Наноформы бактерий в некоторых почвах России тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Конова, Ирина Александровна

• Конова, Ирина Александровна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Конова, Ирина Александровна

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. История открытия и исследования наноформ бактерий

1.2. Методы выделения наноформ бактерий

1.3 Особенности морфологии, физиологии и биохимии наноформ бактерий

1.4 Таксономическая принадлежность наиболее изученных наноформ

бактерий

1.5. Наноформы бактерий в биосфере и их экологическая роль

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Численность, потенциальная жизнеспособность и таксономическое разнообразие наноформ бактерий в природных

почвах

Глава 4. Численность и потенциальная жизнеспособность

наноформ бактерий в городских почвах

Глава 5. Численность, потенциальная жизнеспособность и таксономическое разнообразие наноформ бактерий в почвенных

новообразованиях

Глава 6. Изучение морфологии наноформ бактерий при помощи

электронной микроскопии

Заключение

ВЫВОДЫ

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Наноформы бактерий в некоторых почвах России»

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время в связи с развитием электронно-микроскопических и молекулярно-биологических методов исследования стало ясно, что мелкие бактерии с размером клеток около 200—300 нм, описываемые терминами «ультрамикробактерии», «нанобактерии», «наноформы», «фильтрующиеся формы», «ультрамикроклетки», широко распространены в природных средах, гораздо шире, чем это представляется с первого взгляда (Дуда и др., 2007, 2012; Дмитриев и др., 2008; Panikov, 2005).

Впервые микроскопические живые объекты размером менее 300 нм, выделенные из морской воды, описал микробиолог Р. Морита в 1981 г, под названием «ультрамикробактерии», или «наннобактерии». Современное понятие о нанобактериях ввел в научный оборот Р. Фолк, обнаруживший в 1988 г. в итальянских травертинах округлые и овальные тельца размером менее 200 мкм. Фолк полагал, что эти образования представляют собой доселе неизвестную форму жизни, и высказал мнение, что они участвуют в процессах образования вторичных минералов (Folk, 1996; 1999). В конце 90х гг. прошлого века группа финских микробиологов под руководством Олави Каяндера сообщила об обнаружении в организме человека живых размножающихся микрообъектов размером около 200 нм (Kajander, Ciftcioglu, 1998).

В нашей стране один из первых обзоров о «невидимых формах видимых бактерий» был дан Д.М. Новогрудским (1933 г.). С развитием

электронно-микроскопических методов интерес к наноформам бактерий возрос, и было показано, что клетки в почвах имеют меньшие размеры, чем на лабораторных питательных средах; примерно 40% почвенных бактерий в природе имеют размеры, лежащие за пределами видимости светового микроскопа (Ананьева, Никитин, 1979).

Проблема выделения и исследования наноформ бактерий (ультрамикробактерий) привлекла особо пристальное внимание исследователей в последнее время связи с возросшим интересом к развитию нанотехнологий. Высказывается предположение, что наноформы бактерий могут рассматриваться как составная часть «скрытого» разнообразия почвенных бактерий, функции которых в биосфере практически не исследованы и которые могут играть значительную роль в процессах, происходящих в почвах (Чернов и др., 2012).

Предположение об участии микроорганизмов в формировании железомарганцевых конкреций (микробиологическая концепция) высказывалось еще в прошлом веке (Перфильев, Габе, 1961; Аристовская, 1965). Однако, несмотря на имеющиеся в литературе сведения, участие микроорганизмов в процессах образования почвенных конкреций изучено явно недостаточно. Вне поля зрения ученых остается изучение наноформ бактерий в почвенных конкрециях.

Под наноформами бактерий мы понимали бактериальные клетки, прошедшие через фильтр с размером пор 200 нм, при этом их форма и таксономическая принадлежность не играют роли.

Целью данной работы была оценка численности, изучение потенциальной жизнеспособности, таксономического состава и морфологии наноформ бактерий в некоторых почвах России и отдельных почвенных локусах для получения представления об их роли в почве.

Задачи исследования:

1. определение численности наноформ бактерий в различных природных и городских почвах и почвенных железо-марганцевых и карбонатных новообразованиях методом люминесцентной микроскопии (окраска акридином оранжевым и L7012 (LIVE/DEAD));

2. определение потенциальной жизнеспособности наноформ бактерий в почвах и почвенных железо-марганцевых и карбонатных новообразованиях;

3. исследование таксономического разнообразия наноформ бактерий на уровне филумов с помощью метода FISH (fluorescence in situ hybridization);

4. изучение морфологического разнообразия наноформ методами сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии.

Научная новизна. Впервые установлено, что численность наноформ бактерий в образцах различных природных почв велика и составляет от десятков до сотен миллионов клеток в 1 г почвы, при этом в городских загрязненных почвах доля наноформ бактерий выше, чем в природных ненарушенных почвах. Впервые показано, что в почвенных новообразованиях (железо-марганцевые конкреции и карбонатные новообразования) значительная часть бактерий представлена наноформами бактерий. При помощи метода FISH среди наноформ бактерий были обнаружены представители основных доменов прокариот: Archaea и Bacteria (филумы Actinobacteria, Proteobacteria, Acidobacteria и Planctomycetes). Впервые в образцах почвенных конкреций были обнаружены представители малоизученных филумов Acidobacteria и Planctomycetes. Электронно-микроскопические исследования продемонстрировали большое морфологическое разнообразие клеток наноформ бактерий в почвах и конкрециях.

Практическая значимость. Проведенные исследования позволяют предположить, что именно наноформы бактерий служат тем «пулом» бактерий, который обеспечивает сохранение биоразнообразия почвенных бактерий в неблагоприятных условиях, способных переходить в активное состояние при изменении условий в сторону, благоприятную для развития этих бактерий. Наноформы бактерий являются перспективным компонентом

для создания бактериальных удобрений, поскольку их высокая потенциальная жизнеспособность обеспечивает высокую устойчивость при хранении. Высокую доля и значительная жизнеспособность наноформ бактерий, в том числе грамотрицательных, среди которых много патогенных форм, в городских почвах необходимо принимать во внимание при проведении санитарно-эпидемиологических исследований.

Результаты проведенных исследований используются при чтении лекций по курсам «Общая экология» и «Экология бактерий» для студентов факультета почвоведения МГУ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: XV Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), Международный научно-технический конгресс ЕЬР1Т-2011 (Тольятти, 2011), XVI Международная экологическая студенческая конференция «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2011), Международная конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, 2013).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 13 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных работ.

Объем и структура работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, изложение результатов экспериментов и их обсуждение, выводы и список упоминаемых в тексте литературных источников. Работа изложена на 119 страницах текста, иллюстрирована 19 рисунками, содержит 11 таблиц. Список литературы состоит из 110 наименований, из них 59 на иностранном языке. Работа выполнена при финансовой поддержке проектов: ГК № 02.740.11.0283, НШ-2227.2008.4.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. История открытия и исследования наноформ бактерий.

Подавляющее большинство бактерий, изучаемых и используемых микробиологией, имеет линейные размеры примерно 2-5 мкм и диаметр 0,61,0 мкм. В почвах же средние размеры бактериальных клеток меньше: биометрический анализ, проведенный микроскопическими методами, показал, что средний диаметр клеток составляет 0,8 мкм, длина - 1,4 мкм (Гузев, Звягинцев, 2003; Гузев, Вызов, 2006). Мелкие бактериальные формы, диаметром менее 0,2-0,3 мкм, исследованы значительно меньше. Развитие современных методов: применение ядерных мембранных фильтров, флуоресцентного микроскопа, просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии для исследования почвенных препаратов и ультратонких срезов бактерий, внедрение молекулярно-биологических методов, позволило по-иному взглянуть на мельчайших представителей мира прокариот.

Мельчайшие формы у представителей рода АгоШЬа^ег впервые были обнаружены Денисом и Смитом в 1916 г. Позже Д.М. Новогрудский показал наличие фильтрующихся форм AzotoЪacteт в чистой культуре, при этом отмечалось, что «невидимые формы» прорастают гораздо медленнее, чем исходные культуры. В дальнейшем Д.М. Новогрудский показал, что и в почве имеются фильтрующиеся формы азотобактера, сильно адсорбированные на почвенных частицах (Новогрудский, 1933, 1956).

H.A. Красильников наблюдал образование ультрамикроформ (регенеративные тельца) в гигантских клетках Azotobacter croococcum на сусло-агаре и в МПБ (Красильников, 1954). Образование таких телец, по его мнению, следует рассматривать как биологический процесс, направленный на выживание и сохранение вида.

В ЗОх годах XX века были получены фильтрующиеся формы бактерий рода Rhizobium (Almon, Baldwin, 1933, цит. по Мишустина, Калюжная, 1987). Образование фильтрующихся форм клубеньковых бактерий проходит через потерю клеточной стенки и образование протопластов (бактероидов), как у некоторых патогенных и близких им форм при L-трансформации. Было показано, что образование фильтрующихся форм клубеньковых бактерий непосредственно связано с таким важным их свойством, как инфекционность (Мишустина, Калюжная, 1987).

В 1996 году наноформы бактерий обратили на себя особое внимание общественности и прессы, когда учёные объявили о находке ископаемых организмов (окаменелостей) в марсианском метеорите. Это событие вызвало предположение о том, что на Марсе некогда существовали, а может, существуют и сейчас примитивные формы жизни (Golden et al., 1997; Folk, Taylor, 2002; Багатурова, 2005).

С 1988 года исследованием нанобактерий активно занялись медицинские микробиологи. Группа финских исследователей опубликовала материалы, в которых сообщалось, что им удалось выделить и

культивировать in vitro нанобактерии из почечных камней. Сообщалось об успешном выделении и анализе ДНК. Эти же авторы впервые возложили на нанобактерии ответственность за процессы патологической кальцификации в человеческом организме (Kajander et ah, 1997).

Вместе с тем, судя по микробиологической литературе, интерес к жизнеспособным мелким формам появился ранее, возрастая периодически в связи с теми или иными важными для медицины открытиями: в конце 1920-х годов при описании формирования наноклеток внутри туберкулезной палочки. В 1930-1950-хгодах при обнаружении образования «элементарных тел» в результате обработки бактерий антибиотиками, затем при обсуждении механизма переноса инфекционных заболеваний соответствующими фильтрующимися формами (Вайнштейн, Сузина, Абашина, 2007).

У микоплазм феномен нанотрансформации был описан в ходе опытов с культурой Acholeplasma laidlawii, т. н. «вездесущей» микоплазмы, обнаруживаемой в почве, компосте, сточных водах, клеточных культурах, тканях человека, животных и растений (Чернов и др., 2004, 2005). В ходе эксперимента клетки Acholeplasma laidlawii подвергались различным стрессам, после чего в культуре обнаруживались наноформы клеток размером менее 200 нм. Позже этой же группой исследователей была выявлена способность к нанотрансформации у другой микоплазмы — Mycoplasma gallisepticum (Чернов и др., 2008). Клетки этого микроорганизма, выращенные в условиях ограничения по субстрату, характеризовались

малыми размерами (150-200 нм), причем при отмене неблагоприятных условий клетки ревертировали, превращаясь в вегетативные формы М ЗаШяерИсит обычного размера.

Известно, что бактерии в почве имеют гораздо меньшие размеры, чем на питательных средах (Никитин, 1964; Ананьева, Никитин, 1979; Гузев, Звягинцев, 2003; Гузев, Вызов, 2006). Однако к данным о размерах бактериальных клеток, полученным с использованием флуоресцентного и электронного микроскопа, следует относиться с большой осторожностью, поскольку они не дают точного представления о величине объекта. Считается, что размеры клеток в сканирующем электронном микроскопе завышены вследствие напыления металла. При наблюдении клеток бактерий под люминесцентным микроскопом размер клеток занижен, поскольку светится, в основном, нуклеоид клетки (Гузев, Звягинцев, 2003).

Изучение бактерий, обитающих в вечномерзлых грунтах, методом дифференциального центрифугирования с последующим получением срезов клеток сконцентрированной биомассы, свидетельствует о малом размере клеток бактерий, обитающих в этом биотопе (ОШсЫпБку а1., 1993; Бота е1 а1., 1994; 1995, 2004; Дмитриев и др., 2001). Так, доля ультрамелких клеток, обнаруженных в образцах почв и мерзлых грунтов Арктики и Антарктики была довольно значительной и составляла более половины от числа всех выявляемых клеток. Малые размеры клеток рассматриваются авторами

публикаций как один из возможных механизмов, предотвращающих механические повреждения бактерий кристаллами льда.

Позже в печати появилось сообщение об открытии нового царства архей, обитающих при высокой температуре в анаэробных условиях и представляющих собой мини-клетки, способные к росту только в кокультуре с хемолитотрофным кренархеотным организмом рода ^тсоссш. Игникоккус и его симбионт выделены из Срединно-Атлантического хребта на глубине около 160 м. К настоящему времени новое царство, названное 1Яапоагскаео1а, имеет только один род — Иапоагскаеит с одним видом N. едиИат (НиЬег а1., 2003, 2006).

Изучению наноформ бактерий, обитающих в морях и внутриконтинентальных водоемах, посвящены работы многих исследователей (Оюуаппоги ег а1., 1990; 8сЬШ е1 а1., 1993).

После обнаружения нанобактерий в организме человека, появились публикации, согласно которым нанобактерии ответственны за широкий спектр заболеваний: от простатита до рака (Рашкоу, 2005), однако четкие доказательства этой теории отсутствуют.

Так как было констатировано широкое распространение нанобактерий в различных средах обитания, некоторые ученые (\Vickramasinghe, \У1скгата8т§11е, 2006) считают, что это может быть ключом к разгадке начала жизни на Земле. Во всех моделях панспермии высушенные бактериальные клетки и бактериальные споры считаются основными

агентами. Нанобактерии по организации еще проще, они устойчивы ко многим неблагоприятным воздействиям, в том числе к ионизирующей радиации, поэтому они могли доминировать в этом процессе (Wickramasinghe, Wickramasinghe, 2006).

Термин «нанобактерии» впервые употребил Р. Морита (Morita, 1988), однако широко использоваться он начал в работах финского микробиолога О. Каяндера, обнаружившего такие клетки внутри песчинок при мочекаменной болезни, и в работах американского геолога Р. Фолка, описавшего подобные микроорганизмы в пробах осадочных пород (Folk, 1996, 1997, 1999, 2002). В настоящее время к нанобактериям относят мелкие прокариотные организмы с линейными размерами менее 200 нм (по мнению некоторых авторов — менее 400 нм). В научной литературе помимо термина «нанобактерии» используют другие названия: ультрамикробактерии, наноформы, наннобактерии, карликовые клетки, фильтрующиеся клетки, /формы и некоторые другие (Литвин и др., 2000; Casida, 1969; Вае, Casida, 1973; Morita, 1988).

Надо отметить, что выбор точного термина для мелких бактериальных клеток оказался поводом для отдельных дискуссий.

Следует уточнить разницу между «нанобактериями», «ультрамикробактериями», «голодающими формами». Проблема в том, что при сходных размерах представители этих групп зачастую проявляют одинаковые свойства (Velimirov, 2001).

Большое внимание проблеме терминологии уделено в обзоре В.И. Дуды с соавт. (Дуда и др., 2012). Термин «ультрамикробактерии» (далее УМБ) был впервые использован Ф. Торелла и Р. Морита для описания экстремально мелких бактерий с диаметром менее 300 нм (Torella, Morita, 1981). Эти бактерии были выделены из морской воды и образовывали на агаровых пластинках «ультрамикроколонии». При этом мелкие размеры клеток сохранялись.

М. МакДонелл и М. Худ расширили описание группы УМБ за счет бактерий, полученных фильтрацией речной воды через мембранный фильтр. Эти бактерии образовывали колонии нормальной величины (MacDonell, Hood, 1982).

Позже была в характеристику УМБ, был включен показатель объема

о

клетки. Этот показатель должен составлять менее 0,1 мкм и не изменяться в зависимости от ростовых условий (Schut et al., 1997).

Таким образом в основу современной концепции УМБ (Дуда и др., 2012) положен таксономический (видовой) диагностический принцип и учет принадлежности организмов к УМБ по следующим обязательным признакам: 1) ультрамелким размерам у большинства клеток в популяции; 2) сохранению ультрамалых размеров клеток вне зависимости от ростовых условий и стадии развития культур; 3) малому размеру генома (3,2-0,58 Mb).

Виды с гомогенными по величине клетками в популяции следует считать облигатными УМБ, а виды, содержащие в популяциях растущих

культур небольшую часть клеток с объемами менее 0,1 мкм3, характеризовать как факультативные УМБ.

Не существует четкого определения термина «нанобактерия», хотя подобные организмы предварительно отнесены к той же фенотипической группе, что и ультрамикробактерии (УеНшкоу, 2001).

Термин «нанобактерии» использовался разными авторами в несколько различных значениях:

1) Р. Морита употребил термин «нанобактерии» как синоним слову «ультрамикробактерии» (1988);

2) Р. Фолк назвал нанобактериями индигенные формы кокковидных бактерий, встречающиеся в геологических породах и характеризующиеся сверхмелкими размерами: 100-300 нм (1996).

3) Группа финских микробиологов во главе с О. Каяндером назвала нанобактериями представителей патогенных для человека бактерий рода ЫапоЬаМепит с диаметром клеток 50-300 нм (1997).

4) В 2004 году И.Е. Мишустина под названием «нанобактерии» объединила прокариотные организмы различной морфологии, имеющие размеры нанометров (Мишустина, 2004).

Термин «нанобы» был использован Ф. Увинсом для обозначения ультрамелких образований неизвестной природы, имеющих признаки биологических объектов, обнаруженных на поверхности автралийских песчаников (и-мпэ & а1., 1998).

Кроме того, существует ряд обобщающих терминов: ультрамикроклетки, наноклетки, клетки-карлики, лилипуты, наноразмерные клетки, обозначающих коккоидные клетки 150-400 нм в диаметре (Дуда и др., 2012).

Таким образом, единой точки зрения на то, что следует относить к наноформам бактерий, не существует.

В нашей стране работы по выделению и изучению наноформ бактерий успешно идут в лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ РАН под руководством доктора биологических наук В.И. Дуды. В этой лаборатории выделены и описаны ультрамикробпактерий из вечномерзлых отложений, из нефтяных шламов (илов) со дна водоемов, симбионтов сине-зеленых водорослей, ризосферы растения Pedilanthus tithymaloides (Дмитриев и др., 2004; Дуда и др., 2007; Сузина и др., 2008; Дмитриев и др., 2008). В ходе экспериментов ультрамикробактерии рода Kaistia проявляли себя как типичные эктопаразиты. Было показано, что свободноживущие нанобактерии могут быть паразитами как фототрофных, так и гетеротрофных бактерий.

Довольно высокий процент бактерий размером от 150 до 230 нм в почве констатирован нашими JI.M. Полянской. В ходе сукцессии доля фракции бактериальных клеток размером 230-150 нм, которая может быть отнесена к наноформам бактерий, составляла 3-12% (Полянская и др., 2012).

В 2013 году группа ученых из РГАУ-МСХА с помощью метода посева на плотные питательные среды показала, что большая часть бактерий в почве и корневой зоне растений имеют ультрамикроскопические размеры (Ванькова и др., 2013).

1.2. Методы выделения наноформ бактерий.

Технически выделение наноформ осуществляется следующими способами. Первый — обогащение путем применения мембранных фильтров. Он включает спорадическое удаление больших клеток при проходе обогащенной культуры через фильтры с размером пор 200 или 400 нм и последующее перемещение культуры на свежие среды. Этим способом было получено несколько изолятов (Bakken and Olsen, 1987; Rutz and Kieft, 2004), причем часть клеток впоследствии приобрела «нормальные» размеры. Остальные клетки сохранили малые размеры, что указывает на их принадлежность к «карликовым» бактериям. Некоторые выделенные организмы были отнесены к новым видам. Например, среди видов, выделенных из загрязненных верхних почвенных горизонтов, в основном присутствовали представители трех филумов: Beta- и Gammaproteobacteria и Actinobacteria, но ни один вид не был описан ранее.

Второй способ выделения наноформ бактерий был изначально разработан для морских олиготрофных сред обитания (Button et al., 1993; Schut et al., 1993) и относительно недавно модифицирован (Hahn et al., 2004).

Анализируемый материал, например морская вода, последовательно разбавляется стерильной водой и длительное время инкубируется (от 9 недель до 1 года). В течение инкубации нативные олиготрофные бактерии сохраняют медленный рост и в конце концов достигают плотности 104 клеток на мл. В пробирках с наивысшими разведениями содержатся чистые культуры, которые затем можно выращивать на более концентрированных средах для получения большей биомассы.

Проращивание ультрамикроформ возможно непостредственно на фильтрах. При этом последние помещают на чашки Петри с соответствующей питательной средой (БсЫетапп, 1981).

Л.М. Полянской был использован метод каскадной фильтрации для выделения разных фракций почвенных бактерий, в том числе клеток размером 150-230 нм (Полянская и др., 2012).

1.3. Особенности морфологии, физиологии и биохимии наноформ бактерий.

К настоящему времени микробиологи накопили достаточно данных, чтобы признать существование жизнеспособных прокариот с очень малыми значениями линейных у размеров клетки. Однако природа наноформ бактерий исследована пока сравнительно мало.

Известно, что одним из механизмов выживания микроорганизмов под воздействием стрессоров является переход в так называемые

«некультивируемые, но жизнеспособные формы» (Головлев, 1998), характеризующиеся значительным снижением метаболической активности, устойчивостью клеток к стрессовым воздействиям и отсутствием деления (Шлеева и др., 2010). Традиционно покоящееся состояние связывали с образованием высокодифференцированных спор и цист. Однако в последние годы была экспериментально установлена возможность перехода в покоящееся состояние для неспорообразующих бактерий, сопровождающееся образованием менее дифференцированных цистоподобных форм, отличных от спор. Так, были описаны цистоподобные клетки в образцах нефтешламов (Дмитриев и др., 2004). Были обнаружены разнообразные цистоподобные клетки бактерии АгоэртИит ЬгавИете (Мулюкин и др., 2009). Эти клетки характеризуются повышенной термоустойчивостью и имеют дополнительные слои в электронно-плотных покровах, капсулы или же заключены в обширный матрикс.

Характерной особенностью некультивируемых, но жизнеспособных форм бактерий является резистентность к физическим и химическим воздействиям и уменьшение клеточного размера.

Согласно литературным данным, фильтрующиеся формы бактерий сложно культивировать на питательных средах. Так, учет численности фильтрующихся клеток из образцов пресной воды методом посева на питательные среды 112А и БВ2 показал, что лишь 0,5-1,2% способны сформировать колонии (Федотова, 2013).

Искусственно полученные наноформы отличались резистентностью к различным стрессовым факторам: высушиванию, гамма- и УФ излучению, воздействию химических веществ, тепловой обработке и т.д. (Vainstein et al., 1998; Bjorcland et al., 1998).

Размеры нанобактерий приближаются к так называемому «запрещенному объему» клетки с диаметром 150 нм (Гусев, Минеева, 2003). Возникает вопрос: как может такая клетка вмещать всё необходимое для жизни?

Известно, что биомолекулы имеют определённые физические размеры. Исходя из объёма клетки с диаметром 150 нм легко подсчитать, что в ней может содержаться приблизительно 1200 молекул белка и осуществляться около 100 ферментативных реакций. Минимальное число ферментов, нуклеиновых кислот и других компонентов, необходимых для самовоспроизведения теоретической «минимальной» клетки, составляет, по проведённой оценке, не менее 100. Это то количество, которое необходимо для поддержания клеточной структуры и обеспечения клеточного метаболизма (Гусев, Минеева, 2003). Была выдвинута гипотеза, объясняющая существование клеток диаметром около 150 нм (Kajander et al., 1998). Для объяснения особенностей нанобактерий предложена следующая теория:

1. Наноформы не синтезируют многие аминокислоты и жирные кислоты, а используют уже готовые, в том числе, возможно, фосфорилированные.

2. У наноформ отсутствуют «энергоёмкие» системы активного транспорта, характерные для про- и эукариотических клеток. Транспорт вещества в клетку и из клетки осуществляется за счёт диффузии и броуновского движения; этому способствуют ультрамикроскопические размеры клетки, то есть выгодное соотношение поверхность/объём.

3. Концентрация растворённых веществ и осмотическое давление внутри клеток наноформ мало отличается от окружающей среды. Отсутствие затрат на поддержание гомеостаза позволяет наноформам «голодать» неограниченно долго.

В настоящее время в отношении наиболее изученных штаммов наноформ бактерий известно (Folk, 1997; Panikov, 2005; Дуда, 2007; Абашина и др., 2000; De Fede, Sexstone, 2001), что:

1. Они имеют клеточное строение: цитоплазма, в которой выделяются электронноплотные участки, и клеточная стенка, похожая на клеточную стенку грамотрицательных бактерий. Муреиновый слой клеточной стенки либо значительно модифицирован, либо вовсе не выявляется методами электронной микроскопии. Кроме того, наноформы бактерий отличаются большим размером периплазматического пространства и обладают микрокапсулой.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Конова, Ирина Александровна, 2013 год

Список литературы

1. Абашина Т.Н., Сузина Н.Е., Вайнштейн М.Б. Особенности ультраструктурной организации клеточной оболочки нанобактерий // Институт биохимии и физиологии микроорганизмов. 2000.

2. Ананьева Н.Д., Никитин Д.И. Размеры бактерий в некоторых почвах// Почвоведение. 1979. №4. С. 132 - 135.

3. Аристовская Т.В. Микробиология подзолистых почв. - M.-JI. «Наука». 1965. 188 с.

4. Аристовская Т. В. Роль микроорганизмов в мобилизации и закреплении железа в почвах. // Почвоведение №4. 1975. С. 87-91.

5. Аристовская Т. В. Микробиология процессов почвообразования. - Л. «Наука». 1980. 187 с.

6. Багатурова А. Новая форма жизни. 2005.

7. Белова С.Э., Федотова A.B., Дедыш С.Н. Ультрамикроформы прокариот в сфагновом болоте водосбора Верхней Волги // Микробиология. 2012. Т. 81. №5. С. 665-671.

8. Вайнштейн М. Б., Кудряшова Е.Б. О наннобактериях // Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 163-174.

9. Вайнштейн М.Б., Сузина М.Б., Абашина Т.Н. Нанобактерии // Наука в России. 2007. №3. С. 10-14.

10. Ванъкова A.A., Иванов П.И., Емцев В.Т. Фильтрующиеся формы почвенных бактерий // Почвоведение. 2013. № 3. С. 335-342.

11. Водяницкий, Ю. Н. Гидроксиды железа в почвах (обзор литературы) //Почвоведение. 2010. № 11. С. 1341-1352.

12. Волкова Н.Н. Исследование биоминерализационного геоэкологического фактора в подземных водах Томского района / Автореферат канд. дисс. ... Томск. 2006.

13. Головлев E.JI. Другое состояние неспорулирующих бактерий// Микробиология. 1998. Т. 67. № 6. С. 725-735.

14. Гузев B.C., Звягинцев Д.Г. Биометрический анализ клеток бактерий в почве // Микробиология. 2003. Т. 72. №2. С. 221-227.

15. Гузев B.C., Вызов Б.А. Морфометрический анализ бактерий, ассоциированных с почвенными многоножками // Микробиология. 2006. Т. 75. №2. С. 264-270.

16. Гусев М.В., Минеева JJ.A. Микробиология //М.: Издат. центр «Академия». 2003. 464 с.

17. Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Баринова Е.С., Дуда В.И., Воронин A.M. Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры микробных клеток in situ в экстремальных биотопах // Микробиология. 2004. Т. 73. № 6. С. 832-840.

18. Дмитриев В. В., Сузина Н. Е., Русакова Т. Г., Гиличинский Д. А., Дуда В. И. Ультраструктурные особенности природных форм микроорганизмав, изолированных из грунтов вечной мерзлоты Восточной

Сибири методом низкотемпературного фракционирования // Докл. АН. 2001. Т. 378. С. 846-849.

19. Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Русакова Т.Г., Петров П.Ю., Олейников P.P., Есикова Т.З., Холоденко В.П., Дуда В.И., Воронин A.M. Электронно-микроскопическое обнаружение и характеристика наноформ бактерий in situ в экстремальных биотопах // Микробиология. 2008. Т. 77. № 1.С. 46-54.

20. Добровольская Т.Г., Головченко A.B., Поздняков А.И. Вертикальная организация бактериальных сообществ в торфяных почвах поймы реки Яхромы // Изв. РАН. Сер. биологическая. 2007. № 5. С. 629-635.

21. Дуда В.И., Сузина Н.Е., Акимов В.И., Вайнштейн М.Б., Дмитриев В.В., Баринова Е.С., Абашина Т.Н., Олейников P.P., Есикова Т.З., Воронин A.M. Особенности ультраструктурной организации и цикла развития почвенных ультрамикробактерий, относящихся к классу Alphaproteobacteria //Микробиология. 2007. Т. 76. №5. С. 652-661.

22. Дуда В.К, Сузина Н.Е., Поливцева В.Н., Воронин A.M. Ультрамикробактерии: становление концепции и вклад ультрамикробактерий в биологию. Микробиология. 2012. Т. 81. № 4. С. 415-427.

23. Звягинцев Д.Г., Т.Г. Добровольская, И.П. Бабьева, Г.М .Зенова, JI.B. Лысак, Марфенина O.E. Роль микроорганизмов в биогеоценотических реакциях почв // Почвоведение. 1992. №6. С. 63-77.

24. Калина Г.П. Развитие микробных клеток из доклеточного вещества / Киев. Медгиз. 1954. 472 с.

25. Классификация и диагностика почв России / Авт. и сост. JI.JI. Шишов, И.И. Лебедева, М.И. Герасимова. Смоленск: Ойкумена. 2004. 342 с.

26. Классификация и диагностика почв СССР. / Егоров B.B. М.: Колос. 1977. 222 с.

27. Красилъников H.A. О неклеточных формах у микроорганизмов // Успехи современной биологии. 1954. Т. 54. Вып. 6. С. 22 - 32.

28. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарёва В.И., Романова Ю.М. Обратимый переход патогенных бактерий в покоящееся (некультивируемое) состояние: экологические и генетические механизмы // ВРАМ. 2000. № 1. С. 7-13.

29. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. / Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. М.: МАКС Пресс. 2003. 120 с.

30. Манучарова H.A. Идентификация метаболически активных клеток прокариот в почвах с применением молекулярно-биологического флюоресцентно-микроскопического метода анализа fluorescence in situ hybridization (FISH) // M. Издательство МГУ. 2008. 24 с.

31. Манучарова H.A., Власенко А.Н., Менъко Е.В., Звягинцев Д.Г. Специфика хитинолитического микробного комплекса в почвах,

инкубируемых при различных температурах // Микробиология. 2011. Т. 80. №2. С. 219-229.

32. Методы почвенной биохимии и микробиологии. Ред. Звягинцев Д.Г. М.: Издательство Московского университета. 1991. 304 с.

33. Мишустина И.Е., Калюжная Т.В. Ультрамикроформы бактерий в почве и море// Известия РАН. Сер. биологическая. 1987. №5. С. 686 - 700.

34. Мишустина И. Е. Нанобиология океана // Известия РАН. Серия биологическая. 2004. № 5. С. 597-600.

35. Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Погорелова А.Ю., Антонюк Л.П., Дуда В.И., Элъ-Регистан Г.И. Разнообразие морфотипов покоящихся клеток и условия их образования у Azospirillum brasilense II Микробиология. 2009. Т. 78. № 1.С. 42-51.

36. Никитин Д.И. Применение электронной микроскопии для изучения почвенных суспензий // Почвоведение. 1964. № 6. С. 86 - 91.

37. Никитин Д.И., Васильева Л.В., Лохмачева P.A. Новые и редкие формы почвенных микроорганизмов // М., 1966.

38. Новогрудский Д.М. Невидимые формы видимых бактерий // Микробиология. 1933. Т. 2. Вып. 4. С. 377 - 402.

39. Новогрудский Д.М. Почвенная микробиология. Алма-Ата: Изд-во АН КазССР. 1956. 402 с.

40. Панкратов Т. А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия прокариотных микроорганизмов в

сфагновых болотах с использованием метода FISH // Микробиология. 2005. Т. 74. №6. С. 831-837.

41. Перфильев Б.В., Габе Д.Р. Капиллярные методы изучения микроорганизмов. //М.-Л. АНСССР. 1961. 534 с.

42. Пиневич А. В. Микробиология железа и марганца. Издательство Санкт-Петербургского университета. 2005. 373 с.

43. Полянская Л.Ы., Горбачева М.А., Звягинцев Д.Г. Размеры бактерий в черноземе в ходе микробной сукцессии при инкубировании почвы в аэробных условиях // Почвоведение. 2012. № 11. С. 1181-1187.

44. Сузина Н.Е., Есикова Т.З., Акимов В.Н., Абашина Т.М., Дмитриев В.В., Поливцева В.Н., Дуда В.К, Воронин A.M. II Электронно-микроскопическое и флуоресцентно-микроскопическое изучение эктопаразитизма ультрамикробактерий рода Kaistia, штаммов NF1 и NF3 // Микробиология. 2008. Т. 77. №1. С. 55-62.

45. Сузина Н.Е., Дуда В.И., Есикова Т.З., Шорохова А.П., Гафаров A.B., Олейников P.P., Акимов В.Н., Абашина Т.Н., Поливцева В.Н., Воронин A.M. Новые ультрамикробактерии из рода Chryseobacteriu, штаммы NF4 и NF5 - факультативные эпибионты Bacillus subtilis I ! Микробиология. 2011. T.80. С. 529-542.

46. Федотова A.B. Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей ультрапресных вод // Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. 2013.

47. Федотова А.В., Белова С.Э., Куличевская И.С., Дедыш С.Н. Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий в воде ацидных озер севера России // Микробиология. 2012. Т.81., № 3. С. 306-313.

48. Чернов В.М., Гоголев Ю.В., Мухаметшина Н.Е., Абдрахнмов Ф.А., Чернова О.А. Адаптация микоплазм к биогенным и абиогенным стрессорам: наннотрансформация и мини-тела Acholeplasma laidlawii // Доклады академии наук. 2004. Т. 396. № 3. С. 417-420.

49. Чернов В. М., Мухаметшина Н. Е., Головлёв Ю. В., Абдрахнмов Ф. А., Чернова О. А. Адаптивные реакции микоплазм in vitro: "жизнеспособные, но некультивируемые формы" и наноклетки Acholeplasma laidlawii II Микробиология. 2005. Т. 74. № 4. С. 498-504.

50. Чернов В.М., Чернова О.А., Горшков О.В., Музыкантов А.А., Шаимарданова Г.Ф., Пелъникович АД., Маргулис А.Б., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Адаптация Mycoplasma gallisepticum к неблагоприятным условиям роста: изменение морфологических и физиологческих свойств // Микробиология. 2008. Т. 77. № 6. С. 777-780.

51. Шлеева М.О., Салина Е.Г., Капрельянц А.С. Покоящиеся формы микобактерий. Микробиология. 2010. Т. 79. № 1. С. 3-15.

52. Bae Н.С., Casida L.E. Responses of indigenous microorganisms to soil incubation as viewed by transmission electron microscopy of cell thin sections // J. Bacteriol. 1983. V. 113. P. 1462 - 1473.

53. Bakken L.R., Olsen R.A. The relationship between cell size and viability of soil bacteria // Microb. Ecol. 1987. V. 13. № 2. P. 103-114.

54. Bjorklund M, Ciftioglu N., Kajander E.O. Extraordinary survival of nanobacteria under extreme conditions // Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology. 1998. V. 3441. P. 123-129.

55. Button D., Schut F., Quang P., Martin R., Robertson B. Viability and isolation of marine bacteria by dilution culture: Theory, procedures, and initial results // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 881-891.

56. Casida L.E. Observation of microorganisms in soil and other habitats //Appl. Microbiol. 1969. V.18. P. 1065-1071.

57. Cisar J.O., Xu D.-Q., Thompson J., Swaim W., Hue L., Kopeckoe D.J. An alternative interpretation of nanobacteria-induced biomineralization // Stanford University. 2000.

58. Cavicchiolli R., Ostrowski M., Fegatella F., Goodchild A., Guixa-Boixereu N. Life under nutrient limitation in oligotrophic marine environments: an ecophysiological perspective of Sphyngopixies alaskensis (Tormely Sphyngomonas alaskensis) II Microb. Ecology. 2003. V. 45. P. 203-217.

59. De Fede K.L., Sexstone A.J. Differential response of size-fractioned soil bacteria in BIOLOG microtitre plates // Soil Biol. Biochem. V. 33. P. 15471554.

60. De Fede K.L., Panaccione D.G., Sextone A.J. Characterization of dilution enrichment cultures obtained from size-fractionated soil bacteria by

BIOLOG® community-level physiological profiles and restriction analysis of 16S-rRNA genes // Soil Biol. Biochem. 2001. V. 33. P. 1555-1562.

61. Folk R. L. In defense of nannobacteria // Science. 1996. V. 274. P. 1285e-1289e.

62. Folk R. L. Nanobacteria and the precipitation of carbonate in unusual environments // Sediment. Geol. 1999. V. 126. P. 47-55.

63. Folk R. L., Lynch F.L. The possible role of nannobacteria (dwarf bacteria) in clay-mineral diagenesis and the importance of careful sample preparation in higth-magnification SEM study // J. Sediment Res. 1997. V. 67. P. 583-589.

64. Folk R. L., Lynch F.L. Nannobacteria are alive on Earth as well as Mars // SPIE Proceedings. 1997. V. 3111. P. 406 - 419.

65. Folk R. L., Taylor L.A. Nannobacterial alteration of pyroxenes in martian meteotite Allan Hills 84001 // Meteor. Planet. Science. 2002. V. 37. P. 1057-1069.

66. Geissinger O., Herlemann D.P.R., Morshel E., Maier U.G., Brune A. The ultramicrobacterium "Elusimicrobium minutum" gen. nov., sp. nov., the first cultivated representative of the termit group 1 phylum // Appl. Environ. Microbiol. 2009. V. 75. P. 2831-2840.

67. Gilichinsky D.A., Soina V.S., Petrova M.A. Cryoprotective properties of water in the Earth cryolithosphere and its role in exobiology / Origin of Life and Evolution of the Biosphere. 1993. V. 23. P. 65-75.

68. Giovannoni S.J., Britschi T.B., Moyer C.L., Field K.G. Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton //Nature. 1990. V. 345. P. 60-63.

69. Giovanonni S. J., Tripp H.J., Givan St. et al. Genome streamlining in a cosmopolitan oceanic bacterium //Nature. 2005. V. 309. P. 1242-1245.

70. Godoy F., Vancanneyt M., Martinez M., Steinbüchel A., Swings J., Rehm B.H.A. Sphingopyxischilensis sp. nov., a chlorophenol-degrading bacterium that accumulates polyhydroxyalkanoate, and transfer of Sphingomonas alaskensis to Sphingopyxys alaskensis comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 473-477.

71. Golden D.C., Allen C.C., Gibson E.R. The search for terrestrial nanobacteria as possible analogs for purported in the Martian Meteorite ALH84001// Abstr. 28th Lunar and Plan. Sei. Conf.1997. Houston.

72. Hahn MM., LunsdorfH., Wu Q., Shaurer M., Hofle M.G., BoenigkJ., and Stadler P. Isolation of novel ultramicrobacteria classified as Actinobacteria from five freshwater habitats in Europe and Asia // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 1442-1451.

73. Hahn M.W., Stadler P., Wu Q.L., Pockl M. The filtration-acclimatization method for isolationof an important fraction of the not readily cultivable bacteria // J. Microbiol. Methods. 2004. V. 57. P. 379-390.

74. Huber H., Hohn M.J., Rachel R., Stetter K.O. The phylum Nanoarchaeota; Present knowledge and future perspectives of a unique form of life //Res. Microbiol. 2003. V.154. P. 165-171.

75. Huber H., Michael J.H., Rachel R., Stetter K.O. Nanoarchaeota // Procaryotes. 2006. Chapter 14.

76. Iizuka H., Yamanaka S., Nishiyama T., Hiraishi A. Isolation and phylogenetic analysis of aerobic copiotrophic ultramicrobacteria from urban soil // J. Gen. Appl. Microbiol. 1998. V. 44. P. 165-171.

77. Janssen P., Schulman A., Morschel E., Rainey F. Novel anaerobic ultramicrobacteria belonging to the Verrucomicrobiales lineage of bacterial descent isolated by dilution culture from anoxic rice paddy soil // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 1382-1388.

78. Kajander E. O., Kuronen I., Akerman k., Pelttari A., Ciftcioglu N. Nanobacteria from blood, the smallest culturable autonomously replicating agent on Earth // SPIE Proceedings. 1997. V. 3111. P. 420^28.

79. Kajander E.O., Ciftioglu N. Nanobakteria: An alternative mechanism for pathogenic intra- and extracellular calcification and stone formation // University of cuopio. 1998.

80. Kjelleberg S., Humphrey B.A., Marshall K.C. II Initial phases of starvation and activity of bacteria at surfaces // Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 46. P. 978-984.

81. Kriss A.E., Birusova V.I. Zolkover A. (1948). Drop dialysis— a method of preparing biological preparates for electron microscopy // Microbiologia. 1948. V. 17. P. 484.

82. Kuhn P., Sternberg E. Ueber bacterien und pettenkoffferien // Zbl. Bakt. I. Orig. 1931. V. 121. P. 113-161.

83. Lindahl V., Frostegard A., Bakken L.R., Baath E. Phospholipid fatty acid composition of size fractioned indigenius soil bacteria // Soil Biol. Biochem. 1997. V. 29. P. 1565-1569.

84. LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit for microscopy and quantitative assays. Product Information. Molecular Probes. 2004. P. 1-8. http://biology.fullerton.edu/facilities/em/lAbrarv/LiveDead.pdf/.

85. Loveland-Curtze J., Miteva V., Brenchley J. Novel ultramicrobacterial isolates from a deep Greenland glacial ice core represent a proposed new species, Chryseobacterium greenlandense sp. nov // Extremophiles. 2010. V. 14. P. 61-69.

86. Lovelande-Curtze JMiteva V.I., Brenchley J.E. Herminiimonas glaciei sp. nov., a novel ultramicrobacterium from 3042 m deep Greenland glacial ice // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 1272-1277.

87. MacDonell M.T., Hood M.A. Isolation and characterization of ultramicrobacteria from a Gulf Coast estuary // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 43. P. 566-571.

88. May H.D., Miller G.S., Kjellerup B.V., and Sovers K.R. Dehalorespiration with polychlorinated biphenyls by an anaerobic ultramicrobacterium // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 2089-2094.

89. Mishustina I.E. Submicroscopic forms in marine muds isolated by a density gradient method and studied by electronmicroscopy // Bull. Ecol. Res. Comm. (Stockholm). 1973. V. 17. P. 143-149.

90. Morita R.Y. Starvation and miniaturization of heterotrophs, with special emphasis on maintenance of the starved viable state // In: Bacteria in Their Natural Environment / Ed. by Fletcher M., Floodgate G.D. London: Academic Press. 1985. P. 111-130.

91. Morita R.Y. Bioavailability of energy and starvation survival in nature // Can. J. Microbiol. 1988. V. 34. P. 436-441.

92. Panikov N. Contribution of nanosized bacteria to the total biomass and activity of a soil microbial community // Advances in Applied Microbiology. 2005. V. 57. P. 245-296.

93. Rappe M.S., Connon S.A., Vergin K.L.,Giovannoni S.J. Cultivation of the ubiquitous SAP 11 marine bacterioplancton clade // Nature. 2002. V. 418. P. 630-633.

94. RoszakD.B., Colwell R.R. Survival strategies of bacteria in the natural environment // Microbiol.Rev. 1987. V.51. P. 367 - 379.

95. Rutz B.A., Kieft T.L. Phylogenetic characterization of dwarf archaea and bacteria from a semiarid soil // Soil Biol. Biochem. 2004. V. 36. P. 825-833.

96. Schut F., de Vries E., Gottschal J., Robertson B., Harder W., Prins R., Button D. Isolation of typical marine bacteria by dilution culture: Growth,

maintenance, and characteristics of isolates under laboratory conditions // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 2150-2160.

97. Shiemann D.A. Advances of membrane filtration // Membrane Filtration application technique and problems. 1981. P. 537.

98. Sizova M.V., Panikov N.S., Tourova T.P., Patrick F.W. Isolation and characterization of oligotrophic acido-tolerant methanogenic consortia from a Sfagnum peat bog // FEMS Microbiology Ecology. 2003. V. 45. P. 301-315.

99. Soina V.S., Mulyukin A.L., Demkina E.V., Vorobyova E.A., El-Registan G.I. The structure of resting bacterial population in soil permafrost // Astrobiology.2004. V.4. P. 435-458.

100. Soina V.S., Vorobiova E.A., Zvyagintsev D.G., Gilichinsky D.A. Preservation of cell structure in permafrost: a model for exobiology // Adv. Space Res. 1995. V. 15. N3. p. 237 - 242.

101. Soina V.S., Vorobiova E.A. Preservation of microbial cell structure in permafrost / Viable Microorganisms in Permafrost. Pushchino. 1994. P. 37 - 47.

102. Torella F., Morita R.Y. Microcultural study of bacterial size changes and microcolony and ultramicrocolony formation by heterotrophic bacteria in seawater// Appl. Environ. Microbiol. 1981. V. 41. P. 518-527.

103. Uwins Philippa J.R., Webb R.I., Taylor A.P. Novel nano-organizms from Australian sandstones // American Mineralogist. 1998. V. 83. P. 1541-1550.

104. Vainstein M, Kudryashova E., Suzina N., Ariskina E., Voronkov V. Formation of bacterial nanocells // Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology. 1998. V. 3441.P. 95-99.

105. Vancanneyt M, Schut F., Snauwaert C., Goris J., Swings J., Gottschal J. Sphingomonas alaskensis sp. nov., a dominant bacterium from a marine oligotrophic environment // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 73-79.

106. Velimirov B. Nanobacteria, Ultramicrobacteria and Starvation forms: A Search for the Smallest Metabolizing Bacterium // Microbes and Environment. 2001. Vol. 16. №2. P. 67-77.

107. Wainwright M. Nanobacteria and associated elementary bodies in human disease and cancer // Microbiology. 1999. V. 145. P. 2623-2624.

108. Watson S. W., Novitsky T.Y., Quinby H.L., Valois F.G. Determination of bacterial number and biomass in the marine environment // Appl. Environ. Microbiol. 1977. V. 33. № 4. P. 940.

109. Wickramasinghe J. T., Wickramasinghe N. C. A Cosmic Prevalence of Nanobacteria? 11 Astrophys Space Sci. 2006. P. 411-413.

110. YoungJ.,MartelJ., Young L., WuC-Y., Young A., Young D. Putative Nanobacteria Represent Physiological Remnants and Culture By-Products of Normal Calcium Homeostasis // PubMed. 2009.