Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы. Клинические возможности и перспективы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Трифанов Владимир Сергеевич

• Трифанов Владимир Сергеевич
• доктор наук
• 2021

Оглавление диссертации доктор наук Трифанов Владимир Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕЙРО-ЭНДОКРИННЫХ ОПУХОЛЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (обзор литературы)

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Дизайн исследования

2.2 Характеристика используемого клинического материала

2.3 Методика иммуногистохимического исследования

2.4 Высокопроизводительное параллельное секвенирование

2.5 Определение микросателлитной нестабильности

2.6 Определение уровня CpG-метилирования

2.7 Экспериментальное исследование

2.8 Статистические методы исследования

Глава 3. КЛИНИКО-ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕЙРО-

ЭНДОКРИННЫХ ОПУХОЛЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Глава 4. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ТАРГЕТНОГО ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ НЕЙРОЭНДОКРИН-НЫХ ОПУХОЛЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Глава 5. АНАЛИЗ МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ, ПАТТЕРНА СрС-МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОВ, ИХ КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

5.1 Исследование микросателлитной нестабильности нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы

5.2 Статус метилирования восьми генов-онкосупрессоров: AHRR, APC1A, DAPK, MGMT, MLH1, P16, RASSF1A, RUNX3, и ретротранспозона LINE1 в нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы

5.3 Определение показателей прогноза для выполнения спленосохранных корпорокаудальных резекций нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы

Глава 6. ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ ГЕНОВ И ИЗМЕНЕНИЙ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПУТЕЙ В ТКАНИ НЕЙРОЭНДОКРИННЫХ ОПУХОЛЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ОБЩУЮ И БЕЗРЕЦИДИВНУЮ ВЫЖИВАЕМОСТЬ БОЛЬНЫХ

6.1 Общая выживаемость больных с нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы в течение 10 лет после хирургического лечения

6.2 Безрецидивная выживаемость больных с нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы в течение 10 лет после хирургического лечения

6.3 Влияние молекулярно-генетического портрета нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы на общую и безрецидивную выживаемость больных

Глава 7. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

7.1 Создание РЭХ-модели нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека на иммунодефицитных мышах

7.2 Исследование влияния спленэктомии на частоту развития пневмонических осложнений у экспериментальных животных, получавших терапию препаратом Эверолимус

Глава 8. МНОГОУРОВНЕВАЯ СИСТЕМА ДИАГНОСТИКИ И НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ НЕЙРОЭНДОКРИННЫХ ОПУХОЛЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы. Клинические возможности и перспективы»

Актуальность исследования

Нейрoэндoкринные неoплaзии (НЭН) прeдстaвляют сoбoй бoльшую гeтерогeнную группу oпухoлей эпитeлиaльнoго происхoждения. Сложность ультраструктурной организации, неопределенность иммуногистохимической экспрессии различных маркеров, варьирующие степени митотической активности и непредсказуемый клинический прогноз предопределили исторически существующие разногласия в терминологии НЭН. С тех пор как в 1907 году Зигфрид Оберндорфер определил высокодифференцированные нейроэндокринные опухоли (НЭО) желудочно-кишечного тракта c доброкачественным течением как «карциноиды», была создана не одна классификация. В нaстоящее время дeйствует уже чeтвeртaя рeдакция клaссификации НЭН желудочно-кишечного тракта Всeмирнoй Организaции Здрaвooхранения (ВОЗ) от 2017 года (1пгаш F. et al., 2018).

Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы (НЭО ПЖ) являются относительно редкими новообразованиями, состоящими из эпителиальных клеток с фенотипической и ультраструктурной нейроэндокринной дифференцировкой (Reid M. et al., 2014; Ohmoto A. et al., 2017). Частота встречаемости НЭО ПЖ с 1973 по 2004 годы увеличилась вдвое - с 0,16 до 0,33 случаев на 100 000 населения, что специалисты объясняют как следствие технического прогресса в области диагностики (Kimura W. et al., 1991; Halfdanarson Т. et а1., 2008; Уао I. et а1., 2008; Ohmoto А. et а1., 2017). Нейроэндокринные опухоли ПЖ способны секретировать в кровь гормоны и вазоактивные субстанции, приводящие к развитию соответствующей клинической картины синдрома гормональной гиперпродукции. Но большая часть из них относится к группе функционально-неактивных НЭО ПЖ (ФН-НЭО ПЖ), клинически проявляющих себя только на поздних стадиях болезни в связи с местной инвазией в окружающие ткани или метастазированием (Di Domenico А. et а1., 2017). Средняя продолжительность жизни для пациентов с НЭО ПЖ составляет 3,6 года, для

пациентов с метастатическими опухолями - от 1 до 3 лет (Halfdanarson T. et al., 2008; Yao J. et al., 2008; Zhang J. et al., 2013).

Результаты полногемномного секвенирования ДНК высоко -дифференцированных нейроэндокринных опухолей и низкодифференцированных нейроэндокринных карцином продемонстрировали, что эти два подтипа НЭН обладают совершенно разным биологическим паттерном, клинико-патологическими особенностями и прогнозом (George J. et al., 2015; Tang L.H. et al., 2016; Scarpa A. et al., 2017).

В исследовании, посвященном НЭО ПЖ, A. Scarpa et al. (2017) в общей сложности обнаружили 3097 соматических мутаций в 2567 генах, из которых 2498 не были синонимичными, или молчащими. Были идентифицированы 16 генов, которые подвергались мутациям наиболее часто. Среди них оказались гены MEN1, ATRX, DAXX, PTEN, DEPDC5, TSC1, TSC2, TP53, SETD2 и другие.

И, несмотря на очевидную значимость в канцерогенезе PI3K/mTOR пути, по крайней мере, в некоторых подгруппах НЭО ПЖ до сих пор невозможно провести рациональную стратификацию пациентов, к которым бы могла быть с успехом применена терапия ингибиторами mTOR (Liu P. et al., 2009).

Таким образом, углубленное понимание молекулярных характеристик НЭО ПЖ имеет первостепенное значение, прежде всего, для подбора рациональной терапии.

Степень разработанности темы

Успехи фундаментальной науки легли в основу новых исследовательских инструментов изучения злокачественных процессов различных локализаций, которые еще в полной мере не повлияли на изменение подхода к диагностике и лечению нейроэндокринных неоплазий поджелудочной железы.

В 2010 году была защищена докторская диссертация С.Б. Поликарповой «Нейроэндокринные опухоли органов брюшной полости и забрюшинного пространства (клиника, диагностика, лечение, прогноз)».

В работе проведен ретроспективный анализ на выборке пациентов НЭО органов брюшной полости и забрюшинного пространства, проходивших лечение и наблюдающихся в условиях РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, с учетом клинических, морфологических, биохимических и молекулярно-биологических факторов, влияющих на прогноз при данной патологии.

Статистический анализ обширного клинического материала позволил определить значение и роль различных методов диагностики и лечения, что дало возможность рекомендовать применение в клинической практике наиболее эффективных вариантов лечения НЭО органов брюшной полости и забрюшинного пространства в зависимости от локализации и распространенности опухолевого процесса.

Были определены факторы неблагоприятного течения заболевания на основании проведенного многофакторного анализа как клинических, так и лабораторных данных, что позволило разработать и обосновать тактику лечения данной группы новообразований. Однако анализ клинических, морфологических, биохимических факторов, влияющих на прогноз при данной патологии, был выполнен без учета молекулярно-генетических данных. Не изучена взаимосвязь экспрессии генов и выживаемости больных с НЭО ПЖ.

В 2015 году вышла монография «Нейроэндокринные опухоли. Общие принципы диагностики и лечения» под редакцией профессора В.А. Горбуновой, которая на сегодняшний день является наиболее полным российским научным исследованием в области опухолей данного гистологического типа.

Монография посвящена эпидемиологии, диагностике, особенностям хирургического лечения нейроэндокринных опухолей, а также интервенционной терапии и лекарственному лечению. Определено значение различных клинических, морфологических, иммуногистохимических факторов в прогнозировании течения нейроэндокринных неоплазий. Проведен анализ отдаленных результатов хирургического лечения, на основании которого и выработаны критерии выбора рационального объема медицинской помощи больным нейроэндокринными опухолями.

В работе не описаны результаты молекулярно-генетических исследований НЭО ПЖ в зависимости от стадии и уровня дифференцировки (Grade). В своем исследовании мы коснемся необходимости разработки так называемой «молекулярной классификации» нейроэндокринных опухолей, которая должна дополнить гистологическую классификацию и способствовать точному определению различных морфологических типов и выбору оптимальной терапевтической стратегии.

Цель исследования

Изучить влияние молекулярно-генетического портрета на прогноз, течение и лечение заболевания, определив молекулярно-биологические маркеры нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы.

Задачи исследования

1. Создать коллекцию образцов тканей нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы пациентов ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, «Московского областного научно-исследовательского клинического института имени М.Ф. Владимирского», Научно-исследовательского института -Краснодарская краевая клиническая больница № 1 имени профессора С.В. Очаповского с целью проведения таргетного высокопроизводительного секвенирования.

2. Провести иммуногистохимический анализ нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, оптимизировав панель маркеров (Ki-67, CK 7, CK 18, CK 20, AE1/AE3, NSE, CD 56, Synaptophysin, Chromogranin A).

3. Получить и проанализировать результаты таргетного высокопроизводительного секвенирования панели генов высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы методом биоинформационного анализа.

4. Провести анализ значения показателей микросателлитной нестабильности, паттерна CPG-метилирования генов для выбора тактики хирургического лечения больных нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы.

5. Проанализировать влияние мутаций генов и изменений сигнальных молекулярно-генетических путей в ткани нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы на общую и безрецидивную выживаемость больных.

6. Создать PDX-модель нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы на иммунодефицитных животных.

7. Разработать многоуровневую модель определения тактики лечения нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы.

Научная новизна исследования

В диссертационной работе:

- впервые в России проведено таргетное высокопроизводительное секвенирование высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы больных ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, «Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского» (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского), Научно-исследовательского института - Краевая клиническая больница № 1 имени профессора С.В. Очаповского.

- впервые разработан «Способ прогнозирования клинического течения высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы» (патент РФ № 2747679), заключающийся в определении наличия мутаций в генах ROS1 и KMT2D, которые связаны с течением заболевания без прогрессии, и мутации в генах FGFR2 и BCR, которые сцеплены с метастазированием и агрессивной формой опухолевого роста.

- впервые с помощью таргетного высокопроизводительного секвенирования высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы определены гены, в которых наиболее часто идентифицировали варианты мутаций (свыше 5% в расчете на человека): KMT2C, MEN1, ATRX, CTNNB1, KMT2D, ITGA10, и оценена их связь с выживаемостью.

- впервые разработан «Способ трансплантации фрагмента нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека в поджелудочную

железу иммунодефицитных мышей» (патент № 2725273 РФ), позволяющий получить РЭХ-модель нейроэндокринной опухоли, которую можно использовать для проведения доклинических исследований новых фармакологических субстанций.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты раскрывают новые особенности молекулярно-генетического портрета нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы и его взаимосвязь с положительным и отрицательным прогнозом течения.

Разработанная многоуровневая система диагностики нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы позволяет практическим врачам-онкологам в каждом конкретном случае НЭО выбирать оптимальный лечебный подход с целью улучшения отдаленных результатов лечения, а также проводить длительное динамическое наблюдение за пациентами и их целенаправленное обследование в зависимости от ожидаемого возникновения метастазов.

Впервые разработан способ диагностики нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы по определению в плазме крови содержания белка ТОБ-Р и его рецептора ТОБМ (патент РФ № 2722276).

Впервые разработан способ определения отрицательного прогноза течения нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы на основе анализа статуса метилирования восьми генов-онкосупрессоров - ЛИЯЯ, АРС1А, БАРК, ЫОМГ, ЫЬИ1, Р16, ЯАЖ^А, киыхз, и ретротранспозона ШЕ1.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения

Результаты исследования внедрены в практику работы отделений абдоминальной онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. Фундаментальные теоретические положения внедрены в учебный процесс преподавания на кафедре онкологии ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России.

Методология и методы диссертационного исследования

Методы научного познания и последовательное их применение явились методологической основой диссертационной работы, которая выполнялась в

дизайне сравнительного исследования с использованием общеклинических, анамнестических, лабораторных, экспериментальных и статистических методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту

• Определение молекулярно-генетического портрета нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы лежит в основе тактики лечения и должно войти в стандарт обследования этой категории пациентов.

• Результаты таргетного высокопроизводительного секвенирования высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы позволили разработать прогностическую панель, включающую исследования мутаций в генах ROS1 и KMT2D, которые связаны с течением заболевания без прогрессии, и мутаций в генах FGFR2 и BCR, которые связаны с отрицательным прогнозом.

• Многоуровневая модель диагностики и определения тактики лечения нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, основанная на изучении значений эпигенетических маркеров (метилирование генов AHRR, APC1A, DAPK, MGMT, MLH1, P16, RASSF1A, RUNX3 и ретротранспозона LINE1) и на результатах исследования панели генов (FGFR2, BCR, KMT2D и ROSI), позволяет планировать объем хирургического лечения, определяя показания к выполнению резекции поджелудочной железы без лимфаденэктомии (спленосохраняющие корпорокаудальные резекции, энуклеации, срединные резекции).

Степень достоверности результатов работы и их апробация

Автором проведен анализ отечественной и зарубежной литературы, касающейся проблем лечения, молекулярно-генетической диагностики нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы. Разработан дизайн исследования. Автором выполнены хирургические вмешательства при нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы. Статистическая обработка данных, интерпретация полученных результатов, оформление диссертации осуществлены автором лично.

Апробация результатов работы проводилась на заседании ученого совета ФБГУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России 1 апреля 2021 года.

Основные положения диссертации и результаты работы доложены на Всероссийской конференции «Мультидисциплинарный подход в терапии и диагностике нейроэндокринных опухолей» (Ростов-на-Дону, 23.05.2015 г.), на конференции РНИОИ и РостГМУ «Современный взгляд на диагностику и лечение нейроэндокринных опухолей» (Ростов-на-Дону, 01.04.2016 г.), на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы лечения опухолей билиопанкреатодуоденальной зоны» (Ростов-на-Дону,

11.05.2018 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Мультидисциплинарный подход к лечению нейроэндокринных опухолей» (Ростов-на-Дону, 21.11.2018 г.), на 16-м Ежегодном съезде Европейской ассоциации по лечению нейроэндокринных опухолей (ENETS) (Барселона, Испания), на Всероссийской научно-практической конференции «Трудные вопросы диагностики и лечения нероэндокринных опухолей» (Краснодар,

29.07.2019 г.), на Конгрессе Азиатско-Тихоокеанской Ассоциации хирургов гепатологов-панкреатологов (А-РИРБЛ 2019) (Сеул, Южная Корея, 05.09.2019 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Мультидисциплинарный подход в лечении пациентов - залог успеха терапии нейроэндокринных опухолей» (Москва, 25.10.2019 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Мультидисциплинарный подход в лечении пациентов - залог успеха терапии нейроэндокринных опухолей» (Москва, 10.12.2020 г.), на XII съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Москва, 14-16 04.2021).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 38 печатных работ, из них 8 в журналах, рекомендованных ВАК Министерства науки и высшего образования Российской Федерации для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора медицинских наук (3 входят в международные научные базы цитирования), получено 3 патента на изобретение Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 273 странице печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 368 источников, в том числе 43 отечественных и 325 зарубежных. Работа иллюстрирована 123 рисунками и 54 таблицами.

Глава 1

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕЙРОЭНДОКРИННЫХ ОПУХОЛЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

(обзор литературы)

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) классифицировала НЭО ПЖ на основании оценки индекса Ki-67 на следующие группы: высокодифференцированные НЭО ПЖ со значениями Ki-67<3% (G1), высокодифференцированные НЭО ПЖ со значениями Ki-67 3-20%, высокодифференцированные НЭО и низкодифференцированные нейроэндокринные карциномы (НЭК) с Ki-67 более 20% (Bosman F. et al., 2010; Reid M. et al., 2014; Lloyd R. et al., 2017). Установлено, что для высоко-дифференцированных НЭО ПЖ характерен более благоприятный прогноз, но до сих пор неизвестно, какие именно молекулярные предпосылки лежат в основе этого. Еще предстоит идентифицировать молекулярные критерии назначения ранней агрессивной терапии пациентам, у которых особенности мутационного статуса во много раз повышают риски раннего метастазирования и рецидивов.

Незначительная часть НЭО ПЖ (10%) является отдельным проявлением наследственных заболеваний, генетические предпосылки которых позволили понять основные механизмы развития данных опухолей и применить эти знания в отношении спорадических НЭО ПЖ. Благодаря методам секвенирования нового поколения стало возможным выделить и изучить основные драйверные мутации, запускающие процессы канцерогенеза. Однако сложность исследований заключается в ограниченном количестве образцов в связи с редкостью заболевания. Углубленное понимание молекулярных характеристик НЭО ПЖ имеет первостепенное значение, прежде всего, для подбора рациональной терапии. Этот раздел работы посвятим некоторым актуальным вопросам классификации, морфологии и иммунногистохимического подхода диагностики НЭО ПЖ, а также обобщению самых последних достижений ученых в области молекулярной онкологии и генетики.

Классификация. До 2010 года НЭО ПЖ, согласно классификации ВОЗ, обозначались как «высокодифференцированные нейроэндокринные опухоли» и «высокодифференцированные нейроэндокринные карциномы», в случае наличия отдаленных метастазов. В настоящее время действует четвертая редакция классификации НЭО, разработанной Всемирной Организацией Здравоохранения в 2017 году (предыдущие были созданы в 2000, 2004 и 2010 гг.).

Новая классификация интересна тем, что разделы, посвященные НЭО ПЖ, были модернизированы. Кроме того, появился новый термин «НЭО G3», обозначающий категорию опухолей с высокодифференцированным строением, но с индексом пролиферации, соответствующим G3, отсутствием выраженной иммуногистохимической экспрессии р53 и RB (Tang L. et al., 2016; Bastürk O. et al., 2017; Scarpa A. et al., 2017). Нейроэндокринные карциномы (НЭК) по умолчанию имеют высокий индекс пролиферации, G3, и низкодифференцированное строение. Выраженные фенотипические различия между НЭО и НЭК являются следствием различий на генетическом уровне. Считается допустимой с течением времени эволюция высокодифференцированной НЭО с G1-G2 до G3 и реже до НЭК (Tang L. et al., 2020). В новой редакции классификации вводится понятие «смешанные нейроэндокринные неоплазии», чтобы подчеркнуть возможность нахождения в составе НЭО различных типов карцином с различным уровнем дифференцировки и злокачественности. Категория пренеопластических поражений была исключена из новой классификации 2017 года в связи с нечеткостью критериев, которые работали только в случае наследственных синдромов МЭН-1, болезни Гиппеля-Ландау, клеточной дисплазии и неоплазии.

Морфологические и иммуногистохимические характеристики. Большинство НЭО ПЖ отграничены от подлежащих тканей - инкапсулированы. Небольшие по размерам опухоли по консистенции обычно мягкие или плотноэластические. Кистозное строение не характерно, возможно образование кист вторично вследствие дегенеративных изменений в тканях. Крупные по размеру НЭО ПЖ отличаются тенденцией к мультифокальному росту и высоким

потенциалом инвазии в окружающие ткани: брыжейку, желудок, двенадцатиперстную кишку, ободочную кишку, селезенку и селезеночную вену. Обычно НЭО ПЖ не прорастают в главный проток поджелудочной железы. Но если это происходит, такую опухоль легко спутать с протоковой аденокарциномой (McCall C. et al., 2012).

Микроскопически НЭО ПЖ характеризуются несколькими вариантами гистологического строения. Так, различают трабекулярный тип строения с двумя подтипами: а) выраженной стромой и минимальным клеточным компонентом; б) минимальным количеством стромы и гиперклеточностью. Кроме того, выделяют ангиоматозный, солидный, «островковоподобный», ациноподобный варианты (Кузавлева Е.И. и соавт., 2015).

Группы неопластических клеток разделены богатой сетью хрупких сосудов. У большинства НЭО ПЖ выражена гиперклеточная структура и имеется сравнительно мало стромы. Но в некоторых случаях сосудистая стенка способна продуцировать коллаген с образованием плотной гиализированной стромы (Tang L. et al., 2016).

Опухолевые клетки обычно полигональной формы, содержат обильную, гранулированную эозинофильную или амфифильную цитоплазму. Ядра клеток расположены центрально или периферически, одинакового размера и формы. НЭО ПЖ с ядерной атипией носят название плеоморфных. Их можно ошибочно принять за недифференцированную протоковую аденокарциному. Но в отличие от последней, большинство плеоморфных НЭО ПЖ не демонстрируют высокие уровни пролиферативной активности (Zee S. et al., 2005).

В диагностике НЭО ПЖ широко применяется иммуногистохимический метод с использованием стандартной панели маркеров, подтверждающих нейроэндокринную природу опухоли (Bellizzi A.M. et al., 2020). Считается, что универсальными маркерами НЭО с высокой специфичностью и чувствительностью являются хромогранин А (ХгА) и синаптофизин. Чувствительность синаптофизина достигает 100% в высокодифференцированных НЭО ПЖ. Хромогранин А при этом отличается меньшей чувствительностью по

сравнению с синаптофизином, но более специфичен: его экспрессия выражена в 80-90% НЭО ПЖ (Bellizzi A.M. et al., 2020; Tatsuo T., 2020).

В случае НЭО ПЖ G3 экспрессия синаптофизина и ХгА выражена меньше -60,0 и 50,0%, соответственно. При этом в НЭК экспрессия ХгА может вовсе отсутствовать и необязательна в низкодифференцированных НЭО ПЖ. Синаптофизин, напротив, экспрессируется и в НЭО G1-G3, и в НЭК ПЖ, что еще раз говорит в пользу его высокой диагностической ценности. CD56 - молекула адгезии нейронов - также экспрессируется на клетках НЭО ПЖ, но вследствие низкой специфичности применение маркера ограничено (Трифанов В.С. и соавт., 2019).

Использование цитокератинов в качестве иммуногистохимических маркеров оправдано при диагностике метастазов неизвестного происхождения, для того чтобы подтвердить эпителиальную природу первичной опухоли. Для этих целей обычно используются СК7 и СК20, но они практически не экспрессируются нейроэндокринными клетками поджелудочной железы, которым более свойственна экспрессия СК8 и СК18 (Bellizzi A.M. et al., 2020). Результаты нашего исследования этому не противоречат: экспрессия СК20 отсутствовала во всех 20 проанализированных образцах НЭО ПЖ, СК7 был зарегистрирован только в 5% (1/20), СК18 - в 80%. При этом мы рекомендуем для диагностики НЭО ПЖ использовать маркеры АЕ1/АЕ3 и NSE, экспрессия которых была выявлена в 75,0 и 95,0%, соответственно (Трифанов В.С. и соавт., 2019).

Роль эпигенетических изменений генома в канцерогенезе нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы. Эпигенетическая регуляция как основной механизм изменения паттерна экспрессии генов без нарушения их нуклеотидной последовательности известна давно. Ремоделирование хроматина включает в себя два основных процесса: посттрансляционные модификации гистонов и метилирование ДНК. Основное значение ремоделирования хроматина - изменение транскрипции гена за счет ослабления связи между ДНК и гистонами и препятствование связи участка ДНК с транскрипционными факторами.

Соматическая мутация гена SETD2 наблюдается примерно у 20% спорадических НЭО ПЖ. Ранее она же была описана для светлоклеточной почечной карциномы (Thakker R. et al., 2014; Scarpa A. et al., 2017). Для НЭО ПЖ также характерно гиперметилирование промоторных регионов генов-супрессоров RASSF1 и CDKN2A (House M. et al., 2003; Karpathakis A. et al., 2013; Meeker A. et al., 2014). Кроме того, инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF2) обладает уникальной сигнатурой гиперметилирования в инсулиномах. Это значит, что, возможно, есть связь между подтипом НЭО ПЖ и особенностями эпигенетических изменений (Luco R. et al., 2011).

В литературе есть сообщения о высокой частоте соматических мутаций с потерей гетерозиготности и гиперметилирования промоторного участка гена PHLDA3, являющегося р53-регулируемым репрессором Akt (Ohki R. et al., 2014).

Соматическая мутация Trp372Arg гена YY1, регулирующего работу митохондриального комплекса mTORCl, была зарегистрирована в 15-30% спорадических инсулином. Данная мутация повышает экспрессию гена YY1 с образованием большого количества транскриптационных факторов, что ведет к повышению экспрессии таргетных генов IDH3A и UCP2. В инсулиномах в 8% случаев также встречаются мутации генов H3F3A, KDM6A и ATR (Cao Y. et al., 2009).

C.M. Heaphy et al. (2011), работающие под руководством профессора Алана Микера (Meeker A. et al., 2014) из американского университета Джона Хопкинса (Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, USA), в 2011 году в журнале «Sciеnce» опубликовали статью о своем революционном открытии нового альтернативного способа удлинения теломер, связанного с наличием мутаций в генах ATRX и DAXX. Предыдущие исследования сообщали о нахождении вышеупомянутых мутаций примерно у 43% исследованных НЭО ПЖ.

Кроме того, было известно, что кодируемые этими генами белки (pATRX и pDAXX, соответственно) взаимодействуют друг с другом и выполняют различные функции в клетке, в частности участвуют в процессе хроматинового ремоделирования. При этом pDAXX обладает исключительным свойством с

высокой точностью распознавать гистоновый белок H3.3, а pATRX помогает внедрить его в теломерный хроматин за счет своей способности встраиваться в повторяющиеся нуклеотидные тандемы. Кроме того, pATRX принимает непoсредствeнное учaстиe в репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Таким образом, pATRX и pDAXX в норме стабилизируют теломерный хроматин. Принимая во внимание абсолютное участие этих белков в ремоделировании теломерного хроматина, C. M. Heaphy et al. (2011) решили оценить теломерный статус в НЭО ПЖ с мутацией генов ATRX и DAXX с помощью секвенирования по классическому методу Сэнгера и определили высокую корреляцию между наличием вышеупомянутых мутаций и выраженностью механизма альтернативного способа удлинения теломер. Кроме того, мутация гена ATRX позже была детектирована в глиобластомах детей (14,3%), в глиобластомах взрослых (7,1%), олигодендроглиомах (7,7%) и медуллобластомах (1,5%). Таким образом, зависимость проявления альтернативного удлинения теломер от наличия мутаций ATRX и DAXX выявлялась в опухолях из совершенно разных тканей, отличных по своим характеристикам. Это дало повод C.M. Heaphy et al. (2011) сделать вывод о том, что снижение экспрессии белков pATRX и pDAXX и, как следствие, отсутствие встраивания гистона Н3.3 в теломерный хроматин неизбежно приводит к дестабилизации хромосом вследствие изменения эпигенетического статуса, образования большого количества РНК, содержащей теломерные повторы, telomeric repeat-containing RNA (TERRA), повышению гомологичной рекомбинации и удлинению теломер, что индуцирует переход соматической клетки в плюрипотентное состояние по аналогии с эмбриональными клетками (Gonzalo S. et. al., 2006). Кроме индукции aльтернaтивного удлинения теломер, повышается экспрeссия генов, располaгающихся вблизи тaндeмных повторов (Liu Р. et al., 2009).

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Трифанов Владимир Сергеевич, 2021 год

-в - -

г®»

к

Я

т

/л

* *«| ¿А

' Г'

Г*

' %

•»V/ »

Т"

V »1

уЛ I

V <

" I* т

'Ф*

.V

г

Л» V» .

13й л Ъ " ж У

!? í Л

■ ■ ггЧ ■

г Л » А

§ Л тьгЛ«/^

£

I >1.

V /г к

£

1 • <

"К >

А, 3 ц.

.-Л; -

•г*

/« А

а

■

^ л*'

\ -

• »

» т

ш*

* . »

«

•" %

•Л '

«' 4 •

I ц V <

к _ V. 1»Л *

^- ^ ' л* 4

/V / 1

Рисунок 7.50. Выраженная лимфоцитарная инфильтрация межальвеолярных перегородок с распространением на их просвет слева. Многие альвеолы эмфизематозно расширены.

Окраска гемотоксилином и эозином. х400

Рисунок 7.51 Пневмонит. Инфильтрация межальвеолярных перегородок и просвета альвеол сегментоядерными лейкоцитами. Окраска гемотоксилином и эозином. х200

Таким образом, проведенное экспериментальное исследование доказало, что удаление селезенки является неблагоприятным фактором для последущей терапии Эверолимусом. При предполагаемом благоприятном течении НЭО ПЖ необходимо при выборе объема оперативного лечения избегать неоправданных спленэктомий.

198

Глава 8

МНОГОУРОВНЕВАЯ СИСТЕМА ДИАГНОСТИКИ И НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ НЕЙРОЭНДОКРИННЫХ ОПУХОЛЕЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Проведенное нами исследование нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы поставило ряд вопросов, связанных как с определением тактики при образованиях менее и более 2 см, так и с объемом оперативных вмешательств, которые позволят получить максимальную безрецидивную выживаемость и высокое качество жизни. Молекулярно-генетическое исследование портрета нейроэндокринных опухолей выявило генетические предикторы положительного и отрицательного прогноза. При этом анализ метилирования генов опухоли позволил определить показатели прогноза метастазирования.

Федеральные онкологические центры не проводили терапию пациентов с НЭО ПЖ препаратом Эверолимус, а только рекомендовали его в выписных документах для длительного приема. Затем больные обращались в региональные онкодиспансеры, где получали препарат в таблетированной форме амбулаторно. В ходе лечения Эверолимусом пациенты повторно обращались в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России для прохождения планового обследования.

Развитие пневмонитов на фоне лечения Эверолимусом, по данным литературы, встречается в 3-30% случаев (Zhou Q. et al., 2012). С этим осложнением сталкиваются онкологи на местах, присылая пациентов для внеплановых консультаций с целью определения дальнейшей тактики. На представленных компьютерных томограммах одного из таких больных имеются признаки двухстороннего пневмонита на фоне лечения Эверолимусом (рисунок 8.1). В ходе ведения регистра больных с НЭО ПЖ мы столкнулись с таким осложнением терапии в 12 случаях (события возникли до 2015 года). Анализ частоты развития указанного осложнения выявил тот факт, что в 10 случаях оно сочеталось с ранее выполненой корпорокаудальной резекцией и спленэктомией. Поскольку НЭО ПЖ - достаточно редкая патология, мы не

смогли на своей выборке с помощью статистических методов доказать достоверную связь пневмонитов и спленэктомий. В результате мы предприняли экспериментальное исследование (см. главу 7). Действительно, у мышей с удаленной селезенкой пневмониты развивались чаще. Синергичный характер патогенеза данного осложнения стал отправной точкой для внедрения спленосохраняющих операций у больных с НЭО ПЖ.

Рисунок 8.1. Компьютерные томограммы больного с пневмонитом на фоне лечения Эверолимусом (в анамнезе корпорокаудальная резекция поджелудочной

железы, спленэктомия)

С 2016 года мы подошли к необходимости формирования новых диагностических алгоритмов для определения тактики диспансерного наблюдения и лечения пациентов (рисунки 8.2, 8.3).

При подозрении на опухоль поджелудочной железы пациенты обращались к нам в центр часто без какой-либо клиники (более 60% случаев), имея на руках заключение УЗИ, КТ или МРТ с описанием образования. На догоспитальном этапе диагноз НЭО ПЖ чаще всего не ставился. В случаях, когда опухоль была небольшая (до 2 см), отсутствовала информация о возможных метастазах, и не было механической желтухи, мы предполагали нейроэндокринный характер опухоли, хотя достаточно часто так выявлялась доброкачественная патология или протоковый рак. Таким образом, НЭО ПЖ не имели косвенных достоверных признаков вплоть до получения гистологического заключения. Поскольку для постановки диагноза нейроэндокринной опухоли требовалось дополнительное обследование, имеющее некоторые особенности в отличие от диагностики протоковой аденокарциномы, на поликлиническом этапе нами был разработан и применялся способ дифференциальной диагностики нейроэндокринных опухолей и доброкачественных образований поджелудочной железы с использованием маркеров плазмы крови. Способ осуществлялся следующим образом.

Утром натощак из локтевой вены больного забирают 5 мл крови, центрифугируют ее при 3000 об./мин 15 минут, отбирают сыворотку крови и методом ИФА определяют в ней уровень белка TGF-P и его рецептора TGFR1, рассчитывают отношение TGF-P к TGFR1. При уровне его, равном 1,32±0,2, прогнозируют, что у больного нейроэндокринная опухоль (Патент РФ №2722276).

Выполнение данного исследования стало базовым в формировании наших алгоритмов, результаты его применения не зависели от размеров опухоли. При положительном суждении о возможной нейроэндокринной природе образования мы предупреждали специалистов, производящих тонкоигольную биопсию под контролем УЗИ, о необходимости получения дополнительного материала из опухоли для проведения молекулярно-генетического исследования (в случае размера опухоли от 2 до 3 см).

Рисунок S.2. Опухоли, размером до 2 см

В Исследование плазмы крови с целью дифференциальной Щ диагностики (показатели ТОБ-Р и ТОБЯ!)

Подозрение на нейроэндокринную опухоль

Пункция образования под контролем УЗИ

Биологический материал (два столбика ткани после трепанбиопсии)

Лазерная микродиссекция

Определение мутаций в генах ROS1, KMT2D, FGFR2, BCR

Определение тактики лечения

4 1

Опухоли с низким злокачественным потенциалом Опухоли с высоким злокачественным потенциалом

1 4

Ангиография сосудов ПЖ, детальное исследование коморбидной патологии

4

Наблюдение

Спленосохраняющая корпорокаудальная резекция ПЖ, и поперечная резекция

Корпорокаудальные резекции ПЖ со спленэктомией, панкреато-дуоденальные резекции

Ежегодные МРТ, ПЭТ КТ исследования, определение ИГХ-маркеров

Рисунок 8.3. Опухоли, размером более 2 см, но менее 3 см

Ткань опухоли поступала вначале на гистологическое и иммуногистохимическое исследование. При доказательстве наличия НЭО ПЖ в случае размера опухоли менее 2 см для выполнения молекулярно-генетического исследования (метилирования) использовалась лазерная микродиссекция, позволяющая обнаружить подозрительные участки на гистологическом стекле и выделить данный биологический материал для последущего получения ДНК.

В случае размера опухоли более 2, но менее 3 см биологического материала после лазерной микродиссекции достаточно для ПЦР панели генов ROS1, KMT2D, FGFR2, BCR, которые позволяли судить о злокачественности опухоли. Здесь мы использовали разработанный нами способ прогнозирования клинического течения высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы (патент РФ №2747679).

В 2017 г. ВОЗ опубликовала классификацию нейроэдокринных новообразований поджелудочной железы, которая внесла существенные коррективы в диагностические критерии и терапевтические стратегии данного заболевания. В частности, был выделен новый подтип опухолей НЭО G3 и внесены изменения в критерии отбора НЭО Gl (Chai S.M., Brown I.S., Kumarasinghe M.P., 2018). Тем не менее даже НЭО, классифицируемые как Gl или G2, иногда склонны к раннему метастазированию, что не укладывается в рамки действующей классификации. Генетические особенности и молекулярные механизмы онкогенеза каждого выделенного подтипа нейроэндокринных опухолей остаются объектом пристального внимания исследователей, широко привлекающих для этих целей NGS-технологию. В результате были открыты новые генетические сигнатуры, обнаружены хромосомные перестройки и нарушения в эпигенетической регуляции экспрессии генов (Chou W.C., Lin P.H., Yeh Y.C. et al., 2016; Scarpa A., Chang D.K., Nones K. et al., 2017; Ji S., Yang W., Liu J. et al., 2018; Raj N., Shah R., Stadler Z. et al., 2018; Tirosh A., Mukherjee S., Lack J. et al., 2019). Однако в связи с выраженной гетерогенностью высокодифференцированных НЭО ПЖ и популяционными особенностями остается актуальным поиск ассоциаций биомаркеров с клинико-

морфологическими данными и отбор биомаркеров для прогнозирования и ранней диагностики.

Существует широкий диапазон прогностических подходов (клинико-инструментальные, иммунологические, генетические, цитологические и др.) определения формы течения онкопатологии, эффективность которых весьма различна для разных типов нозоологий. Так, известен способ прогнозирования эффективности лечения и течения опухолевого процесса у больных раком носоглотки (см. патент RU №2526830). Для этого до начала химиолучевого лечения и перед каждым последующим курсом у больных раком носоглотки Ш-1У стадии определяют в периферической крови значения коэффициентов отношения среднего объема нейтрофилов и среднего объема лимфоцитов к их абсолютному количеству: МУ№/#№ и МУЪу/^у. При значениях коэффициентов в динамике лечения свыше 45 констатируют низкую эффективность лечения и отрицательный прогноз течения заболевания при отсутствии клинических признаков манифестации. При значениях указанных коэффициентов ниже 45 констатируют положительный эффект лечения и благоприятный прогноз течения заболевания. Изобретение позволяет определить генерализацию опухолевого процесса при отсутствии клинических признаков манифестации заболевания и скорректировать лечение больных на основании полученных коэффициентов. Вышеуказанный способ не лишен существенного недостатка: он не позволяет сразу определить прогноз течения заболевания, кроме того определение среднего объема нейтрофила является неспецифичным изменением при онкологической патологии и во многом зависит от квалификации лаборантов, получающих исходные показатели.

К другим подходам можно отнести способ определения прогрессии рака органов брюшной полости (см. патент RU №2503409). Для этого осуществляют динамическое обследование больного после хирургического лечения. На фоне нутритивно-метаболической терапии 1 раз не менее чем в 28-30 дней определяют изменение состава тела больного с помощью биоимпедансного анализа. При этом оценивают массу тела, индекс массы тела, жировую массу, а также массу

внеклеточной жидкости. При уменьшении массы тела, индекса массы тела и/или уменьшении жировой массы с одновременным увеличением массы внеклеточной жидкости по сравнению с предыдущими результатами биоимпедансного анализа у больного определяют прогрессию рака органов брюшной полости. Данный способ имеет существенные недостатки: у пациента крайне затруднительно точно рассчитать массу внеклеточной жидкости, кроме того, способ предполагает постоянный контроль за пациентом каждые 30 дней и только по истечение первых 30 дней после операции позволяет определить прогноз течения заболевания.

Из литературных источников известна работа М.Е. Борисковой (2019), в которой впервые показана возможность формирования групп риска с использованием онкомаркеров, определяемых на дооперационном этапе. В работе была создана и апробирована новая молекулярно-генетическая панель для диагностики и прогнозирования течения высокодифференцированного рака щитовидной железы. Выявление мутации гена ВЯЛБ и снижения уровня экспрессии НИС ниже 1% являются независимыми факторами риска агрессивного течения высокодифференцированного рака щитовидной железы, что обусловливает необходимость определения наличия мутации гена ВЯЛБ и уровня экспрессии НИС с целью формирования на дооперационном этапе группы высокого риска рецидива/персистенции заболевания.

Работа, на наш взгляд, имеет следующие недостатки:

1) определение БЯЛЕ мутации не позволяет судить о прогнозе при нейроэндокринных опухолях;

2) использование в панели только одного маркера снижает точность предлагаемого способа определения агрессивности течения опухолевой патологии.

Разработанный нами «Способ прогнозирования клинического течения высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы» использовал генотипирование SNP для прогнозирования риска прогрессирования опухолевого процесса у больных с НЭО ПЖ. Заявленный способ предполагал использование нескольких генетических маркеров, что

повышало точность прогноза и не требовало значительных затрат времени. Сущность заявленного способа заключалась в генотипировании c.2411C>A rs200615700 в гене ROS1, c.13588G>A rs768143170 в гене KMT2D, c.289G>A rs372430349 в гене FGFR2 и c.967G>A в гене BCR. Наличие мутаций в генах ROS1 и KMT2D определяло вероятность течения НЭО ПЖ без прогрессии, мутации в генах FGFR2 и BCR были сцеплены с риском метастазирования и агрессивной формы опухолевого роста.

Оценка рисков осуществлялась по формулам:

р1 = X 100%,

р2 = х 100%,

где Pi - вероятность безрецидивной формы НЭО ПЖ, Р2 - вероятность прогрессирования опухоли, К1 - коэффициент для мутации c.2411C>A rs200615700 в гене ROS1, К2 - коэффициент для мутации c.13588G>A rs768143170 в гене KMT2D, К3 - коэффициент для мутации c.289G>A rs372430349 в гене FGFR2 и К4 - коэффициент для мутации c.967G>A в гене BCR. Значение коэффициентов зависело от генотипа: 0 в случае гомозиготы дикого типа, 0,5 - гетерозиготы и 1 - мутантной гомозиготы.

Способ осуществлялся в несколько этапов:

• Выделение тотальной ДНК из 200 мкл венозной крови или буккального эпителия любым подходящим методом, например, с помощью комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «АмплиПрайм ДНК-сорб В» («АмплиСенс», Россия) согласно инструкции производителя;

• Определение полиморфизмов методом HRM-PCR (High Resolution Melt Polymerase chain reaction) в присутствии красителя EvaGreen® Dye и специфичных праймеров на матрице очищенной ДНК;

• Анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора с определением генотипа относительно референсных образцов.

Идентификацию SNP проводили методом HRM-PCR, который представлял собой ПЦР в реальном времени с последующим плавлением наработанных ампликонов. Для приготовления рабочей смеси использовали компоненты ПЦР и неспецифический ДНК-связывающий краситель типа EvaGreen® Dye, 20-кратный водный раствор (Biotium, США). Состав и соотношение компонентов рабочего раствора на один исследуемый образец представлены в таблице 8.1.

Таблица 8.1 - Состав и соотношение компонентов рабочего раствора для проведения НИМ-PCR

Компоненты ПЦР-смеси Объем на 1 пробу, мкл

10-кратный ПЦР буфер 2,20

25 мМ-ый MgCl2 1,32

25 мМ-ый dNTP 0,18

ДМСО 100% 0,68

Eva Green (20х) 1,10

10 цМ-ая смесь праймеров (F + R) 1,10

ПЦР вода 4,20

Taq ДНК полимераза 0,22

Метод НИМ предполагает наличие референсных образцов - нормальной гомозиготы, вариантной гетерозиготы и гомозиготы. Характеристики праймеров для НИМ и секвенирования указаны в таблице 8.2. Таблица 8.2 - Характеристика праймеров

Ген, полиморфизм HRM (5-3') Секвенирование по Сэнгеру (5-3')

ROS1 c.2411C>A Прямой: TGGTGGATTCAGTTGGTGGAT Обратный: CAAGGCTGTGTCTGTAGTACA Прямой: TAGTTCCCTTCTCTTTGGAGGC Обратный: CACCAACTGAATCCACCACC

KMT2D c.13588G>A Прямой: CCTTCAATGGGCTTATTTGGC Обратный: TTCTTTCGGGAGCTCACCAA Прямой: AGCAGCCTTCAATGGGCTTAT Обратный: GTTTGCATCGCTGTCTTGCAC

FGFR2 c.289G>A Прямой: CGCCGTGATCAGTTGGACTA Обратный: GCATAGAGGCCGGAGTCTC Прямой: TCCTTCCCЛTCTGTCTCCGT Обратный: TCTCACTACCTTTTCACTTGGC

BCR c.967G>A Прямой: GTTTTGAGGATTGCGGAGGC Обратный: GAGAAGTCCTCCTCGCTGGA Прямой: CGGAGTTTTGAGGATTGCGG Обратный: CGAAGGACTGTTGCGAGTTC

В результате получаемый молекулярно-генетический портрет опухоли позволял судить о злокачественном потенциале. Именно в этой точке алгоритма мы определялись с хирургической тактикой. При высоком злокачественном потенциале вне зависимости от размеров опухоли, наличия метастазов выполнялись корпорокаудальные резекции со спленэктомией и панкреатодуоденальные резекции. Если определялся низкий злокачественный потенциал, мы предполагали два сценария. У больных с декомпенсированной коморбидной патологией, а также с особенностями анатомии сосудов поджелудочной железы (определялись при ангиографии, рисунок 8.4), мы рекомендовали динамическое наблюдение и терапию Эверолимусом, предполагая, что сохранение селезенки позволит избежать осложнений данного лечения.

Рисунок 8.4. Ангиография чревного ствола с целью определения анатомических особенностей сосудов поджелудочной железы

Если противопоказаний к спленосохраняющим резекциям ПЖ не было, рекомендовали хирургическую тактику. После операции назначали Эверолимус, будучи уверенными, что пневмонита удастся избежать. В ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России резекции поджелудочной железы без лимфаденэктомии выполнены 16 пациентам (спленосохраняющие корпрокаудальные резекции - 8, энуклеации - 4, срединные резекции - 4).

Клинический пример 1. Срединная резекция поджелудочной железы.

Больной М. 51 года, поступил в отделение 20.03.2017 с диагнозом: нейроэндокринная опухоль тела поджелудочной железы 1В, Т2^М0, кл.гр.2.

По результату гистологического исследования биопсийного материала: нейроэндокринная опухоль поджелудочной железы G1. При МРТ размер опухоли составил 24x22x20 мм.

При молекулярно-генетическом исследовании выявлен полиморфизм генов KMT2D (гетерозигота), ROS1 (вариантная гомозигота). Мутации в генах FGFR2 и BCR не обнаружены.

р ! = ^y^- х 1 о о % = 7 5 % ,

р 2 = — х 1 о о % = о %.

г 2

Вероятность безрецидивного клинического течения оценена в 75%, риск опухолевой прогрессии - 0%. Проведено комплексное обследование, сопутствующей коморбидной патологии не выявлено. Принято решение выполнить срединную резекцию поджелудочной железы.

На русунках 8.5, 8.6 представлены этапы выполнения операции. В нашем центре на реконструктивном этапе мы выполняли формирование панкреатикоэнтероанастомоза на выключенной по Ру петле тонкой кишки. В протоке оставляли «потеряный» дренаж.

Рисунок 8.5. Срединная резекция поджелудочной железы: а - состояние после пересечения

железы, удаления части железы с опухолью, культи железы взяты на держалки; б - проксимальная культя железы (головка ПЖ) ушита отдельными швами, проток перевязан, проток ПЖ в дистальной культе (тело, хвост ПЖ) дренирован силиконовой трубкой

Рисунок 8.6. Этапы формирования панкриато-кишечного анастомоза на выключенной по Ру петле: а - сформирована задняя полуокружность анастомоза между протоком и отверстием в кишке, силиконовый «потеряный» дренаж погружают в просвет кишки; б - окончательный вид

сформированного анастомоза

Удаленный препарат (часть поджелудочной железы с опухолью) представлен на рисунке 8.7.

Рисунок 8.7. НЭО ПЖ на разрезе. Диаметр опухоли 24 х 22 х 20 мм

Последнее обследование проведено в апреле 2020 года. Данных за прогрессирование онкологического процесса и развитие метастазов не выявлено.

Клинический пример 2. Спленосохранная резекция поджелудочной железы

Больной К. 48 лет, поступил в отделение 10.10.2018 с диагнозом: нейроэндокринная опухоль тела поджелудочной железы St. 1А, кл.гр.2.

По результату гистологического исследования биопсийного материала: морфологическая картина и иммунофенотип соответствуют высокодифференцированной нейроэндокринной опухоли, G1. Размер опухоли составил 15^16x17 мм. В связи с небольшим количеством биологического материала, полученного при биопсии, с целью определения тактики лечения нами было выполнено исследование метилирования генов AHRR, APC1A, DAPK, MGMT, ^Ш, P16, RASSF1A, RUNX3 и ретротранспозона LINE1: получено значение MetLINE1=74%, MetAPC1=80/o, MetMGMT=9,50/o, MetRAssF1A=10% и MetRuNxз=9%, что прогнозировало низкий риск метастазирования после проведения спленсохранной корпокоудальной резекции НЭО ПЖ. При обследовании у пациента не было выявлено сопутствующей декомпенсированной коморбидной патологии, анатомическое строение сосудов ПЖ - без аномалий. Было принято решение выпонить операцию в указанном объеме.

Этапы операции представлены на рисунках 8.8-8.11.

Рисунок 8.8. НЭО ПЖ в области тела, левее портальной вены

Рисунок 8.9. Интраоперационное планирование. Определение расположения трубчатых структур поджелудочной железы (артерии, вены, протока) с помощью УЗИ

Рисунок 8.10. Зона пересечения железы над портальной веной. Края железы прошиты одиночными лигатурами проксимальнее и дистальнее предполагаемого рассечения

Рисунок 8.11. Поджелудочная железа пересечена, культя ушита одиночными швами. Этапы мобилизации хвоста и тела поджелудочной железы в сторону ворот селезенки

На рисунке 8.12 представлен макропрепарат с опухолью.

Рисунок 8.12. Макропрепарат хвоста и тела поджелудочной железы вместе с опухолью

После удаления макропрепарата в ложе тела и хвоста ПЖ определялись неповрежденные селезеночные артерия и вена (рисунок 8.13).

селезеночная

артерия

желудок

селезеночная

культя

поджелудочной железы

вена

портальная вена

Рисунок 8.13. Ложе удаленного препарата. Визуализируются ушитая культя поджелудочной железы (головка), селезеночная артерия, селезеночная вена, портальная вена

На контрольном приеме через 2 года после операции метастазов и рецидивов не обнаружено.

После выполнения резекции ПЖ без лимфадиссекции у пациентов не были отмечены хирургические осложнения.

Пациенты с секретирующими опухолями получали в раннем послеоперационном периоде «Октреотид» короткого действия подкожно в дозе 100 мкг 3 раза в сутки в течение 2 недель перед назначением пролонгированных форм, затем применялся «Октреотид-депо» пролонгированного действия в дозе 30 мг внутримышечно. При НЭО 01-02 больные длительно принимали Эверолимус в дозе 10 мг/сут ежедневно. Больным с НЭО ПЖ 03 (10 пациентов) проводили химиотерапию по схеме ХЕLOХ (Оксалиплатин 130 мг/м в/в в

л

1-й день + капецитабин 2000 мг/м внутрь в 1-14-й дни). Диспансеризация больных осуществлялась согласно клиническим рекомедациям «Нейроэнодокринные опухоли» 2019 года с соблюдением следующей частоты обследования пациентов: в 1-й и 2-й годы - 1 раз в 3 месяца; в 3-5-й годы - 1 раз в 6 месяцев, после 5 лет - 1 раз в год (Практические рекомендации по

лекарственному лечению нейроэндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы и других локализаций, 2019).

В последнее время большое внимание уделяется малоинвазивным методикам в лечении метастазов в печень. При НЭО поджелудочной железы вторичное поражение печени мы диагностировали у 10 больных. В 2-х случаях метастазы были резецированы в ходе открытых хирургических вмешательств. Двум пациентам были выполнены гемигепатэктомии слева. В трех случаях, вследствие распространенности поражения, пациенты получали только химиотерапию. Трем пациентам с опухолью G3 химиотерапию дополняли выполнением методики трансартериальной химиоэмболизации (ТАХЭ) метастатических узлов печени. В асептических условиях рентгеноперационной в положении больного на спине, после соответствующей обработки операционного поля, выполняется пункция правой плечевой артерии в типичном месте (игла ангиографическая 18 G). Артерия катетеризируется по Сельдингеру (интродьюсер 5F 11 см). Катетер СВ1 по проводнику .035" 150 см последовательно проводится в правую подмышечную, подключичную артерии, в брахиоцефальный ствол, нисходящую аорту. Удаляют проводник, выполняют аортографию. Оценивают состояние чревного ствола и отходящих от него селезеночной артерии, левой желудочной артерии, общей печеночной артерии. Катетером Р1 5F на гидрофильном проводнике .035" 180 см селективно последовательно катетеризируют правую, затем левую печеночные артерии. Микрокатетером 2,6F 150 см на микропроводнике .014" 300 см суперселективно последовательно катетеризируют сегментарные артерии, кровоснабжающие опухолевый очаг. Приготовляют эмульсию из оксалиплатина 120 мг/м2, выполняют паренхиматозную химиоэмболизацию печени. Артериальную эмболизацию выполняют измельченной гемостатической губкой (gelfoam slurry) Spongostan. При контрольной ангиографии определяют выраженное замедление контрастирования по сегментарным ветвям правой печеночной артерии, кровоснабжающим опухолевый очаг. Выявляют наличие признаков нецелевой эмболизации. Катетер выводят в аорту. Инструментарий последовательно

удаляют. Выбор именно печеночной артерии для селективной химиоэмболизации обусловлен тем, что до 95% опухолевой ткани печени кровоснабжается ею.

Согласно клиническим рекомендациям, в пред- и постпроцедурном периоде ТАХЭ пациенты получали инфузионную терапию, октреотид (при выраженной гормональной активности), нестероидные противовоспалительные препараты, глюкокортикоиды (дексаметазон 4 мг, 2-3 раза в день, per os, для купирования постэмболического синдрома и нивелирования таких симптомов, как тошнота, рвота, жар, боли в животе, снижение аппетита), антибактериальные препараты (накануне ТАХЭ для предотвращения таких осложнений, как абсцесс печени, холангит, сепсис), противогрибковые препараты.

Во всех случаях ответ на терапию нами был оценен при помощи данных КТ, полученных спустя 3-6 месяцев после проведения ТАХЭ. При этом использовались критерии RECIST 1.1 от 2009 года.

У одного пациента спустя 3 месяца после ТАХЭ отмечалась относительная стабилизация процесса, спустя 6 месяцев наблюдается прогрессирование заболевания. У двоих больных наблюдался стойкий частичный ответ опухоли на терапию спустя 3 и 6 месяцев после ТАХЭ.

Таким образом, применение молекулярно-генетических методов, позволивших уточнить прогноз течения НЭО ПЖ, стало уникальным инструментом индивидуализации методик лечения пациентов с данной патологией, являя собой актуальный пример трансляционной медицины.

217

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы (НЭО ПЖ) являются достаточно редкой патологией, поэтому диссертационная работа была выполнена как многоцентровое исследование в сотрудничестве с несколькими профильными клиниками (ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, «Московского областного научно-исследовательского клинического института имени М.Ф. Владимирского», ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Научно-исследовательского института - Краевая клиническая больница № 1 имени профессора С.В. Очаповского), что позволило собрать достаточное количество случаев для анализа.

Целью исследования являлось изучение молекулярно-биологических маркеров нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы и определение влияния молекулярно-генетического портрета на прогноз, течение и лечение заболевания.

Для реализации поставленной цели была создана коллекция образцов тканей нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы больных ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, «Московского областного научно-исследовательского клинического института имени М.Ф. Владимирского» (ГБУЗ МО МОНИКИ имени М.Ф. Владимирского), Научно-исследовательского института - Краевая клиническая больница №1 имени профессора С.В. Очаповского с целью проведения таргетного высокопроизводительного секвенирования; его результаты проанализированы, выявлены предикторы положительного и отрицательного прогноза; проведен клинико-иммуногистохимический анализ нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы; выполнен анализ значения показателей микросателлитной нестабильности, паттерна CрG-метилирования генов при выборе тактики хирургического лечения; проанализирована взаимосвязь мутаций генов и изменений сигнальных молекулярно-генетических путей в ткани нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы общей и безрецидивной выживаемости больных; исследовано влияние спленэктомии в эксперименте на

частоту развития пневмонических осложнений у животных, получавших терапию препаратом Эверолимус; разработана многоуровневая модель ранней диагностики и определения тактики лечения нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы.

В диссертационном исследовании прослежена выживаемость 111 больных с нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы в течение 10 лет после оперативного лечения. Соотношение женщин и мужчин составило 1,6:1. Число пациентов женского пола статистически значимо (р=0,0013) превышало число мужчин.

Для секвенирования 24 образцов нейроэндокринных опухолей (НЭО) поджелудочной железы было выполнено два запуска NextSeq 550. Средний размер выходных данных на эксперимент составил 137,2 Gbp. Среднее значение Q30 превышало 91%, а медиана процента ридов, картированных на целевую область, равнялась 99% (98,3-99,5%). Средняя величина покрытия составила 3907,1 ридов. В ходе биоинформационного анализа данных NGS идентифицировано 119 вариантов в 54 генах у 24 пациентов.

Шестнадцать генетических вариантов (как соматических, так и герминальных) были охарактеризованы как новые, так как не были аннотированы в популяционных базах данных, базах соматических или герминальных вариантов. Большинство программ-предикторов in silico указывали на их повреждающий эффект и на драйверные свойства. Гены, подверженные соответствующим мутационным изменениям, регулируют сигнальные пути, ассоциированные с исследуемым заболеванием. На основании вышеперечисленного мы временно классифицировали обнаруженные новые варианты как варианты с неизвестным клиническим значением. В дальнейшем провели функциональный анализ, который был необходим для уточнения патогенности в каждом конкретном случае.

В ходе публикационного поиска и программного анализа был сформирован перечень потенциальных генов-кандидатов, мутантный статус которых не исследовали ранее.

Ген CREB1 кодирует одноименный транскрипционный фактор (cAMP responsive element binding protein 1; CREB1). CREB1 способен связываться с определенными участками (cAMP response elements) в промоторных областях генов и индуцирует их транскрипцию. Взаимодействие CREB1 с RRM2 приводит к пролиферации, инвазии и миграции опухолевых клеток.

Белок TCF12, кодируемый TCF12, является представителем семейства димеризующихся факторов транскрипции (helix-loop-helixproteins, HLH). Известно, что TCF12 способен функционировать как онкоген или онкосупрессор при прогрессировании опухолей. Показано, что при колоректальном раке TCF12 выступает в роли транскрипционного репрессора E-кадгерина, и его уровень экспрессии коррелирует с риском метастазирования (Lee C.C. et al., 2012).

Ген PRKAR1A кодирует регуляторную последовательность cAMP-зависимой протеинкиназы 1а (PKA) (Wang S. et al., 2016). Экспрессия PRKAR1A подвержена значительным изменениям при метастазирующих неоплазиях, например, таких как миксома сердца (Burke A., Tavora F., 2015), одонтогенная миксома (Sousa S.F. et al., 2015), анапластический рак щитовидной железы (Ferrero S. et al., 2015), рак молочной железы (Beristain A.G. et al., 2015), аденома гипофиза у детей (Guaraldi F. et al., 2014) и шваннома (Manchanda P.K. et al., 2013).

Одноименный продукт гена BCL11A (B-Cell CLL/Lymphoma 11A) является фактором транскрипции. W.T. Khaled с соавторами продемонстрировали, что BCL11A является онкогеном при TNBC (тройной негативный рак молочной железы), и его сверхэкспрессия играет важную роль в прогрессировании опухоли и инвазии (Khaled W.T. et al., 2015).

Ген BUB1B (серин/треонинкиназа B митотической контрольной точки BUB1) является членом семейства белков SAC. BUB1B является ключевым компонентом комплекса митотической контрольной точки, который включает Cdc20, Mad2 и Bub3. BUB1B напрямую взаимодействует с Cdc20 и ингибирует комплекс стимуляции анафазы и таким образом подавляет начало анафазы, чтобы обеспечить правильную сегрегацию хромосом (Fu X. et al., 2016).

Нами были проанализированы выявленные сигнальные пути НЭО ПЖ. Результаты анализа обогащения по функциональной принадлежности получены с использованием g:Profiler и Cytoscape (модуль ReactomeFIViz). Исследуемые варианты были идентифицированы в генах, которые осуществляют регуляцию преимущественно шести молекулярных механизмов: регуляция ангиогенеза, метилирование и деметилирование гистонов, ремоделирование хроматина, репарация ДНК, mTOR и SMAD2/3 сигнальные пути.

Ангиогенез представляет собой биологический процесс образования новых кровеносных сосудов. Он имеет решающее значение для заживления ран, эмбриогенеза и роста тканей. Однако ангиогенез также характерен для развития опухолей: для роста опухоли необходима ее способность васкуляризироваться. В частности, НЭО ПЖ представляют собой васкуляризированные новообразования. В нашем исследовании было выявлено, что для НЭО ПЖ характерно подавление активности FGFR2 и VEGFR, что повышает чувствительность опухолевых клеток к таргетным антиангиогенным препаратам (Zhou Y. et al., 2020).

Проведенный нами анализ сигнальных путей позволил выделить путь SMAD2/3, который характеризуется многочисленными мутационными событиями (21%) среди больных, проходивших лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. Стоит отметить, что данный сигнальный механизм крайне редко рассматривается в работах, посвященных НЭО ПЖ. Основными участниками SMAD2/3 сигнального пути являются семейство трансформирующего фактора в (TGF-в) и группа SMAD-белков. Передача сигнала инициируется активацией лиганда TGF-в и его связыванием с рецептором типа II (T-eR II). Затем рецептор T-eR II рекрутирует и фосфорилирует рецептор типа I (T-eR I), который, в свою очередь, фосфорилирует SMAD2/3. Фосфорилированная форма SMAD2/3 образует с SMAD4 гетеродимерный комплекс, который транслоцируется в ядро, где связывается с SBE и рекрутирует котранскрипционные факторы для трансактивации или репрессии генов-мишеней. В регуляции SMAD2/3 сигнального пути участвуют транскрипционные факторы (NCOA1, NCOA2, CREB1), а передачу сигнала способны осуществлять гены

эстрогеновых и андрогеновых рецепторов (ESR1 и AR). Данный сигнальный путь ответственен за широкий спектр клеточных процессов: пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, миграцию клеток, а также инициацию и прогрессирование опухолей. Предполагается, что мутации в регуляторных генах NCOA1, NCOA2, CREB1, ESR1 и AR могут служить переключателем SMAD2/3 сигнального пути с его естественных клеточных функций на онкогенные функции - ангиогенез опухоли, миграцию и инвазию опухолевых клеток, метастазирование (Kidd M. et al., 2013; Rohira A.D. et al., 2017; Zhao M. et al., 2018).

Микросателлитная нестабильность (MSI), как приобретенный признак некоторых видов злокачественных опухолей, является следствием нарушений в работе системы репарации неспаренных оснований, что ассоциируется с высокой мутационной нагрузкой опухолевого генома (Bonneville R. et al., 2017; Cortes-Ciriano I. еt al., 2017). Дефицит системы репарации, так же как и микросателлитная нестабильность, хорошо изучены и чаще всего встречаются при карциноме эндометрия матки, аденокарциноме желудка и толстой кишки. Микросателлитная нестабильность в этих случаях является предиктивным и прогностическим маркером. Менее агрессивную природу MSI-положительных опухолей связывают с высокой частотой соматических мутаций, что приводит к большему уровню измененных белковых продуктов, которые вызывают противоопухолевый иммунный ответ. В итоге опухоли с MSI должны лучше реагировать на иммунотерапию анти-CTLA-4 и анти-PD-!, что и было подтверждено в отношении меланомы и колоректального рака (Snyder A. et al., 2014; Le D.T. et al., 2015). Тем не менее работ, оценивающих MSI в образцах НЭО разной локализации, не много.

На современном этапе определение микросателлитной нестабильности не входит в клинические рекомендации по диагностике и лечению нейроэндокринных опухолей различных локализаций. Однако потенциальная польза от такого тестирования может быть значительна, учитывая продемонстрированную эффективность иммунотерапии для злокачественных

опухолей с MSI-статусом (Snyder A. et al., 2014; Le D.T. et al., 2015). Во всех случаях неблагоприятного течения заболевания (прогрессия, смертельный исход) в нашей выборке отмечен MSS-статус опухоли. Подтверждение значимости данного предиктора требует большей выборки.

В настоящей работе были исследованы уровни метилирования восьми генов-кандидатов в образцах НЭО поджелудочной железы. Гены были отобраны на основании описанной для них опухоль-супрессорной функции и данных для злокачественных новообразований, в основном локализованных в ЖКТ.

В образцах НЭО ПЖ было обнаружено повышенное метилирование семи генов с индивидуальным индексом метилирования Met>10%. Наиболее метилированными в образцах опухолей были промоторы генов APC и RASSF1A с медианой Met 22% и 29% соответственно. Напротив, случаи с индивидуальным Met>10% редко наблюдали для локусов DAPK, MLH1. Для онкосупрессора P16 был зафиксирован только один случай повышения метилирования (Met=15%), несмотря на то, что это явление не редкое для НЭО других локализаций. Например, в НЭО КРР гиперметилирование P16 было характерно для 44% случаев, ранее для гастрином разной локализаций частота события была определена в 52% (Serrano J., 2000).

Аберрантное метилирование онко-ассоциированных генов - частое событие в опухолях человека. Аберрантное метилирование ДНК присутствует не только на ранних этапах канцерогенеза, но и является признаком дальнейшей прогрессии и метастазирования. Изменение метилирования регуляторных районов генов, осуществляющих негативную регуляцию внутриклеточных механизмов, связанных с инициацией и развитием злокачественного процесса приводит к инактивации онкосупрессоров без нарушения структуры ДНК.

Полученные нами данные по кластеризации высокодифференцированных НЭО ПЖ на основании уровня метилирования восьми генетических локусов (AHRR, APC1A, DAPK, MGMT, MLH1, P16, RASSF1A, RUNX3, и ретротранспозона LINE1) и клинических наблюдений позволили сделать предположение о возможности использования этих показателей в качестве

прогностических факторов риска при орган-сохранных корпорокаудальных резекциях.

Общая выживаемость больных нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы (НЭО ПЖ) после оперативного лечения, рассчитанная относительно общего количества пациентов в группе, составила: 1-летняя -91,9%, 3-летняя - 84,7%, 5-летняя - 76,6% и 10-летняя - 64%.

В работе была дана характеристика общей выживаемости пациентов с нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы в зависимости от степени злокачественности опухоли и пола, что позволило в дальнейшем оценить патогенетическое влияние мутаций генов в ткани опухоли на общую выживаемость больных.

Безрецидивная выживаемость больных нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы после оперативного лечения в группе пациентов составила: однолетняя - 91%, трехлетняя - 78,4%, пятилетняя - 62,2% и десятилетняя - 48,7%.

При массовом параллельном секвенировании тканевых образцов НЭО поджелудочной железы с использованием таргетной панели генов была проведена оценка мутационных генетических изменений. В результате были найдены гены-кандидаты, потенциально ассоциированные с онкогенезом НЭО ПЖ. В дальнейшую научную задачу входило оценить влияние генетических мутационных изменений на клинический признак - выживаемость больных НЭО ПЖ.

Среди прямых влияний на летальность больных с НЭО ПЖ наиболее выраженными по прогностической значимости были мутации генов FGFR2 и BCR и менее выраженное по силе влияние оказывали мутации генов NCOA2 и HNF1A.

Обратное влияние на летальность больных НЭО ПЖ оказывали гены KMT2D и ROS1. При наличии мутаций в KMT2D и ROS1 в тканевых образцах опухоли летальность пациентов клинической группы была ниже, а общая выживаемость выше.

На основании проведенного молекулярно-генетического исследования нами был разработан способ прогнозирования клинического течения высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы (патент РФ № 2747679). Методика заключалась в генотипировании с.2411С>А ге200615700 в гене ROS1, c.13588G>A ге768143170 в гене KMT2D, c.289G>A rs372430349 в гене FGFR2 и c.967G>A в гене ВСК Наличие мутаций в генах ROS1 и KMT2D определяет вероятность течения НЭО ПЖ без прогрессии, мутации в генах FGFR2 и BCR повышают риск метастазирования и агрессивной формы опухолевого роста.

В ходе экспериментального исследования нами была получена РЭХ-модель нейроэндокринной опухоли, а также доказано отрицательное влияние ранее выполненной спленэктомии на развитие легочных осложнений терапии Эверолимусом.

Таким образом, в ходе диссертационного исследования были выявлены молекулярно-генетические критерии, позволяющие предположить благоприятное течение (без ранних рецидивов и метастазов) нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы. В связи с возможной необходимостью длительной терапии Эверолимусом у данной категории пациентов мы обосновали необходимость выполнения резекции поджелудочной железы без лимфаденэктомии: спленосохраняющие корпрокаудальные резекции, энуклеации, срединные резекции.

Проведенное исследование позволит в дальнейшем предложить молекулярно-генетические критерии оценки степени злокачественности нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, которые необходимо учитывать при планировании лечебной тактики и ведении больных после проведенного лечения с целью раннего выявления возможного рецидива заболевания. В течение последних лет достигнут значительный прогресс в понимании морфологических особенностей и молекулярных механизмов развития НЭО пищеварительной системы. Наряду с гистологическим анализом опухоли в процессе морфологической диагностики большое значение имеет определение

клеточного иммунофенотипа, пролиферативной активности и молекулярных параметров, отражающих особенности биологического поведения и лекарственной чувствительности новообразования. Необходимы дальнейшие исследования для совершенствования современной номенклатуры и классификации нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, а также валидации выявленных нами специфичных молекулярных маркеров на больших выборках больных, которые служили бы дополнительными диагностическими и прогностическими показателями и, возможно, новыми потенциальными мишенями для противоопухолевой таргетной терапии.

226

ВЫВОДЫ

1. Создана первая в России паспортизированная коллекция из 111 образцов тканей нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы пациентов ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, «Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского» (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского), Научно-исследовательского института - Краевая клиническая больница № 1 имени профессора С.В. Очаповского.

2. По результатам первого в России таргетного высокопроизводительного секвенирования образцов высокодифференцированных НЭО поджелудочной железы выявлено 57 генетических вариантов, среди которых 16 являлись новыми. Функциональные изменения белков были описаны для пяти из 16-ти новых вариантов: c.474C>A MEN1, c.1363C>G SRC; c.1336_1346delGTGCAGTCCCT MEN1; c.913G>C BUB1B. В ходе анализа генов по функциональному вкладу выбраны новые гены-кандидаты, которые ранее не упоминались в работах, посвященных молекулярным особенностям НЭО ПЖ: CREB1, TCF12, PRKAR1A, BCL11A и BUB1B.

3. По результатам таргетного высокопроизводительного секвенирования образцов высокодифференцированных НЭО поджелудочной железы определены сигнальные пути, участвующие в онкогенезе высокодифференцированных НЭО ПЖ: ремоделирование хроматина (ATRX, DAXX, ESR1, HNF1A), метилирование и деметилирование гистонов (MEN1, KMT2C, KMT2D, TET1), ангиогенез (KDR, SRC, FGFR2), сигнальный путь mTOR (TSC2, KMT2D), репарация ДНК (ATM, CHEK2, WHSC1, MUTYH), регуляция сигнального пути SMAD2/3 (NCOA1, NCOA2, CREB1, ESR1, AR). Результаты нашего исследования свидетельствует о значительной частоте (21%) мутаций в генах, регулирующих SMAD2/3 сигнальный путь.

4. Разработан способ прогнозирования клинического течения высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, заключающийся в генотипировании c.2411C>A rs200615700 в гене ROS1,

c.13588G>A rs768143170 в гене KMT2D, c.289G>A rs372430349 в гене FGFR2 и c.967G>A в гене BCR. Наличие мутаций в генах ROS1 и KMT2D определяет вероятность течения НЭО ПЖ без прогрессии, мутации в генах FGFR2 и BCR повышают риск метастазирования и агрессивной формы опухолевого роста.

5. Проведенное исследование иммуногистохимического портрета нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы собранной нами уникальной коллекции установило, что из 111 -ти исследованных образцов NSE выявлялась в 94,6% случаев (резко выраженная реакция - 88 случаев, умеренно выраженная реакция - 17 случаев), СК18 был выявлен в 80,1% случаев (слабо выраженная реакция в 39 случаях, 33 образца - резко выраженная реакция, в 4-х образцах - умеренно выраженная реакция), АЕ1/АЕ3 выявлялся в 74,8% случаев (в 33 случаях была отмечена резко выраженная реакция, в 4-х - умеренно выраженная, в 39 - слабо выраженная реакция).

6. Функционирующие НЭО ПЖ продемонстрировали больший уровень метилирования по локусам APC1 (p=0,0073), CDH13 (p=0,019), DAPK (0,01), в то же время меньший уровень - гена RASSF1A (р=0,0032). Для большинства функционирующих НЭО ПЖ отмечено гиперметилирование промотора гена MLH1 (p<0,0001). Разработан способ на основе анализа статуса метилирования 4 генов-онкосупрессоров (APC1A, MGMT, RASSF1A, RUNX3) и ретротранспозона LINE1, который позволяет определить прогноз течения нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы и скорректировать тактику хирургического лечения.

7. В исследовании достоверно установлено, что в зависимости от степени дифференцировки НЭО ПЖ (G1, G2, G3) динамика кумулятивной безрецидивной выживаемости различалась (p=0,0004). За 10 лет после операции безрецидивная выживаемость больных НЭО ПЖ при степени дифференцировки опухоли G1 по методу Каплана-Мейера составила - 52,2%, при G2 - 9% и при G3 - 0. Медиана дожития у больных нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы за период наблюдения при степени дифференцировки опухоли G1 достигнута не была, при G2 составила 6,3 года и при G3 - 2,2 года.

8. Проведенный многомерный регрессионный анализ совместного влияния мутаций генов FGFR2, BCR, NCOA2, HNF1A KMT2D и ROS1 в опухолевых образцах на общую выживаемость больных НЭО ПЖ показал, что с развитием летального исхода были ассоциированы мутационные изменения генов FGFR2 (ß-стандартизированный показатель, M+m 0,86+0,37, exp(B) 2,37, Wald 5,5, p (Wald) 0,0188), BCR (ß-стандартизированный показатель, M+m 1,18+0,34, exp(B) 3,28, Wald 12,1, p (Wald) 0,0004), NCOA2 (ß-стандартизированный показатель, M+m 0,43+0,28, exp(B) 1,54, Wald 3,2, p (Wald) 0,0254), HNF1A (ß-стандартизированный показатель, M+m 0,17+0,36, exp(B) 1,18, Wald 0,22, p (Wald) 0,6353). Наиболее выраженную предикторную независимую значимость имели мутации генов FGFR2 и BCR. Протективное действие, как в отношении общей, так и безрецидивной выживаемости, имели гены KMT2D (ß-стандартизированный показатель, M+m -0,46+0,24, exp(B) 0,62, Wald 2,53, p (Wald) 0,0637) и ROS1 (ß-стандартизированный показатель, M+m -0,95+0,44, exp(B) 0,38, Wald 3,2, p (Wald) 0,0365).

9. В эксперименте получена ортотопическая PDX-модель первичной человеческой высокодифференцированной нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы, которая может быть использована как при проведении доклинических исследований новых терапевтических подходов к лечению, так и для дальнейшего изучении этиологии и патогенеза данного заболевания.

10. Разработана многоуровневая модель диагностики и определения тактики лечения нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы при размерах опухоли менее 2 см и от 2 см до 3 см, которая основывается на исследовании молекулярно-генетического портрета опухоли. При недостаточном количестве биопсийного материала (опухоль до 2 см) выбор лечебной тактики основывается на исследовании значений эпигенетических маркеров (метилирование генов AHRR, APC1A, DAPK, MGMT, MLH1, P16, RASSF1A, RUNX3 и ретротранспозона LINE1), а при достаточном количестве материала на результатах исследования панели генов - FGFR2, BCR, KMT2D и ROS1.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для определения прогноза течения НЭО ПЖ рекомендуем выполнять исследование метилирования генов ЛИЯЯ, АРС1А, БАРК, МОМТ, МЬИ1, Р16, КА88Е1Л, ЯиМХЗ и ретротранспозона ЬШЕ1:

• При значениях Ме1ЫМЕ1>72%, Ме1ЛРС1<11%, Ме1МОМТ<10,5%, Ме1КЛ88р1Л<12% и Ме1кшХ3<10% прогнозируют низкий риск метастазирования после проведения спленсохранной корпорокаудальной резекции НЭО ПЖ.

• При значениях Ме1ЫКЕ1<72%, Ме1ЛРС1>11%, Ме1МОМТ>10,5%, Ме1кЛ88р1Л>12% и Ме1яшХ3>10% прогнозируют высокий риск метастазирования после проведения спленсохранной корпорокаудальной резекции НЭО ПЖ.

2. При НЭО ПЖ низкого риска метастазирования, размерах опухоли не более 2 см рекомендуем выполнять резекции поджелудочной железы без лимфаденэктомии: спленосохраняющие корпрокаудальные резекции, энуклеации, срединные резекции.

3. При размерах опухоли более 2 см, но менее 3 см для решения вопроса о выполнении оперативного лечения рекомендуем выполнять высокопроизводительное секвенирование для определения всех возможных предикторов положительного и отрицательного исхода.

4. Для определения риска прогрессии течения НЭО ПЖ рекомендуем проводить генотипирование с.2411С>А ^200615700 в гене ROS1, c.13588G>A ^768143170 в гене KMT2D, c.289G>A rs372430349 в гене FGFR2 и c.967G>A в гене BCR. Наличие мутаций в генах ROS1 и KMT2D определяет вероятность течения НЭО ПЖ без прогрессии, мутации в генах FGFR2 и BCR повышают риск метастазирования и агрессивной формы опухолевого роста. Оценка рисков осуществляется по формулам:

Р1 =(К 1 +К2)/2 х100%, Р2=(К3+К4)/2х100%.

Здесь Р1 - вероятность безрецидивной формы НЭО ПЖ, Р2 - вероятность прогрессирования опухоли, К1 - коэффициент для мутации с.2411С>А ^200615700 в гене ROS1, К2 - коэффициент для мутации c.13588G>A ^768143170 в гене KMT2D, КЗ - коэффициент для мутации c.289G>A ^372430349 в гене FGFR2 и К4 - коэффициент для мутации c.967G>A в гене BCR. Значение коэффициентов зависит от генотипа: 0 в случае гомозиготы дикого типа, 0,5 - гетерозиготы и 1 - мутантной гомозиготы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

НЭН - нейроэндокринные неоплазии НЭO - нейроэндокринные опухоли ПЖ - поджелудочная железа

ФН-НЭO ПЖ - функционально-неактивные НЭO ПЖ ПГС - полногеномное секвенирование ПЭС - полноэкзомное секвенирование ВКГ - вариация копий числа генов

MSI - микросателлитная нестабильность

SPF (Specific pathogen free) - свободный от специфических патогенов Grade, G - степени злокачественности опухоли NSE - нейрон-специфическая энолаза

а.о. - аминокислотные остатки

ERE - эстроген-чувствительный элемент

HNF - ядерные факторы гепатоцитов

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт КРР - колоректальный рак

ИЛД - интерстициальная болезнь легких

ТАХЭ - трансартериальная химиоэмболизация микроРНК - малая не кодирующая рибонуклеиновая кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота Balb/c Nude - субштамм бэг-альбинос обнаженный (Bagg Albino Nude) PDX - модели ксенотрансплантата опухоли пациента (Patient-Derived

Xenograft)

NGS (next generation sequencing) - секвенирование нового поколения

Met - усредненное метилирование промоторного участка на основании

значений метилирования отдельного CpG-сайта HLH (helix-loop-helixproteins) - семейства димеризующихся факторов транскрипции

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андрианова, М.А. Характеристики точечного мутагенеза в раковых клетках человека: специальность 03.01.09 - «математическая биология, биоинформатика»: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Андрианова Мария Александровна; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт проблем передачи информации имени А.А. Харкевича» Российской академии наук. - Москва, 2019. - 113 с. - Текст: непосредственный.

2. Борискова, М.Е. Влияние молекулярно-генетического профиля высокодифференцированного рака щитовидной железы на хирургическую тактику: специальность 4.01.12 - «онкология»; 14.01.17 - «хирургия»: диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Борискова Марина Евгеньевна; Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова. - Санкт-Петербург, 2019. - 239 с. - Библиогр.: с. 198-237. - Текст: непосредственный.

3. Гвалдин, Д.Ю. Результаты NGS-типирования метастатической нейроэндокриной опухоли поджелудочной железы / Д.Ю. Гвалдин,

B.С. Трифанов, Н.Н. Тимошкина, Д.С. Кутилин, Н.С. Карнаухов, Е.Н. Колесников, О.И. Кит. - Текст: непосредственный // Исследования и практика в медицине. Материалы Второго международного форума онкологии и радиологии; Москва, 23-27 сентября 2019. - 2019. - Т. 6, спецвыпуск 1. - C. 98.

4. Гуревич Л.Е. Современные подходы к морфологической диагностике нейроэндокринных опухолей: проблемы и ошибки / Л.Е. Гуревич. - Текст: электронный // III Ежегодный Конгресс Российского общества онкопатологов 2021 апреля 2018 года, г. Казань. - 2018.

5. Делекторская, В.В. Нэйроэндокриные новообразования поджелудочной железы: новые аспекты морфологической классификации (Всемирная организация здравоохранения, 2017) / В.В. Делекторская. - Текст: непосредственный // Успехи молекулярной онкологии. - 2017. - Т. 4, № 3. -

C. 104-108. DOI: 10.17650/2313-805X-2017-4-3-104-108.

6. Имянитов, Е.Н. Применение молекулярно-генетического анализа для выбора противоопухолевой цитостатической терапии / Е.Н. Имянитов,

B.М. Моисеенко. - Текст: непосредственный // Онкогематология. - 2007. - № 3. -

C. 4-8.

7. Киричук, В.Ф. Изменение показателей микроциркуляции и иммунного статуса в отдаленном послеоперационном периоде после операций на травмированной селезенке / В.Ф. Киричук, Ю.Г. Шапкин, В.В. Масляков. - Текст: непосредственный // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2007. - № 3 (17). - С. 98-103.

8. Кит, О.И. Аберрантное метилирование промоторных участков генов APC, CDH13 и MGMT у больных колоректальным раком / О.И. Кит, Д.И. Водолажский, К.В. Двадненко, И.Ю. Ефимова, Е.Н. Олейникова, Д.Д. Олейников, Н.Н. Тимошкина. - Текст: непосредственный // Сибирский онкологический журнал. - 2016. - Т. 15, № 2. - С. 48-55.

9. Кит О.И. Вопросы классификации нейроэндокринных опухолей желудка / О.И. Кит, И.С. Дерижанова, Н.С. Карнаухов. - Текст: непосредственный // Вопросы онкологии. - 2016. - Т. 62, № 5. - С. 573-579.

10. Кит, О.И. Данные статистических, морфологических и иммуноферментных исследований нейроэндокринноклеточных опухолей по материалам регистра РНИОИ / О.И. Кит, В.С. Трифанов, Е.Ю. Златник, Е.М. Непомнящая, Г.И. Закора, Е.Н. Колесников, Л.В. Харин, П.Н. Габричидзе. -Текст: непосредственный // Материалы Второго онкологического форума Юга России. Ростов-на-Дону, 31.10-01.11.2016. - С. 50.

11. Кит, О.И. Молекулярно-генетические особенности нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы / О.И. Кит, Д.Ю. Гвалдин, В.С. Трифанов, Е.Н. Колесников, Н.Н. Тимошкина. - Текст: непосредственный // Генетика. -2020. - Т. 56, № 1. - С. 142-160.

12. Кит, О.И. Некоторые клинико-морфологические особенности нейроэндокринноклеточных опухолей поджелудочной железы / О.И. Кит, Е.М. Непомнящая, В.С. Трифанов. - Текст: непосредственный // Материалы

Международной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». - Москва, 16-17 апреля 2014. - С. 122-124.

13. Кит, О.И. Опыт лабораторной оценки нейроэндокринных опухолей по данным регистра ростовского НИИ онкологии / О.И. Кит, Е.Ю. Златник, А. Л. Базаев, И.А. Новикова, О.Н. Селютина, А.Ю. Максимов, Е.Н. Колесников, В.С. Трифанов, Л.В. Харин, П.Н. Габричидзе, А.В. Тетерников. - Текст: непосредственный // Злокачественные опухоли. - 2016. - № 4-Б1 (21). - С. 166-167.

14. Кит, О.И. Послеоперационная выживаемость больных раком поджелудочной железы в зависимости от процентного содержания клеток с нейроэндокринной дифференцировкой в опухоли / О.И. Кит, Е.М. Франциянц, И.С. Дерижанова, Н.С. Карнаухов, М.А. Кузнецова, М.В. Волошин, В.С. Трифанов, В.И. Алейнов. - Текст: непосредственный // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2020. - Вып. 184, № 12. - С. 38-44. https://doi.org/10.31146/1682-8658-ecg-184-12-38-44.

15. Кузавлева, Е.И. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы (хирургическое лечение и клинико-морфологические факторы прогноза): специальность 14.01.17 - «хирургия»: диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Кузавлева Елена Игоревна; Московский Областной Научно-Исследовательский Клинический Институт им. М.Ф. Владимирского. -Москва, 2015. - 117 с. - Текст: непосредственный.

16. Масляков, В.В. Физиологическое обоснование органосохраняющих операций при травмах селезенки / В.В. Масляков, В.Г. Барсуков, А.Ю. Чуманов, А.З. Шахмагомедов. - Текст: непосредственный // Казанский медицинский журнал. - 2011. - Т. 92, № 3. - С. 35-40.

17. Масляков, В.В. Иммунный статус больных, оперированных по поводу повреждений селезенки / В.В. Масляков, В.Ф. Киричук, В.Г. Барсуков, А.Ю. Чуманов. - Текст: непосредственный // Клиническая медицина. - 2012. - № 5. - С.48-52.

18. Масляков, В.В. Изменение иммунного статуса в ближайшем послеоперационном периоде у пациентов, оперированных при травме селезенки /

В.В. Масляков, В.Ф. Киричук, А.Ю. Чуманов. - Текст: непосредственный // Новости хирургии. - 2011. - Т. 19, № 1. - С. 32-37.

19. Миндарь, М.В. Значение иммунодефицитных мышей для экспериментальных и доклинических исследований в онкологии / М.В. Миндарь, Е.А. Лукбанова, С.О. Кит, А.Е. Анисимов, Г.Ю. Егоров, В.Г. Воловик. - Текст: непосредственный // Сибирский научный медицинский журнал. - 2020. - Т. 40, № 3. - С. 10-20. doi: 10.15372/SSMJ20200302.

20. Нейроэндокринные опухоли. Общие принципы диагностики и лечения. Руководство / Кит. О.И., Колесников Е.Н, Снежко А.В., Трифанов В.С., Тимошкина Н.Н., Гвалдин Д.Ю., Мещерякова М.Ю. [и др.]; под редакцией д.м.н. проф. В.А. Горбуновой. - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2021. - 600 с. Артикул NF0019627 ISBN. 978-5-9704-5997-3. - Текст: непосредственный.

21. Орел, Н.Ф. Практические рекомендации по лекарственному лечению нейроэндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы: практические рекомендации RUSSCO / Н.Ф. Орел, В.А. Горбунова, В.В. Делекторская, Г.С. Емельянова, Н.В. Любимова, А.А. Маркович, Р.В. Орлова, В.С. Трифанов. - Текст: непосредственный // Злокачественные опухоли. - 2018. - Т. 8, № 3-s2. С. 430-439.

22. Орел, Н.Ф. Практические рекомендации по лекарственному лечению нейроэндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы и других локализаций / Н.Ф. Орел, Е.В. Артамонова, В.А. Горбунова, В.В. Делекторская, Г.С. Емельянова, Н.В. Любимова, А.А. Маркович, К.В. Орлова, Р.В. Орлова, В.С. Трифанов. - Текст: непосредственный // Злокачественные опухоли. - 2019. - Т. 9, № 3-S2. С. 486-497.

23. Орел, Н.Ф. Практические рекомендации по лекарственному лечению нейроэндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы / Н.Ф. Орел, В.А. Горбунова, В.В. Дворниченко, Г.С. Емельянова, А.Е. Кузьминов, Н.В. Любимова, А.А. Маркович, Р.В. Орлова, В.С. Трифанов. -Текст: непосредственный // Злокачественные опухоли: Практические рекомендации RUSSCO #3s2. - 2017. - Т. 7. - С. 395-403.

24. Павлова, И.Е. Т-хелперы 1-го и 2-го типа у больных, перенесших операции на селезенке в связи с травмой / И.Е. Павлова, Л.Н. Бубнова - Текст: непосредственный // Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2006. -Серия 11, вып. 3. - С. 102-106.

25. Патент № 2722276 Российская Федерация, МПК С0Ш. Способ диагностики аденокарциномы поджелудочной железы с нейроэндокринным компонентом: №2019140707: заявлено 09.12.2019: опубликовано 28.05.2020 / Кит О.И., Франциянц Е.М., Трифанов В.С., Алейнов В.И., Бандовкина В.А; заявитель и патентообладатель Национальный медицинский исследовательский центр онкологии ^и). - 10 с. - Текст: непосредственный.

26. Патент № 2725273 Российская Федерация, МПК С0Ш, А61В. Способ трансплантации фрагмента нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека в поджелудочную железу иммунодефицитных мышей: №2019135409: заявлено 05.11.2019: опубликовано 30.06.2020 / Трифанов В.С., Максимов А.Ю., Кит С.О., Гончарова А.С., Волкова А.В., Лукбанова Е.А. Миндарь М.В., Ходакова Д.В., Ткачев С.Ю., Заикина Е.В., Протасова Т.П.; заявитель и патентообладатель Национальный медицинский исследовательский центр онкологии (Яи). - 10 с. - Текст: непосредственный.

27. Патент № 2747679 Российская Федерация, МПК С0Ш, С610. Способ прогнозирования клинического течения высокодифференцированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы: №2020123486: заявлено 09.07.2020: опубликовано 12.05.2021 / Кит О.И., Трифанов В.С., Колесников Е.Н., Тимошкина Н.Н., Гвалдин Д.Ю., Трифанов Д.С.; заявитель и патентообладатель Национальный медицинский исследовательский центр онкологии (ЯИ). - 10 с. -Текст: непосредственный.

28. Пинский, С.Б. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы / С.Б. Пинский, В.А. Белобородов, Ю.К. Батороев, В.В. Дворниченко. - Текст: непосредственный // Сибирский медицинский журнал. - 2013. - № 5. - С. 12-17.

29. Поликарпова, С.Б. Нейроэндокринные опухоли органов брюшной полости и забрюшинного пространства (клиника, диагностика, лечение, прогноз):

специальность 14.00.14 - «Онкология»: диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Поликарпова Светлана Борисовна; Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН. - Москва, 2010. -336 с. - Текст: непосредственный.

30. Смирнова, А.В. Особенности проведения анестезии у крыс при полостных операциях / А.В. Смирнова, Л.Д. Лагутина, И.Е. Трубицына, О.С. Васнев, О.Б. Янова. - Текст: непосредственный // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2012. - № 5. - С. 62-65.

31. Трещалина, Е.М. Иммунодефицитные мыши Balb/c Nude и моделирование различных вариантов опухолевого роста для доклинических исследований / Е.М. Трещалина. - Текст: непосредственный // Российский биотерапевтический журнал. - 2017. - Т. 16, № 16. - С. 6-13.

32. Трифанов, В.С. PDX-модель высокодифференцированной нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы на иммунодефицитных мышах линии Balb/c Nude / В.С. Трифанов, А.Ю. Максимов, А.С. Гончарова, Е.А. Лукбанова, Н.С. Карнаухов, С.О. Кит, А.В. Волкова, Т.П. Протасова, С.Ю. Ткачев, Д.В. Ходакова, Е.В. Заикина, М.В. Миндарь, И.М. Акульшина. -Текст: непосредственный // Альманах клинической медицины. - 2020. - Т.48, № 2. - С. 117-124. Doi: 10.18786/2072-0505-2020-48-026

33. Трифанов, В.С. Генетический профиль нейроэндокринных новообразований поджелудочной железы: комплексное исследование на базе реестра ФГБУ «РНИОИ». Исследования и практика в медицине / В.С. Трифанов,

0.И. Кит, Н.Н. Тимошкина, Д.Ю. Гвалдин, Д.С. Кутилин, Н.С. Карнаухов. -Текст: непосредственный // Материалы Второго международного форума онкологии и радиологии, Москва, 23-27 сентября 2019. - 2019. - Т.6, спецвыпуск

1. - C. 270.

34. Трифанов, В.С. Изучение прогностической роли метилирования генов-онкосупрессоров в спорадических высокодифференцированных нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы / В.С. Трифанов, Е.Н. Колесников, Д.Ю. Гвалдин, Н.А. Петрусенко, Д.С. Потемкин, М.Ю. Мещерякова

- Текст: электронный // Современные проблемы науки и образования. - 2021. -№3; URL: http://www.science-education.ru/article/view?id=30892 (дата обращения: 21.06.2021).

35. Трифанов, В.С. Клинико-иммуногистохимический анализ нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы / В.С. Трифанов, О.И. Кит, Е.Н. Колесников, Н.С. Карнаухов, Н.Н. Тимошкина, Е.М. Непомнящая, Т.Н. Гудцкова, М.Ю. Мещерякова, А.Л. Базаев. - Текст: электронный // Современные проблемы науки и образования. - 2019. - №3; - URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?Id=28865

36. Трифанов, В.С. Наследственная мутация гена NTRK3 (A645C) как новый фактор патогенеза нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы / В.С. Трифанов, Е.Н. Колесников, Д.Ю. Гвалдин, Н.А. Петрусенко, Д.С. Потемкин,

A.В. Снежко, П.Н. Габричидзе, У.М. Газиев, М.Ю. Мещерякова. - Текст: электронный // Современные проблемы науки и образования. - 2020. - № 6; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=30368 (дата обращения: 26.03.2021).

37. Трифанов, В.С. Опыт лечения метастазов нейроэндокринно клеточного рака в печень с применением трансартериальной химиоэмболизации /

B.С. Трифанов, Е.Н. Колесников, А.В. Снежко, М.Н. Черняк, А.Л. Базаев, М.Ю. Мещерякова. - Текст: непосредственный // Якутский медицинский журнал. - 2020. - № 1(69). - С. 109-112.

38. Трифанов, В.С. Сплен-сохраняющие дистальные резекции поджелудочной железы при нейроэндокринных опухолях / В.С. Трифанов, Е.Н. Колесников, А.В. Снежко, С.В. Санамянц, М.А. Кожушко, М.А. Аверкин, Т.Б. Кациева, М.Ю. Мещерякова. - Текст: электронный // Современные проблемы науки и образования. - 2021. - № 1; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=30388 (дата обращения: 26.03.2021).

39. Холоденко, И.В. Опухолевые модели в изучении онкологических заболеваний / И.В. Холоденко, И.И. Доронин, Р.В. Холоденко. - Текст: непосредственный // Иммунология. - 2013. - №5. - С.282-286.

40. Черноусов, А.Ф. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы:

30-летний опыт клиники факультетской хирургии им. Н.Н. Бурденко / А.Ф. Черноусов, А.В. Егоров, Г.Х. Мусаев [и др.] - Текст: непосредственный // Хирургия. - 2013. - № 7. - С. 13-19.

41. Шапкин, Ю.Г. Селезенка и иммунный статус организма / Ю.Г. Шапкин, В.В. Масляков. - Текст: непосредственный // Вестник хирургии. Селезенка и иммунитет. - 2009. - Т. 168, № 2. - С. 110-113.

42. Шапкин, Ю.Г. Типичные осложнения в отдаленном послеоперационном периоде у больных, оперированных при травме селезенки / Ю.Г. Шапкин, В.В. Масляков. - Текст: непосредственный // Вестник хирургии. Вопросы общей и частной хирургии. - 2009. - Т.168, №3. - С.39-43.

43. Янкин, А.В. Нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта / А.В. Янкин. - Текст: непосредственный // Практическая онкология. -2005. - Т.6, № 4. - С. 227-233.

44. Agarwal S.K. Multiple endocrine neoplasia type 1. Front Horm Res. 2013; 41:1-15.

45. Agarwal S.K. The future: genetics advances in MEN1 therapeutic approaches and management strategies. Endocr Relat Cancer. 2017;24(10):T119-34.

46. Agarwal S.K., Guru S.C., Heppner C. et al. Menin interacts with the AP1 transcription factor JunD and represses JunD-activated transcription. Cell 1999;96(1):143-52.

47. Agarwal S.K., Novotny E.A., Crabtree J.S. et al. Transcription factor JunD, deprived of menin, switches from growth suppressor to growth promoter. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100(19):10770-5.

48. Alexandrov L.B. et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 2013;500:415-421.

49. Aleynov V.I., Frantsiyants E.M., Bandovkina V.A., Cheryarina N.D., Trifanov V.S., Chernyak M.N., Mezentsev S.S., Grechkin F.N., Katsieva T.B., Kit O.I., Shaposhnikov A.V., Petrov D.S., Fomenko Y.A. Effect of neuroendocrine component in pancreatic adenocarcinoma on blood levels of steroid hormones. Journal of clinical oncology. 2020; 38(suppl 15): abstr e16695.

50. Aleynov V.I., Frantsiyants E.M., Bandovkina V.A., Cheryarina N.D., Trifanov V.S., Sanamyants S.V., Averkin M.A., Kit O.I., Shaposhnikov A.V., Fomenko Y.A., Petrov D.S. Blood levels of steroid hormone precursors allow differentiation between pancreatic adenocarcinoma and neuroendocrine tumors. 2020 ASCO Annual Meeting J. Clin. Oncol. 38, 2020 (suppl; abstr e16692).

51. Almeida F., Amorim S., Sarmento A., Santos L. Life-Threatening Everolimus-Associated Pneumonitis: A Case Report and a Review of the Literature. Transplant Proc. 2018 Apr; 50(3):933-938. doi: 10.1016/j.transproceed.2017.12.003.Epub 2018 Mar 24.

52. Andersen M.L., Winter L.M.F. Animal model sinbiological and biomedical research-experimental and ethical concerns. An. Acad. Bras. Scienc. 2017

53. Apostolou P., Papasotiriou I. Current perspectives on CHEK2 mutations in breast cancer. Breast Cancer Targets Ther. 2017;9:331-335. https://doi.org/10.2147/BCTT.S111394

54. Attisano L., Wrana J.L. Signal transduction by the TGF-beta superfamily. Science. 2002;296(5573):1646-7.

55. Aversa J.G., De Abreu F.B., Yano S., Xi L., Hadley D.W., Manoli I., Raffeld M., Sadowski S.M., Nilubol N. The first pancreatic neuroendocrine tumor in Li-Fraumeni syndrome: a case report. BMC Cancer. 2020 Mar 30;20(1):256. doi: 10.1186/s12885-020-06723-6.

56. Bader E. et al. Identificaiton of proliferative and mature beta cells in the islets of Langerhans. Nature. 2016;535, 430-434.

57. Baglietto L., Ponzi E., Haycock P., Hodge A., Bianca Assumma M., Jung C.H. et al. DNA methylation changes measured in pre-diagnostic peripheral blood samples are associated with smoking and lung cancer risk. Int J Cancer. 2017;140(1):50-61.

58. Bankert R.B., Egilmez N.K., Hess S.D. Human-SCID mouse chimeric models for the evaluation of anti-cancer therapies. Trends Immunol. 2001; 22 (7): 386393. doi: 10.1016/s1471 -4906(01)01943-3

59. Bartsch D.K., Kersting M., Wild A., Ramaswamy A., Gerdes B.,

Schuermann M., Simon B., Rothmund M. Low frequency of p16(INK4a) alteration in insulinomas. Digestion. 2000;62(2-3): 171-7. doi: 10.1159/000007810.

60. Basturk O., Yang Z., Tang L.H. et al. The high-grade (WHO G3) pancreatic neuroendocrine tumor category is morphologically and biologically heterogenous and includes both well differentiated and poorly differentiated neoplasms. Am J Surg Pathol. 2015;39(5):683-90.

61. Becher O.J., Holland E.C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 2006; 66: 3355-3358. doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-3827

62. Bellizzi A.M. Pathologic considerations in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Surg Oncol Clin N Am. 2020;29:185-208. https://doi.org/10.1016/j.soc.2019.11.003

63. Bente D.A., Melkus M.W., Garcia J.V., Rico-Hesse R. Dengue fever in humanized NOD/SCID mice. J. Virol. 2005;79(21):13797-13799. doi: 10.1128/JVI.79.21.13797-13799.2005

64. Beristain A.G., Molyneux S.D., Joshi P.A. et al. PKA signaling drives mammary tumorigenesis through Src. Oncogene. 2015;34:1160-1173. https://doi.org/10.1038/onc.2014.41

65. Bettini R., Partelli S., Boninsegna L., Capelli P., Crippa S., Pederzoli P., Scarpa A., Falconi M. Tumor Size Correlates with Malignancy in Non-Functioning Pancreatic Endocrine Tumor. Surgery. 2011;150(1):75-82. DOI 10.1016/j.surg.2011.02.022

66. Blättler S.M. et al. Yin Yang 1 deficiency in skeletal muscle protects against rapamycin-induced diabetic-like symptoms through activation of insulin/IGF signaling. Cell Metab. 2012;15:505-517.

67. Boggon T.J., Eck M.J. Structure and regulation of Src family kinases. Oncogene. 2004;23:7918-7927.

68. Bojesen S.E., Timpson N., Relton C., Davey Smith G., Nordestgaard B.G. AHRR (cg05575921) hypomethylation marks smoking behaviour, morbidity and mortality. Thorax. 2017;72(7):646-53.

69. Boldes T., Boldes T., Merenbakh-Lamin K. et al. R269C variant of ESR1: High prevalence and differential function in a subset of pancreatic cancers. BMC Cancer. 2020;20:1-15. https://doi.org/10.1186/s12885-020-07005-x

70. Bonneville R., Krook M.A., Kautto E.A., Miya J., Wing M.R., Chen H.Z., Reeser J.W., Yu L., Roychowdhury S. Landscape of Microsatellite Instability Across 39 Cancer Types. JCO Precis Oncol. 2017;2017:P0.17.00073. doi: 10.1200/P0.17.00073. Epub 2017 Oct 3. PMID: 29850653; PMCID: PMC5972025.

71. Bosman F.T., Carneiro F., Hruban R.H. et al. WHO classification of tumours of the digestive system. 4th edition. Lyon (France): International Agency for Research on Cancer (IARC). 2010; 3.

72. Brems H., Beert E., de Ravel T. et al. Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1. Lancet Oncol. 2009;10(5): 508-15.

73. Brenet, F. et al. DNA methylation of the first exon is tightly linked to transcriptional silencing. PLoS One. 2011;6: e14524.

74. Brohl A. S. et al. The genomic landscape of the Ewing Sarcoma family of tumors reveals recurrent STAG2 mutation. PLoS Genet. 2014;10: e1004475.

75. Bruix J., Han K.H., Gores G. et al. Liver cancer: Approaching a personalized care. J. Hepatol. 2015;62:S144-S156.

76. Burke A., Tavora F. The 2015 WHO Classification of tumors of the heart and pericardium. J. Thorac. Oncol. 2016;11:441-452.

77. Burks D.J. & White M.F. IRS proteins and beta-cell function. Diabetes. 2001;50(Suppl 1):S140-S145.

78. Caiazza F., Ryan E.J., Doherty G.et al. Estrogen receptors and their implications in colorectal carcinogenesis. Front Oncol. 2015;5:1-9. https://doi.org/10.3389/fonc.2015.00019

79. Canaff L., Vanbellinghen J.F., Kaji H. et al. Impaired transforming growth factorbeta (TGF-beta) transcriptional activity and cell proliferation control of a menin in-frame deletion mutant associated with multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1). J Biol Chem. 2012;287(11):8584-97.

80. Cao Y., Liu R., Jiang X. et al. Nuclear-cytoplasmic shuttling of menin

regulates nuclear translocation of {beta}-catenin. Mol Cell Biol. 2009;29(20):5477-87.

81. Cao Y.N., Gao Z.B., Li L. et al. Whole exome sequencing of insulinoma reveals recurrent T372R mutations in YY1. Nat Commun. 2013;4:2810.

82. Capdevila J., Casanovas O., Salazar R. et al. Translational research in neuroendocrine tumors: pitfalls and opportunities. Oncogene. 2017;36(14):1899-907.

83. Capozzi M., Von Arx C., De Divitiis C. et al. Antiangiogenic therapy in pancreatic neuroendocrine tumors. Anticancer Res. 2016;36:5025-5030.

84. Capurso G., Di Florio A., Sette C., Delle Fave G. Signalling pathways passing Src in pancreatic endocrine tumours: Relevance for possible combined targeted therapies. Neuroendocrinology. 2013;97:67-73. https://doi.org/10.1159/000336093

85. Carpten J.D., Faber A.L., Horn C., Donoho G.P., Briggs S.L., Robbins C.M., Hostetter G., Boguslawski S., Moses T.Y., Savage S. et al. A transforming mutation in the pleckstrin homology domain of AKT1 in cancer. Nature. 2007;448:439-444.

86. Cejas P., Drier Y., Dreijerink K.M.A. et al. Enhancer signatures stratify and predict outcomes of non-functional pancreatic neuroendocrine tumors. Nat Med. 2019;25:1260-1265.

87. Chai S.M., Brown I.S., Kumarasinghe M.P. Gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms: selected pathology review and molecular updates. Histopathology. 2018;72:153-167.

88. Chan C.S., Laddha S.V., Lewis P.W. et al. ATRX, DAXX or MEN1 mutant pancreatic neuroendocrine tumors are a distinct alpha-cell signature subgroup. Nat Commun. 2018;9:1-10. https://doi.org/10.1038/s41467-018-06498-2

89. Chan C.S., Laddha S.V., Lewis P.W., Koletsky M.S., Robzyk K. et al. ATRX, DAXX or MEN1 mutant pancreatic neuroendocrine tumors are a distinct alpha-cell signature subgroup. NATURE COMMUNICATIONS. 2018;9:4158. DOI: 10.1038/s41467-018-06498-2

90. Chen H., Lee J., Kljavin N.M. et al. Requirement for BUB1B/BUBR1 in tumor progression of lung adenocarcinoma. Genes Cancer. 2015 Mar;6(3-4): 106-18. doi: 10.18632/genesandcancer.53.

91. Chen Q.B., Liang Y.K., Zhang Y.Q. et al. Decreased expression of TCF12 contributes to progression and predicts biochemical recurrence in patients with prostate cancer. Tumor Biol. 2017;39: https://doi.org/10.1177/1010428317703924

92. Chen Y.F., Yang C.C., Kao S.Y. et al. MicroRNA-211 enhances the oncogenicity of carcinogen-induced oral carcinoma by repressing TCF12 and increasing antioxidant activity. Cancer Res. 2016;76:4872-4886. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-15-1664

93. Choi I.S., Estecio M., Nagano Y. et al. Hypomethylation of LINE-1 and Alu in well-differentiated neuroendocrine tumors (pancreatic endocrine tumors and carcinoid tumors). Mod Pathol. 2007;20:802-810. https://doi.org/10.1038/modpathol.3800825

94. Choi M., Kipps T., Kurzrock R. ATM mutations in cancer: Therapeutic implications. Mol Cancer Ther. 2016;15:1781-1791. https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-15-0945

95. Choi Y.Y., Lee J.E., Kim H., Sim M.H., Kim K.-K., Lee G., Kim H.-I., An J.Y., Hyung W.J., Kim C.-B. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Sci. Rep. 2016;6;22172. doi:10.103 8/srep22172

96. Chou W.C., Lin P.H., Yeh Y.C. et al. Genes involved in angiogenesis and mTOR pathways are frequently mutated in Asian patients with pancreatic neuroendocrine tumors. Int J Biol Sci. 2016;12:1523-1532.

97. Chou W.C., Lin P.H., Yeh Y.C. et al. Genes involved in angiogenesis and mTOR pathways are frequently mutated in Asian patients with pancreatic neuroendocrine tumors. Int J Biol Sci. 2016;12:1523-1532. https://doi.org/10.7150/ijbs.16233

98. Chu I.M., Hengst L., Slingerland J.M. The Cdk inhibitor p27 in human cancer: prognostic potential and relevance to anticancer therapy. Nat Rev Cancer. 2008;8:253-267.

99. Conemans E.B., Lodewijk L., Moelans C.M. et al. DNA methylation profiling in MEN1-related pancreatic neuroendocrine tumors reveals a potential

epigenetic target for treatment. Eur J Endo-crinol. 2018;179:153-160.

100. Corbo V, Dalai I, Scardoni M, et al. MEN1 in pancreatic endocrine tumors: analysis of gene and protein status in 169 sporadic neoplasms reveals alterations in the vast majority of cases. Endocr Relat Cancer. 2010;17: 771-783.

101. Cortes-Ciriano I., Lee S., Park W.Y. et al. A molecular portrait of microsatellite instability across multiple cancers. Nat Commun. 2017;8:15180. https://doi.org/10.1038/ncomms 15180

102. Cromer M.K., Choi M., Nelson-Williams C., Fonseca A.L., Kunstman J.W. et al. Neomorphic effects of recurrent somatic mutations in Yin Yang 1 in insulin-producing adenomas. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112(13):4062-7. doi: 10.1073/pnas.1503696112.

103. Crompton B.D. et al. The genomic landscape of pediatric Ewing sarcoma. Cancer Discov. 2014;4:1326-1341.

104. Cunningham J.T. et al. mTOR controls mitochondrial oxidative function through a YY1-PGC-1alpha transcriptional complex. Nature. 2007;450:736-740.

105. Cuperlovic-Culf M., Cormier K., Touaibia M. et al. HNMR metabolomics analysis of renal cell carcinoma cells: Effect of VHL inactivation on metabolism. Int J Cancer. 2016;138:2439-2349.

106. D'Arcy S., Davies O.R., Blundell T.L., Bolanos-Garcia V.M. Defining the molecular basis of BubR1 kinetochore interactions and APC/C-CDC20 inhibition. J Biol Chem. 2010;285:14764-14776. https://doi.org/10.1074/jbc.M109.082016

107. Dasari A., Shen C., Halperin D. et al. Trends in the incidence, prevalence, and survival outcomes in patients with neuroendocrine tumors in the United States. JAMA Oncol. 2017;3:1335-42.

108. de Wilde R.F., Edil B.H., Hruban R.H. et al. Well-differentiated pancreatic neuroendocrine tumors: from genetics to therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2012; 9(4):199-208.

109. Dejeux E., Olaso R., Dousset B., Audebourg A., Gut I.G., Terris B., Tost J. Hypermethylation of the IGF2 differentially methylated region 2 is a specific event in insulinomas leading to loss-of-imprinting and overexpression. Endocr Relat Cancer.

2009;16(3): 939-52. doi: 10.1677/ ERC-08-0331.

110. Delattre O. et al. Gene fusion with an ETS DNA-binding domain caused by chromosome translocation in human tumours. Nature. 1992;359:162-165.

111. Di Domenico A., Wiedmer T., Marinoni I. & Perren A. Genetic and epigenetic drivers of neuroendocrine tumours (NET). Endocr Relat Cancer. 2017;24 R315-R334.

112. Dorrell C. et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nat. Commun. 2016;7:11756.

113. Drane P., Ouararhni K., Depaux A. et al. The death-associated protein DAXX is a novel histone chaperone involved in the replication-independent deposition of H3.3. Genes Dev. 2010;24(12):1253-65.

114. Dreijerink K.M.A., Timmers H.T.M., Brown M. Twenty years of menin: emerging opportunities for restoration of transcriptional regulation in MEN1. Endocr. Relat. Cancer. 2017;24:T135-T145.

115. Duerr E.M., Chung D.C. Molecular genetics of neuroendocrine tumors. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2007;21(1):1-14. doi: 10.1016/j.beem.2006.12.001

116. Duerr E.M., Mizukami Y., Ng A. et al. Defining molecular classifications and targets in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors through DNA microarray analysis. Endocrine Relat Cancer. 2008;15: 243-256.

117. Duff S.E., Jeziorska M., Rosa D.D. et al. Vascular endothelial growth factors and receptors in colorectal cancer: Implications for anti-angiogenic therapy. Eur J Cancer. 2006;42:112-117. https://doi.org/10.1016Zj.ejca.2005.09.018

118. Dumanski J.P., Rasi C., Björklund P. et al. A MUTYH germline mutation is associated with small intestinal neuroendocrine tumors. Endocr Relat Cancer. 2017;24:427-443. https://doi.org/10.1530/ERC-17-0196

119. Elsasser S.J., Allis C.D., Lewis P.W. New epigenetic drivers of cancers. Science. 2011;331(6021): 1145-6.

120. Fagan R.J., Dingwall A.K. COMPASS Ascending: Emerging clues regarding the roles of MLL3/KMT2C and MLL2/KMT2D proteins in cancer. Cancer