 2004; Coskuncelebi и др., 2005).

В отличие от других химических соединений, применяемых для предобработки, колхицин обладает специфическим действием на клетки: он повреждает микротрубочки митотического аппарата, блокируя деление клетки в метафазе. Влияние колхицина на митоз настолько специфично, что в литературе утвердился термин «С-митоз» или «К-митоз». Парализуя механизм расхождения хромосом к полюсам, колхицин не препятствует их репродукции. В последние десятилетия показано, что остановку митоза в метафазе вызывает не только колхицин, но и другие яды (колцемид, винб-ластин, винкристин, аценафтен, метанол и др.). Для «К-митоза» характерны и изменения хромосом. Действие колхицина и колцемида усиливает укорочение хромосом, приводя к формированию «К-метафаз» с сильно укороченными и уплощенными хромосомами. При этом короткие хромосомы сокращаются сильнее, чем длинные. Исход «К-митоза» зависит от интенсивности воздействия яда: либо происходит пикноз ядра и гибель клетки (токсические дозы), либо полиплоидизация клетки, либо восстановление митотического аппарата и завершение митоза.

Для предобработки применяется водный раствор колхицина слабой концентрации (0,01-0,05%). Передозировка колхицина может привести к

возникновению полиплоидных ядер и как следствие к ошибке при подсчете числа хромосом.

Способы обработки колхицином, необходимые концентрации его растворов и продолжительность воздействия для каждого вида растения и фазы его развития могут быть установлены лишь опытным путем. Применяются экспозиции от нескольких часов до суток в зависимости от чувствительности объекта.

Чтобы избежать ошибки при подсчете хромосом, нужно обращать внимание на толщину хромосом и расположение хроматид. В случае поли-плоидизации они лежат попарно, параллельно друг другу, и их толщина вдвое меньше, чем у хромосом других клеток исследуемого объекта.

Оксихинолин применяется в виде насыщенного раствора, который обладает заметным уплотняющим действием на хромосомы. Первичные и вторичные перетяжки выступают резче (Shozo Nöda, 1971; Загрекова и др., 1973; Матвеева, 1980; Martens, 1988; Eaton, 2004; Барыкина, 2004).

A.K. Шарма, Л. Леван, Е.А. Колобаева и др. применяли 8-оксихинолин либо для предварительной обработки объекта или как составную часть фиксатора. Предварительное охлаждение материала при 0°С в течение суток и обработка 8-оксихолином вызывали значительное укорочение хромосом, что имеет большое значение для подсчета длинных хромосом.

Я. Кагава для укорочения хромосом применил хлоралгидрат. Обычно берется водный раствор этого реактива в концентрации 0,3-1%. Корешки погружают на 1 час в раствор, затем столько же времени промывают в проточной воде. После этого их помещают во влажную камеру на 2-4 часа и потом фиксируют (Кедров-Зихман, Шилко, 1973; Паушева, 1974).

Часто для достижения максимального эффекта укорочения используют несколько химических реагентов сразу: проростки помещают на 2 часа в

0,05% раствор колхицина, затем в 0,03%) раствор 8-оксихинолина (Горбунов и др., 1993).

Кумарин - ароматическое вещество, которое обуславливает запах некоторых растений, в частности донника. Для предобработки используют 2% водный раствор кумарина (насыщенный раствор). Обработку кончиков корней проводят в течение двух часов при температуре 12-16°С.

Парадихлорбензол используется в виде насыщенного раствора. Материал обрабатывают раствором 2-Зч. при температуре 12-16°С (Барыкина, 2004).

а-Монобромнафталин - ядовитая маслянистая жидкость, нерастворимая в воде (Дыленок, Каминская, 1973; Лиходзиевская, Балыкина, 1988).

Во многих публикациях утверждается, что лучшие результаты дает предобработка несколькими веществами, действующими последовательно или в смеси. Хорошие результаты дает предобработка колхицином в сочетании с последующей обработкой насыщенным раствором 8-оксихинолина или смесями колхицина с а-монобромнафталином или колхицина со смесью насыщенного раствора парадихлорбензола и 0,002 М раствора 8-ортооксихинолина (1:1) в течение двух часов (Горбунов и др., 1993; Барыкина, 2004).

Парасинхронизация клеток - прием, который позволяет добиться того, что большинство клеток меристемы оказывается в одной стадии деления. Для этого используют ингибитор синтеза ДНК - 5-аминоурацил (5-АУ) в концентрации 500-800 мкг/мл. Синхронизацию деления клеток можно вызвать воздействием пониженной температуры. Для этого наклюнувшиеся семена в чашках Петри помещают на несколько дней в холодильник при 2-4°С (это позволяет накопить профазы), а затем возвращают в лабораторию (комнатная температура обеспечивает переход в метафазу) (Барыкина, 2004).

При приготовлении давленых препаратов, применяемых для изучения хромосом, чаще всего используют спиртовые фиксаторы, в состав которых в качестве обязательного компонента входит ледяная уксусная кислота, хорошо сохраняющая форму хромосом.

Подвергнутые предобработке и промытые водой кончики корней переносят в фиксатор. Часто используемые фиксаторы: фиксатор Кларка или уксусный алкоголь (спирт: ледяная уксусная кислота -3:1) (Лиходзиев-ская, Балыкина, 1988; Cremonini и др., 1991; Lim и др., 2004; Coskuncelebi и др., 2005), фиксатор Карнуа, фиксатор Ньюкомер, фиксатор Батталья. Материал фиксируют в течение 3-24 часов (Загрекова и др., 1973; Паушева, 1974; Барыкина, 2004).

После всех перечисленных фиксаторов материал рекомендуется хранить в 70%-м спирте в холодильнике (0-4°С). Однако длительное хранение ухудшает качество последующего окрашивания. Поэтому рекомендуется хранить материал не более 2 месяцев (Загрекова и др., 1973; Барыкина, 2004).

Мацерация - обязательный этап приготовления давленых препаратов, содержащих монослой клеток. Добиться хорошего монослоя можно путем нарушения связей между клетками, что достигается путем обработки фиксированного материала мацерирующим раствором или ферментами.

В качестве мацерирующего вещества используют 1н HCl (Martens, Reich, 1988; Cremonini и др., 1991), Зн HCl, также горячую 45% уксусную или пропионовую кислоту. Мацерация хлоралгидратом применяется непосредственно в процессе приготовления давленых препаратов после окрашивания ткани. Хлоралгидрат просветляет цитоплазму и размягчает оболочку клеток, облегчая получение хорошего монослоя. После мацерации независимо от ее способа приступают к окрашиванию материала (Барыкина, 2004).

Для окрашивания в исследовании хромосом наиболее часто используются ацетокармин, пропионовый кармин, ацетоорсеин, реактив Шиффа, ацетолакмоид (пропионолакмоид), ацетожелезогематоксилин, краситель Гимза и др. Все красители, кроме последнего, позволяют окрашивать материал целиком перед приготовлением препарата (Барыкина, 2004).

После окрашивания раздавливание объекта производится в 45%-й уксусной кислоте или насыщенном растворе хлоралгидрата.

Полученный временный препарат необходимо окантовать, чтобы предотвратить испарение жидкости и его высыхание. Для окантовки временных препаратов используют нанесенные кисточкой по периметру покровного стекла клей БФ, лак для ногтей, расплавленный парафин и др. В таком виде препарат может храниться в холодильнике от нескольких дней до двух месяцев. Временные препараты можно также перевести в постоянные (Барыкина, 2004).

Приготовление препаратов из основания листьев. Модификация кембриджской методики по подсчету хромосом в корешках проростков пшеницы позволяет проводить подсчет хромосом в соматических клетках побегов пшеницы. Для этих целей используются молодые побеги, находящиеся на стадии выхода в трубку (колос в трубке 1,5-2,0 см). Для фиксации берется часть побега с междоузлием (Дыленок, Каминская, 1973).

Приготовление препаратов мейотических хромосом из микроспоро-цитов пыльников. Для подсчета числа хромосом можно использовать мета-фазу I мейоза, когда хорошо видны биваленты хромосом и, следовательно, можно установить гаплоидное число хромосом у исследуемого объекта.

Наиболее удобным объектом для изучения мейотических хромосом являются микроспороциты благодаря заложению их в большом числе в каждом гнезде пыльника. В летнее время для приготовления препаратов можно использовать живой материал, в зимнее время используют предварительно зафиксированные в период микроспорогенеза бутоны, цветки и со-

цветия растений. Для определения уровня развития спорогенной ткани готовят временные препараты из пыльников различного возраста, то есть взятых из бутонов различной величины, от самых мелких до раскрывшихся цветков (Барыкина, 2004). Взаимосвязь длины пыльцевых зерен и числа хромосом описывает А. А. Афонин (2006). Можно предположить, что увеличение объема хроматина на одну ХЕ приводит к увеличению длины пыльцевого зерна в 1,012 раза. Исследование проводилось на пыльце ив. Автор выявил, что условия произрастания не оказывают существенное влияние на длину пыльцевых зерен (Афонин, 2006).

Установлено, что длина молекулы ДНК у L. longiflorum Thunb. равна

п

1,610 мкм (Богданов, 1983).

1.3. Достижения экспериментальной полиплоидии у лилий

В роде Lilium около 100 видов, которые эволюционировали в природе и культуре в основном на диплоидном уровне. Большинство видов имеют одинаковое число хромосом 2п=24, и только у L. lancifolium Thunb., L. rhodopaeum Delip., L. szovitsianum Fisch, et Ave-Lall. в природе обнаружены триплоидные цитотипы (2п=36) (Хромосомные..., 1969; Кудряшова, 1971; Петрова, 1977; Матвеева, 1980; Числа..., 1990).

Диплоидная форма L. lancifolium занимает очень небольшой ареал в Японии - на острове Теушима и в бухте Киушу. Диплоид вполне фертилен и скрещивается с триплоидными формами. У него значительно более мелкие цветки. Диплоиды очень подвержены вирусным заболеваниям и быстро выпадают в культуре.

Экспериментальное получение полиплоидных лилий было начато в 40-х годах в Англии и США (Emsweiler, 1946, 1949; Darby, 1965). Особенных успехов удалось достигнуть у применяемых для выгонки видов: L. longiforum, L. formosanum Wallace и их гибридов. Всего было создано около

20 тетраплоидных сортов, а затем путем их скрещивания с диплоидами созданы и триплоидные сорта.

Даже после интродукции Эмсвеллером таких выдающихся тетрап-лоидов как 'Маунтайнир', 'Мега', 'Брэндивайн', 'Блек Бьюти' прогресс в области полиплоидных лилий был слабо заметен. Гигантский рывок вперед произошел после введения Р. Грисбахом сорта 'Лесли Вудриф' и стрейна Тетра 'Уайт Вудриф' х Тетра белый трубчатый. После этого тетраплоидная селекция стала использоваться шире. Оптимальным уровнем плоидности у лилий считается тетраплоидный уровень (Матвеева, 1980; Отрошко, 1992).

В настоящее время селекцией тетраплоидных лилий занимаются (Пугачева, 2001):

- в Канаде: J. Ericksen, F. Fellner, D. Knowlton, D. Thomas;

- в США: L. Freimann, J. Romine, D. Schaefer, J. Uhring;

- в Австралии: J. R. Boden, J. M. McKoy;

- в Нидерландах серьезная работа с привлечением сложной аппаратуры

ведется доктором J. van Tuyl;

- в Германии: Е. Schmitzer;

- в Чехословакии: В. Miculka.

В России работы по полиплоидизации малочисленны. Большинство специалистов-лилиеводов ведут селекцию на другие важные признаки: повышение зимостойкости, бульбоностность, улучшение аромата, ранние сроки цветения, устойчивость к болезням и т.д. (Киреева, 1981, 1984, 1988, 1992, 2000, 2001; Коршикова, 1980, 1981, 1988; Отрошко, 1993; Сорокопу-дова, 2005; Экспериментальное..., 2005; Сорокопудова и др., 2007). Поли-плоидизацией Трубчатых гибридов лилий занимается Г. М. Пугачева во ВНИИС и семеноводства им. И. В. Мичурина (Пугачева, 2005).

Таким образом, экспериментальная полиплоидия позволила создать десятки разных сортов лилий из различных гибридных групп и у разных видов. С ее помощью значительно расширились селекционные возможно-

сти, так как она обеспечила восстановление фертильности у ряда перспективных гибридных сортов (Матвеева, 1980).

Полиплоидные лилии обладают рядом преимуществ по сравнению с диплоидами: более крупные и иногда в большем количестве образующиеся цветки, большая плотность листочков околоцветника и связанная с этим более сильная устойчивость к неблагоприятным погодным условиям и лучшая транспортабельность, устойчивость к вирусным и другим заболеваниям (Матвеева, 1980; Трунин, 1982; Freimann, 1987; Andersen, 1989; От-рошко, 1992, 1993; Жукова, 2008). Многие виды лилий уже на диплоидном уровне имеют крупные цветки, например L. regale Wils., L. henryi Baker, L. brownii F. E. Brown. Поэтому гигантизм, являющийся одним из следствий экспериментально вызванной автополиплоидии, не так уж заманчив для многих видов лилий. И, тем не менее, применение индуцированной полиплоидии позволило и у этих растений добиться значительных улучшений.

Еще одно преимущество тетраплоидов в том, что трудности, которые возникают при скрещивании отдаленных групп (разделов) лилий, легче преодолеть на уровне тетраплоидов, чем диплоидов.

Тетраплоидные лилии имеют и некоторые недостатки: как правило, уменьшается число цветков в соцветиях, сдвигаются сроки цветения к более поздним, чем у диплоида того же сорта (Васариетис, 1992).

Особенно широким распространением пользуются экспериментально полученные полиплоидные гибриды L. formosanum и L. longiflorum: трип-лоид 'Formobel' и тетраплоидные 'Florosanum', 'Formolongii', 'Welwyn', 'Tetrabel' (Матвеева, 1980).

Во Всесоюзном научно-исследовательском институте эфирномасличных культур в Симферополе экспериментально были получены тетраплоиды L. candidum L. и L. regale, отличавшиеся повышенным содержанием эфирного масла и интересные в декоративном отношении (Матвеева, 1980).

1.4. Культура лилий in vitro

Многие новые формы гибридного происхождения сложно получить из-за явления постгамной несовместимости без использования методов культивирования in vitro. Кроме того, из-за длительного прегенеративного периода у растений, выращиваемых из семян в естественных условиях, оценка полученных форм и гибридов, их размножение затягивается на несколько лет. Для ускорения селекционного процесса успешно используется методы эмбриокультуры и клонального микроразмножения in vitro. Их применение позволяет значительно сократить сроки оценки результатов гибридизации, получить высокий коэффициент размножения и получения посадочного материала, свободного от опасных патогенов (Ишмуратова, Рахимова, 1999; Мазур, Калашникова, 2000; Иванова, 2001; Пугачева, 2004; Набиева, 2005; Набиева, Доронина 2008б). Идею о возможности культивирования изолированных тканей растений впервые высказал Gottlieb Haberlandt в 1902 г. (Haberlandt, 1902).

Известно, что развитие растения в культуре in vitro имеет свои особенности в зависимости от эколого-географических местообитаний исходного материала (Румынии, 1998а).

В настоящее время метод массового клонального размножения растений in vitro получил широкое применение в практике. Используя его, можно тиражировать ценные и редкие сорта, получать огромное количество однородного и здорового посадочного материала, а также новые перспективные формы (Чурикова и др., 1994; Иванова, 2001, Набиева, 2008, Набиева, Доронина, 2008а, Пугачева, Соколова, 2010).

В мировой практике интерес к ускоренному размножению лилий возник еще в 50-е годы. Одни исследователи (Haberlandt, 1902; Hacketi, 1969; Takayama, Misawa, 1979; Novak, Petru, 1981) строили свои схемы масс-клонального размножения лилий на основе непосредственного получения

луковичек из сегментов чешуй, в то время как другие (Sharp, Raskin, 1971; Simmonds, Cumming, 1976) отдавали предпочтение каллусной культуре. В первом случае теоретически можно получить до 100000 растений из одной луковицы среднего размера в течение полугода. При каллусной культуре можно получать до 6><1012 растений в год из 1 г каллуса.

Первоочередная задача на этапе введения в культуру in vitro - подобрать наиболее подходящий источник эксплантов и отработать методику стерилизации (Бутенко, 1999).

В качестве эксплантов у лилий используют чешуи луковиц (Чурикова и др., 1991; Чурикова и др., 1994; Мазур, Калашникова, 2000; Varshney и др., 2000), лукрвицы-дети, листья, семена, зародыши (Carlos и др., 1998; Ветчинкина и др., 2003а,б, 2005; Байбурина, 2004; Катасонова, 2007, На-биева, 2008), сегменты стебля (Лапчик и др., 1984; Чурикова и др., 1991; Lian и др., 2002), фрагменты соцветий (Байбурина и др., 2006, Набиева, 2008; Мухаметвафина, 2009). Исследования, проведенные с различными сортами азиатских и восточных лилий показали возможность использования в качестве эксплантов различных вегетативных органов, хотя предпочтение следует отдавать луковичным чешуям (Кильчевский, Французенок, 2002). Важное значение играет также возраст растения, органа, из которого вычленяется эксплант (Сидорович, Кутас, 1996).

Для удаления микроорганизмов, находящихся на поверхности растения, необходима дезинфекция тканей. Наличие любого загрязнения влияет на рост эксплантов или культур. Загрязнение культур растений грибами и бактериями обычно выявляется через 1-14 дней после посадки в культуру. Загрязненные культуры следует тотчас же удалить, так как их присутствие приводит к дальнейшему заражению воздуха в комнате, где поддерживается культура (Калашникова и др., 2006).

К стерилизующим соедимнениям, обладающим сильным дезинфицирующим действием относят соединения, содержащие ртуть (сулема, диа-

цид, азотнокислая ртуть). Соединения, обладающие средним дезинфицирующим действием - соединения содержащие в своем составе активный хлор - гипохлориты натрия, калия, кальция, хлорамин, хлорная известь. К соединениям, обладающим слабым дезинфицирующим действием относятся перекись водорода и перманганат калия (Сидорович и др., 1996).

Различные авторы, применяют разнообразные виды стерилизации растительного материала: Ветчинкина Е.М. для стерилизации семян IRIS L. использует 96% этанол в течение 5 минут, затем гипохлорит натрия 15-20 минут, с последующим обжиганием семян (Ветчинкина и др., 2005); для семян огурцов, помидор, перцев применяют 1% раствор перманганата калия, в котором выдерживают семена 20-30 минут (Шафранский, 2005), для семян капусты и моркови применяют выдерживание семян в горячей 50-52°С воде (Шафранский, 2005), также применяют 2-3% раствор перекиси водорода, подогретый до температуры 38-45 °С, в котором семена выдерживают 5-10 минут (Обработка семян, 2005). При стерилизации растительного материала лилий используются: для стерилизации чешуй - 0,1% раствор сулемы (дихлорид ртути) в течение 10 минут (Калашникова и др., 2006), 1-5% гипохлорит кальция (Французенок и др., 2002), Байбурина Р.К. для стерилизации чешуй и семян использует 0,5% раствор перманганата калия в течение 1 часа, затем 1% раствор медного купороса в течение 1 часа, затем 70% этанолом и 0,2% раствором диацида (Байбурина и др., 2004); для стерилизации соцветий - 70% этанол в течение 1 минуты, затем 0,01% раствор диацида 10 минут (Байбурина, 2006). Пугачева Г.М. в качестве дешевого и нетоксичного средства предлагает обработку коробочек лилий 96% этиловым спиртом, с последующим обжиганием над пламенем спиртовки (Пугачева, 2005).

Состав питательной среды представляет собой следующий важный параметр, который необходимо оптимизировать для получения успешной регенерации растений. Среда, разработанная Мурасиге и Скугом в 1962 г., -

это наиболее распространенная среда, используемая при работе с культурами тканей растений (Zwierzykowski и др., 1985; Бутенко, 1999; Сорокина и др., 2002; Lian и др., 2002; Ветчинкина и др., 2003; Лутова, 2003; Байбурина и др., 2006; Калашникова и др., 2006, Набиева, 2008; Мухаметвафина, 2009).

Используя однотипную среду для культивирования (например, Мура-сиге-Скуга) и варьируя концентрациями и типами регуляторов роста, часто можно довольно успешно определять путь морфогенеза in vitro (Жужжало-ва и др., 2007).

При культивировании семян важное значение имеет содержание сахарозы в питательной среде, оптимальной концентрацией является 30-45 г/л; при увеличении сахарозы в среде наблюдается заметное снижения развития проростков. Увеличение концентрации сахарозы в питательной среде до 60-90 г/л снижало показатели всхожести и энергии прорастания семян в 1,3-2,2 раза. На питательной среде, содержащей 60 г/л сахарозы, проростки существенно отставали в развитии по сравнению с питательной средой, содержащей 30 г/л сахарозы. Семядоли только приподнимались над уровнем питательной среды, и проростки имели один корень (Байбурина и др., 2004).

Повышенное содержание в среде нитратного азота существенно ин-гибирует индукцию культуры у лилий. Нитраты способствуют выделению из эксплантов флавоновых и фенольных соединений в питательную среду, которые характеризуются ингибирующим эффектом (Румынии, 1998б).

Обычно среды, содержащие высокие концентрации ауксина, способствуют формированию каллуса (Молканова и др., 2004). Введение цитоки-нинов в сочетании с ауксинами для некоторых видов растений также способствует формированию каллуса. Снижение концентрации ауксинов и повышение содержания цитокининов обычно используется для индукции образования побегов из каллуса (Лапчик и др., 1984; Биотехнология..., 1989).

В качестве фитогормонов изучены а-нафтилуксусная кислота (НУК) и 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрациях от 0,1 до 1 мг/л. Данные показали, что НУК наиболее активно стимулирует пролиферацию (увеличение числа клеток луковичек). Было установлено, что высокие концентрации НУК (4,0-5,0 мг/л) вызывали обильное каллусообразование. По данным некоторых авторов, низкие концентрации НУК ускоряли процесс регенерации и рост микролуковичек, внесение в питательную среду цитоке-нинов не влияло на регенерационные процессы и приводило к нарушениям роста (Stimart, Asher, 1978; Van Aartijk, Blom-Barnhoorn, 1979).

6-БАП способствует увеличению коэффициента размножения только в сочетании с НУК. Добиться достаточно высокого коэффициента размножения, при котором формируются крупные луковички с хорошо развитыми корнями, можно с одновременным использованием 6-БАП и НУК (Мок-шин, 2005).

Среды, содержащие различные концентрации фитогормонов (6-БАП, кинетин, НУК, индолилуксусную кислоту (ИУК)), оказывали угнетающее влияние на развитие зародышей и проростков из семян. Наблюдалось подавление роста, утолщение органов и другие изменения, в то время как на безгормональной среде формировались нормальные, активно развивающиеся проростки (Ветчинкина и др., 2003). Содержание 6-БАП в среде также влияло на размер образовавшихся луковичек. Максимальный размер луковичек наблюдали на среде с 6-БАП 0,5-1,0 мг/л (Пугачева, 2005).

К. Anderson при культивировании лилий in vitro добавлял в питательную среду 6-БАП (5 мг/л), 2,4-Д (5 мг/л), НУК (0,5 мг/л). Внесение этих регуляторов роста способствовало значительному увеличению выхода луковичек (Anderson, 1977).

При изучении влияния фитогормонов индолилмасляной кислоты (ИМК) и ИУК на прорастание семян L. regale оказалось, что на начальных этапах проращивания в течение первых 2 месяцев культивирования добав-

ление ИМК в питательную среду стимулирует, тогда как ИУК ингибирует прорастание семян.

На разных этапах клонального размножения соотношение экзогенных регуляторов роста должно было быть разным для того, чтобы индуцировать регенерационные процессы (образование адвентивных луковиц, ризогенез, каллусообразование) (Мокшин, Лукаткин, 2005).

При культивировании Восточных гибридов лилий добавление ауксинов и цитокининов в питательную среду значительно стимулировало формирование микролуковиц. Присутствие в среде 6-БАП в концентрации более 1,5 мг/л в сочетании с ИУК или НУК - 0,5 мг/л приводило к образованию максимального количества луковичек (5-7 шт. в зависимости от сорта). Оптимальной для развития корневой системы была питательная среда, содержащая НУК в концентрации от 0,2 мг/л до 0,5 мг/л. (Мазур, Калашникова, 2000).

Установлено, что для регенерации микролуковиц от чешуй и бульб лучше подходит модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга, в которую добавлено 5 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК, 3500 мг/л сахарозы, 7000 мг/л агара; при регенерации базальной части лепестка - питательная среда Мурасиге-Скуга, в которую добавлено 5 мг/л 6-БАП, 0,5 мг/л НУК, 3000 мг/л сахарозы, 10000 мг/л агара; при регенерации из базальной части долей околоцветника - 0,1 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК, 5000 мг/л сахарозы, 7000 мг/л агара (Дапкунене и др., 2004).

Для более успешного укоренения сформировавшихся растений необходимо использовать только НУК, причем в низких концентрациях (Лапчик и др., 1984; Мокшин, Лукаткин, 2005; Байбурина и др., 2006).

В зависимости от условий культивирования культуры тканей растений растут по-разному. Интенсивность, тип и продолжительность освещения, температуры, соотношение кислорода и углекислого газа, а также дру-

гих газов, как и физический состав среды, - все важно в процессе морфогенеза культуры тканей растений. Обычно каллус растет в темноте, при температуре 24-26°С, поскольку свет вызывает эмбриогенез, формирование побегов и зеленение каллуса. Экспланты часто культивируют при интенсивности освещения 500-1000 лк и длине светового дня 16 ч. Растения освещаются обычно холодным белым светом или с помощью специальных люминесцентных ламп, предназначенных для выращивания растений. На более поздних стадиях морфогнеза развитие регенератов активируется под действием более интенсивного освещения - 5000-10000 лк, необходимого для ускорения развития фотосинтезирующих листьев и помогающего привыканию растения при переходе к условиям роста in vivo. Температура в комнате для культивирования обычно поддерживается около 25°С (Биотехнология..., 1989; Набиева, 2008).

Перенос укорененных растений in vivo представляет определенные трудности, обусловленные биологическими особенностями лилий. Из литературы известно, что перед высадкой в почву необходим период покоя при 4°С в течение не менее 40 дней (Румынии, Слюсаренко, 1989; Кильчевский, Французенок, 2002). Процедура охлаждения в ряде случаев снижает приживаемость высаживаемых растений. Высадка растений без охлаждения более предпочтительна, так как до периода естественного покоя они успевают сформировать нормальную луковичку. Лучшее время посадки - апрель -май, что позволяет масс-клонально полученным растениям пройти полный цикл вегетации и к октябрю сформировать луковицу размером около 1 см. Более поздние сроки высадки не позволяют получить достаточно крупную луковичку, тем не менее мелкие луковички Азиатских гибридов нормально проходят период покоя зимой, и в течение следующего вегетационного периода такие растения формируют луковицы размером 2,5-4 см, способные через год развить цветоносные побеги (Румынии, Слюсаренко, 1989).

1.5. Пигменты цветков лилий

Окраска является наиболее важным показателем декоративности и отличимости цветочных культур.

Околоцветник выполняет функции привлечения насекомых и защиты генеративных органов. Для привлечения насекомых окраска должна быть яркой, насыщенной и выделяющейся на фоне листвы. Для успешной селекции на признак «окраска цветка» необходимо знать состав и характер наследования химических соединений его определяющих (Мартынова, 2001). Желтую, оранжевую, красную окраску плодам и цветкам придают хромопласты (от греч. hroma - цвет и plastos). В них синтезируются пигменты, участвующие в фотосинтезе - каротиноиды (Гуринович и др., 2002; Биология, 2007). Среди высших растений каротиноиды наиболее заметны в окраске цветков. Они представляют собой один из наиболее интересных и наиболее распространенных классов естественных пигментов. Кроме визуального привлекательного эффекта (окраска цветков, плодов) каротиноиды выполняют и другие важные биологические функции (Armstrong, Hearst, 1996). Каротиноиды относятся к жирорастворимым фитопитательным веществам. Сначала их использовали как красители, а сегодня они известны человеку как питательные вещества, такие как прекурсоры витамина А и антиокси-данты. Действуя как антиоксиданты, они уменьшают повреждения, вызванные свободными радикалами. Повреждения в результате окисления, вызванного именно действием свободных радикалов, ассоциируется с преждевременным старением, возрастной дегенерацией желтого пятна (повреждением сетчатки), а также с другими заболеваниями (Каротиноиды, 2006).

Пигменты, окрашивающие околоцветник, группируют в три класса: 1) антоцианы, которые обуславливают красную окраску; 2) антоксантины -придают окрашиванию различные оттенки желтого от палевых до темно-

желтых; 3) пластидные пигменты - дают оранжевый и желтый цвет (От-рошко, 1993).

Интенсивность окраски околоцветников зависит от количественного состава пигментов - у форм с интенсивной окраской их больше. В.В. Мар-тыновой было изучено соотношение антоцианидинов у некоторых видов и сортов лилий; у форм с интенсивной окраской их больше. Чистота и яркость окраски в определенной степени связана с качественным и количественным содержанием флавонолов: кемпферола и кверцетина. В гибридном потомстве доминирует окраска более интенсивно окрашенной родительской формы (Мартынова, 2001).

Д. Томас после 10 лет работы с Ь. ритПит вырастил тысячи сеянцев этого вида, из которых отобрал только два природных тетра-клона и два триплоидных клона. Использование их в скрещиваниях дало сеянцы, с более крупным габитусом и здоровым внешним видом. Триплоидные потомки от Ь. ритйит скрещивались между собой, их потомки дали серию гибридов с очень яркой поверхностью листочков околоцветника (Отрошко, 1993).

Заключение диссертации по теме «Ботаника», Лабунская, Наталия Александровна

выводы

1. При мейотической полиплоидизации лилий наиболее продуктивными оказались комбинации скрещиваний полиплоидов между собой с участием в качестве исходных форм сортов-тетраплоидов 'Foggia' и 'Nove Cento'; при использовании тетраплоидов в качестве отцовских форм. Уровень пло-идности полученных тетраплоидов и триплоидов подтвержден данными по длине замыкающих клеток устьиц и подсчетом числа хромосом.

2. Обработка чешуй луковиц лилий 0,2% раствором колхицина в течение 6 часов, позволила получить полиплоидные формы лилий сортов 'Аэлита', 'Отрада', 'Желтая Птица', 'Диадема', 'Корона', 'Connecticut King'. Удвоенный набор хромосом у полиплоидных растений подтвержден данными цитологического анализа; длина замыкающих клеток устьиц в их листьях была выше, чем у исходных растений, на 37-72%).

3. На этапе введения семян лилий в культуру in vitro для их стерилизации наряду с известными способами выявлены варианты обработки, не снижающие всхожесть семян: 3% раствор Н202 температурой 38-40°С в течение 7-8 минут; 2% раствор КМп04 в течение 20 минут; 1% раствор КМп04 в течение 20 минут. Выявлена целесообразность повторного использования питательной среды Мурасиге-Скуга.

4. Длина замыкающих клеток устьиц листьев (ЗКУ) лилий может значительно варьировать в зависимости от генотипа, возраста растений, яруса листьев, места расположения устьиц на листовой пластинке. Для предварительной диагностики уровня плоидности растений после искусственной полиплоидизации следует учитывать индивидуальные особенности изменчивости длины ЗКУ у видов и сортов лилий, особенно у молодых растений.

5. Выявлена тенденция к увеличению длины ЗКУ от апикальной части листовой пластинки к базальной (у 92% исследованных сортов и видов лилий, г = 0,82) и укрупнению ЗКУ от листьев верхнего яруса к нижнему у некоторых сортов. У 4-х изученных сортов длина ЗКУ листьев в ювенильном онтогенетическом состоянии была больше, чем во взрослом генеративном на 14,6-45,4%.

6. Установлено, что комбинированная предфиксационная обработка растений лилий растворами мутагенов и охлаждением позволяет получить наиболее качественные цитологические препараты: 1) 0,03%-0,05% раствором колхицина в течение 3 ч с последующим охлаждением в течение суток или без этапа охлаждения; 2) последовательная обработка 0,05% раствором колхицина в течение 3 ч и 0,002 М раствором 8-оксихинолина в течение 1 ч.

7. Из изученных оранжевых и красноцветковых сортов лилий наивысшее содержание ксантофиллов обнаружено в околоцветниках Lilium ри-тйит (6,24 мг/г в свежих листочках околоцветника) и L. buschianum (1,28 мг/г в свежих листочках и около 25,86 мг/г - в высушенных). Красные тона окрасок связаны с присутствием в околоцветниках антоцианов, главным образом цианидин-3-рутинозида, содержание которых у сортов с бордовыми цветками сопоставимо с таким источниками антоцианов, как плоды Ribes nigrum, Mahonia aquifolium.

практические рекомендации

1. В цитологическом анализе для оценки способов предфиксационной обработки растительного материала видов и сортов с крупными и многочисленными хромосомами предложены балльные шкалы по признакам: расположению клеток относительно друг друга, наличию повреждений, окрашиванию хромосом, степени их укорочения и расхождения.

2. Виды Liliumpumilum и L. buschianum, сорта 'Summer Night' и 'Забава', содержащие в околоцветниках максимальное количество пигментов (капсантина и капсорубина, цианидин-3-рутинозида), рекомендуются для культивирования в промышленных целях для получения естественных красителей и в селекции в качестве источников высокой концентрации этих пигментов.

3. Семена лилий, полученные в ценных, но низкопродуктивных комбинациях скрещиваний, целесообразно проращивать на безгормональной питательной среде Мурасиге-Скуга in vitro.

4. Для получения полиплоидов рекомендуется использовать метод гибридизации с использованием сортов-полиплоидов 'Foggia' и 'Nove Cento', продуктивность которого оказалась выше, чем при обработке ба-зальных частей чешуй раствором колхицина - выход полиплоидных растений составил 3,5 %.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лабунская, Наталия Александровна, 2012 год

список литературы

1. Агроклиматические ресурсы Белгородской области [Текст]. -Ленинград: Гидрометеоиздат, 1972. - 90 с.

2. Афонин, A.A. Палинометрический анализ - оценка уровня анеу-плоидии и возможной полиплоидии в популяциях ив на основании измерения длины пыльцевых зерен (к вопросу об изменчивости числа хромосом Salix) [Электронный ресурс]. - 2006. - Режим доступа: http://afonin-59-salix.narod.ru/060825_PA.htm.

3. Бабкина, Н. Размножение лилий [Текст] / Н. Бабкина // Цветоводство. - 2001. - № 6. - С. 42-43.

4. Байбурина, Р.К. Опыт культивирования некоторых видов Lilium L. in vitro [Текст] / P.K. Байбурина, A.A. Мухаметвафина, JI.В. Миронова // Растительные ресурсы. - 2004. - Т. 40, Вып. 1. - С. 82-89.

5. Байбурина, Р.К. Особенности регенерации гибридов Азиатских лилий из фрагментов соцветий в культуре in vitro [Текст] / Р.К. Байбурина, A.A. Мухаметвафина, Л.В. Миронова // Сельскохозяйственная биология. Серия биология растений. - 2006. - №1. - С. 80-85.

6. Бакулин, В.Т. Новые тетраплоидные формы тополя, полученные в результате колхицинирования семян [Текст] / В.Т. Бакулин // Состояние и перспективы развития лесной генетики, селекции, семеноводства и интродукции. Методы селекции древесных пород. - Рига, 1974. - С. 116-119.

7. Бакулин, В.Т. Интродукция и селекция тополя в Сибири [Текст]: автореф. дис. ... д-ра биол. наук / В.Т. Бакулин. - Новосибирск, 1990. - 32 с.

8. Баранова, М.В. Лилии [Текст] / М.В. Баранова // Декоративные травянистые растения. Однодольные: Справочник. - Л.: Наука, 1977. - Т. 2. -С. 122-161.

9. Баранова, М.В. Лилии [Текст] / М.В. Баранова - Л.: Агропром-издат.- 1990.-229 с.

10. Баранова, M.B. Луковичные растения семейства Лилейных (география, биоморфологический анализ, выращивание) [Текст] / М.В. Баранова. - СПб.: Наука, 1999. - 229 с.

11. Баранова, М.В. Луковичка [Текст] // Эмбриология цветочных растений. Терминология и концепция. Том 3. Системы репродукции. - СПб.: «Мир и Семья». - 2000. - С. 327-329.

12. Барыкина, Р.П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы [Текст] / Р.П. Барыкина. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с.

13. Батыгина, Т.Б. Размножение растений [Текст] / Т.Б. Батыгина, О.Г. Васильева. - СПб.: Изд-во СПб ун-та, 2002. - 232 с.

14. Белгородский государственный университет. Ботанический сад природного парка «Нежеголь» [Электронный ресурс]. - 2008. - Режим доступа: http://old.bsu.edu.ru/Struktura/Nezhegol/BotanicGarden.

15. Биология [Электронный ресурс]. - 2007. - Режим доступа: http://www.ebio.ru/kle05 .html.

16. Биотехнология растений: культура клеток [Текст]. - М.: Агро-промиздат, 1989. - 280 с.

17. Биохимический справочник [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.xumuk.ru/biospravochnik/839.html.

18. Богданов, Ю.Ф. Ультраструктура хромосом и синаптонемного комплекса в профазе мейоза у лилий [Текст] / Ю.Ф. Богданов // Цитология. -1983.-Т. 25, № 1.-С. 17-23.

19. Бормотов, В.Е. Полиплоидия и полиморфизм растений по величине клеток [Текст] / В.Е. Бормотов, Т.И. Лопатина. - Мн.: Наука и техника, 1986.- 165 с.

20. Бороевич, С. Принципы и методы селекции растений [Текст] / С. Бороевич. - М.: Колос, 1984 - 344 с.

21. Бреславец, Л.П. Полиплоидия в природе и опыте [Текст] / Л.П. Бреславец. - М.: Наука, 1963. - 363 с.

22. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе [Текст] / Р.Г. Бутенко. - М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. -160 с.

23. Бутова, Г.П. Получение полиплоидов у древесных растений методом культуры тканей [Текст] / Г.П. Бутова, Т.М. Табацкая, О.С. Машкина, JI.H. Вьюнова, JI.M. Бурдаева // Генет. и экол. основы повышения продуктивности лесов. - Воронеж, 1993 (1994). - С. 56-64.

24. Былов, В.Н. Полиплоиды декоративных растений природной флоры [Текст] / В.Н. Былов, Г.П. Халипова // Интродукционное изучение и основы селекции декоративных растений. - М.: Наука, 1988. - С. 111-131.

25. Васариетис Я.Ф. Полиплоидные лилии [Текст] / Я.Ф. Васариетис // Лилии. - М.: Хоббикнига, 1993. - С. 18-20.

26. Ветчинкина, Е.М. Возможности использования эмбриокультуры для ускорения селекционного процесса у бородатых ирисов [Текст] / Е.М. Ветчинкина, H.A. Мамаева, A.C. Демидов // Материалы конференции посвященной 100-летию научной селекции в России. - М., 2003а - С. 48-50.

27. Ветчинкина, Е.М. Использование биотехнологических методов для ускорения размножения гибридов Iris hybrida Hort. [Текст] / Е.М. Ветчинкина, H.A. Мамаева, A.C. Демидов // Биологическое разнообразие. Интродукция растений. - СПб., 20036. - С. 354-355.

28. Ветчинкина, Е.М. Некоторые аспекты использования культуры семян и зародышей in vitro для изучения и сохранения биоразнообразия рода Iris L. [Текст] / Е.М. Ветчинкина, H.A. Мамаева // Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем. Сборник статей участников молодежного научного семинара. - Екатеринбург, 2005. - С. 21-25.

29. География Белгородской области [Электронный ресурс]. - 2008. - Режим доступа: http://www.allrf.ru/article/215.

30. Горбунов, А.Б. Методика приготовления препаратов клюквы, пригодных для подсчета числа хромосом [Текст] / А.Б. Горбунов, Л.Н. Ва-силюк, Л.С. Богуславская // Цитология. - 1993. - Т. 35, № 1 - С. 105-108.

31. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. Том 1 Сорта растений [Текст]: Государственная комиссия Российской Федерации по испытанию и охране селекционных достижений. - М., 2011. - 3 84 с.

32. Грот, В.А. Лилии и их культура [Текст] / В.А. Грот - М.: Изд-во МГУ, 1966.-91 с.

33. Гуринович, Л.К. Фотосинтезирующая масса зеленых растений -неиссякаемый источник биологически активных веществ [Электронный ресурс] / Л.К. Гуринович, H.H. Гесслер, В.Н. Бузов: электронный журн. / Ры-нока БАД. - 2002. - № 3(5). - Режим доступа: http://www.farosplus.ru/ index.htm?/bad/bad_3_5/fitosintez.htm.

34. Дабкявичене, Г. Применение метода изолированных зародышей для получения полиплоидов клевера лугового [Текст] / Г. Дабкявичене // Стратегии и новые методы в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур, - Мн., 1994. - С. 70.

35. Дапкунене, С. Роль экспланта в регенерации лилий в культуре in vitro [Текст] / С. Дапкунене, Л. Шимонете, Р. Юодкайте // Роль ботанических садов в сохранении и обогащении биологического разнообразия видов. - Калининград, 2004. - С. 184-185.

36. Дейнека, В.И. Основные антоцианы некоторых растений семейства Grossulariaceae [Текст] / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, В.М. Староверов, А.А Сиротин // Химия природных соединений. - 2003. - № 4. - С. 324325.

37. Дейнека, В.И. Инкрементный подход в анализе каротиноидов методом ОФ ВЭЖХ. Разделение диэфиров ксантофиллов [Текст] / В.И. Дейнека, Л.А. Дейнека // Сорбц. и хроматограф, процессы. - 2006. - Т. 6, № 3. -С. 366-375.

38. Дейнека, В.И., Сорокопудов В.Н., Дейнека Л.А., Третьяков М.Ю. Исследование цветков Tagetes sp. как источника лютеина [Текст] /

В.И. Дейнека, В.Н. Сорокопудов, JI.A. Дейнека, М.Ю. Третьяков //Хим.-фарм. ж. -2007.- Т. 41, № 10.-С. 30-32.

39. Долматов, Е.А. Великолепные JIA [Текст] / Е.А. Долматов // Приусадебное хозяйство. - 2003. - № 11. - С. 66-69.

40. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) [Текст]: Учебник для агрономических специальностей сельскохозяйственных вузов / Б.А. Доспехов. -М.: Колос, 1973.-336 с.

41. Дыленок, JI.A. Определение числа хромосом у пшеницы на стадии выхода в трубку [Текст] / JI.A. Дыленок, JI.H. Камная // Методики гене-тико-селекционного и генетического экспериментов. - Мн.: Наука и техника, 1973.-С. 161-163.

42. Жимулев, И.Ф. Общая и молекулярная генетика [Текст]: учеб. пособие для вузов / И.Ф. Жимулев; под ред. Е.С. Беляев, А.П. Акифьева. - 3-е изд., испр. - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2006. - 479 с.

43. Жужжалова, Т. П. Репродуктивная биология сахарной свеклы [Текст] / Т. П. Жужжалова, В.В. Знаменская, О. А. По двигана, Г. И. Ярмо-люк. - Воронеж: Тип. ООО «Сотрудничество», 2006. -232 с.

44. Жукова, М. Полиплоидия орхидей [Электронный ресурс] -2008. - Режим доступа: http://www.molo.ru/articles,special, 1,14.htm.

45. Завадская, JI.B. Интродукция и сортоизучение лилий из раздела Азиатские гибриды [Текст] / JI.B. Завадская // Цветоводство - сегодня и завтра: тезисы докладов III Международной конференции. - М., 1998. - С. 107109.

46. Загрекова, В.Н. К методике цитологического анализа полиплоидных форм сахарной свеклы [Текст] / В.Н. Загрекова, А.Д. Ахраменко, В.Е. Бормотов // Методики генетико-селекционного и генетического экспериментов - Мн.: Наука и техника, 1973. - С. 117-122.

47. Зеленцов, C.B. Способ создания исходного материала для селекции растений [Электронный ресурс] /C.B. Зеленцов, A.B. Кочегура. - Пат.

2215407 Российская Федерация - 2003. - Режим доступа: http://www.ntpo.com/patents_harvest/harvest_l/harvest_279.shtml.

48. Зильберварг, И.Р. Использование динитроанилиновых и фосфо-ротиоамидных гербицидов в целях экспериментальной полиплоидии котовника в условиях in vitro [Текст] / И.Р. Зильберварг // Ученые записки Таврического национального университета. - 2001. - Т. 14 (53), № 1. - С. 79-83.

49. Иванова, Н.В. Микроклональное размножение Азиатских гибридов лилий [Текст] / Н.В. Иванова, Г.М. Пугачева // Основные итоги и перспективы научных исследований ВНИИС им. И.В. Мичурина (1993-2001 гг): Сб. науч. тр. - Тамбов: Изд-во ТГТУ, 2001. - Т. 1. - С. 199-203.

50. Ишмуратова, М.М. Использование культуры in vitro для размножения гибридов Iris L. [Текст] / М.М. Ишмуратова, А.Ф. Рахимова // Растительные ресурсы. - 1999. - Т. 35, Вып. 4. - С. 74-78.

51. Калашникова, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии [Текст] / Е.А. Калашникова, Е.З. Кочнева, О.Ю. Миронова. - М.: КолосС, 2006.-144 с.

52. Каротиноиды [Электронный ресурс] - 2006. - Режим доступа: http ://www. lutein.ru/about/.

53. Катасонова, A.A. Оптимизация технологии получения растений-регенератов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук / A.A. Катасонова. - Уфа, 2007. - 25 с.

54. Кедров-Зихман, О.О. Определение числа хромосом в соматических клетках ржи [Текст] / О.О. Кедров-Зихман, Т.С. Шилко // Методики ге-нетико-селекционного и генетического экспериментов. - Мн.: Наука и техника, 1973.-С. 152-156.

55. Кильчевский, A.B. Клональное микроразмножение лилий на разных этапах культивирования [Текст] / A.B. Кильчевский, В.В. Французе-нок // Сельскохозяйственная биотехнология. - 2002. - С. 183-184.

56. Киреева, М.Ф. Селекция лилий в Мичуринске [Текст] / М.Ф. Киреева, Н.Г. Коршикова // Развитие научного наследия И.В. Мичурина

(Краткие тез докл. обл. науч. конфер.) / ЦГЛ им. И.В. Мичурина. - Мичуринск, 1981.-С. 32-34.

57. Киреева, М.Ф. Лилии [Текст] / М.Ф. Киреева - М.: Россельхоз-издат, 1984.-206 с.

58. Киреева, М.Ф. Использование сорта Коннектикут Кинг (США) в селекции лилий // Сб. науч. тр. / ВНИИ садоводства им. И.В. Мичурина. -Мичуринск, 1988(а). - Вып. 52. - С. 7-15.

59. Киреева, М.Ф. Итоги и перспективы селекции лилий [Текст] / М.Ф. Киреева // Сб. науч. тр. / ВНИИ садоводства им. И.В. Мичурина. -Мичуринск, 1988(6). - Вып. 52. - С. 3-6.

60. Киреева, М.Ф. Лилии на вашем участке [Текст] / М.Ф. Киреева // Лилии. - Тула: Лев Толстой, 1992(а). - С. 3-6.

61. Киреева, М.Ф. Результаты и перспективы селекции лилий во ВНИИ садоводства им. И.В. Мичурина [Текст] / М.Ф. Киреева, Н.Г. Корши-кова, Н.В. Иванова, В.В. Мартынова // Лилии. - Тула: Лев Толстой, 1992(6). -С. 15-17.

62. Киреева, М. В тайниках божественной природы [Электронный ресурс] / М. Киреева - Режим доступа: http://flower.onego.ru/lukov/ lilium_e.html.

63. Киреева, М.Ф. Лилии [Текст] / М.Ф. Киреева. - М.: ЗАО «Фи-тон+», 2000. - 160 с.

64. Киреева, М.Ф. Селекция зимостойких лилий [Текст] / М.Ф. Киреева, Н.В. Иванова, В.В. Мартынова // Основные итоги и перспективы научных исследований ВНИИС им И. В. Мичурина (1931-2001 гг). Сб. науч. тр. - Тамбов: Изд-во ТГТУ, 2001. - Т. 1. - С. 160-171.

65. Киреева, М.Ф. Цветок Миледи [Текст] / М.Ф. Киреева // Приусадебное хозяйство, приложение к журналу. - 2001. - № 6. - 14 с.

66. Клоц, Д.У. От создания мира [Электронный ресурс] / Д.У. Клоц. - 1998. - Режим доступа: http://svitlo.by.ru/bibloteka/ot_sozd_mira/ot_sozd_ mirai 1 .html.

67. Колесников, А.И. Колхицин и получение новых форм сельскохозяйственных растений [Текст] / А.И. Колесников - JL: Колос, Ленингр. отд-ние, 1972.-128 с.

68. Коршикова, Н.Г. Влияние гамма-облучения пыльцы лилий на результаты отдаленной гибридизации [Текст] / Н.Г. Коршикова // Бюл. Гл. ботан. сада. - 1980. - Вып. 117. - С. 66-69.

69. Коршикова, Н.Г. Получение отдаленных гибридов лилий методом культуры зародышей на искусственной среде [Текст] / Н.Г. Коршикова // Бюл. Гл. ботан. сада. - 1981. - Вып. 120. - С. 77-80.

70. Коршикова, Н.Г. Селекция раноцветущих лилий [Текст] / Н.Г. Коршикова // Сб. науч. тр. / ВНИИ садоводства им. И.В. Мичурина. - Мичуринск, 1988. - Вып. 52. - С. 15-20.

71. Кудряшова, ГЛ. Карио-систематическое исследование кавказских лилий [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Г.Л. Кудряшова. - Л., 1971.-25 с.

72. Лапчик, В.Ф. Использование метода культуры тканей для быстрого и эффективного размножения редких и исчезающих, лекарственных и декоративных видов растений [Текст] / В.Ф. Лапчик, Д.М. Глеба, В.А. Ступницкий // Охрана, изучение и обогащение растительного мира. - 1984. -№ 11. - С. 97-100.

73. Леди Lilium. Золотые правила селекции. [Электронный ресурс]. - 2005. - Режим доступа: http://flowers31.narod.ru/Selection_Gold_rules.html.

74. Лиходзиевская, Л.А. Методика подсчета числа хромосом у лом-коколосника ситникового [Текст] / Л.А. Лиходзиевская, Н.В. Балыкина // Научно-технический бюллетень. - М.: ВАСХНИЛ. СО, 1988. - Т. 1. - С. 2830.

75. Лойко, В. Лилия белая в медицине и косметике [Электронный ресурс] / В. Лойко. - 2010. - Режим доступа: http://www.gazetasadovod.ru/ apt/858-liliya-belaya-v-medicine-i-kosmetike.html.

76. Лукин, В.Д. Генетическая стратегия получения селекционного исходного материала смородины [Текст] / В.Д. Лукин // Селекция и семеноводство с.-х. культур. - Пенза, 2003. - С. 164-166.

77. Лутова, Л.А. Биотехнология высших растений [Текст] / Л.А. Лу-това - СПб.: Изд-во С.-Петерб. университета, 2003. - 228 с.

78. Лучникова, C.B. Подсчет чисел хромосом у плодовых растений [Текст] /C.B. Лучникова, Л.А. Фролова (Топильская) // Флора и фауна Черноземья. - Тамб. гос. ун-т. Тамбов, 2003. - Вып. 6. - С. 48-53.

79. Мазур, A.M. Клональное микроразмножение ценных гибридов лилий [Текст] / A.M. Мазур, Е.А. Калашникова // Сельскохозяйственная биотехнология. - М., 2000. - Т. 1. - С. 99-105.

80. Мамаева, H.A. Сравнительный анализ морфологических и биологических признаков сортов садовых бородатых ирисов (секция Iris рода Iris L.) [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук /H.A. Мамаева. - М., 2008. -23 с.

81. Мартынова, В.В, Некоторые аспекты селекции бульбоносных лилий [Текст]: автореф. дис. ... канд. с/х. наук / В.В. Мартынова. - Мичуринск, 2001. - 27 с.

82. Матвеева, Т.С. Полиплоидные декоративные растения [Текст] / Т.С. Матвеева. - Л.: Наука, 1980. - 300 с.

83. Миронова Н. Селекция это интересно! [Электронный ресурс] / Н. Миронова. - 2006- Режим доступа: http: //flowers31.narod.ru/2_SELEC-TION.html.

84. Мокшин, Е.В. Влияние регуляторов роста на морфогенез лон-гифлорум-азиатик гибридов лилий в культуре in vitro [Текст] /Е.В. Мокшин, A.C. Лукаткин // Агрохимия. - 2005. - № 3. - С. 55-59.

85. Мокшин, Е.В. Морфо-физиологические особенности клонально-го микроразмножения in vitro различных сортов лилий (Lilium L.) и гладиолусов (Gladiolus L.) [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Е.В. Мокшин. - Саранск, 2005. - 20 с.

86. Молканова, О.И. Разработка и совершенствование биотехнологических методов размножения и сохранения полезных и редких растений [Текст] / О.И. Молканова, JI.H. Коновалова, Т.С. Стахеева, О.Г. Васильева // Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур: Сборник научных трудов международной научно-практической конференции. - М.: ГНУ ВНИИО РАСХН, 2004. - Вып. 1. - С. 227-231.

87. Мосин, О.В. Биосинтез каротиноидов в клетке [Электронный ресурс] / О.В. Мосин/ - 2006. - Режим доступа: http://zhurnal.lib.ru/ o/oleg_w_m/cdocumentsandsettingsolegmoidokumenlybiosintezkarotinoidowwkletk e2rtf.shtml.

88. Мухаметвафина, А. А. Интродукция лилий в Башкирском Пре-дуралье и их размножение in vivo и in vitro [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук / A.A. Мухаметвафина. - Уфа, 2009 - 16 с.

89. Набиева, А.Ю. Преимущества использования методов культуры ткани для размножения новых сортов лилий [Текст] / А.Ю. Набиева // Тез. докл. юбилейной конф. «Садоводство и цветоводство на современном этапе». РАСХН. Сиб. отд-ние. НЗПЯОС им. И.В. Мичурина. Новосибирск, 2005.-С. 203-207.

90. Набиева, А.Ю. Размножение и сохранение в культуре in vitro двух редких видов лилий - Lilium distichum Nakai и L. Cernuum Кот. [Текст] / А.Ю. Набиева, О.В. Дорогина, Красников A.A. // Раст. Ресурсы. - 2008(a). Т.44, вып.2. - С. 23-29.

91. Набиева, А.Ю. Создание отдаленных гибридов лилий и их идентификация на ранних этапах онтогенеза [Текст] / А.Ю. Набиева, О.В. Дорогина, O.A. Сорокопудова, С.С. Кирикович, Е.В. Левитес // Доклады РАСХН. - 2008(6).-№3,-С. 26-28.

92. Набиева, А.Ю. Сохранение и размножение в культуре in vitro генотипов редких видов лилий азиатской части России [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук / А.Ю. Набиева. - Новосибирск, 2008 - 17 с.

93. Назаренко, Б.П. Полиплоидия в растениеводстве [Текст]: ВНИИТЭИСХ Обзорная информация / Б.П. Назаренко. - М., 1975. - 56 с.

94. Насауле, В.П. Лилии [Текст] / В.П. Насауле, В.П. Орехов - Рига: Лиесма, 1973.- 151 с.

95. Недялков, С.Ф. Выращивание лилий 4.1. Покупка, посадка и уход [Электронный ресурс] / С.Ф. Недялков - 2009. - Режим доступа: http://www.gardenia.ru/pages/lil_010.htm.

96. Немченко, Э.П. Анатомическое строение некоторых видов Li-lium L. [Текст] / Э.П. Немченко, B.C. Новиков // Биологические науки. -1979.-№ 6.-С. 53-58.

97. Обработка семян [Электронный ресурс]. - 2005. - Режим доступа: http://cesla.rWindex.php?name=Html_Content&op=page&folder=Semena& contentsite=semena.html.

98. Онтогенетический атлас лекарственных растений [Текст]. -Учебное пособие. Map. гос. ун-т. - Йошкар-Ола, 2000. - 268 с.

99. Отдаленная гибридизация и полиплоидия в селекции растений [Текст]. - Воронеж, 1989. - 150 с.

100. Отрошко, A.B. Селекция лилий за рубежом [Текст] / A.B. От-рошко // Лилии - Тула: Издательско-полиграфическое объединение «Лев Толстой», 1992. - С. 25-27.

101. Отрошко, A.B. Лилии [Текст] / A.B. Отрошко. - М.: Хоббикнига, 1993.-С. 23-27.

102. Панин, В.А. Биологическая наука - сельскому хозяйству. Методика массового получения и отборов тетраплоидных форм сахарной свеклы [Текст] / В.А. Панин, Е.Б. Панина, А.Н. Лутков, В.П. Зосимович. - Киев: Изд-во АН УССР, 1962. - 41 с.

103. Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений [Текст] / З.П. Паушева - М.: Колос, 1974. - 288 с.

104. Першина, JI.А. Культивирование изолированных клеток и тканей растений. Часть 1 [Текст]: учебное пособие / Л.А. Першина. - Новосибирск, 2000(a). - 45 с.

105. Першина, Л.А. Методы культивирования in vitro в биотехнологии растений. Часть 2 [Текст]: учебное пособие / Л.А. Першина - Новосибирск, 2000(6). - 69 с.

106. Петрова, Т.Ф. Цитоэмбриология лилейных. Подсемейство Lilioi-deae [Текст] / Т.Ф. Петрова. - М.: Наука, 1977. - 214 с.

107. Пленник, Р.Я. Морфологическая эволюция бобовых Юго-Восточного Алтая [Текст] / Р.Я. Пленник. - Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1976.-216 с.

108. Плохинский, H.A. Алгоритмы биометрии. [Текст] / H.A. Пло-хинский. - М.: Изд-воМоск. Ун-та, 1970. - 367с.

109. Пугачева, Г.М. Клональное микроразмножение отдаленных гибридов лилий [Текст] / Г.М. Пугачева // Генетические ресурсы растениеводства Дальнего Востока: Международная конференция. Владивосток: Даль-наука, 2004. - С. 393-397.

110. Пугачева, Г.М. Методы создания исходного материала для селекции лилий [Текст]: автореф. дис. ... канд. с.-х. наук / Г.М. Пугачева. -Мичуринск, 2005. - 149 с.

111. Пугачева, Г.М. Клональное микроразмножение лилий [Текст] / Г.М. Пугачева, Соколова М.А. // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета, 2010. - С. 35-37.

112. Путеводитель по лилиям: классификация [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://read.bestgarden.ru/articles/guide_lilies/2006-08-09/.

113. Работнов, Т.А. Жизненный цикл многолетних травянистых растений в луговых ценозах [Текст] // Тр. БИН АНСССР, Сер. 3, Геоботаника. -М., Л., 1950. - Вып. 6. - С. 7-204.

114. Работягов, В.Д. Сравнительное изучение анатомо-морфологических признаков диплоидных и тетраплоидных растений лаван-

ды [Текст] / В.Д. Работягов // Бюл. Никитск. ботан. сада. - Ялта, 1977. -Вып. 1 (32).-С. 66-71.

115. Раджабли, Е.П. Получение и использование полиплоидных форм растений [Текст] / Е.П. Раджабли, В.Д. Рудь. - Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1972. - 132 с.

116. Румынии, В.А. Масс-клональное размножение лилий [Текст] / В.А. Румынии, А.Г. Слюсаренко // Бюл. Гл. ботан. сада. - 1989. - Вып. 153. - С. 62-69.

117. Румынии, В.А. Особенности морфогенеза in vitro представителей рода Lilium из разных областей природного местообитания [Текст] / В.А. Румынии // Цветоводство - сегодня и завтра: тезисы докладов III Международной конференции. - М., 1998(a). - С. 233.

118. Румынии, В.А. Особенности размножения in vitro представителей семейств Liliaceae, Amaryllidaceae и Iridaceae [Текст] / В.А Румынии, А.Г. Слюсаренко // Цветоводство - сегодня и завтра: тезисы докладов III Международной конференции. - М., 1998(6). - С. 232.

119. Савченко, В.К. Генетический анализ в сетевых и пробных скрещиваниях [Текст] / В.К. Савченко. - Мн.: Наука и техника, 1984. - 223 с.

120. Савченко, В.К. Генетический анализ и синтез в практической селекции [Текст] / В.К. Савченко. - Мн.: Наука и техника, 1986. - 92 с.

121. Савченко, Л.Ф. Получение и выделение полиплоидных форм у сортов шалфея мускатного различного эколого-географического происхождения по косвенным признакам [Текст] / Л.Ф. Савченко // Труды ВНИИ эфиромасличных культур. - 1990. - Т. XXI. - С. 24-33.

122. Санкин, Л.С. Новый способ получения мейотических полиплоидов смородины и крыжовника [Текст] / Л.С. Санкин // Сиб. вестн. с.-х. науки. - 1997. - № 1 -2. - С. 78-81.

123. Свободная энциклопедия [Электронный ресурс]. - 2008. - Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9B%D0%B5%D 1 %81 %D0%BE%D 1 %81 %D 1 %82%D0%B5%D0%BF%D 1 %8С.

124. Седышева, Г.А. Полиплоидия и селекция яблони [Текст] / Г.А. Седышева, E.H. Седов. - Орел, 1994. - 268 с.

125. Сидорович, Е.А. Клональное микроразмножение новых плодово-ягодных растений [Текст] / Е.А. Сидорович, E.H. Кутас. - Мн.: Наука и техника, 1996. - 246 с.

126. Современные методы и подходы в селекции растений [Текст] -Кишинев, 1991.- 170 с.

127. Соколовская, А.П. К вопросу о корреляции между числом хромосом и величиной пыльцевого зерна у видов диких растений [Текст] / А.П. Соколовская // Полиплоидия у растений. - М., 1962. - С. 80-82.

128. Сорокина, И.К. Основы биотехнологии растений. Культура клеток и тканей [Текст]: учебное пособие / И.К. Сорокина, Н.И. Старичкова, Т.Б. Решетникова. - СГУ, 2002. - 43 с.

129. Сорокопудов, В.Н. Опыт интродукции магонии падуболистной и перспективы ее использования [Текст] / В.Н. Сорокопудов, В.А. Хлебников, В.И. Дейнека // Вестник РАСХН. - Саратов, 2006. - № 3. - С. 35-36.

130. Сорокопудова, O.A. Некоторые анатомо-морфологические характеристики видов и сортов рода Lilium [Текст] / O.A. Сорокопудова // Бюл. Гл. ботан. сада. - 2002. - Вып. 183. - С. 46-53.

131. Сорокопудова, O.A. Особенности прорастания семян лилий и способы повышения их всхожести [Текст] / Сорокопудова O.A. // Повышение эффективности селекции и семеноводства сельскохозяйственных растений: Докл. и сообщ. VIII генетико-селекцион. шк. (11-16 нояб. 2001 г.) / РАСХН. Сиб. отд-ние. СибНИИРС. НГАУ. - Новосибирск, 2002. - С. 397400.

132. Сорокорудова, O.A. Биологические особенности лилий в Сибири [Текст] / O.A. Сорокопудова. - Белгород: Изд-во БелГУ, 2005. - 244 с.

133. Сорокопудова, O.A. Перспективы интродукции и селекции Lilium в БелГУ [Текс] / O.A. Сорокопудова, H.A. Лабунская, И. Шахова // На-

уч. ведомости БелГУ. Серия «Естеств. науки". - 2007. - Вып. 5, № 5 (36). -С. 21-24.

134. Суриков, И.М. Получение и характеристика ячменно-пшеничных гибридов [Текст] / И.М. Суриков, Н. И. Кисель // Сборник научных трудов по прикладной ботанике, генетике и селекции ВИР. - 1992. - Т. 148.-С. 12-18.

135. Трунин, JI.JI. Эффективность различных способов воздействия колхицином при получении полиплоидов крыжовника [Текст] / JI.JT. Трунин. - В кн.: Краткие тезисы докладов Второй Всесоюзной конференции по садоводству. - Мичуринск, 1976. - С. 287-288.

136. Трунин, J1.JI. Выделение полиплоидов смородины и крыжовника по величине пыльцевых зерен [Текст] / JI.JI. Трунин // Достижения науки - в практику. Тез. докл. - Тамбов, 1978. - С. 15.

137. Трунин, JI.JI. Онтогенетические изменения полиплоидизируе-мых растений смородины и крыжовника и идентификация полиплоидов на разных этапах развития [Текст] / JI.JI. Трунин // Проблемы повышения эффективности современного садоводства. Кратк. тез. докл. Всесоюзн. науч. конф. молодых ученых. - Мичуринск, 1982. - С. 176-178.

138. Трунин, JI.JI. Исследование биологических и цитологических особенностей индуцированных полиплоидных форм черной смородины и крыжовника [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук / JI.JI. Трунин. - М.: Ротапринт ВНИИС им. И. В. Мичурина, 1984. - 26 с.

139. Уранов, A.A. Возрастной спектр фитоценопопуляций как функция времени и эмпирических волновых процессов // Биол. науки. - 1975. -№2. - С. 7-34.

140. Френкель, Р. Механизмы опыления, размножения и селекции растений [Текст] / Р. Френкель, Э. Галун. - М.: Колос, 1982. - 384 с.

141. Халипова, Г.И. Экспериментальная полиплоидия дикорастущих декоративных растений [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Г.И. Халипова.-М., 1990.-23 с.

142. Химический мутагенез и задачи сельскохозяйственного производства [Текст]. - М.: Наука, 1993. - 237 с.

143. Хромосомные числа цветковых растений [Текст] / Сост.: З.В. Волховских, В.Г. Гриф, О.И. Захарьева, Т.С. Матвеева и др. - Л.: Наука. Ле-нингр. отд-ние, 1969. - 927 с.

144. Черепанов, С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств [Текст] / С.К. Черепанов. - СПб.: Мир и семья, 1995. - 990 с.

145. Числа хромосом цветковых растений флоры СССР: Семейства Aceraceae - Menyanthaceae [Текст] /под ред. А.Л. Тахтаджян. - Л.: Наука, 1990.-509 с.

146. Чурикова, O.A. Некоторые особенности морфогенеза in vitro при масс-клональном размножении лилий [Текст] / O.A. Чурикова, В.А. Румынии, Р.П. Барыкин, А.Г. Слюсаренко // Бюл. Гл. ботан. сада. - 1991. - Вып. 159.-С. 43-49.

147. Чурикова, O.A. Морфологические процессы в луковичных че-шуях некоторых видов лилий в условиях масс-клонального размножения in vitro [Текст] / O.A. Чурикова, В.А. Румынии, Р.П. Барыкин, А.Г. Слюсаренко // Бюл. Гл. ботан. сада. - 1994. - Вып. 169. - С. 105-111.

148. Чучин, В. Новые фавориты в мире лилий [Текст] / В. Чучин // Цветоводство. - 1999. -№ 1. - С. 13-14.

149. Шафранский, В. Займемся семенами [Электронный ресурс] / Шафранский В. - 2005. - Режим доступа: http://www.sadovod.spb.ru/ TextShablon.php?LinkPage= 182.

150. Шиповская, Е.И. Лилии (виды, разновидности и гибридные формы) [Текст] / Е.И. Шиповская, В.И. Колокольникова, Г.В. Матросова. -М.: Изд-во Моск. ун-та, 1972. - 156 с.

151. Шмальц, X. Селекция растений [Текст] / X. Шмальц. - М.: Колос, 1973.-295 с.

152. Экспериментальное получение полиплоидных форм Lilium L. и их анатомо-морфологические особенности [Текст]: Актуальные задачи се-

лекции и семеноводства сельскохозяйственных растений на современном этапе: Докл. и сообщ. IX генетико-селекцион. шк. (5-9 апр. 2004 г.) / РАСХН. Сиб. отд-ние. СибНИИРС. НГАУ. - Новосибирск, 2005. - С. 506512.

153. Юданова, С.С. Миксоплоидия клеточных популяций сахарной свеклы и ее связь с репродуктивными признаками [Текст]: автореф. дис. ... канд. биол. наук / С.С. Юданова. - СПб., 2004. - 19 с.

154. Яшин, Т.А. Получение тетраплоидов томата культурного (Lycopersicon esculentum) и их идентификация в С поколении [Текст] / Т.А. Яшин, С.В. Иванова, Е.И. Хорьков // Сб. студенч. науч. работ / Моск. с.-х. акад. - М., 2000. - Вып. 6. - С. 61-69.

155. Anderson, W.C. Rapid propagation of Liliurn cv. Red Carpet [Text] / W.C. Anderson // In vitro. - 1977. - Vol. 13. - P. 145.

156. Andersen, K. Lecture of Peter Schenk [Text] / K. Anderson // The Lily Yearbook. - 1989. - № 42. - P. 16-17.

157. Armstrong, G.A. Генетика и молекулярная биология биосинтеза каротиноидных пигментов [Электронный ресурс] / G.A. Armstrong, J.E. Hearst. - 1996. - Режим доступа: http://www.lutein.ru/library/2006/10/19/ library_4.html.

158. Banba, Н. Pigments of lily flowers. II Survey of carotenoid [Text] / H. Banba // Japan. Soc. Horticult. Sci. - 1968. - Vol. 37(4). - P. 368-378.

159. Brown, D.H. Tissue culture without intimidation [Text] / D.H. Brown // The Lily Yearbook. - 1981. - № 34. - P. 28-33.

160. Carlos, M. The potential uses of somatic embryogenesis in agrofore-stry are not limited to synthetic seed technology [Text] / M. Carlos, F. Vicient, X. Martinez // Revisla Brasileira de Fisiologia Vegetal. - 1998. - Vol. 10, № 1. - P. 1-12.

161. Charles, K. A first experience with embryo culture at home [Text] / K. Charles, A. Kroell // The Lily Yearbook. - 1982. - № 35. - P. 87-93.

162. Coskuncelebi, K. Karyotypic variations in Lilium spp. [Text] / K. Coskuncelebi, H. Inceer, O. Beyazoglu // Bangladesh J. Bot. - 2005. - Vol. 34 (2).-P. 85-89.

163. Cremonini, R. Interspecific hybridization in sunflower [Text] / R. Cremonini, S. Palla, G.P. Vannozzi // Helia. - 1991. - T. 14, № 14. - P. 43-50.

164. Dabkeviciene, G. Polyploid Production of Alsike Clover in Embryo Culture [Text] / G. Dabkeviciene // Biologija. - 1995. - № 3/4. - P. 102-104.

165. Dabkeviciene, G. Comparison of colchicine treatment methods used in clover polyploidy [Text] / G. Dabkeviciene // Biologija. - 1999. - № 3. - P. 3335.

166. Darby, G.W. Lilium hybrid 'Black Beauty' / G.W. Darby // Yearbook NALS, 1965,-P. 116.

167. Deli J. Isolation and characterization of 3,5,6-trihydroxy-carotenoids from petals of Lilium tigrinum [Text] / J. Deli, P. Molnär, Z. Matus, G. Toth, A. Steck, H. Pfander // Chromatographia. - 1998. - Vol.48. - P. 27-31.

168. Eation, T.D. Determination of the Level of Variation in Polyploidy among Kentucky Bluegrass Cultivars by Means of Flow Cytometry [Text] / T.D. Eation, J. Curley, R.C. Williamson, G. Jung // Crop Science. - 2004. - Vol. 44, № 6.-P. 2168-2174.

169. Eizenga, G.C. Cytologycal and Isozyme Evalution of Tall Fescue x Italian Ryegrass Hybrids [Text] / G.C. Eizenga, R.C. Buckner // Plant Breeding. -1986. - T. 97, № 4. - P. 340-344.

170. Emsweller, S.L. A method for making tetraploid lilies/ S.L. Emswel-ler // Lily YB North Amer. Lily Soc. - 1946. - P. 16-18.

171. Emsweller, S.L. Colchicine-induced polyploidy in Lilium longiflo-rum [Text] / S.L. Emsweller // Amer. J. Bot. - 1949. - Vol. 36, № 2. - P. 135144.

172. Emsweller, S.L. Developments in plant breeding due to the use of colchicines [Text] / S.L. Emsweller // The Lily Yearbook. - 1988. - № 41. - P. 75-86.

173. Freemann, J. Stomate size and pollen characteristics as an indication of chromosome numbers in Lilies [Text] / J. Freeman // The Lily Yearbook. -1987.-№40.-P. 19-26.

174. Freimann, L. Breeding with Tetraploid Lilies [Text] / L. Freimann // The Lily Yearbook. - 1987. - № 40. - P. 13-14.

175. Gamiette, F. Ploidy determination of some yam species (Dioscorea spp.) by flow cytometry and conventional chromosomes counting [Text] / F. Gamiette, F. Barky, G. Ano // Genetic Resources and Crop Evolution. - 1999. - Vol. 46, № l.-P. 19-27.

176. Giusti, M.M. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy [Text] / M.M. Giusti, E. Ronald, R.E. Wrolstad// Current Protocols in Food Analytical Chemistry. - 2001 - Fl.2.1-F 1.2.13.

177. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Planzenzellen [Text] / G. Haberlandt // Sitzungsb. Akad. Wiss. Wien. Math.-naturwiss. KI. - 1902. - Bd. 3.-P. 69-92.

178. Hacketi, W.P. Aceptic multiplication of lily bulblets from bulb scales [Text] / W.P. Hacketi // Proc. Intern. Plant Prop. Soc. - 1969. - Vol. 19. - P. 105-108.

179. Hsieh, C.-L. Optimisation of lily microbulb multiplication operations [Text] / C.-L. Hsieh, T.-T. Lin // Biosystems Engg. - 2002. - Vol. 82, № 3. - P. 279-288.

180. Ishikawa, K. Establisment of tetraplloid plants of Capsicum annuum L. by colchicines treatment with the analysis of flow cytometry [Text] / K. Ishikawa, K. Mishiba, H. Yoshida, O. Nunomura // Capsicum Eggplant Newsletter. -Turin. - 1997. - № 6. - C. 44-47.

181. Jaap M. van Tuyl, Research on polyploidy in interspecific hybridization of Lily [Text] / Jaap M. van Tuyl, A.M. Ton // The Lily Yearbook. - 1989. -№42.-P. 62-65.

182. Jaap M. van Tuyl, Survey Research on mitotic and meiotic polyploi-dization at CPRO-DLO [Text] / Jaap M. van Tuyl // The Lily Yearbook. -1990(a).-№43.-P. 10-27.

183. Jaap M. van Tuyl, The use of oryzalin as an alternative for colchicines in in-vitro chromosome doubling of Lilium [Text] / Jaap M. van Tuyl, B.M. van Dien, M.P. van Dien // The Lily Yearbook/ - 1990 (6). - № 43. - P. 19-22.

184. Kazunori, N. Induced Polyploid Grapes via in vitro Chromosome Doubling [Text] / N. Kazunori, T. Tsuru, M. Shiraishi // J. Japan. Soc. Hortic Sc. - 2000. - Vol. 69, № 5. - P. 543-551.

185. Kim, H.J. Frequency of Viable Seeds Obtained from Several Lilium spp. Cross-Pollinated at Different Floral Stages [Text] / H.J. Kim, Y. Niimi // J. Japan. Soc. Hortic Sc. - 2002. - Vol. 71, № 2. - P. 231-235.

186. Kobza, F. Labour-saving technique for cytology in Daucaceae [Text] / F. Kobza // Breeding of root vegetables. - 1985. - P. 74-75.

187. Kosar, M. Antioxidant activity and phenolic composition of sumac (Rhus coriaria L.) extracts [Text] / M. Kosar, B. Bozan, F. Temelli, K.H.C. Baser // Food Chem. - 2007. - V. 103. - P. 952-959.

188. Lian, M.-L. Effect of light emitting diodes (LEDs) on the in vitro induction and growth of bulblets of Lilium oriental hybrid "Pesaro" [Text] / M.-L. Lian, H.N. Murthy, K.-Y. Paek // Scientia Horticulturae. - 2002. - Vol. 94, № 3/4.-P. 365-370.

189. Lim Ki-Byung, Occurrence of SDR 2N-gametes in Lilium Hybrids [Text] / K-B. Lim, T-M. Shen, R. Barbara-Gonzalez, M.S. Ramanna, J.M. van Tuyl // Breeding Science. - 2004. - Vol. 54. - P. 13-18.

190. M.G.M. van Creij. Wide interspecific hybridization of Lilium: Preliminary results of the application of pollination and embrio-rescue methods [Text] / M.G.M. van Creij, L.W.D. van Raamsdonk, J.M. van Tuyl // The Lily Yearbook. - 1990. - № 43. - P. 28-37.

191. Martens, M.R. An Improved Techique for Counting Chromosomes in Grapes [Text] / M.R. Martens, B.I. Reich // Hort Science. - 1988 - T. 23, № 5. -P. 896-899.

192. Martens S. Impact of biochemical pre-studies on specific metabolic engineering strategies of flavonoid biosynthesis in plant tissues [Text] / S. Mar-

tens, J. Knott, C.A. Seitz, L. Janvari, S.-N. Yu, G. Forkmann // Biochem. Eng. J. 2003. v.14. P. 227-235.

193. Merel, L-G. Hot-water treatment before tissue culture reduces initial contamination in Lilium and Acer [Text] / L-G. Merel, A. Marion, Greet-Jan De Klerk // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 1998. - P. 75-77.

194. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures [Text] / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant - 1962. - P. 473-497.

195. Niraoka, N. Atractylodes lancea autotetraploids induced by colchicines treatment of shoot cultures [Text] / N. Niraoka // Biologia & pharmaceutical bulletin. - 1998 - Vol. 84, № 996. - p. 399-409.

196. Novak, FJ. Tissue culture propagation of Lilium hybrids [Text] / F.J. Novak, E. Petru // Sei. hort. - 1981. - Vol. 14.-P. 191-199.

197. Norbak R. Anthocyanins from flowers of Lilium {Liliaceae) [Text] / R. Norbak, T. Kondo // Phytochem. - 1999. - Vol. 50(7). - P. 11 Sill 84.

198. Polyploidy [Электронный ресурс]. - 2003. - Режим доступа: http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e37/37d.htm.

199. Rodriguez-Amaya, D.R. A guide to carotenoid analysis in foods. [Text] / D.R. Rodriguez-Amaya // ISLI Press. - Washington, 2001. - 64 p.

200. Roegiers, P. The persistence of tetraploid perennial ryegrass in a mixture with diploid perennial ryegrass [Text] / P. Roegiers, D. Reheul, G. Bogaert // J. Agron. Crop Sc. - 1988. - T. 161. № 1, - P. 40-44.

201. Sari, N. Comparision of ploidy level screening methods in watermelon: Citrullus lanatus (Thumb.) Matsum. and Nakai [Text] / N. Sari, K. Abac, M. Pitrat // Scientia Horticulturae. - 1999. - Vol. 82, № 3.4. _ p. 265-277.

202. Schenk, P.C. New Directions with polyploids in Asiatic and Oriental Lilies [Text] / P.C. Schenk // The Lily Yearbook. - 1987. - № 40. - P. 7-18.

203. Schmitzer, E. Polyploid Lilies of the Asiatic section [Text] / E. Schmitzer // The Lily Yearbook. - 1985. - № 38. - P. 67-75.

204. Sharp, W.R. Haploidy in Lilium [Text] / W.R. Sharp, R.S. Raskin // Phytomorphology. - 1971. - Vol. 21. - P. 334-337.

205. Shozo Nöda. Cytogenetic studies in the hybrid lilies [Text] / Shozo Nöda // Euphytica. - 1971. - Vol. 84, № 996. - P. 399-409.

206. Simmonds, J.A. Propagation of Lilium hybrids 2. Production of plan-tlets from bulbscale callus cultures for increased propagation rates [Text] / J.A. Simmonds, B.G. Cumming // Sei. hort. - 1976. - Vol. 5. - P. 161-170.

207. Stimart, D.P. Tissue culture of bulb-scale section for a sexual propagation of Lilium longiflorum Thumb [Text] / D.P. Stimart, P.D. Asher // J. Amer. Soc. Hort. Sei.- 1978.-Vol. 103.-P. 182-184.

208. Strasser, V. Polyploidization with and without colchicine [Text] / V. Strasser // The Lily Yearbook. - 1983. - № 36. - P. 97-100.

209. Takayama, S. Differentiation in Lilium bulbscales grown in vitro. Effect of various cultural conditions [Text] / S. Takayama, M. Misawa // Physiol. Plant. - 1979. - Vol. 46. - P. 184-190.

210. The International Lily Register and Checklist 2007 [Text] / The Royal Holticultural Sosiety. - London. - 2007. - 948 p.

211. The Online Lily Register [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.lilyregister.com/.

212. Thomas, W. Plants from aseptic culture of the lily Embryo cotyledon [Text] / W. Thomas, Zimmerman, P.D. Ascher // The Lily Yearbook. - 1982. - № 35.-P. 120-123.

213. Uquiche, E. Supercritical carbon dioxide extraction of red pepper (iCapsicum annuum L.) oleoresin [Text] / E. Uquiche, J.M. del Valle, J. Ortiz // J. Food Engin. - 2004. - Vol. 65 (1). - P. 55-66.

214. Van Aartrijk, J. Some influences of naphtylacetic acid on the differentiation of meristems of Lilium speciosum 'Rubrum' NR 10 in vitro [Text] / J. Van Aartrijk, G.J. Blom-Barnhoorn // Acta Hort. - 1979. - Vol. 91, № 8. - P. 269-279.

215. L.R.G Yaladon. Carotenoids of lilies and of red pepper: biogenesis of capsanthin and capsorubin [Text] / L.R.G. Valadon, R.S. Mummery // Z. Pflan-zenphysiol. - 1976. - V.82 (5). - P. 407-416.

216. Varshney, A. Synergistic Effect of Polyamines on Bulblet Multiplication in Lilium sp (Asiatic Hybrids) [Text] / A. Varshney, D. Vibha, P.S. Srivasta-va // Plant Biochemistry & Biotechnology. - 2000. - Vol. 9. - P. 115-118.

217. William, F. Tissue culture at lilies international ltd., New Zealand [Text] / F. William, D.W. Doreen, M.W. Doreen // The Lily Yearbook. - 1985. -№38.-P. 59-63.

218. Zwierzykowski, Z Regeneration of plants and chromosome doubling in callus culture of Lolium multiflorum Lam. (2n=14) * Festuca pratensis Huds. (2n=14) hybrid [Text] / Z. Zwierzykowski, A. Slusarkiewicz-Jarzina, J.J. Rybo-zynski // Genetica Polonica. - 1985. - Vol. 26, № 2. - P. 187-189.