Морфометрико-стереологический анализ ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Пилипенко, Даниил Игоревич

• Пилипенко, Даниил Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пилипенко, Даниил Игоревич

Введение

Обзор литературы

I. Методы морфометрии и стереологии

1. Краткая история стереологии

2. Основные принципы стереологического анализа

2.1. Фундаментальные стереологические формулы и 10 преобразования

2.2. Методы подсчёта точек и пересечений

2.3. Принципы отбора снимков

2.4. Изотропные и анизотропные структуры

2.5. Выбор тестовых систем для стереологического анализа

2.6. Преимущества стереологических методов

3. Параметры, получаемые методами стереологии

3.1. Разнообразие стереологических параметров

3.2. «Дисектор» — метод подсчёта количества объектов

3.3. Метод расчёта поверхностной плотности

3.4. Метод расчёта объёмной плотности структуры

3.5. Стереологический анализ митохондрий

4. Альтернативные методы анализа пространственной 23 структуры объектов в электронной микроскопии

4.1. Метод трёхмерной реконструкции

4.2. Высоковольтная электронная микроскопия

II. Динамичность митохондрий, окислительный стресс и 24 антиоксидант БкСЬ

1. Динамичность и полиморфизм митохондрий

1.1. Внутриклеточная локализация митохондрий

1.1.1. Хондриом летательных мышц насекомых

1.1.2. Хондриом скелетных мышц

1.1.3. Хондриом кардиомиоцитов

1.2. Фрагментация и слияние митохондрий

1.2.1. Размеры и количество митохондрий

1.2.2. Фрагментация митохондриального ретикулума

1.2.3. Слияние митохондрий

1.2.4. Значение слияния и деления

1.3. Элиминирование митохондрий 38 1.3.1. Клетки хрусталика глаза

1.3.2. Созревание ретикулоцитов в эритроциты

1.3.3. Митоптоз и «энергетический шок» 44 1.4. Ультраструктура митохондрий

1.4.1. Общие представления

1.4.2. Корреляция с функциональным состоянием

2. Окислительный стресс

2.1. Генерация АФК в митохондриях

2.2. Антиоксидантная защита и митоптоз

2.2.1. Внутренняя мембрана и межмембранное пространство

2.2.2. Митохондриальный матрикс

2.2.3. Защита от перекисного окисления липидов

2.2.4. Пора во внутренней мембране и митоптоз

2.3. Роль окислительного стресса в старении и развитии патологий

2.3.1. Нейродегенеративные заболевания

2.3.2. Инфаркт миокарда

2.3.3. Возрастная макулодистрофия сетчатки

2.3.4. Процесс старения

2.4. Ультраструктура митохондрий при окислительном стрессе

3. Антиоксидант SkQi 63 III. Задачи работы '

Результаты и методы

I. Изменения ультраструктуры митохондрий летательной мышцы 65 Drosophila melanogaster при естественном старении. Влияние антиоксиданта SkQi

1. Описание модели

2. Методы

3. Результаты

II. Изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов мышей, 72 мутантных по PolgA, при ускоренном старении. Влияние антиоксиданта SkQi

1. Описание модели

2. Методы

2.1. Относительное количество сечений митохондрий

2.2. Анализ внутренней мембраны и матрикса митохондрий

3. Результаты

3.1. Относительное количество сечений митохондрий

3.2. Поверхностная плотность и объёмная доля внутренней 89 мембраны митохондрий

3.3. Относительная электронная плотность матрикса митохондрий

III. Изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов крыс при 91 экспериментальном инфаркте миокарда. Влияние антиоксиданта SkQi

1. Описание модели

2. Методы

3. Результаты

IV. Ультраструктура клеток пигментного эпителия крыс линии OXYS в 99 процессе старения. Динамика липофусциновых гранул. Действие SkQi

1. Описание модели

1.1. Крысы линии OXYS и действие антиоксиданта SkQi

1.2. Описание экспериментальных групп

1.3. Описание состояния сетчатки крыс линии Wistar

1.4. Описание состояния сетчатки крыс линии OXYS

1.5. Описание состояния сетчатки крыс линии OXYS, 105 получавших антиоксидант SkQi в виде глазных капель

1.6. Количественная оценка: параметры

2. Методы

2.1. Электронная микроскопия

2.2. Статистическая обработка

2.3. Подсчёт относительного количества (плотности) 109 липофусциновых гранул и всех электронно-плотных гранул

2.4. Подсчёт площадей сечения электронно-плотных гранул

2.5. Подсчёт ширины зоны распределения электронно-плотных 111 гранул

3. Результаты

3.1. Относительное количество (плотность) липофусциновых 112 гранул

3.2. Относительное количество (плотность) электронно-плотных 114 гранул

3.3. Относительная средняя площадь сечения электронно-плотных 116 гранул

3.4. Ширина зоны распределения электронно-плотных гранул

3.5. Корреляция с балльной оценкой

Обсуждение результатов

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Морфометрико-стереологический анализ ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе»

В последнее время находится всё больше подтверждений того, что основой процесса старения и ряда патологических возрастных заболеваний является действие активных форм кислорода. Основным источником активных форм кислорода в клетке считаются митохондрии, характерная особенность которых - взаимосвязь структуры и функции.

В.П.Скулачёвым был разработан митохондриально-направленный антиоксидант SkQb представляющий собой соединение молекулы хлоропластного антиоксиданта пластохинона и проникающего катиона додецилтрифенилфосфония. Ключевой особенностью SkQi является способность избирательно накапливаться в митохондриях за счёт трансмембранного потенциала. Показано, что SkQi замедляет или предотвращает развитие огромного числа патологий и процессов старения [Скулачёв, 2007]. На клеточном уровне показано, что SkQi способен предотвращать апоптоз, вызываемый перекисью водорода. На мышах показано, что SkQi замедляет развитие трёх различных типов ускоренного старения (прогерии). Аналогичный эффект получен на беспозвоночных - плодовой мушке Drosophila melanogaster и дафниях. SkQi обладает мощным лечебным действием при множестве глазных заболеваний: при врождённой дисплазии сетчатки, при возрастной макулярной дистрофии, при экспериментальном увейте и глаукоме. Показан защитный эффект SkQj при экспериментальном инфаркте миокарда на крысах, получавших SkQi с пищей в течение трёх недель до эксперимента. Предварительный приём SkQi спасает животных при экспериментальном инфаркте почки и сильно снижает зону поражения мозга при экспериментальном инсульте [Скулачёв, 2007].

Визуальное описание выявляемых изменений в исследовании методами электронной микроскопии структуры митохондрий при различных патологических процессах, как, впрочем, и других клеточных компонентов, является недостаточным и малоинформативным: оно не может дать точную, объективную и статистически достоверную оценку степени этих изменений. Такая оценка возможна лишь с использованием специальных методов, — методов морфометрии, стереологии и трёхмерной реконструкции, -позволяющих объективизировать исследование и получить принципиально новые данные о строении и пространственной организации изучаемых структур.

Центральной задачей настоящей работы была разработка и применение методов морфометрического и стереологического анализа для количественной характеристики изменений ультраструктуры митохондрий при различных патологических процессах, обусловленных окислительным стрессом, при естественном и ускоренном старении, а также для количественной характеристики защитного эффекта ЭкСЬ, проявляющегося на уровне ультраструктуры митохондрий.

В рамках настоящей работы были разработаны компьютерные методы оценки поверхностной плотности внутренней митохондриальной мембраны — отношения площади поверхности мембраны к объёму митохондрии. Метод также позволяет оценить электронную плотность матрикса и другие параметры, дающие возможность судить о функциональном состоянии митохондрий.

Разработка методов количественной оценки состояния ультраструктуры митохондрий по большим выборкам электронно-микроскопических фотографий, на наш взгляд, является перспективным направлением, поскольку позволяет характеризовать ультраструктуру митохондрий с высокой точностью по сравнению с обычно принятыми описательными характеристиками наблюдаемых явлений. В связи с повышенным вниманием исследователей к митохондриям, играющим ключевую роль в огромном множестве патологий, а также, по-видимому, в развитии процесса старения, разработка компьютерных методов морфометрико-стереологического анализа митохондрий в настоящее время является чрезвычайно актуальной.

Обзор литературы I. Методы морфометрии и стереологии

Морфометрия — это наука об измерении структуры, совокупность различных методов, с помощью которых можно получить информацию о реальных размерах трёхмерных структур.

Стереология - это система методов, разработанных на основе аналитической геометрии и теории вероятностей, предназначенных для исследования трёхмерных структур по их двумерным изображениям (фотографиям срезов или проекциям). Стереологические методы позволяют получить морфометрические результаты, так как с их помощью можно установить форму и пространственную ориентацию изучаемых структур [Непомнящих и др., 1986].

Ультратонкие срезы, используемые в электронной микроскопии, можно считать двумерными, поэтому применение инструментов стереологии к исследованию клеточных структур, исследуемых с помощью электронного микроскопа, является целесообразным. Использование методов стереологического анализа в количественной микроскопии при изучении тканевых, клеточных и внутриклеточных структур имеет существенное преимущество перед описательными методами исследований [БеНой-, ЫЫпез, 1968].

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Пилипенко, Даниил Игоревич

Выводы

1. Разработаны морфометрико-стереологические методы, позволяющие анализировать и оценивать изменения ультраструктуры митохондрий.

2. Применение разработанных методов для анализа ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе показало, что митохондриально-направленный антиоксидант SkQl снижает степень основных ультраструктурных изменений митохондрий при естественном и ускоренном старении, а также при экспериментальном инфаркте миокарда, а именно: a. В процессе старения в летательной мышце Drosophila melanogaster происходит увеличение доли митохондрий, имеющих миелиноподобные структуры ("swirls"), а получение SkQl в виде сухого корма в концентрации 1,85 нМ снижает долю таких митохондрий, как у самок, так и у самцов. Причём у самцов это снижение имеет более выраженный характер. b. У 39-недельных мышей, мутантных по PolgA-субъединице митохондриальной ДНК-полимеразы (подверженных ускоренному старению), по сравнению с мышами дикого типа того же возраста наблюдается снижение трёх параметров митохондрий кардиомиоцитов:

• относительного количества сечений митохондрий (на 1 мкм2);

• поверхностной плотности внутренней мембраны (мкм2/мкм3);

• относительной электронной плотности матрикса.

При ежедневном получении мутантными мышами препарата SkQl (в концентрации 1 мкмоль на килограмм веса животного) в течение всей жизни снижение значений указанных параметров не наблюдается: значения соответствуют значениям у мышей дикого типа. c. У крыс при экспериментальном инфаркте миокарда наблюдается снижение двух параметров митохондрий кардиомиоцитов зоны ишемического повреждения:

• поверхностной плотности внутренней мембраны (мкм2/мкм3);

• относительной электронной плотности матрикса.

При ежедневном получении крысами препарата 8к(^1 в концентрации 250 нМ в течение 3-х недель до инфаркта и последующем инфаркте миокарда снижение значений указанных параметров не наблюдается: значения соответствуют значениям у крыс, не подвергнутых инфаркту. с1. У 11-месячных крыс линии ОХУБ (модель ускоренного старения) по сравнению с крысами линии \yistar в клетках пигментного эпителия сетчатки наблюдается:

• снижение относительного количества электронно-плотных гранул (на 1 мкм длины мембраны Бруха);

• снижение суммарной площади сечений электронно-плотных гранул в расчёте на 1 мкм длины мембраны Бруха;

• увеличение ширины зоны распределения электронно-плотных гранул;

• значительное увеличение относительного количества липофусциновых гранул (на 1 мкм длины мембраны Бруха).

При получении препарата 8кС>1 в виде глазных капель (250 нМ) в течение 68 суток указанные изменения не наблюдаются, а значения соответствуют значениям у крыс \Vistar.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пилипенко, Даниил Игоревич, 2010 год

1. Авцын А.П., Шахламов В. А. (1979) Ультраструктурные основы патологии клетки. М.Медицина. 320с.

2. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. (1994) Молекулярная биология клетки. М., издательство «Мир»; 3-й том, стр. 154-156.

3. Бакеева JI.E., Северина И.И., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С., Ясайтис A.A. (1971) Проникающие ионы и структура митохондрий. В сб.: "Митохондрии. Структура и функции в норме и патологии". М: Наука, с. 67.

4. Бакеева Л.Е., Ясайтис A.A. (1972) Изменения структуры митохондрий в ответ на функциональные воздействия. В книге «Митохондрии. Молекулярные механизмы ферментативных реакций» М: Наука; стр. 56-64.

5. Бакеева Л.Е., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С. (1977) Митохондриальный ретикулум: строение и возможные функции внутриклеточных структур нового типа в мышечной ткани. Вестн. Моск. Ун-та. сер. Биология, том 3, стр. 23-38.

6. Бакеева Л.Е., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С. (1982) Межмитохондриальные контакты кардиомиоцитов. Цитология, том 24 (2), стр. 161-166.

7. Бакеева Л.Е., Зоров Д.Б., Скулачёв В.П., Ченцов Ю.С. (1986) Мембранный электрический кабель. 1. Нитчатые митохондрии фибробластов. Биологические мембраны, том 3 (11), стр. 1130-1136.

8. Бакеева Л.Е., Ченцов Ю.С. (1989) Митохондриальный ретикулум: строение и некоторые функциональные свойства. «Итоги науки и техники», сер. общая биол. -М.: ВИНИТИ, том 9, 104 с.

9. Бакеева Л.Е., Сапрунова В.Б., Пасюкова Е.Г., Рощина Н.В. (2007) Митоптоз в летательной мышце Drosophila melanogaster. Доклады Академии наук, том 413 (3), стр. 1-3.

10. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. (1972) Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. — М.: Наука, 252 с.12,13,14,15,1617,18