Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Зайцева, Марина Алексеевна

• Зайцева, Марина Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зайцева, Марина Алексеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. «БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА G-КВАДРУПЛЕКСОВ» (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).

2.1 Введение.

2.2 G-квадруплексы.

2.3 Структура G-квадруплекса.

2.4 Биологическая значимость G-квадруплексов.

2.4.1 Взаимодействие с белками.

2.4.2 Роль G-квадруплексов в нерасшифрованных участках генома.

2.4.3 Теломеры и теломераза.

2.5. G-квадруплексные аптамеры.

2.5.1 Тромбиновый аптамер.

2.5.2 Биологическая активность тромбинового аптамера.

2.5.3 Методы повышения стабильности тромбинового аптамера.

2.5.3.1 Изменение состава квадруплексного мотива.

2.5.3.2. Добавление к структуре дополнительных элементов.

2.5.3.3. Модификация оснований, входящих в структуру.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Синтез олигонуклеотидов.

3.2 Синтез жирнокислотных производных олигонуклеотидов.

3.3 Конфокальная флуоресцентная микроскопия.

3.4 Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности живых клеток.

3.4.1 Проточная цитометрия.

3.4.2 Тест на выживание клеток.

3.4.3 Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности клеток Jurkat и макрофагов J774.

3.4.4 Жизнеспособность клеток в присутствии жирнокислотных производных.

3.5 Исследование физико-химических параметров олигонуклеотидов.

3.5.1 Измерение спектров поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма.

3.5.2 Метод поляризованной флуоресценции EtBr.

3.6 Исследование биологических свойств полученных олигонуклеотидов.

3.6.1 Нуклеазный гидролиз.

3.6.2 Влияние олигонуклеотидов на скорость свертываемости крови (определение тромбинового времени).

3.6.3 Исследование стабильности олигонуклеотидов в плазме крови.

3.7 МАЛДИмасс-спектрометрия олигонуклеотидов.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1 Оптимизация методов получения модифицированных олигонуклеотидов.

4.1.1 Жирнокислотные производные олигонуклеотидов.

4.1.1.1 Выбор структуры жирнокислотных конъюгатов олигонуклеотидов.

4.1.1.2 Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности живых клеток.

4.1.2. Олигонуклеотиды, несущие тиофосфорильные модификации заданной локализации.

4.1.2.1 Конструирование тиоаналогов ТВА.

4.1.2.2 Синтез модифицированных локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов.

4.2 Структурно-функциональные свойства тиоаналогов ТВА.

4.2.1 Стерическая организация олигомеров.

4.2.2 Термодинамические характеристики тиоаналогов ТВА.

4.2.3 Влияние локализации тиофосфорильных замен на стабильность олигомеров.

4.3 Биологические свойства олигонуклеотидов.

4.3.1 Влияние тиоаналогов ТВА на скорость свертываемости крови.

4.3.2 Исследование кинетики нуклеазного гидролиза ТВА и его тиоаналогов.

4.3.3 Исследование стабильности олигонуклеотидов в плазме крови.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов для разработки новых исследовательских и лекарственных средств»

Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов с заданными свойствами - одна из перспективных задач в области биоорганической химии. Создание новых модифицированных олигонуклеотидов необходимо для проведения молекулярно-биологических и медико-биологических фундаментальных исследований, для развития и совершенствования методов ДНК-диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, разработки новых высокоизбирательных лекарств. Изучение особенностей строения и синтеза модифицированных олигонуклеотидов - активно развивающаяся область науки. В настоящее время описан широкий круг производных ДНК, модифицированных по гетероциклическим основаниям, сахаро-фосфатному остову, несущих в своем составе метки и ненуклеотидные звенья [3, 4]. Особенностью настоящей работы является конструирование потенциально биосовместимых функциональных производных олигомеров с заданными свойствами, в частности, такими, как способность встраиваться в мембрану живой клетки, стабильность в плазме крови и др.

Согласно литературным данным, в ряде случаев дополнительные свойства олигонуклеотидам можно придавать введением в структуру молекулы концевых заместителей, например, меток или функциональны групп. В настоящей работе такой прием был использован для получения, в соответствии с известным методами, аминоалкильных и флуоресцентных олигомеров. Кроме того, были синтезированы новые, амфифильные производные олигомеров для создания универсального метода нековалентной фиксации олигонуклеотидов на внешней мембране живых клеток. Перспективность использования ДНК-мечения поверхности клеток для их направленной иммобилизации на твердом носителе была показана в работе [5]. Однако реализация этой идеи ограничена необходимостью использования небезопасных абиогенных интермедиатов и длительностью процедуры ДНК-модификации клеток. Поэтому для создания нового способа быстрой и безопасной для жизнеспособности клеток ассоциации ДНК с плазматической мембраной в настоящей работе были сконструированы и получены производные олигонуклеотидов, содержащие концевые остатки стеариновой и пальмитиновой кислот.

Выбор стратегии введения модификаций в состав олигомеров определяется на основе анализа структуры олигонуклеотидов. В области поиска эффективных ДНК-лекарств актуальной остается проблема быстрой биодеградации фосфодиэфирных фрагментов полинуклеотидов in vivo. Поэтому для антисмысловых олигомеров, действие которых основано на комплементарных взаимодействиях с полинуклеотидной мишенью, был предложен ряд эффективных решений, основанных на введении стабилизирующих модификаций сахаро-фосфатного остова олигомеров. Сегодня одним из наиболее изученных приемов является замена фосфодиэфирных межнуклеотидных связей на тиофосфорильные [6-8]. Такие тиоолигомеры, хотя и обладают заметной системной токсичностью [6, 7], однако уже применяются в современной медицине. При конструировании биологически активных олигомеров, функциональность которых опосредована их стерической организацией, важно учитывать, что введение модификаций может приводить к конформационным искажениям исходной структуры ДНК [9-13, 5]. Поэтому наиболее перспективными для дальнейшего применения в молекулярно-медицинских исследованиях свойствами обладают олигонуклеотиды, содержащие G-квадруплексы структуры ДНК, состоящие из сложенной вчетверо (вследствие взаимодействия четырех гуанинов), одной молекулы или четырех нитей различных молекул. Более 40% промоторов в человеческом геноме содержит по крайней мере один квадруплекс [14, 15]. G-богатые участки ДНК найдены в центромерах, в повторах синдрома Мартина-Белла (т.н. «синдром ломкой хромосомы») [16], в теломерах на концах линейных хромосом [17], участвуют в работе теломеразы [18]. Обнаружены G-квадруплексные биологически активные аптамеры (олигонуклеотиды, отобранные по сродству к молекулярным или иным мишеням), однако их применение in vivo тоже ограничено низкой устойчивостью к нуклеазному гидролизу. В настоящей работе для поиска структуры более стабильного функционального

G-квадруплексного олигомера была выбрана стратегия введения в его состав локальных тиофосфорильных связей. В работе был исследован ТВА

Thrombin binding aptamer -тромбинсвязывающий ДНК-аптамер состава

GGTTGGTGTGGTTGG) [19, 20]. Проведение системного анализа влияния 7 тиофосфорильных замен в составе ДНК G-квадруплексов на их конформацию и биологические свойства необходимо при создании новых эффективных лекарств нуклеотидной природы. В связи с этим, нами был проведен анализ термодинамических и биологических свойств тиогомологов ТВА, синтезированных с помощью разработанного нами метода, что позволило выявить ряд закономерностей и найти оптимальные структуры.

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы состоит в разработке методов конструирования потенциально биосовместимых модифицированных олигонуклеотидов с заданными свойствами на примере жирнокислотных конъюгатов олигомеров и локально тиофосфорилированных аналогов ДНК.

При выполнении данной работы решались следующие задачи:

- оптимизация методов синтеза и очистки жирнокислотных конъюгатов фрагментов ДНК, флуоресцентномеченых олигомеров, локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов, и олигомеров, содержащих концевые алифатические аминогруппы;

- разработка дизайна и наработка частичных тиоаналогов ТВА;

-сравнительное исследование ТВА и его тиоаналогов по физикохимическим (конформация, термодинамика и др.) и биологическим (антитромбиновые свойства и стабильность в плазме крови, кинетика нуклеазного гидролиза) параметрам.

Научная новизна и практическая значимость

Оптимизированы методы синтеза и очистки жирнокислотных конъюгатов фрагментов ДНК, флуоресцентномеченых, локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов, и олигомеров, содержащих концевые алифатические аминогруппы. Использование полученных модифицированных олигонуклеотидов стало основой для проведения таких работ, как исследование ДНК-комплексов с наночастицами никеля. Конъюгаты олигонуклеотидов с остатками стеариновой и пальмитиновой кислот, полученные в настоящей работе, использовались при разработке способа нековалентной иммобилизации фрагментов ДНК на поверхности живых клеток.

Для создания эффективных терапевтически значимых структур олигонуклеотидного типа впервые получен ряд аналогов ТВА, содержащих тиофосфорильные замены. Оценены антикоагуляционные свойства полученных аналогов ТВА, изучено влияние локальных тио-модификаций на их структурно-функциональные свойства, в том числе на стабильность в плазме крови и в отношении действия ДНК-нуклеаз. В результате исследования термодинамических параметров олигомеров получена зависимость устойчивости структуры от локализации тифосфорильной связи.

Обнаружено, что модификация в петлях стабилизирует конформацию, а в плоскостях G-квадруплекса снижает его стабильность. Найден перспективный модифицированный олигонуклеотид (LL11), структура которого изменена только в Т-Т-петлях. Он сохраняет антитромбиновые 9 свойства ТВА, и в то же время обладает большей устойчивостью к биодеградации.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Зайцева, Марина Алексеевна

5. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

1. Впервые разработан подход к конструированию производных фрагментов ДНК, способных самопроизвольно фиксироваться на внешней мембране клеток. ДНК-маркирование живых клеток продемонстрировано на примере синтезированных в работе пальмитиновых и стеариновых конъюгатов олигонуклеотидов.

2. Для поиска терапевтически значимых структур олигонуклеотидной природы впервые осуществлен синтез ряда тиоаналогов тромбинсвязывающего ДНК-аптамера (ТВА, состава GGTTGGTGTGGTTGG,), с различным количеством и локализацией межнуклеотидных тиофосфорильных связей (13 олигонуклеотидов).

3. Проведено сравнительное структурно-функциональное исследование ТВА и его тиоаналогов:

3.1 Показаны условия образования мономолекулярных структур тиоаналогов ТВА и установлена их конформация и стабильность.

3.2 Найдена зависимость между локализацией тиофосфорильных замен и термодинамической устойчивостью олигонуклеотидов.

3.3 На основе антикоагуляционных свойств и данных о кинетике нуклеазного гидролиза в плазме крови, полученных для наиболее термодинамически стабильных олигомеров (Satr, LL, LL11, L3), выявлен перспективный аналог тромбин-связывающего аптамера

80

LL11, имеющий тифосфорильные замены в малых петлях), сочетающий высокую антикоагуляционную активность с большей в сравнении с ТВА устойчивостью к биодеградации. Благодарности

Приношу благодарность за помощь, сотрудничество, консультации, научные дискуссии коллективу лаборатории искусственного антителогенеза, ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА, а также коллективу лабораторий института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зайцева, Марина Алексеевна, 2010 год

1. Jayapal P., Mayer G., Heckel A., Wennmohs F. Structure-activity relationshipsof a caged thrombin binding DNA aptamer: insight gained from molecular dynamics simulation studies. // J Struct Biol. 2009. V. 166, №3, P. 241-250.

2. Huppert J.L. Hunting G-quadruplexes. // Biochimie. 2008. V. 90, №8, P. 11401148.

3. Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. // Eur J Biochem. 2003. V. 270, №8, P. 1628-1644.

4. Sacca В., Lacroix L., Mergny J.L. The effect of chemical modifications on the thermal stability of different G-quadruplex-forming oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33, №4, P. 1182-1192.

5. Chandra R.A., Douglas E.S., Mathies R.A., Bertozzi C.R., Francis M.B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. // Angew Chem Int Ed Engl. 2006. V. 45, №6, P. 896-901.

6. Han S., Mahato R.I., Sung Y.K., Kim S.W. Development of biomaterials for gene therapy. // Mol Ther. 2000. V. 2, №4, P. 302-317.

7. Dias N., Stein C.A. Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. // Mol Cancer Ther. 2002. V. 1, №5, P. 347-355.

8. Herbert B.S., Pongracz K., Shay J.W., Gryaznov S.M. Oligonucleotide N3'-->P5' phosphoramidates as efficient telomerase inhibitors. // Oncogene. 2002. V. 21, №4, P. 638-642.

9. Smirnov I., Shafer R.H. Effect of loop sequence and size on DNA aptamer stability. // Biochemistry. 2000. V. 39, №6, P. 1462-1468.

10. Meyers L.A., Lee J.F., Cowperthwaite M., Ellington A.D. The robustness of naturally and artificially selected nucleic acid secondary structures. // J Mol Evol. 2004. V. 58, №6, P. 681-691.

11. Huppert J.L., Balasubramanian S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33, №9, P. 2908-2916.

12. Todd A.K., Haider S.M., Parkinson G.N., Neidle S. Sequence occurrence and structural uniqueness of a G-quadruplex in the human c-kit promoter. // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35, №17, P. 5799-5808.

13. Usdin K. NGG-triplet repeats form similar intrastrand structures: implications for the triplet expansion diseases. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26, №17, P. 4078-4085.

14. Wright W.E., Tesmer V.M., Huffman K.E., Levene S.D., Shay J.W. Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. // Genes Dev. 1997. V. 11, №21, P. 2801-2809.

15. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., de Lange T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. // Cell. 1999. V. 97, №4, P. 503-514.

16. Padmanabhan К., Tulinsky A. An ambiguous structure of a DNA 15-mer thrombin complex. // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1996. V. 52, № 2, P. 272-282.

17. Gusfield D.: Algorithms on Strings, Trees, and Sequences: Computer Science and Computational Biology: Cambridge University Press; 1997.

18. Kypr J., Kejnovska I., Renciuk D., Vorlickova M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37, №6, P. 1713-1725.

19. Gellert M., Lipsett M.N., Davies D.R. Helix formation by guanylic acid. // Proc Natl Acad SciUS A. 1962. V. 48, P. 2013-2018.

20. Sen D., Gilbert W. Formation of parallel four-stranded complexes by guanine-rich motifs in DNA and its implications for meiosis. // Nature. 1988. V. 334, №6180, P. 364-366.

21. Sundquist W.I., Klug A. Telomeric DNA dimerizes by formation of guanine tetrads between hairpin loops. //Nature. 1989. V. 342, №6251, P. 825-829.

22. Rawal P., Kummarasetti V.B., Ravindran J., Kumar N., Haider K., Sharma R., Mukerji M., Das S.K., Chowdhury S. Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: role in Escherichia coli global regulation. // Genome Res. 2006. V. 16, №5, P. 644-655.

23. Hershman S.G., Chen Q., Lee J.Y., Kozak M.L., Yue P., Wang L.S., Johnson F.B. Genomic distribution and functional analyses of potential G-quadrupIexforming sequences in Saccharomyces cerevisiae. // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36, №1, P. 144-156.

24. Schaffitzel C., Berger I., Postberg J., Hanes J., Lipps H.J., Pluckthun A. In vitro generated antibodies specific for telomeric guanine-quadruplex DNA react with Stylonychia lemnae macronuclei. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98, №15, P. 8572-8577.

25. Paeschke K., Simonsson Т., Postberg J., Rhodes D., Lipps HJ. Telomere end-binding proteins control the formation of G-quadruplex DNA structures in vivo. // Nat Struct Mol Biol. 2005. V. 12, №10, P. 847-854.

26. Blackburn E.H. Structure and function of telomeres. // Nature. 1991. V. 350, №6319, P. 569-573.

27. Wellinger R.J., Wolf A.J., Zakian V.A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. // Cell. 1993. V. 72, №1, P. 51-60.

28. Cech T.R. Life at the End of the Chromosome: Telomeres and Telomerase. // Angew Chem Int Ed Engl. 2000. V. 39, №1, P. 34-43.

29. Zhao Y., Du Z., Li N. Extensive selection for the enrichment of G4 DNA motifs in transcriptional regulatory regions of warm blooded animals. // FEBS Lett. 2007. V. 581, №10, P. 1951-1956.

30. Lipps H.J., Rhodes D. G-quadruplex structures: in vivo evidence and function. // Trends Cell Biol. 2009. V. 19, №8, P. 414-422.

31. Yadav V.K., Abraham J.K., Mani P., Kulshrestha R., Chowdhury S. QuadBase: genome-wide database of G4 DNA—occurrence and conservation inhuman, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes. // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36, P. 381-385.

32. Todd A.K., Johnston M., Neidle S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33, №9, P. 29012907.

33. Huppert J.L., Balasubramanian S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35, №2, P. 406-413.

34. Maizels N. Dynamic roles for G4 DNA in the biology of eukaryotic cells. // Nat Struct Mol Biol. 2006. V. 13, №12, P. 1055-1059.

35. Huppert J.L., Bugaut A., Kumari S., Balasubramanian S. G-quadruplexes: the beginning and end of UTRs. // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36, №19, P. 62606268.

36. Johnson J.E., Smith J.S., Kozak M.L., Johnson F.B. In vivo Veritas: using yeast to probe the biological functions of G-quadruplexes. // Biochimie. 2008. V. 90, №8, P. 1250-1263.

37. Fry M., Loeb L.A. Human werner syndrome DNA helicase unwinds tetrahelical structures of the fragile X syndrome repeat sequence d(CGG)n. // J Biol Chem. 1999. V. 274, №18, P. 12797-12802.

38. Saha Т., Usdin K. Tetraplex formation by the progressive myoclonus epilepsy type-1 repeat: implications for instability in the repeat expansion diseases. // FEBS Lett. 2001. V. 491, №3, P. 184-187.

39. Cogoi S., Quadrifoglio F., Xodo L.E. G-rich oligonucleotide inhibits the binding of a nuclear protein to the Ki-ras promoter and strongly reduces cell growth in human carcinoma pancreatic cells. // Biochemistry. 2004. V. 43, №9, P. 2512-2523.

40. Christiansen J., Kofod M., Nielsen F.C. A guanosine quadruplex and two stable hairpins flank a major cleavage site in insulin-like growth factor II mRNA. //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22, №25, P. 5709-5716.

41. Guschlbauer W., Chantot J.F., Thiele D. Four-stranded nucleic acid structures 25 years later: from guanosine gels to telomer DNA. // J Biomol Struct Dyn. 1990. V. 8, №3, P. 491-511.

42. Simonsson T. G-quadruplex DNA structures—variations on a theme. // Biol Chem. 2001. V. 382, №4, P. 621-628.

43. Webba da Silva M. NMR methods for studying quadruplex nucleic acids. // Methods. 2007. V. 43, №4, P. 264-277.

44. Campbell N.H., Parkinson G.N. Crystallographic studies of quadruplex nucleic acids. // Methods. 2007. V. 43, №4, P. 252-263.

45. Neaves K.J., Huppert J.L., Henderson R.M., Edwardson J.M. Direct visualization of G-quadruplexes in DNA using atomic force microscopy. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37, №18, P. 6269-6275.

46. Nakken S., Rognes Т., Hovig E. The disruptive positions in human G-quadruplex motifs are less polymorphic and more conserved than their neutral counterparts. //Nucleic Acids Res. 2009. V. 37, №17, P. 5749-5756.

47. Mirkin S.M. Discovery of alternative DNA structures: a heroic decade (19791989). // Front Biosci. 2008. V. 13, P. 1064-1071.

48. Parkinson G.N., Lee M.P., Neidle S. Crystal structure of parallel quadruplexes from human telomeric DNA. // Nature. 2002. V. 417, №6891, P. 876-880.

49. Wang Y., Patel D.J. Solution structure of the human telomeric repeat dAG3(T2AG3)3. G-tetraplex. // Structure. 1993. V. 1, №4, P. 263-282.

50. Balagurumoorthy P., Brahmachari S.K. Structure and stability of human telomeric sequence. // J Biol Chem. 1994. V. 269, №34, P. 21858-21869.

51. Fry M. Tetraplex DNA and its interacting proteins. // Front Biosci. 2007. V. 12, P. 4336-4351.

52. Kerwin S.M. G-Quadruplex DNA as a target for drug design. // Curr Pharm Des. 2000. V. 6, №4, P. 441-478.

53. Dapic V., Abdomerovic V., Marrington R., Peberdy J., Rodger A., Trent J.O., Bates PJ. Biophysical and biological properties of quadruplex oligodeoxyribonucleotides. //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31, №8, P. 2097-2107.

54. Larson E.D., Duquette M.L., Cummings W.J., Streiff R.J., Maizels N. MutSalpha binds to and promotes synapsis of transcriptionally activated immunoglobulin switch regions. // Curr Biol. 2005. V. 15, №5, P. 470-474.

55. Liu Z., Lee A., Gilbert W. Gene disruption of a G4-DNA-dependent nuclease in yeast leads to cellular senescence and telomere shortening. // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V. 92, №13, P. 6002-6006.

56. Sun H., Karow J.K., Hickson I.D., Maizels N. The Bloom's syndrome helicase unwinds G4 DNA. // J Biol Chem. 1998. V. 273, №42, P. 27587-27592.

57. Lin Y.C., Shih J.W., Hsu C.L., Lin J.J. Binding and partial denaturing of G-quartet DNA by Cdcl3p of Saccharomyces cerevisiae. // J Biol Chem. 2001. V. 276, №50, P. 47671-47674.

58. Gottschling D.E., Zakian V.A. Telomere proteins: specific recognition and protection of the natural termini of Oxytricha macronuclear DNA. // Cell. 1986. V. 47, №2, P. 195-205.

59. Gray J.T., Celander D.W., Price C.M., Cech T.R. Cloning and expression of genes for the Oxytricha telomere-binding protein: specific subunit interactions in the telomeric complex. // Cell. 1991. V. 67, №4, P. 807-814.

60. De Armond R., Wood S., Sun D., Hurley L.H., Ebbinghaus S.W. Evidence for the presence of a guanine quadruplex forming region within a polypurine tract of the hypoxia inducible factor 1 alpha promoter. // Biochemistry. 2005. V. 44, №49, P. 16341-16350.

61. Marcu K.B., Bossone S.A., Patel A.J. myc function and regulation. // Annu Rev Biochem. 1992. V. 61, P. 809-860.

62. Simonsson Т., Pecinka P., Kubista M. DNA tetraplex formation in the control region of c-myc. //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26, №5, P. 1167-1172.

63. Siddiqui-Jain A., Grand C.L., Bearss D.J., Hurley L.H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule torepress c-MYC transcription. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99, N218, P. 11593-11598.

64. Kumari S., Bugaut A., Huppert J.L., Balasubramanian S. An RNA G-quadruplex in the 5' UTR of the NRAS proto-oncogene modulates translation. // Nat Chem Biol. 2007. V. 3, №4, P. 218-221.

65. Богданов А. Теломеры и теломераза. // Соросовский Образовательный журнал. 1998. Т. 12, С. 12-18.

66. Egan С.А., Savre-Train I., Shay J.W., Wilson S.E., Bourne W.M. Analysis of telomere lengths in human corneal endothelial cells from donors of different ages. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998. V. 39, №3, P. 648-653.

67. Olovnikov A.M. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. // J Theor Biol. 1973. V. 41, №1, P. 181-190.

68. Greider C.W., Blackburn E.H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. // Cell. 1985. V. 43, №2 Pt 1, P. 405413.

69. Блэкберн E. Теломера и теломераза: нуклеопротеидные комплексы, участвующие в гомеостатической системе поддержания постоянной длины теломер. // Биохимия,. 1997. Т. 62, №11, С. 1400-1406.

70. Shore D. The means to bind the ends. // Nat Struct Biol. 1996. V. 3, №6, P. 491-493.81. van Steensel В., de Lange T. Control of telomere length by the human telomeric proteinTRF1. //Nature. 1997. V. 385, №6618, P. 740-743.

71. Krauskopf A., Blackburn E.H. Rapl protein regulates telomere turnover in yeast. // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V. 95, №21, P. 12486-12491.

72. McEachern M.J., Blackburn E.H. Runaway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. // Nature. 1995. V. 376, №6539, P. 403-409.

73. Krauskopf A., Blackburn E.H. Control of telomere growth by interactions of RAP1 with the most distal telomeric repeats. // Nature. 1996. V. 383, №6598, P. 354-357.

74. Lee H.W., Blasco M.A., Gottlieb G.J., Horner J.W., 2nd, Greider C.W., DePinho R.A. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. // Nature. 1998. V. 392, №6676, P. 569-574.

75. Simonsson T. A substrate for telomerase. // Trends Biochem Sci. 2003. V. 28, №12, P. 632-638.

76. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. // Nature. 1990. V. 346, №6287, P. 818-822.

77. Tuerk С., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. // Science. 1990. V. 249, №4968, P. 505-510.

78. Pendergrast P.S., Marsh H.N., Grate D., Healy J.M., Stanton M. Nucleic acid aptamers for target validation and therapeutic applications. // J Biomol Tech. 2005. V. 16, №3, P. 224-234.

79. Mazumder A., Neamati N., Ojwang J.O., Sunder S., Rando R.F., Pommier Y. Inhibition of the human immunodeficiency virus type 1 integrase by guanosine quartet structures. //Biochemistry. 1996. V. 35, №43, P. 13762-13771.

80. Cherepanov P., Este J.A., Rando R.F., Ojwang J.O., Reekmans G., Steinfeld R., David G., De Clercq E., Debyser Z. Mode of interaction of G-quartets with the integrase of human immunodeficiency virus type 1. // Mol Pharmacol. 1997. V. 52, №5, P. 771-780.

81. Bless N.M., Smith D., Charlton J., Czermak B.J., Schmal H., Friedl H.P., Ward P.A. Protective effects of an aptamer inhibitor of neutrophil elastase in lung inflammatory injury. // Curr Biol. 1997. V. 7, №11, P. 877-880.

82. Konopka K., Duzgunes N., Rossi J., Lee N.S. Receptor ligand-facilitated cationic liposome delivery of anti-HTV-1 Rev-binding aptamer and ribozyme DNAs. // J Drug Target. 1998. V. 5, №4, P. 247-259.

83. Lin Y., Jayasena S.D. Inhibition of multiple thermostable DNA polymerases by a heterodimeric aptamer. // J Mol Biol. 1997. V. 271, №1, P. 100-111.

84. Gatto В., Palumbo M., Sissi С. Nucleic acid aptamers based on the G-quadruplex structure: therapeutic and diagnostic potential. // Curr Med Chem. 2009. V. 16, №10, P. 1248-1265.

85. Davie E.W., Fujikawa K., Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. // Biochemistry. 1991. V. 30, №43, P. 10363-10370.

86. Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. // Nature. 1992. V. 355, №6360, P. 564-566.

87. Macaya R.F., Schultze P., Smith F.W., Roe J.A., Feigon J. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution. // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V. 90, №8, P. 3745-3749.

88. Huntington J.A. Molecular recognition mechanisms of thrombin. // J Thromb Haemost. 2005. V. 3, №8, P. 1861-1872.

89. Fenton J.W., 2nd. Thrombin specificity. //AnnNY Acad Sci. 1981. V. 370, P. 468-495.

90. Fenton J.W., 2nd, Olson T.A., Zabinski M.P., Wilner G.D. Anion-binding exosite of human alpha-thrombin and fibrin(ogen) recognition. // Biochemistry. 1988. V. 27, №18, P. 7106-7112.

91. Wu Q., Tsiang M., Sadler J.E. Localization of the single-stranded DNA binding site in the thrombin anion-binding exosite. // J Biol Chem. 1992. V. 267, №34, P. 24408-24412.

92. Padmanabhan K., Padmanabhan K.P., Ferrara J.D., Sadler J.E., Tulinsky A. The structure of alpha-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer. // J Biol Chem. 1993. V. 268, №24, P. 17651-17654.

93. Tasset D.M., Kubik M.F., Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. // J Mol Biol. 1997. V. 272, №5, P. 688-698.

94. Martino L., Virno A., Randazzo A., Virgilio A., Esposito V., Giancola C., Bucci M., Cirino G., Mayol L. A new modified thrombin binding aptamer containing a 5'-5' inversion of polarity site. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34, №22, P. 6653-6662.

95. DeAnda A., Jr., Coutre S.E., Moon M.R., Vial C.M., Griffin L.C., Law V.S., Komeda M., Leung L.L., Miller D.C. Pilot study of the efficacy of a thrombin inhibitor for use during cardiopulmonary bypass. // Ann Thorac Surg. 1994. V. 58, №2, P. 344-350.

96. Li W.X., Kaplan A.V., Grant G.W., Toole J J., Leung L.L. A novel nucleotide-based thrombin inhibitor inhibits clot-bound thrombin and reduces arterial platelet thrombus formation. // Blood. 1994. V. 83, №3, P. 677-682.

97. Peng C.G., Damha M.J. G-quadruplex induced stabilization by 2'-deoxy-2'-fluoro-D-arabinonucleic acids (2'F-ANA). // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35, №15, P. 4977-4988.

98. Keniry M.A., Owen E.A., Shafer R.H. The contribution of thymine-thymine interactions to the stability of folded dimeric quadruplexes. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25, №21, P. 4389-4392.

99. Решетников Р., Головин А., Спиридонова В., Копылов А.д.с. Модульное конструирование аптамеров методами суперкомпьютерных вычислений. // Сб тез секц докл Роснано 2008.

100. Добровольский А.Б., Титаева Е.В., Хаспекова С.Г., Спиридонова В.А., Копылов A.M., Мазуров А.В. Ингибирование активности тромбина ДНК-аптамерами. // Бюлл эксперим биол и мед. 2009. Т. 148, №7, С. 41-45.

101. Eckstein F. Nucleoside phosphorothioates. // Annu Rev Biochem. 1985. V. 54, P. 367-402.

102. Stein C., Cohen J. Physicochemical properties of phospborothioate oligodeoxynucleotides. // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16, № 8, P. 3209 3221.

103. Yaswen P., Stampfer M.R., Ghosh K., Cohen J.S. Effects of sequence of thioated oligonucleotides on cultured human mammary epithelial cells. // Antisense Res Dev. 1993. V. 3, №1, P. 67-77.

104. Dean F.B., Nelson J.R., Giesler T.L., Lasken R.S. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification. // Genome Res. 2001. V. 11, №6, P. 1095-1099.

105. Di Giusto D., King G.C. Single base extension (SBE) with proofreading polymerases and phosphorothioate primers: improved fidelity in single-substrate assays. //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31, №3, P. e7.

106. Лактионов П.П., Брыксин A.B., Рыкова Е.Ю., Амирханов Н.В., Власов В.В. Исследование фармокинетики и стабильности в крови in vivoфосфодиэфирных и модифицированных производных олигонуклеотидов. // Вопросы медицинской химии. 1999. Т. 45, №3, С. 170-177.

107. Marky L.A., Breslauer K.J. Calculating thermodynamic data for transitions of any molecularity from equilibrium melting curves. // Biopolymers. 1987. V. 26, №9, P. 1601-1620.

108. Zarytova V.F., Ivanova E.M., Chasovskikh M.N. Synthesis of steroid-containing oligonucleotides and their alkylating derivatives. // Bioorg Khim. 1990. V. 16, №5, P. 610-616.

109. Yoshina-Ishii C.5 Boxer S.G. Arrays of mobile tethered vesicles on supported lipid bilayers. // J Am Chem Soc. 2003. V. 125, №13, P. 3696-3697.

110. Yoshina-Ishii C., Miller G.P., Kraft M.L., Kool E.T., Boxer S.G. General method for modification of liposomes for encoded assembly on supported bilayers. //J Am Chem Soc. 2005. V. 127, №5, P. 1356-1357.

111. Mishra R.K., Moreau C., Ramazeilles C., Moreau S., Bonnet J., Toulme J.J. Improved leishmanicidal effect of phosphorotioate antisense oligonucleotides by LDL-mediated delivery. // Biochim Biophys Acta. 1995. V. 1264, №2, P. 229237.

112. Dean D.A. Peptide nucleic acids: versatile tools for gene therapy strategies. // Adv Drug Deliv Rev. 2000. V. 44, №2-3, P. 81-95.

113. Анцыпович И. Пептидно-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. // Успехи химии.2002. Т. 71, №1, С. 81-96.

114. Кнорре Д.Г., Власов В.В. Клеточные мембраны как барьер при биологических применениях антисмысловых олигонуклеотидов, их производных и аналогов. //Биоорг химия. 1992. Т. 18, №10-11, С. 1330-1340.

115. Ikebukuro К., Okumura Y., Sumikura К., Karube I. A novel method of screening thrombin-inhibiting DNA aptamers using an evolution-mimicking algorithm. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33, №12, P. el08.