Морфометрические особенности бластных клеток в стандартных цитоцентрифугатах костного мозга при острых миелоидных лейкозах. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат медицинских наук Краснова, Любовь Сергеевна

• Краснова, Любовь Сергеевна
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Краснова, Любовь Сергеевна

Список используемых сокращений.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материал исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Протокол приготовления цитоцентрифугатов периферической крови и костного мозга.

2.2.2. Лабораторные методы исследования периферической крови и костного мозга.

2.2.3. Система анализа клеточного изображения.

2.2.4. Статистическая обработка.

Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Разработка протокола пробоподготовки периферической крови практически здоровых людей и больных анемиями.

3.2. Разработка протокола пробоподготовки костного мозга практически здоровых людей и больных острыми лейкозами.

3.3. Оценка особенностей расположения клеток в цитоцентрифугатах и воспроизводимость результатов, полученных на приборе «АСПЕК».

3.4. Сравнение гемограмм, подсчитанных в обычных мазках и цитоцентрифугатах периферической крови с нормальными и с отличными от нормы гематологическими показателями.

3.5. Сравнительный анализ обычных мазков и цитоцентрифугатов костного мозга.

3.6. Морфометрические особенности бластных клеток в стандартных цитоцентрифугатах костного мозга больных различными вариантами острых миелоидных лейкозов.

3.6.1. Контрольная морфометрия эритроцитов в стандартных цитоцентрифугатах крови практически здорового человека.

3.6.2. Сравнение морфометрических характеристик властных клеток костного мозга в обычных мазках и цитоцентрифугатах больного острым лейкозом.

3.6.3. Морфометрические параметры бластных клеток в стандартных цитоцентрифугатах проб костного мозга практически здоровых людей (контрольная группа из 8 доноров костного мозга).

3.6.4. Морфометрические параметры бластных клеток в стандартных цитоцентрифугатах костного мозга больных острыми миелоидными лейкозами.

3.6.4.1. Острые миелобластные лейкозы.

3.6.4.2. Острый миеломонобластный лейкоз.

3.6.4.3. Острый монобластный лейкоз.

3.6.4.4. Острый эритромиелоз и острый мегакариобластный лейкоз.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Морфометрические особенности бластных клеток в стандартных цитоцентрифугатах костного мозга при острых миелоидных лейкозах.»

Актуальность темы исследования.

Гетерогенность популяции нормальных кроветворных предшественников по фенотипическим признакам и уровням дифференцировки, а также возможность опухолевой трансформации на любой стадии их развития отражается в значительном разнообразии лейкозных клонов. Выявление этой гетерогенности в первую очередь базируются на морфо—цитохимических особенностях лейкозных клеток [50].

Анализ морфо-цитохимических признаков позволил выделить и охарактеризовать типы бластных клеток и разработать классификации острых лейкозов [59, 74]. Применение их в практической гематологии привело к достижению существенных успехов в области диагностики и лечения больных. Использование современных лечебных программ у больных острыми миелоидными лейкозами (OMJT) позволяет получить 62 — 85% полных ремиссий с 5-летней безрецидивной выживаемостью, достигающей 29 - 46% [58]. Однако, у части больных развиваются фатальные рецидивы заболевания, а эскалация доз цитостатиков не всегда оказывает терапевтический эффект.

Под воздействием естественной и «искусственной» (цитостатическая терапия) селекции в лейкозной популяции появляются новые варианты клеток. Давно отмечено, что с введением новых комплексов цитостатических средств, с появлением длительных ремиссий, сменяемых рецидивами, рефрактерными к ранее эффективным цитостатическим препаратам, в первую очередь проявляется изменчивость формы и величины ядер и цитоплазмы лейкозных клеток, причем изменения ядра морфологически более выражены [59, 69].

В настоящее время оценка морфологических и цитохимических признаков бластных клеток при острых лейкозах, которые отражают степень их созревания и дифференцировки и лежат в основе современных классификаций (ФАБ-классификация, 1991; ВОЗ классификация, 2008), носит субъективный характер. Это подчеркивает необходимость перехода с обычного визуального анализа микроскопических изображений к применению методов количественной цитологии, позволяющих выявить и сравнить индивидуальную и внутригрупповую вариабельность цитологических признаков лейкозных клеток.

Оценка современного состояния и внедрения технических достижений в медицинскую практику показывает, что анализаторы изображений клеток охватывают большую область применений, однако используются в основном, в отличие от проточных цитометров, при выполнении научно-исследовательских работ: метод предъявляет повышенные требования к приготовлению исследуемого материала и требует стандартизации этого процесса.

Стандартизация приготовления препаратов периферической крови осуществляется либо с помощью различных автоматических/механических устройств, либо с применением специальных цитоцентрифуг [23. 41, 50, 103, 109]. Однако, нам не встретились опубликованные данные о возможности использования таких устройств для стандартизации пробоподготовки костного мозга с последующим компьютерным морфометрическим анализом его клеточного состава.

Все вышеизложенное определяет актуальность проблемы и позволяет обозначить цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы: определить морфометрические параметры бластных клеток в стандартных цитоцентрифугатах костного мозга больных острыми миелоидными лейкозами.

Задачи исследования:

1. Разработать протокол получения стандартных цитоцентрифугатов на предметных стеклах из проб периферической крови и костного мозга.

2. Выявить особенности расположения клеток в цитоцентрифугатах периферической крови и костного мозга в норме и при острых лейкозах.

3. Определить пригодность стандартных цитоцентрифугатов периферической крови и костного мозга для компьютерного анализа изображения клеток.

4. Исследовать возможности компьютерной морфометрии для оценки морфологической гетерогенности бластных клеток при различных вариантах острых миелоидных лейкозов.

Научная новизна. В работе впервые показано, что морфометрия изображений бластных клеток, отобранных из стандартных цитоцентрифугатов костного мозга больных различными вариантами острого миелоидного лейкоза, может быть положена в основу количественной оценки гетерогенности морфологических особенностей клеточных популяций разного уровня созревания и формирования базы знаний.

Полученными в диссертации достоверными результатами обосновано научное положение о том, что количественная цитология — средство выделения и объективного описания модальных устойчивых классов бластных клеток, характеризующих варианты острых миелоидных лейкозов.

Практическая значимость работы.

Разработанная в ходе настоящего исследования стандартная пробоподготовка периферической крови и костного мозга обеспечивает пригодность препаратов исследуемого материала для объективной оценки с использованием компьютеризированных систем анализа клеточного изображения в научно-исследовательских работах и в практике клинико-лабораторного обследования гематологических больных.

Апробация работы:

1. Разработанная методика используется в лаборатории гемоцитологии учреждения Российской академии медицинский наук Гематологический научный центр РАМН для проведения клинико-лабораторных и научных исследований.

2. Материалы диссертации опубликованы в 16 печатных работах, докладывались на научных и научно-практических конференциях.

3. Полученные в процессе работы аппаратно-программные средства используются при обучении аспирантов и научных сотрудников методам автоматизированного исследования бластных клеток в лаборатории гемоцитологии Гематологического научного центра РАМН.

4. Разработанную установку для автоматизированного компьютерного морфометрического анализа бластных клеток и комплекс методов, полученных в ходе проведения данной работы можно рассматривать как научно-методическую базу для проведения подобного рода исследований.

Положения, выносимые на защиту:

1. Стандартная пробоподготовка периферической крови и костного мозга обеспечивает пригодность цитологических препаратов для объективного анализа.

2. Компьютерная морфометрия бластных клеток, отобранных из стандартных цитоцентрифугатов костного мозга больных различными вариантами острого миелоидного лейкоза, может быть положена в основу количественной оценки гетерогенности морфологических особенностей клеточных популяций разного уровня созревания и формирования базы знаний.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены на Российской научно-практической конференции «Технологии и инновации в лабораторной медицине» (Москва, 2009).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и библиографического указателя, включающего 145 работ, из них 71 работа отечественных авторов. Диссертация иллюстрирована 25 рисунками, содержит 21 таблицу.

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Краснова, Любовь Сергеевна

выводы.

1. Компьютерная морфометрия бластных клеток является средством определения и измерения их параметров. Обязательным условием для компьютерной морфометрии бластных клеток является цитохимическая верификация вариантов острых лейкозов и стандартная пробоподготовка исследуемого материала.

2. Разработан протокол пробоподготовки для получения стандартных монослойных цитоцентрифугатов периферической крови и костного мозга на предметных стеклах с учетом объемов проб и режимов центрифугирования.

3. Установлено, что морфометрический анализ изображений бластных клеток костного мозга является объективным методом изучения морфологической гетерогенности клеточных популяций.

4. Выявлены с помощью компьютерной морфометрии геометрические параметры бластных клеток, характеризующие микро-, мезо- и макрогенерации при различных вариантах острых миелоидных лейкозов.

5. Результаты компьютерной морфометрии бластных клеток в цитоцентрифутатах костного мозга могут лечь в основу формирования базы объективных данных о морфологических особенностях клеточных популяций гемопоэза у практически здоровых людей и у больных острыми миелоидными лейкозами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Для определения морфометрических особенностей бластных клеток костного мозга больных острыми миелоидными лейкозами нами проведена работа по оптимизации и стандартизации приготовления мазков.

Несмотря на успешное применение гемоанализаторов, микроскопия мазков крови остается независимым источником диагностической информации. Высокая трудоемкость и субъективность ручной микроскопии обусловили многочисленные попытки создания систем автоматизированной микроскопии (САМ) мазков крови [40, 48, 83, 109]. Появились САМ для анализа мазков крови, обладающие достаточными для медицинского применения характеристиками точности, надежности и скорости. Становясь основным инструментом количественной цитологии, и в том числе аналитической цитохимии, эти системы позволяют не только увидеть клетку, но и, измерив ее структуры, определить место этой клетки в гетерогенной клеточной популяции [23]. Существенным преимуществом аналитической цитохимии, способной определять более 50 характеристик клеток (геометрических, текстурных, цветояркостных и популяционных), является выделение устойчивых модальных классов клеток.

Опыт квалифицированных специалистов цитологов, дополненный результатами объективной оценки морфологических и других особенностей изучаемых клеток может быть положен в основу формирования базы знаний САМ. Однако, применение САМ и определенных методов, например, морфометрии предъявляет повышенные требования к подготовке исследуемого материала и требует стандартизации этого процесса [27, 40, 43, 49, 80,104,117,119].

Монослойные цитологические препараты позволяют применять цитологическую диагностику по видеоизображениям с использованием телекоммуникаций, использовать компьютерные технологии в оценке результата анализа. Однако, стандартизация в цитологии остается на сегодняшний день важной и трудной проблемой. Лабораторные цитологические методы имеют свои особенности, являясь преимущественно полуколичественными морфологическими методами, которые в отличие от классических лабораторных методов, носят описательный характер. Кроме того, «цитологический диагноз» (заключение) зависит от субъективного фактора: квалификация и практический опыт цитолога, способность оценить различные цитологические признаки [10, 42, 117].

В связи с вышесказанным, в диссертации была поставлена задача стандартизировать процесс приготовления препаратов периферической крови и костного мозга на предметных стеклах, удовлетворяющих требованиям, предъявляемым к унифицированным мазкам как для работы в лаборатории, так и для работы в исследовательской практике на автоматических анализаторах клеточных изображений. В результате проведенной работы разработана методика пробоподготовки периферической крови и костного мозга на предметных стеклах с помощью цитоцентрифуги DiffSpin 2 Slide Spinner (model M 701-22, StatSpin, USA).

Был осуществлен подбор оптимального объема и времени вращения центрифуги для получения монослойных мазков периферической крови 20 практически здоровых людей и 22 больных различными заболеваниями с анемическим синдромом, а также для костного мозга 8 здоровых доноров гемопоэтических клеток и 57 больных острыми лейкозами. Для здоровых людей определен объем периферической крови в 50 мкл, а для людей со сниженными гематологическими показателями объем крови составил 60 мкл, время центрифугирования во всех случаях равно 2 секундам (режим №5). Для получения стандартных препаратов костного мозга определен оптимальный объем в 60-70 мкл при времени вращения центрифуги в 2 секунды (режим №5). Пробоподготовка костного мозга с помощью вышеуказанной методики в нашей работе проведена впервые, так как нет литературных данных о применении специальных устройств для приготовления стандартных монослойных препаратов костного мозга.

В работе впервые была проведена оценка полученных цитоцентрифугатов (ЦЦФ) периферической крови и костного мозга путем микроскопии и на приборе «АСПЕК», которая показала однородное и равномерное распределение клеток на всем их протяжении с сохранением геометрии клеток, структуры, текстуры, количественного соотношения, оптической плотности, цвета и яркости. В то время как, в обычных мазках правильно оценить морфологию клеток и их ферментативную активность возможно только в самом тонком месте мазка (в так называемой «щеточке»), что является нарушением правил подсчета ядросодержащих элементов, так как для правильной их количественной оценки должен быть равномерно просмотрен весь мазок [47].

Показаны особенности расположения клеток при сравнении лейкоцитарной формулы в обычных мазках периферической крови и в ЦЦФ. Оказалось, что различия в количестве лейкоцитов разных видов из мазков и ЦЦФ здоровых людей находятся в пределах физиологических колебаний и клинического значения не имеют. Сравнение лейкоцитарной формулы одного больного сублейкемическим миелозом в развернутой стадии также не выявило различий в количестве бластных клеток, метамиелоцитов трех линий, палочкоядерных нейтрофилов и эозинофилов, а так же сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов и базофилов в обычных мазках и ЦЦФ (р>0,05). В то время как, средние значения числа промиелоцитов и миелоцитов трех ростков в ЦЦФ больного сублейкемическим миелозом были несколько больше средних значений этих элементов в обычных мазках, их количество достоверно различалось (р<0,01). Это, по-видимому, можно объяснить тем, что перечисленные форменные элементы в ручном мазке остаются в его начале, либо сдвигаются в «усы». Количество разрушенных клеток в ЦЦФ достоверно меньше, чем в мазках (р<0,001).

ЦЦФ костного мозга здоровых людей, полученные с помощью вышеуказанной центрифуги также пригодны для подсчета клеточного состава, так как полученные различия количества ядросодержащих клеток разных видов при подсчете миелограммы с мазков и ЦЦФ клинически не значимы.

Сравнительный анализ цитохимической окраски не выявил различий между общепринятыми цитохимическими реакциями на мазках и ЦЦФ, что согласуется с результатами Leif и соавторов [104].

Было проведено контрольное измерение морфометрических показателей клеток в обычных мазках и ЦЦФ периферической крови и костного мозга на приборе «АСПЕК». В работе использована стандартно-измерительная программа, позволяющая оценить площадь, периметр и форму самой клетки, ее ядра, а также ядерно-цитоплазматическое соотношение (ЯЦС). Данное исследование клеток периферической крови и костного мозга достоверных различий в сравниваемых препаратах не выявило (р>0,05). Следовательно, метод приготовления препаратов периферической крови и костного мозга здоровых людей с помощью вышеуказанной центрифуги пригоден, а полученные ЦЦФ могут быть использованы для морфометрического анализа.

Исследование геометрических параметров бластных клеток в обычных мазках и ЦЦФ костного мозга больных острыми миелоидными лейкозами выявило вариабельность формы клеток (р<0,01), ядер (р<0,01) и ядерно-цитоплазматического соотношения (р<0,03), что подтверждает морфологическую гетерогенность лейкозного клона и доказывает целесообразность их исследования методом морфометрического анализа при разных вариантах.

В настоящее время метод автоматизированной морфометрии клеток находит все более широкое применение в гематологической практике [11, 20, 26, 27, 36, 40, 41, 49, 61, 80, 85, 109]. Из многочисленных работ, посвященных проблеме изучения морфологических свойств и функционального состояния клеток крови с помощью современных компьютеризированных анализаторов изображения очевидно их неоспоримое преимущество по сравнению с традиционными визуальными методами [3, 5, 9, 19, 24, 28, 53-56]. Кроме того, внедрение новых компьютерных систем позволяет не только ускорить проведение рутинных исследований, но и объективизировать полученные данные, а также открыть перспективы изучения новых, неизвестных в классической цитологии характеристик клеток и клеточной физиологии [80, 109, 137].

Можно выделить основные группы приборов для количественной цитометрии — проточные гематологические анализаторы, проточные цитометры-сортировщики клеток, универсальные анализаторы изображений, специализированные автоматы изображений. Каждая группа приборов имеет свои принципиально сильные и слабые стороны и не может полностью вытеснить другие группы приборов для проведения цитологических исследований.

Основное преимущество проточных систем — их высокая скорость измерения характеристик клеток, когда измеряются оптические и кондуктометрические параметры клеток [23, 86, 93]. Помимо анализа клеточных параметров, они обеспечивают подсчет количества клеток в единице объема крови, что не могут измерить компьютерные цитометры, анализирующие мазки, а не клеточные суспензии. Однако, недостатком проточных систем является весьма ограниченные возможности в измерении тонкой морфологии клеток. Отсутствие визуального контроля может приводить к затруднениям в интерпретации результатов анализа [35, 119, 121].

Анализаторы изображения измеряют меньшее количество клеток в единицу времени, но зато определяют другие параметры, которые могут оказаться более информативными и/или характеризуются более высокой разрешающей способностью. Их преимуществом является визуализация данных, а также возможность многократных повторных исследований отдельно взятых клеток и обмен данными с другими исследователями, используя для этого современные телекоммуникационные средства [41, 45].

Бластные клетки костного мозга являются родоначальниками соответствующих ростков кроветворения, что находит свое отражение в их морфологии. Однако, для бластных клеток человека пока не разработаны соответствующие критерии и программные алгоритмы их морфологической оценки с помощью компьютерного анализа изображения, которые позволяли бы определить понятие «морфологической нормы» [49, 50, 57].

Литературные данные исследований морфометрических особенностей бластных клеток хорошо изучены при различных вариантах острого лимфобластного лейкоза [64, 118], а при вариантах острого миелоидного лейкоза исследования немногочисленные и результаты их неоднозначны [51, 86, 87, 100, 101, 127, 129]. Поэтому, следующим этапом нашей работы было получение морфометрических данных бластных клеток в стандартных ЦЦФ костного мозга практически здоровых людей и больных различными вариантами острых миелоидных лейкозов до начала терапии.

В ходе нашей работы всего было обследовано 8 здоровых доноров гемопоэтических клеток и 129 человек с острым лейкозом (ОЛ) до лечения. Проведенное морфо-цитохимическое исследование бластных клеток костного мозга больных ОЛ верифицировало 89 больных с острым миелоидным лейкозом, среди них: 9 человек с острым миелобластным лейкозом с минимальной миелоидной дифференцировкой (ОМЛ МО), 18 - с острым миелобластным лейкозом без созревания (ОМЛ Ml), 15 — с острым миелобластным лейкозом с созреванием (ОМЛ М2), 11 — с острым промиелоцитарным лейкозом (ОМЛ МЗ), 26 — с острым миеломонобластным лейкозом (ОМЛ М4), 7 - с острым монобластным лейкозом (ОМЛ М5), 2-е острым эритромиелозом (ОМЛ Мб) и 1 - с острым мегакариобластным лейкозом (ОМЛ М7).

Сравнительный анализ морфо-цитохимических особенностей вариантов острых миелобластных лейкозов (МО — МЗ) выявил, что по мере созревания лейкозной популяции увеличивается процент клеток, содержащих азурофильную зернистость и палочки Ауэра, а также усиливается активность гранулоцитарных ферментов. Содержание миелопероксидазы (1,76 ± 0,13 ед.) в миелобластах М2 достоверно выше (р < 0,01), чем в Ml (0,28 ± 0,04 ед.) при ОМЛ, а в лейкозных промиелоцитах (2,76 ±0,17 ед.) выше (р < 0,01), чем в миелобластах М2, что соответствует исследованиям авторов [16, 25, 32, 65, 78, 81, 84, 97, 139]. Однако, в доступных нам литературных источниках мы встретили разные данные по количеству выявленного в миелобластах гликогена с помощью ШИК—реакции и по количеству изоэнзимов неспецифической эстеразы. Некоторые авторы не выявили различий количества ШИК-положительного вещества в бластных клетках МО — МЗ вариантов ОМЛ [65, 94]. В нашей работе количество ШИК-положительного вещества в бластных клетках Ml и М2 вариантах ОМЛ (0,48 ± 0,13 и 0,68 ±0,15 ед.) было одинаковым (р > 0,01), однако в бластных клетках МО (0,14 ± 0,04 ед.) достоверно меньше (р < 0,01), а в клетках МЗ (91,71 ±0,14) достоверно выше (р < 0,01), чем в Ml и М2. Содержание изоэнзимов неспецифической эстеразы было близким при Ml, М2 и МЗ вариантах ОМЛ (0,43 ± 0,07 ед., 0,58 ± 0,13 ед. и 0,56 ± 0,15 ед.), а при МО (0,09 ± 0,01) достоверно ниже (р < 0,01).

Для получения морфометрических параметров из стандартных ЦЦФ в компьютер вводилось по 105 изображений бластных клеток для каждого человека, отобранных подряд. Из-за очень малого процентного содержания в костном мозге практически здоровых людей, бластные клетки отбирались ,не менее чем из 5-7 цитоцентрифугатов каждого донора. Результаты измерений представлялись в виде таблиц в формате программы Excel (Microsoft) и в виде каталога клеток. Для сравнения значимости различий между средними значениями выборок использовали t-критерий в случае нормального распределения и хи-квадрат в случае всех остальных типов распределения, а также дисперсионный анализ.

Для дискриминации бластных клеток костного мозга здоровых людей по площади и ЯЦС, за основу был взят интервал М ± SD, а эти два показателя выбраны на основе морфологической характеристики бластных клеток [65, 84]. По литературным данным отмечено, что именно такой интервал чаще применяется для анализа гетерогенной популяции клеток [61, 63]. Количественное выражение данных (М ± SD) имеет преимущество перед субъективной градацией (0, 1, 2) и позволяет сравнивать результаты, вводя такие понятия, как достоверность различий. Более того, воспроизводимость морфометрии выше воспроизводимости субъективной оценки [1, 50, 80].

По результатам исследования выявлено, что в норме в костном мозге преобладают бластные клетки средних размеров, которые составляют 71,9%. При этом, 12,3% этих клеток имеют очень высокое ЯЦС, 74,8% - высокое ЯЦС и 12,9% - среднее ЯЦС. Среди клеток мелких размеров преобладают клетки с высоким ЯЦС — 58,9% и очень высоким — 39,3%. А в популяции крупных клеток преобладают клетки с высоким и средним ЯЦС - 66,1% и 30,6% соответственно. Морфологическая гетерогенность размеров бластных клеток здоровых людей объясняется тем, что клетки находятся в разных фазах клеточного цикла [30, 69, 92, 140].

Результаты компьютерной морфометрии показали, что морфологическая гетерогенность бластных клеток костного мозга выявлена у всех больных ОМЛ, обследованных нами в первом остром периоде до начала полихимиотерапии. Более того, отмечены выраженные индивидуальные различия комбинаций исследуемых признаков.

Сравнительный анализ полученных морфометрических характеристик бластных клеток всех вариантов ОМЛ с «контрольной группой» показал, что почти все основные морфометрические параметры бластных клеток представленных групп имеют достоверные различия в средних значениях (р < 0,05).

Площадь бластных клеток является наиболее наглядным и информативным показателем из геометрических параметров, который отражает размер клеток [39, 43, 76, 93]. Средние значения площади бластных клеток костного мозга при вариантах МО и Ml по полученным нами данным увеличены в среднем на 16,5% по сравнению с бластными клетками здоровых людей, при варианте МЗ - на 18,6%, при варианте М5 - на 25,2%, а при вариантах М2 и М4 эти значения уменьшены на 13,4% и 11,1% соответственно. Средние значения площади ядер бластных клеток при варианте МО превышают средние значения ядер «контрольной группы» в среднем на 7,5%, при Ml - на 23,0%, при М5 - на 12,7%, а при М2 и М4 -имеют меньшие значения на 16,9% и 12,9%. Интересно отметить, что средние значения ЯЦС имеют достоверные различия (р < 0,05) при всех вариантах ОМЛ, кроме М4. Процент бластных клеток с неправильной формой ядра увеличивается по мере их созревания среди миелобластных лейкозов, а именно от МО варианта к МЗ, что в доступной нам литературе не описано.

Сравнительный анализ средних значений площадей бластных клеток между группами больных ОМЛ показал отсутствие достоверных различий (р > 0,05) для вариантов МО и МЗ, а также М2 и М4. Это объясняется тем, что популяции бластных клеток вариантов МО и МЗ представлены в основном мезо- и макрогенерациями, а популяции М2 и М4 максимально гетерогенны по размерам бластных клеток. Однако, средние значения площадей ядер клеток и их факторов формы 1 и 2 этих вариантов достоверно отличались (р < 0,05).

По полученным нами морфометрическим параметрам мы провели сравнительный анализ процентного соотношения миелобластов трех типов в соответствии с ФАБ-критериями в группах больных ОМЛ с вариантами МО — МЗ. Мие лоб ласты при ОМЛ М2 и ОМЛ МЗ имеют свои характерные особенности, в то время как миелобласты при ОМЛ МО по этим параметрам сходны с миелобластами при ОМЛ Ml.

Так, при ОМЛ М2 в клеточной популяции преобладали миелобласты 2-го типа (73,8%), а на долю миелобластов 1-го и 3-го типа пришлось 16,7% и 9,5% соответственно, что находит подтверждение в работах [16, 65, 87, 139].

При варианте МЗ миелобласты 3-го типа по нашим данным составили 42,4%, миелобласты 2-го типа — 33,2% и миелобласты 1-го типа — 24,4%. Большинство исследователей говорят о том, что при остром промиелоцитарном лейкозе основную долю в популяции составляют миелобласты 3-го типа [3, 16, 65, 73, 78, 84]. Однако, эти данные основываются на морфологическом исследовании, а значит носят описательный характер. Работ по изучению миелобластов при ОМЛ МЗ на основе морфометрическом методе исследования мы не встретили.

В литературе сведения о процентном соотношении миелобластов при ОМЛ МО также противоречивы и субъективны. Одни авторы отмечают преобладайте в популяции этого варианта миелобластов 1-го типа [8, 74, 78, 106], другие — миелобластов как 1-го, так и 2-го типа [66, 94]. Полученные нами данные согласуются с последними исследователями. Миелобласты 1-го типа при вариантах МО и Ml составили 54,7% и 48,3% соответственно, миелобласты 2-го типа - 42% и 49%, а миелобласты 3-го типа - всего 1,3% и 2,7%. Возможно, неоднородность этих результатов связана с тем, что недостаточно измерение только одних геометрических параметров бластных клеток и необходимо к морфометрическим характеристикам добавить цветные и текстурные.

Таким образом, компьютерный анализ изображения дает очень важную дополнительную информацию, которую трудно или невозможно получить при помощи других методов. При этом можно с высокой точностью измерять не только сдвиги кривой распределения бластных клеток по размерам, но и более тонкие изменения, в частности формы клеток, их ядер и -ЯЦС, что увеличивает чувствительность и специфичность методики тестирования. Полученные результаты исследования показали, что метод компьютерной морфометрии бластных клеток на стандартных препаратах костного мозга позволяет в цифровых значениях геометрических параметров клеток охарактеризовать микро-, мезо- и макрогенерации и установить их соотношения в норме и при различных вариантах острого миелоидного лейкоза. Проведена работа по получению морфометрических параметров бластных клеток костного мозга здоровых людей и больных острыми миелобластными лейкозами, которая в будущем позволит применить их для количественной цитохимии, а также оценить и понять индивидуальную и внутригрупповую вариабельность совокупности цитологических признаков лейкозных клеток.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Краснова, Любовь Сергеевна, 2009 год

1. Автандилов Г.Г. Перспективы развития компьютерной цитогистопатологии. // Архив патологии. 1993. - №2. - С. 3-5.

2. Амелюшкина В.А. Новая технология для стандартизированного приготовления цитологических препаратов. // Лабораторная медицина, 2003. -№ 3. С. 13 - 18.

3. Анишин А.В., Арустамян Ю.С., Сарычева Т.Г. и др. Принципы построения программно-аппаратных средств автоматизированного рабочего места врача-лаборанта. // Клин. лаб. диагностика. — 1997. — №10.-С. 20-23.

4. Архипова Н. В. Влияние времени проведения анализа на конечные параметры периферической крови. // Клин. лаб. диагн. — 2005. — № 1. -С. 37-38.

5. Байдун Л.В., Капшор С.А., Парпара А.А. и др. Автоматическая эритроцитометрия в роботизированном микроскопе МЕКОС-Ц1. // Клин. лаб. диагн. 2003. - № 6. - С. 39^2.

6. Баранова О. Ю., Френкель М. А., Волкова М. А., Тупицын Н. Н. Острый промиелоцитарный лейкоз: проблемы диагностики и возможности современной терапии. // Гематол. и трансфузиол. 2003. - № 4. - с. 3-11.

7. Баранова О.Ю., Волкова М.А., Френкель М.А. и др. Первичные острые миелоидные лейкозы с миелодисплазией: клинико-лабораторные особенности и прогноз. // Гематол. и транфузиол. — 2005. т. 50. - №4. - С. 10-20.

8. Березная И.Я., Гуревич Е.Я., Мацко Д.Е., Михальченко А.И. Теория и практика в создании автоматизированной интеллектуальной системы распознавания гистологических препаратов. // Арх. патологии. — 1993. № 4. - С. 40-43.

9. Большакова Г.Д. Приготовление мазков периферической крови теперь не зависит от мастерства лаборанта. // Научно-практич. журн. «Клинико-лабораторный консилиум» . 2005. — №6. - С. 21.

10. Боровиков В. Statistica. Искусство анализа данных на компьютере. // СПб и др., 2001.

11. Верденская Н.В., Виноградов А.С., Иванова И.А. и др. Сегментация изображений в системе автоматического анализа клеточного состава периферической крови. // Клинич. лаб. Диагностика. 1999. - №10. -С. 25-26.

12. Воробьев И.А., Захарова А.И., Атауллаханов Ф.И. и др. Определение условий компьютерной записи микроскопического изображения на примере кариоцитов периферической крови. // Пробл. гематол. — 1998. -№3. С. 14-20.

13. Воробьев И.А., Худолеева О.А., Рощупкина Т.Д., Грецов Е.М. Иммунофенотипирование опухолей системы крови и лимфатических опухолей. Часть П. Острые лейкозы. // Гематол. и трансфузиол. -2005. т. 50. - № 3. - с. 8-14.

14. Гематологический атлас. Настольная книга врача-лаборанта. / Козинец Г.И., Сарычева Т.Г., Луговская С.А. // М.: Практическая медицина, 2008. — 187 с.

15. Диагностика лейкозов. Атлас и практическое руководство. / Глузман Д.Ф., Абраменко И.В., Скляренко Л.М., Крячок И.А., Надгорная В.А. К.: Морион, 2000. 224 с.

16. Домрачева Е.В., Асеева Е.А. Достижения и перспективы гематологической цитогенетики (по материалам кариологическойлаборатории гематологического научного центра РАМН). // Гематол. и трансфузиол. 2001. — т. 46. — № 3. - с. 14—18.

17. Дризе Н.И. Различия между лейкозными и нормальными кроветворными стволовыми клетками. // Онкогематология. — 2006. — № 1-2.-С.

18. Дружинин Ю.О., Краснов А.Е. Информационные средства обработки и морфометрического анализа изображений клеток. // Сб. тр. РАН Инт пробл. упр. 1998. - № 7. - С. 57-58.

19. Исследование системы крови в клинической практике. / Под ред. Козинца Г.И., Макарова В.А. // М.: Триада-Х, 1997. 480 с.

20. Кинетические аспекты гемопоэза. /Под ред. Козинца Г.И., Гольдберга Д.Е. // Томск: Изд-во Том. ун-та, 1982. 312 с.

21. Клетки крови и костного мозга. Цветной атлас. / Козинец Г.И., Шишканова З.Г., Сарычева Т.Г. // М.: Медицинское международное агентство, 2004. — 203 с.

22. Клетки крови: современные технологии исследования. / Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А., Боев С.Ф., Сазонов В.В. // М.: Триада-Фарм, -2002.-451с.

23. Козинец Г.И., Гусев А.А., Антипов Н.Н. и др. Автоматический анализ мазков крови: пересчет количества клеток с плоскости на объем. // Клин. лаб. диагн. 2000. - № 9. - С. 33-34.

24. Козинец Г.И., Дульцина С.М., Захарова А.В. и др. Цитологическая диагностика острых лейкозов на основе классификации ФАБ и новых цитохимических критериев. // Гемат. и трансф., 1986. № 9. — с. 8-14.

25. Козинец Г.И., Котельников В.М., Погорелов В.М. Применение компьютеров в гематологических цитологических исследованиях. // Лаб. Дело. 1990. - №3. - С. 21-25.

26. Козинец Г.И., Созонов В.В., Гусев А.А. и др. Опыт использования системы автоматической микроскопии периферической крови

27. АСПЕК» в лабораторной практике. // Клин. лаб. диагн. 2000. - № 10.-С. 2.

28. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии. / Автандилов Г.Г. // М.: РМАПО. 1996. — 256с.

29. Коробова Ф.В. Компьютерная морфометрия тромбоцитов периферической крови здоровых людей. // Автореф.канд. мед. наук. М., 2001.

30. Котельников В.М. Параметры пролиферации гемопоэтических клеток в клинике гемобластозов. // Автореф. докт. мед. наук. — М.1991.

31. Кочемасов В. В., Саутина В. О., Воробьев А. И. Приоритетные направления развития фундаментальных научных исследований по проблеме гемобластозов до 2010 г. // Гематол. и трансфузиол. — 2007. -№ 5. с. 3-10.

32. Кровь: клинический анализ и цитохимия. / Козинец Г.И.,

33. B.М.Погорелов, О.А.Дягилева, И.Н.Наумова. // Санкт-Петербург: «Абрис +». 2003. - 188 с.

34. Лабораторная диагностика лейкозов. / Морозова В.Т. // Ленинград: Медицина, 1977. — 152 с.

35. Лабораторная диагностика лейкозов. Учебное пособие. / Луговская

36. C.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е. // Тверь: Губернская медицина, 1999.-78 с.

37. Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови. / Шмаров Д.А., Козинец Г.И. // М.: Медицинское международное агентство, 2004. — 128 с.

38. Макаренков А.С., Терехов С.М., Калашникова А.Е. и др. Использование компьютерных систем анализа изображений в исследованиях на клетках человека in vitro. II Медицинская генетика : Ежемесячный научно-практ. журнал. 2003. - Том 2,N 4 . - С. 170-174.

39. Малахов В. Н., Исаева О. М., Сердюк А. П. и др. Показатели качества гематологических исследований в здравоохранении РФ по данным ФСВОК. // Клин. лаб. диагн. 2006. - № 6. - С. 36-42.

40. Маркина И.Г. Клиническое значение иммунофенотипирования острых нелимфобластных лейкозов. // Дис. .канд. мед. наук. — М., 2000.

41. Медицинская морфометрия. Руководство. / Автандилов Г.Г. // М.: Медицина, 1990. 384 с.

42. Медовый В. С., Николаенко Д. С., Парпара А. А. и др. Автоматизация микроскопических анализов мазков крови и контроль качества с применением референсных виртуальных слайдов. // Клин. лаб. диагн. -2008. —№6.— С. 46-51.

43. Медовый В. С., Парпара А. А., Пятницкий А. М. и др. Методики автоматизированной микроскопии биоматериалов (обзор литературы) Клин. лаб. диагн. 2006. - № 7. - С. 15-20.

44. Меньшиков В. В. Точность, неопределенность и прослеживаемость в клинических лабораторных исследованиях. // Клин. лаб. диагн. — 2007.-№9.-С. 33-34.

45. Меньшиков В. В. Эталоны, стандартные образцы и образцы сравнения в клинической лабораторной аналитике. // Клин. лаб. диагн. 2008. - № 9. - С. 47-48.

46. Морфологические особенности острых лейкозов. / Козинец Г.И., Файнштейн Ф.Э., Хохлова М.П. и др. // Тбилиси: Сабчота Сакартвело, 1979.-212 с.

47. Муравская Н. П. Проблемы создания эталонной базы в области лабораторной медицинской аналитики. // Клин. лаб. диагн. — 2008. — №9.-С. 41.

48. Острые лейкозы. / Ковалева Л.Г. // М., 1990. 272 с.

49. Петросян Э. А., Горбов JI. В., Петросян Н. Э. Методика определения степени погрешности индексов лейкоформулы в клинической практике. // Клин. лаб. диагн. 2005. - № 1. - С. 47-50.

50. Плясунова С.А., Балугян Р.Ш., Хмельницкий KJS., Медовый B.C. и др. Автоматизированные методики микроскопических анализов мазков крови — медицинские испытания комплекса МЕКОС-Ц2. // Клин. лаб. диагн. 2006. - № 10. - С. 22-39.

51. Погорелов В. М., Дягилева О. А., Луговская С. А., Козинец Г. И. Принципы и возможности стандартизации морфоцитохимической диагностики острых лейкозов. // Клин. лаб. диагн. — 2006. — № 7. — С. 20-38.

52. Погорелов В. М., Дягилева О. А., Козинец Г. И. Введение в аналитическую цитохимию острых лейкозов (лекция). // Клин. лаб. диагн. 2005. - № 8. - С. 25-32.

53. Погорелов В.М. Автореф. .док. мед. наук. М., 1989.

54. Погорелов В.М., Иванова И.А., Верденская Н.В., Виноградов А.Г., Гусев А.А., Сазонов В.В., Козинец Г.И. «АСПЕК» отечественная система автоматической микроскопии мазков периферической крови. // Лаборатория. - 1999. - N. 4. - с. 16-17.

55. Погорелов В.М., Козинец Г.И. Диагностическая значимость морфологических особенностей эритроцитов в мазках периферической крови. // Гематол. трансфузиол. 2005. - Т. 50. - № 5. -С. 13-17.

56. Погорелов В.М., Козинец Г.И. Морфология клетки золотой стандарт клинической гематологии. // Пробл. гематол. - 1998. - № 2. -С. 5-10.

57. Погорелов В.М., Медовый B.C., Балабуткин В.А. Методы компьютерной цитологии в гематологических исследованиях. // Клин, лаб. диагностика. 1997. - №11. - С. 40-44.

58. Погорелов В.М., Медовый B.C., Хазем Г.М., Козинец Г.И. Анализ клеточного изображения. // Клин. лаб. диагностика. 1995. - №3. — С. 40-43.

59. Программное лечение лейкозов. / Под ред. Савченко В.Г. // М., 2008. 487с.

60. Руководство по гематологии: в 3 томах. / Под ред. Воробьева А.И. 3-е изд., перераб. и допол. // М.: Ньюдиамед. 2002. - Т. 1. - 280 с.

61. Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н., Исаев В. Г. и др. Острые промиелоцитарные лейкозы: эпоха новых знаний и достижений. // Гематол. и трансфузиол., 2001. — № 3. — с. 26-35.

62. Славинский А.А. Критерий функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, основанные на компьютерном анализе изображения и люминесценции. // Автореф.док. мед. наук. М., 2000.

63. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение. / Чертков И.Л., Гуревич О.А. // М.: Медицина, 1984. 238 с.

64. Стуклов Н.И. Компьютерная морфометрия ретикулоцитов в норме и при анемических состояниях. // Автореф.канд. мед. наук. М., 2004.

65. Тимкина Е.Н. Острый лимфобластный лейкоз: компьютерный цитологический анализ бластных клеток. // Автореф.канд. мед. наук. М., 1989.

66. Френкель М.А. Морфофункциональная характеристика бластных клеток при гемобластозах. // Автореф.док. мед. наук. М., 1989.

67. Френкель М.А. Современная диагностика острых лейкозов (лекция). // Клин. лаб. диагностика. 1999. - № 1. - С. 25-32.

68. Френкель М.А., Тупицын Н.Н., Волкова М.А., Флейшман Е.В. Острый миелобластный лейкоз с минимальной дифференцировкой (МО). // Гематол. и трансфузиол., 1998. т. 43. - №4. - с. 9-13.

69. Цветной атлас системы клеток крови. Один источник и четыре составные части миелопоэза. / Погорелов В.М., Козинец Г.И., Дягилева О.А. // М.: Практическая медицина, 2007. 176 с.

70. Цитофотометрия гемопоэтических клеток. / Козинец Г.И., Котельников В.М., Гольдберг В.Е. // Томск: Изд-во Том. ун-та, 1986. -224 с.

71. Цитохимическая характеристика гемопоэтических клеток здоровых людей. Методические рекомендации. / Козинец Г.И., Дульцина С.М., Дягилева О.А. // М., 1980. 38 с

72. Чертков И.Л., Дризе Н.И. Взлеты и падения клеточной гематологии за три четверти века. // Гематол. и трансфузиол., 2001. — т. 46. — № 3. — с. 10-14.

73. Bain В. Leukemia Diagnosis. Oxford: Blackwell Science Ltd 1999.-200 p.

74. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT et al. A variant form of hypergranular promyelocyte leukaemia (M3). // Br. J. Haematol., 1980. Vol. 44. - P. 169-170.

75. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR et al. Proposals for the classification of acute leukeamias. French— Amirican-British (FAB) co-operative group. // Br. J. Haematol., 1976. — Vol. 33.-P. 451-458.

76. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR et al. Proposal for the recognition of minimally differentiated acute myeloid leukaemia (AML-M0). // Br J Haematol. 1991. - Vol. 78. - P. 325-329.

77. Bins M. Morfometry of white blood cells. // Pure & Applied Chemistry, 1985. Vol. 57, № 4. - P. 599-601.

78. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med 1997.-Vol.3.-P. 730-37.

79. Brunning R. D. Classification of Acute Leukaemias. // Semin. Diagn. Pathol. 2003. - Vol. 20, № 3. - P. 142-153.

80. Brunning R. D., McKenna RW. Tumors of the bone marrow. Washington: Armed Forces Inst Pathol 1993. 406 p.

81. Campbell A., Johnson F., Strutt S. The Virtual Film Library: a multi site model for morphology education. // Int. J. Lab. Hematol. 2008. - Vol. 30. (Suppl. 1).-P. 140.

82. Carolyn Owen, Michael Barnett, Jude Fitzgibbon. Familial myelodysplasia and acute myeloid leukaemia — a review. // Br. J. Hematol. — 2008. — Vol. 140.-№2-P. 123-132.

83. Clinical Hematology. Sandoz Atlas. / Hoffbrand A.V., Pettit J.E. // London, 1988.-292 p.

84. Danny H., O'Sullivan G. et al. Evaluation of the CellaVision DM96 for the enumeration of the bone marrow nucleated differential cell count. // Int. J. Lab. Hematol. 2008. - Vol. 30. (Suppl. 1). - P. 8.

85. Efrench M., Bryon P.A., Fiere D. Et. Al. Quantitative cytology of acute adult leukemia // Transplant Clin immunol. ХШ, Excerpta Medica. -1981.-P. 224-228.

86. Fan-jun С., Ai-de Y., Hong-bao F. The morphological studies on M2/t (8; 21) acute nonlymphocytic leukemia. // J.of Tongji Med.University, 1994. -Vol. 14, № 1. P. 38-41.

87. Gahn В., Haase D., Unterhalt M. et al. De novo AML: cytogenetic and prognostic significance. // Leukaemia. 1996. - Vol. 10. - P. 946-951.

88. Garner D., MacAulays C., Harrison A., Palcic B. Automated quantative image cytometry and the asessment of malignant patentinal of displasia. // ASCT News. 1995. - № 16. - P. 27 - 30.

89. Garner D., Palcic В., MacAulay C., Hanselaar A. Image Cytometry and Rationl Screening Programs for the Early Detection of Cancer. // J. Clin. Cytol. and Cytopathol. 1996. - Vol. 40. - № 1. - P. 63.

90. Goasquen J., Matsuo Т., Cox C. et al. Evaluation of the dysmyelopoiesis in 336 patients with de novo acute myeloid leukaemia: major importance of dysgranulopoiesis for remission and survival. // Leukemia. — 1992. Vol. 6.-P. 520-525.

91. Guan Y., Hogge D.E. Proliferative status of primitive hematopoietic progenitors from patients with acute myelogenous leukemia (AML). Leukemia 2000. Vol. 14. - P. 2135-2141.

92. Gurevich, I.; Kharazishvili, D.; Murashov, D.; Salvetti, O.; Vorobjev, I. Technology for Automated Morphologic Analysis of Cytological Slides. Methods and results. / 18th International Conference. // Pattern Recognition, 2006. Vol. 4. - P. 711-714.

93. Harakati S. E., Al-Momen A. M. et al. Adult Acute Myeloblasts Leukaemia: Experience at King Khalid University Hospital. // Annals of Saudi Medicine. 1998. - Vol. 18. - № 3. - P. 221-225.

94. Hematology. 3rd Ed. / Williams W. J., Beutler E., Erslev A. J., Lichtman M. A. // Mc Graw-Hill book company, 1983. 1728 p.

95. Hope K.J., Jin L., Dick J.E. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity. // Nat. Immunol., 2004. Vol. 5. - P. 738-43.

96. Imkie M., Davis M.K. et al. Biphasic acute myeloid leukemia with near-tetraploidy and immunophenotypic transformation. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2004. - Vol. 128. - P. 448-451.

97. Jacquillat C., Flandrin G. et al. Correlation between cytological varieties and prognosis in acute lymphoblastic leukemia. // Proc. Amer. Ass. Cancer Res. 1973. - Vol. 14. - № 1 - P. 25-30.

98. James V., Winfield D.A., James N.T. Ultrastructural features of acute monoblastic leukaemia cells: A multivariate morphometric analysis. // Virchows Arch. Pathol. Anat., 1988. Vol. 414. - P. 21-27.

99. Kardum-Skelin I. Computerized image analysis. Symposium New Techniques in Clinical Cytology. // Anal. Quant. Cytol. Histol. 2006. -Vol. 46, №6.-P. 57-60.

100. Kuriyama K., Tomonaga M., Kobayashi T. et al. Morphological diagnoses of the Japan Adult Leukaemia Study Group acute myeloid leukaemia protocols: central review. // Int. J. Hematol. 2001. - Vol. 73. - P. 93-99.

101. Leclair S.J. Comparison study between Statspin Diffspin 2 slide spinner and the manual method for differential smears. // Amer. J. of Medical Technology. 2004. - Vol. 39, № 11. - P. 13-17.

102. Leif R.C., Harlow P.N., Vallario L.M. Production, Fixation and Staining of Cells on Slides for Maximum Photometric Sensitivity. // SPIE's Intern. Symp., Los Angeles, California USA, 22 29 Jan. - 1994. - Technical Absyracts. - P. 148.

103. Lessard J., Sauvageau G. Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells. Nature 2003. — Vol. 7. P. 255-60.

104. Licht J. D., Sternberg D. W. The Molecular Pathology of Acute Myeloid Leukaemia. // Am. J. Hematol., 2005. Vol. 137. - P. 277-291.

105. Look AT. Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. Science 1997.-Vol. 278.-P. 1059-1064.

106. Lubbert M, Oster W, Ludwig WD, Ganser A, Mertelsmann R, Herrmann F. A switch toward demethylation is associated with the expression of myeloperoxidase in acute myeloblasts and promyelocytic leukemias. Blood 1992. Vol. 80. - P. 2066-2073.

107. Machin S. J. Standardization and Quality Assurance. // Int. J. Lab. Hematol. 2008. - Vol. 30. (Suppl. 1). - P. 51-54.

108. Martin S. Tallman, D. Gary Gilliland, and Jacob M. Rowe Drug therapy for acute myeloid leukemia. // Blood. — 2005. Vol. 106. -P. 1154-1163.

109. Mathe G., Belpomme D., Dantcher D. et al. Immunoblastic acute lymphoid leukemia. // Biomedicine. 1974. - Vol. 20. - P. 333 - 340.

110. Matsuo T, Cox C, Bennett JM. Prognostic significance of myeloperoxidase positivity of blast cells in acute myeloblasts leukemia without maturation (FAB: Ml): An ECOG study. Hematol Pathol 1989. Vol. 3. - P. 153158.

111. Mauer A.M., Lampkin B.C. Cellular kinetics in acute leukemia. // Ohio J. Science.-1973.-Vol. 73,№ l.-P. 11-15.

112. McCulloch E.A., Howatson A.F., Buick R.N. et al. Acute myeloblasts leukemia considered as a clonal hemopathy. Blood Cells 1979. Vol. 5. — P. 261-82.

113. Meckenstock G., Aul C., Hildebrandt B. et al. Dyshematopoiesis in de novo acute myeloid leukaemia: cell biological features and prognostic significance. // Leuk. Lymphoma. 1997. Vol. - 29. - P. 523-531.

114. Metzger F. L. Tree-minute peripheral blood film evaluation: Preparing the film. // Vet. Med. 2004. - Vol. 131, № 8. - P. 13-20.

115. Nah E.H., Dong W.R. An image analytical study of acute lymphoblastic leukemia cells. // Korean J. Clin. Pathol., 1993. Vol. 13, № 2. - P. 13-17.

116. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference Leukocyte Differential Count and Evaluation of Instrumental Methods: Approved Standards. NCCLS H20-A Villanova, 1992.

117. Oster M., Margileth D., Simon R., Leventhal B. Prognostic value of size in acute lymphoblastic leukemia. // Br. J. Hematol. — 1976. Vol. 33. — P. 131-135.

118. Pan H., Yin C., Dyke T.V. Apoptosis and cancer mechanisms // Cancer Surveys. 1997. - Vol. 29. - P. 305-327.

119. Pardal R., Clarke M.F., Morrison S.J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer 2003. Vol. 3. - P. 895-902.

120. Park I.K., Qian D., Kiel M. et al. Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells. Nature 2003- Vol. 423. -P. 302-305.

121. Passegue E., Jamieson C.H., Ailles L.E. et al. Normal and leukemic hematopoiesis: are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? Proc Natl Acad Sci USA 2003- Vol. 100. P. 11842-9.

122. Peter H. Bartels, Ph.D., Hubert G. Karyometry: Correction Algorithm for Differences in Staining. // Anal. Quant. Cytol. Histol. 2009. - Vol. 31.-P. 63-73.

123. Piller G. J. Leukaemia A Brief Historical Review from Ancient Times to 1950. // Br. J. Hematol. - 2001. - Vol. 112. - P. 282-292.

124. Rajesh L., Pattari S. et al. Image morphometry of acute leukemias. Comparison between lymphoid and myeloid subtypes. // Anal. Quant. Cytol. Histol. 2004. - Vol. 26, № 1. - P. 57-60.

125. Rebar A., Metzger F. L. The Veterinary CE Advisor: Interpreting Hemograms in Cats and Dogs. // Vet. Med. 2001. - Vol. 96, № 12. - P. 1-12.

126. Renneville A., Roumier C., Biggio V. Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature. // Leukaemia. — 2008. — Vol. 22.-P. 915-931.

127. Reya Т., Morrison S.J., Clarke M.F. et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 2001. Vol. 414. - P. 105-111.

128. Rogers C.H. Blood sample preparation for automated differential systems. // Amer. J. of Medical Technology. 1973. - Vol. 39, № 11. - p. 44-52.

129. Satoh C., Ogata K. Hypothesis: Myeloid-restricted hematopoietic stem cells with self-renewal capacity may be the transformation site in acute myeloid leukemia. Leuk Res 2006. Vol. 30. - P. 491-495.

130. Saunders W. B. The complete blood count and bone marrow examination. Textbook of Small Animal Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, 3rd Ed.//Philadelphia, 1999.-P. 11-30.

131. Sefah K., Tang Z.W., Shangguan D.H. et al. Molecular recognition of acute myeloid leukemia using aptamers. // Leukaemia. 2009. - Vol. 23. -P. 235-244.

132. Shibata A, Bennett JM, Castoldi GL, Catovsky D, Flandrin G, Jaffe ES et al. Recommended methods for cytological procedures in haematology. International Committee for Standardization in Haematology (ICSH). Clin Lab Heamatol 1985. Vol. 7. - P. 55-74.

133. Smithson W., Gilchrist G., Burgert E. Childhood acute lymphoblastic leukemia. // Cancer. 1980. - Vol. 30. -№ 3 -P. 158-181.

134. Suic M, Boban D, Markovic-Glamocak M, Petrovecki M, Marusic M, Labar B. Prognostic significance of cytochemical analysis of leukemic M2 blasts. Med Oncol Tumor Pharmacother 1992. Vol. 9. - P. 41-45.

135. Surender Juneja. Morphology of the myeloproliferative disorders. // Int. J. Lab. Hematol. 2008. - Vol. 30. (Suppl. 1). - P. 51-61.

136. Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. // Leukaemia. — 2007. — Vol. 22. — P. 14-22.

137. Vardiman J. W., Harris N. L., Brunning R. D. The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. // Blood. -2002. Vol. 100. - № 7. - P. 2292-2302.

138. Wagner В A, Buettner GR, Oberley LW, Darby CJ, Burns CP. Myeloperoxidase is involved in H202-induced apoptosis of HL-60 human leukemia cells. J Biol Chem 2000. Vol. 275. - P. 22461-22469.

139. Weide M. V., Langenhuijsen M. M., Huijgens P. C. et al. Relation Between Leukaemic Cell Count and Degree of Maturation in Acute Myeloid Leukaemia. // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1987. - Vol. 23, № 8. -P. 1125-1129.

140. World Health Organization classification of tumors. Pathology and Genetics of tumors of Haematopoietic and Lymphoid Tissues / Eds E.S.Jaffer et al. Lyon, 2001.