Морфофизиологические реакции трансгенных растений табака на инсерцию гетерологичного гена HMG1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат наук Ермошин, Александр Анатольевич

• Ермошин, Александр Анатольевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Ермошин, Александр Анатольевич

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Ген ЯМСг, кодируемый им фермент

1.2. Семейство генов НЬЮ у растений

1.3. Регуляция активности фермента З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазы

1.4. Роль генов семейства НМО в жизни растений

1.5. Природные изопреноидные соединения и пути их синтеза

1.6. Роль изопреноидов в жизни растений

1.6.1. Роль стеринов в росте и развитии растений

1.6.2. Роль изопреноидов в устойчивости растений к стрессорам

1.7. Роль сесквитерпенов в микоризации растений

1.8. Трансгенные растения с геном hmgl

1.9. Копийность трансгенной вставки и наследование инсерции

2. Объекты и методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Получение трансгенных линий растений

2.2.2. Молекулярно-генетические методы

2.2.3. Физиолого-биохимические исследования

2.2.4. Анатомо-морфологические методы

2.3. Бактериальные штаммы, антибиотики, среды для культивирования, реактивы

2.4. Статистическая обработка данных

3. Результаты и обсуждение 45 3.1. Получение трансгенных линий Мсойапа ¡аЪасит Ь

3.2. Копийность вставки и её наследование

3.3. Определение экспрессии целевого гена в трансгенных растениях табака

3.4. Биохимическое исследование полученных трансгенных линий

3.4.1. Содержание липидов и стеринов в тканях табака

3.4.2. Включение 14С-фотоассимилятов в липофильные фракции листьев растений табака

3.5. Влияние экспрессии гетерологичного гена на морфологию растений табака

3.6. Влияние экспрессии гетерологичного гена кт%1 на организацию фотосинтетического аппарата листа табака

3.6.1. Структура мезофилла листа растений табака

3.6.2. Содержание фотосинтетических пигментов

3.7. Влияние гена на репродуктивную сферу растений

3.7.1. Содержание антоцианов в венчиках цветков

3.7.2. Влияние экспрессии гена на всхожесть семян

3.7.3. Влияние гена на мужскую генеративную сферу

3.7.4. Исследование женской генеративной сферы

3.8. Устойчивость трансгенных растений к стрессовым факторам

3.8.1. Устойчивость к высоким дозам ионов меди

3.8.2. Реакция растений табака на окислительный стресс, вызванный паракватом

3.8.3. Устойчивость к фитопатогенам

3.9. Влияние гена на степень микоризации трансгенных растений табака

Заключение

Выводы

Литература

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода

БАЛ - 6-бензиламинопурин, синтетический цитокинин

ИМК - индекс мембран клетки

ИУК - индолилуксусная кислота, синтетический ауксин КОХ - клеточный объем хлоропласта МЕР - метилэритритолфосфат МС - среда Мурасиге и Скуга

НУК - нафтилуксусная кислота, синтетический ауксин ОМГ-КоА - фермент З-окси-З-метилглутарил коэнзим А редуктаза ОТ - обратная транскрипция п.о. - пар оснований

ПОЛ - перекисное окисление липидов мембран

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СОД - фермент супероксиддисмутаза

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТМ - тяжелые металлы

ТХУ - трихлоруксусная кислота

УППЛ - удельная поверхностная плотность листа

358 СаМУ - промотор вируса мозаики цветной капусты

СТАВ - цетилтриметиламмоний бромид

НМО, кт% - ген, кодирующий З-окси-З-метилглутарил коэнзим А редуктазу

ЬВ - питательная среда для бактерий Лурия-Бертани прШ- ген неомицинфосфотрансферазы II

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Морфофизиологические реакции трансгенных растений табака на инсерцию гетерологичного гена HMG1»

Введение

Актуальность. Современная физиология и биохимия растений с помощью методов генной инженерии и биотехнологии позволяет решать как фундаментальные научные задачи, связанные с изучением роли отдельных генов или метаболических путей в жизни клетки, так и прикладные, например, создание сельскохозяйственных форм с повышенной продуктивностью, улучшенными пищевыми и вкусовыми качествами, устойчивостью к болезням и фитофагам. Интерес к растениям вызван тем, что они играют в биосфере Земли и жизни человека важнейшую роль, формируя первичную биологическую продуктивность и урожай, используются как источник химического сырья, биологически активных веществ и конструкционных материалов. Клетки растений, в отличие от клеток животных, сохраняют в течение длительного времени свойство тотипотентности, легко вводятся в культуру, поэтому биотехнологические и генно-инженерные манипуляции с ними представляются достаточно простыми и удобными. В настоящее время ведутся интенсивные споры о безопасности генной инженерии растений, её необходимости как инструмента экспериментальной биологии и практической деятельности. Тем не менее, большое количество научных коллективов и ученых в мире уже сейчас согласны с тем, что данная область займёт лидирующее положение в фундаментальных и прикладных биологических исследованиях, а также в практике XXI столетия.

Для растений характерен богатый вторичный метаболизм. Самый многочисленный класс вторичных метаболитов у них - изопреноиды. Он насчитывает несколько десятков тысяч индивидуальных веществ, и с каждым годом этот список расширяется. К классу изопреноидных соединений относятся многие растительные гормоны (фитогормоны) -абсцизовая кислота, гиббереллины, брассиностероиды, цитокинины. Молекулы, связанные с основным метаболизмом растений, такие как

каротиноиды, фитол хлорофиллов, стерины мембран, убихиноны и пластохиноны также имеют изопреноидную природу. Соединения специфического обмена веществ - стероидные гликоалкалоиды, сесквитерпеновые фитоалексины и фитонциды, изопрен, компоненты эфирных масел и другие - тоже принадлежат классу изопреноидов.

В растениях существует два метаболических пути синтеза изопреноидов - ацетатно-мевалонатный, локализованный в цитоплазме клетки (MVA-путь), и 2-мети л-0-эритритол-4-ф о с ф атн ый (МЕР-путь), реализующийся в хлоропласте.

До сих пор достоверно неизвестно, насколько данные пути могут взаимодействовать друг с другом, могут ли они обмениваться интермедиатами, способен ли один заменить другой.

Для решения данной проблемы удобно применение генно-инженерных методов, позволяющих направленно ингибировать или усиливать экспрессию ключевых генов определённого метаболического пути.

Изучение ацетатно-мевалонатного пути биосинтеза изопреноидов представляет особый интерес в связи с тем, что данный метаболический путь отвечает за синтез в растениях цитокининов, брассиностероидов и стеринов мембран, участвующих в регуляции роста и развития, а также в формировании неспецифической устойчивости растений к стрессорам различной природы. Кроме того, из мевалоновой кислоты образуются многие сесквитерпены, которые являются фитоалексинами и аттрактантами, а также, возможно, антиоксидантами.

Ключевым этапом в синтезе изопреноидов в цитозоле является образование мевалоновой кислоты. Этот этап катализируется З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазой, кодируемой генами семейства hmg. Поэтому инсерция гена hmgl, регулирующая синтез вторичных метаболитов изопреноидной природы, может быть интересна для получения трансгенных растений с полезными свойствами, такими как высокая устойчивость к

абиотическим и биотическим факторам и/или большая продуктивность. Для последующего использования таких трансгенных растений необходимо изучение их физиологии.

Целью нашей работы было изучение роли гена hmgl в жизни растительного организма на примере трансгенных моделей.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести трансформацию Шсойапа 1аЪасит конструкциями, несущими ген из АгаЫд.ор$1$ ШаНапа в прямой и обратной ориентациях относительно конститутивного промотора 3588 СаМУ.

2. Доказать трансгенную природу полученных линий, наличие в них экспрессии целевого гена, провести анализ наследования трансгенной вставки в первом семенном поколении.

3. У трансгенных и контрольных растений оценить накопление стеринов как продуктов метаболизации мевалоната (общее количество, синтез по включению 14С02).

4. Изучить анатомо-морфологические (мезоструктура фототрофных тканей, размеры листа) и физиолого-биохимические (интенсивность фотосинтеза, содержание пигментов) характеристики листьев растений, особенности строения и состояния генеративной сферы.

5. Выявить устойчивость трансгенных и контрольных линий к биотическим и абиотическим стрессовым факторам (по ПОЛ, активности ферментов СОД и гваяколовой пероксидазы, накоплению пролина).

6. Определить степень микоризации трансгенных и нетрансгенных растений.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Инсерция гетерологичного гена и изменение его экспрессии

вызывает морфогенетические эффекты у растений табака: регулирует формирование мужского и женского гаметофитов, листьев, их фотосинтетическую активность.

2. Ген hmgl вовлечен в формирование ответных реакций растений табака на действие стрессовых факторов абиотической (ионы меди, гербицид паракват) и биотической природы (инфекция Pseudomonas syringae и Envinia carotovorä).

3. Трансгенные растения табака с усиленной экспрессией гена hmgl имеют более высокую степень микоризации, чем контрольные растения и растения с подавленной экспрессией.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в уточнении роли гена hmgl в регуляции морфогенетических и физиолого-биохимических процессов в растении.

Результаты исследования использованы в лекционных курсах «Биохимия вторичного обмена», «Фитоиммунитет», «Генетика развития растений» для студентов магистратуры, обучающихся по направлению «Биология» и при подготовке учебного пособия «Биохимия вторичного обмена».

Результаты могут представлять интерес для целей практической селекции при создании растений с повышенной продуктивностью и устойчивостью к комплексу стрессовых факторов.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение физиологии трансгенного растения табака, содержащего гетерологичный ген hmgl из арабидопсиса. Показано, что усиление его экспрессии приводит к увеличению размеров листа, изменению размеров внутренней ассимиляционной поверхности.

Впервые показано, что у трансгенных растений табака при подавленной экспрессии гена hmgl увеличивается доля абортивных семязачатков и стерильной пыльцы.

Получены приоритетные данные о вовлеченности гена hmgl в формирование устойчивости растений к ряду стрессовых факторов, таких как действие ионов меди, окислительный стресс, вызванный паракватом,

инфицирование фитопатогенами, а таюке во взаимодействие растений с микоризообразующими грибами.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на I и II Всероссийских с международным участием молодежных конференциях «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 2010, 2012), IX чтениях памяти акад. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2011), съезде ОФР (Нижний Новгород, 2011), Всероссийских симпозиумах «Физиология трансгенного растения» (Москва, 2010, 2012), международных молодежных конференциях «Ломоносов» (Москва, 2010, 2012, 2014), международных конференциях «Eurobiotech» (Краков, 2010, 2011), ежегодных собраниях общества экспериментальных биологов (SEB Annual meeting) (Зальцбург, 2012; Валенсия, 2013), Всероссийской конференции «Физиология, биохимия и биотехнология растений: взгляд в будущее» (Томск, 2013), Международной конференции «Биология растений in vitro» (Казань, 2013), Всероссийской молодежной школе «Биология растительной клетки» (Звенигород, 2014), Всероссийском конгрессе молодых биологов «Симбиоз-Россия - 2014» (Екатеринбург, 2014).

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям: к.б.н., доц. Киселевой И.С. и к.б.н., н.с. Алексеевой В.В. за помощь в выборе темы исследования, ценные советы и замечания при планировании эксперимента и обсуждении результатов, за постоянную и всестороннюю поддержку; коллектив лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН за любезно предоставленные генетические конструкции, коллектив кафедры - за моральную поддержку.

Финансовая поддержка. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке проектов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» и программы развития УрФУ.

1. Обзор литературы 1.1. Ген HMG, кодируемый им фермент

Фермент З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим A (HMG-CoA, ОМГ-КоА) редуктаза катализирует реакцию образования мевалоната. Она является лимитирующей стадией в синтезе изопреноидов в цитозольном или ацетатно-мевалонатном биосинтетическом пути. Этот фермент обнаружен у эукариот и прокариот (Goldstein, Brown, 1990; Basson et al., 1986; Bach, 1987). Сравнение последовательностей аминокислот и филогенетический анализ выявили наличие двух классов ОМГ-КоА-редуктаз, возникших, предположительно, в ходе дивергентной эволюции. Класс I - ферменты эукариот и некоторых архебактерий, класс II обнаружен у эубактерий и большинства архебактерий. Эукариотические формы фермента закреплены на эндоплазматическом ретикулуме, тогда как прокариотические ферменты являются растворимыми (Stermer et al., 1994).

Археи, эубактерии и животные имеют только один ген HMG, хотя у омаров обнаружены как растворимые, так и мембраносвязанные изоферменты, которые кодируются одним геном. Дрожжи имеют две изоформы ОМГ-КоА редуктазы, кодируемые генами HMG1 и HMG2 (Bochar et al., 1999; Hedí et al., 2004). У растений, в клетках которых существуют мевалонат-зависимый и мевалонат-независимый пути синтеза изопреноидов, есть несколько изоферментов, вероятно возникших в результате дупликации генов и последующей их дивергенции (Laule et al., 2003).

Строение и локализация фермента

Каталитический домен ОМГ-КоА редуктазы высоко консервативен у эукариот, тогда как мембранный домен, имеющий от двух до восьми трансмембранных петель, высоко вариабелен и может исчезать у некоторых прокариот. У человека ген HMG, кодирующий одну из форм ОМГ-КоА редуктазы, расположен на хромосоме 5 и имеет более 24,8 т.п.о. в длину. Он содержит 20 экзонов, варьирующих в размерах от 27 до 1813 пар оснований,

которые кодируют домен мембранного якоря (экзоны 2-10), гибкую линкерную область (экзоны 10 и 11), и каталитический домен (экзоны 11-20) (Fresen, Rodwell, 2004).

Фермент имеет димерный активный центр, одна часть которого связывает НАДН или НАДФН для катализа, вторая связывает кофермент А. КоА-связывающий сайт имеет в своем составе консервативные остатки аминокислот, участвующих в катализе и сохранившиеся в обоих классах ферментов: глутамат, лизин, гистидин и аспартат (Fresen, Rodwell, 2004).

В отличие от каталитического центра, С- и N- концевые фрагменты области каталитических доменов не показывают большого сходства между ферментами человека, бактерии Р. mevalonii и растений (Lawrence et al., 1995; Tabernero et al., 1999; Istvan, Deisenhofer, 2000).

Фермент эукариот локализован в эндоплазматической сети, где он заякорен N-концевым участком, тогда как HMG-редуктаза прокариот растворена в цитозоле клетки. Механизм катализа

Реакция, катализируемая ОМГ-КоА редуктазой, описывается следующим уравнением:

ОМГ-КоА + 2 НАДФН + 2 Н*-> 2 Мевалонат + 2 НАДФ+ KoA-SH. Реакция стереоспецифична: (Я)-ОМГ-КоА изомер не является субстратом для фермента (Bochar et al., 1999)

Катализируемая ферментом реакция - трехступенчатая и включает этапы (Bochar et al., 1999; Fresen, Rodwell, 2004):

Этап 1: ОМГ-КоА + НАДФН + Н+-» [Мевалдил-КоА] + НАДФ

Этап 2: [Мевалдил-КоА] —> [Мевальдегид] + KoA-SH

Этап 3: [Мевальдегид + НАДФН + Н1—> Мевалонат + НАДФ

1.2. Семейство генов HMG у растений

Совершенствование и удешевление методов секвенирования ДНК позволили установить у разных биологических видов последовательность около 150 генов, кодирующих фермент ОМГ-КоА редуктазу.

Изучены гены или последовательности кДНК, кодирующие ОМГ-КоА редуктазы таких видов как арабидопсис, томаты, гевея, картофель (Learned, Fink, 1989; Choi et al., 1992; Chye et al., 1992; Denbow et al., 1996). Показано, что ОМГ-КоА редуктаза в растениях кодируется небольшим мультигенным семейством.

Изучение растительных генов семейства HMG началось после работ двух групп исследователей (Learned, Fink, 1989; Caelles et al., 1989), которые независимо друг от друга клонировали ген HMG1 из библиотеки кДНК Arabidopsis thaliana. Авторами определена нуклеотидная последовательность этого гена. Отмечена высокая консервативность С-концевого домена фермента, содержащего каталитический сайт, и его гомологичность таковому дрожжей, человека, хомяка и дрозофилы, в отличие от вариабельного N-концевого домена (Learned, Fink, 1989; Caelles et al., 1989).

Позднее было обнаружено наличие в Arabidopsis thaliana второго гена семейства HMG - HMG2 (Enjuto et al., 1994). Оба гена имеют сходное строение и состоят из четырех экзонов и трех небольших интронов. Кодирующие области генов сходны, однако 5'- и 3'-концевые участки значительно различаются. В экспрессии генов семейства также наблюдаются определенные различия: мРНК HMG1 обнаружена во всех тканях растения, в то время как локализация мРНК HMG2 ограничена проростками, корнями и соцветиями, то есть зонами активных меристем (Enjuto et al., 1994).

Использование в качестве зонда фрагмента гена HMG1 из Arabidopsis thaliana позволило выявить нуклеотидную последовательность генов семейства HMG Solanum tuberosum - HMG1, HMG2, HMG3. Показана

различная картина экспрессии этих генов в ответ на поранение, обработку арахидоновой кислотой и инокуляцию различными расами фитофторы. Это позволило авторам сделать вывод о наличии двух независимых каналов для биосинтеза стеринов и сесквитерпенов в тканях картофеля в норме и в ответ на действие биотических стрессоров (Choi et al., 1992). Показано, что гены HMG2 и HMG3 имеют тканеспецифичные отличия в экспрессии, в частности, в генеративных органах: HMG2 экспрессируется в молодых бутонах и зрелых чашелистиках, a HMG3 - в лепестках и пестике.

Данные о тканеспецифичной экспрессии генов семейства HMG подтверждаются работами на гевее (Chye et al., 1992). Показано, что экспрессия гена HMG3 является конститутивной благодаря промотору, сходному с промотором генов домашнего хозяйства, в то время как HMG1 интенсивно экспрессируется в млечниках и индуцируется этиленом. Таким образом, ген HMG1 участвует в биосинтезе соединений, входящих в состав латекса, a HMG3 - в биосинтезе изопреноидов, необходимых для поддержания жизнедеятельности растения (Chye et al., 1992).

1.3. Регуляция активности фермента З-окси-З-метилглутарил-КоА

редуктазы

Изучение трехмерной структуры каталитического домена ОМГ-КоА-редуктазы из бактерии Pseudomonas mevalonii и из тканей Homo sapiens, а также применение сайт-направленного мутагенеза выявили особенности регуляции работы данного фермента. Она осуществляется на транскрипционном и посттрансляционном уровнях, что может привести к более чем 200-кратному внутриклеточному измененшо активности (Goldstein, Brown, 1990; Enjuto et al., 1994). На уровне транскрипции экспрессию гена регулирует стерол-связывающий белок 2 (SREBP-2), участвующий в регуляции количества транскриптов гена HMG в ответ на изменение в уровне стеринов (Horton et al., 2002). Кроме того, и у животных,

и у растений активность фермента регулируется обратимым фосфорилированием серина, находящегося в положении 872, что снижает его активность (Sipat, 1982; Rüssel et al., 1985; Sato et al., 1993). Известны протеинкиназы, которые инактивируют ОМГ-КоА редуктазу животных. Имеются гомологи этих протеинкиназ у дрожжей и растений (Halford, Paul, 2003). Эти ферменты были выделены и очищены из большого числа видов растений. Имеются убедительные иммунологические доказательства их родства с протеинкиназами, принадлежащими к группе SNF1-родственных киназ (SnRKl) (Ball et al., 1995; Sugden et al., 1999). Кроме того, каталитическая область гена HMG1 из арабидопсиса экспрессирована в клетках кишечной палочки, где она инактивировалась SnRKl цветной капусты в результате фосфорилирования 577 серина от С-концевого фрагмента белка (Dale et al., 1995). Сайт фосфорилирования метиошш-лизнн-тирозин-аспарагин-аргенин-серин-серин-аргенин-аргенин-изолейцин сохраняется у всех растительных ОМГ-КоА редуктаз. Именно первый остаток серина в последовательности является мишенью для фосфорилирования (Halford, Hardie, 1998). Этот сайт пригоден для фосфорилирования, так как остаток серина находится в гидрофобном окружении в позиции -5 и +4, а также в окружении основных остатков в положении -3 и -4 (соответствующие остатки выделены жирным в указанной выше последовательности). Сайт регуляторного фосфорилирования ОМГ-КоА редуктазы хомячка содержит последовательность метионин-валин-гнстидин-аспарагин-аргенин-сернн-лизин-изолейцин-аспарагин-лейцнн-серин, которая также может фосфорилироваться (Sato et al., 1993). В дрожжевом ферменте отсутствует сайт для фосфорилирования SNF1 протеинкиназой, поэтому у дрожжей активность ОМГ-КоА редуктазы не регулируется обратимым фосфорилированием.

1.4. Роль генов семейства HMG в жизни растении

У арабидопсиса обнаружено два гена - HMG1 и HMG2, кодирующих З-окси-З-метилглутарил-КоА редуктазу. Для этих генов были получены и описаны мутанты арабидопсиса (Suzuki et al., 2004). Мутанты по гену hmgl показали плейотропные фенотипы (карликовость, раннее старение, мужская стерильность), hmg2 мутанты не имели явных морфологических отличий от контроля (Suzuki et al., 2004). Другими авторами показана функциональная активность гена HMG1 (Learned, Fink, 1989; Dale et al., 1995). Прямых доказательств функциональности гена HMG2 в растениях арабидопсиса долго не существовало, но считалось, что он работает также как и HMG1 потому, что уровень стеринов и тритерпеноидов у hmgl-мутштов незначительно ниже, чем у растений дикого типа (Ohyama et al., 2007). Сузуки с соавторами показали, что у растений арабидопсиса с полной блокадой гена HMG1 сохранялась активность фермента на уровне 20% от активности у растений дикого типа, что, возможно, связано с функционированием гена HMG2 (Suzuki et al., 2004, 2009).

Японскими исследователями сделана попытка создать двойной мутант с генами hmgl и hmg2, в котором полностью был бы блокирован ацетатно-мевалонатный путь биосинтеза изопреноидов, однако такие растения не были получены, что доказывает важность данного метаболического пути для выживания растений (Suzuki et al., 2009).

Растения, гомозиготные по гену HMG1, обладают мужской стерильностью, что связано с нарушением деления клеток тапетума микроспороцитов. Стерильные гаметофиты характеризуются абберациями, связанными с нарушением структуры мембранных элементов. Изучение экспрессии генов HMG1 и HMG2 в пыльниках растений арабидопсиса дикого типа показало, что HMG1 экспрессируется в тканях тапетума и микроспорах, тогда как HMG2 экспрессируется только в микроспорах. Таким образом, ОМГ-КоА редуктаза играет важную роль в развитии

мужских гаметофитов. Это указывает на то, что вклад интермедиатов МЕР-пути недостаточен для развития мужского гаметофита (Suzuki et al., 2004). С момента открытия этого пути главным вопросом в исследованиях было выявление возможности пересечения цитозольного и хлоропластного метаболических путей. Предполагается, что на уровне изопентенилпирофосфата возможно пересечение цитозольного и пластидного путей биосинтеза изопреноидов (Bick, Lange, 2003). Удобной моделью для получения ответа на этот вопрос могли бы быть двойные мутанты по генам hmgl и htng2. Однако двойные гомозиготы не были получены в связи с дефектами в развитии мужского гаметофита. Ультраструктурные исследования показали, что у них нарушены процессы новообразования мембран ЭПР, при этом морфология пластид не отличалась от контрольных вариантов. Это говорит о том, что биосинтез изопреноидов в пластидах не был затронут. Пластидного биосинтеза недостаточно для обеспечения цитозоля изопреноидными соединениями (Suzuki et al., 2009).

Сузуки с соавторами показали, что у растений арабидопсиса блокировка обоих генов семейства HMG не влияет на развитие женского гаметофита (Suzuki et al., 2009). Они объясняют это тем, что зародышевые мешки содержат значительно больше пластид, чем мужские гаметофиты, и недостаток изопреноидов в них покрывается за счет МЕР-пути. Гены семейства HMG молено отнести к генам основного метаболизма, которые, как правило, требуются как для развития мужского, так и женского гаметофита, однако, необычно то, что ОМГ-КоА редуктаза требуется только для развития мужского гаметофита (Suzuki et al., 2009).

1.5. Природные изоиреноидные соединения и пути их синтеза

Изопреноидами (терпеноидами) называют самый многочисленный класс природных соединений, углеродный скелет которых построен из

разветвленных Сз-единиц, называемых изопреновыми единицами, которые могут быть собраны в различные комбинации (Племенков, 2001).

Изопреноиды повсеместно распространены среди всех живых организмов. Они объединяются в один класс по биогенетическому признаку, поскольку ведут свое начало из единого предшественника -изопентенилпирофосфата (Васильева, Пасешниченко, 1999; Племенков, 2001).

Растения производят широкий спектр изопреноидов путем конденсации изопентенилпирофосфата и его изомера диметилаллилпирофосфата. Они синтезируются через два метаболических пути - ацетатно-мевалонатный (MVA-путь), локализованный в цитозоле, существующий у всех организмов и метилэритритолфосфатный (МЕР-путь), локализованный в хлоропластах и встречающийся в хлоропластах растений, у эубактерий, нескольких внутриклеточных паразитов и у зеленых водорослей и (Lichtenthaler et al., 1997; Пасешниченко, 1998; Rohmer, 1999; Ершов, 2005).

В цитоплазме синтезируются стерины, брассиностероиды и митохондриальные изопреноиды (например, боковые цепи убихинона). При этом изопентинилпирофосфат и его изомер в цитозоле синтезируются из ацетил-КоА. Всего этот путь включает семь ферментативных реакций. Ключевой реакцией, лимитирующей скорость производства цитозольных изопреноидов, является образование мевалоната (Schaller et al., 1995; Manzano et al., 2004; Suzuki et al., 2004). Эта реакция катализируется ОМГ-КоА редуктазой. Значимость данного фермента для синтеза изопреноидов была подтверждена в экспериментах с использованием природных ингибиторов, например, мевинолина также известного как ловастатин (Alberts et al., 1980; Bach et al., 1990).

В пластидах протекает только МЕР-путь (Rohmer, 1999; Lange et al., 2000; Lichtenthaler, 2000). Два пути могут быть связаны посредством обмена

метаболическими предшественниками через мембраны пластид (В ick, Lange, 2003; Laule et al., 2003; Dudareva et al., 2005; Wu et al., 2006). Принято считать, что образование гемитерпенов (С5), монотерпенов (Сю), дитерпенов (С20) и тетратерпенов (С40) происходит в пластидах, в то время как сесквитерпенов (С 15) и тритерпенов (С30) - в цитозоле (Ершов, 2005).

Эксперименты с обработкой растений интермедиатами разных путей биосинтеза изопреноидов показали возможность перекрестного обмена интермедиатами между хлоропластным и цитозольным путями. Метка из мевалонолактона и 1 -дезокси-О-ксилозы включалась как в пластидные, так и в цитозольные изопреноиды у ряски, арабидопсиса и табака (Schwender et al., 2001; Kasahara et al., 2002; Hemmerlin et al., 2003). Биосинтез изопреноидных соединений демонстрирует следующая схема (рис. 1.5.1):

Ацетнл-СоА 4.

HMG-CoA

2-С-метнл-0-эрптрол-4-фосфат

1

■I HMGR

^ Пзопентегаш Днметнлаллпл дпфосфат дпфосфат

Мевалоновая кислота

//

¡иисшсшш днметнлаллпл --—^

дпфосфат дпфосфат —♦ [Изопрен(С?]|

Дпметнлаштл Пзопентегаш

/ (Cs)

/

Герашшдифосфат—* ¡Монотерпены (Сю)

(Сю)

Фарнешцдифосфат (С15)

I

I

i

Герашштерашшдпфосфат (С20)

I

Сесквптерпены Фнтоаяекспны

Ц1гтерпено11ды (Q о)

Хлорофпллы

Токоферолы

Фшоалекспны

Гпбберелшшы

-* Тетратерпенопды(С4о) Каропшопды Абсщповая кислота

ф1гтостер1ШЫ Стерпны мембран Брассгаюстеропды

Прегашгрованные белки

Убтгашоны

Рис. 1.5.1. Пути биосинтеза изопренодных соединений в растительной

клетке

1.6. Роль нзопреноидов в жизни растений

Без участия изопреноидов невозможны такие процессы как рост и развитие растений, поскольку многие гормоны растений (гиббереллины, абсцизовая кислота, брассинолиды) относятся к этому классу соединений. Изопреноидные фрагменты входят в состав фото синтетических пигментов (фитол, каротиноиды) и переносчиков электронов (пренильные боковые цепи убихинонов, пластохинона). Изопреноиды участвуют в биосинтезе полисахаридов (полипренилфосфаты), стабилизируют внутриклеточные мембраны (стерины у эукариот и гопаноиды у бактерий). Однако большая часть известных к настоящему времени изопреноидов относится к веществам специализированного (вторичного) обмена растений (Гудвин, Мерсер, 1986; Племенков, 2001). Многие фитоалексины, репелленты, аттрактанты, токсины имеют изопреноидную структуру (Harborn, 1991, 1999; Farhi et al., 2011, Tholl, Lee, 2011).

По-видимому, основная роль изопреноидов, специфичных для определенных семейств, родов и видов (это главным образом moho-, сескви-, ди-, сестер- и тритерпеноиды), сводится к защите растений от различных неблагоприятных воздействий окружающей среды, в том числе от макро- и микровредителей (Пасешниченко, 1991; Gershenzon, Dudareva, 2007).

1.6.1. Роль стеринов в росте и развитии растений

Стерины, являющиеся особой группой изопреноидов, играют существенную роль в развитии всех эукариотических организмов. Такие стерины как холестерин животных, эргостерин дрожжей, ситостерин, стигмастерин и кампестерин растений являются неотъемлемыми компонентами мембран, участвуют в регуляции их текучести и проницаемости и могут влиять на активность связанных с мембраной ферментов, в том числе, компонентов путей сигналинга (Hartmann, 1998). Эти соединения являются предшественниками стероидных гормонов, в том

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ермошин, Александр Анатольевич, 2015 год

Литература

1. Андреева Е.А., Лутова Л.А. Устойчивость к солям меди и никеля у ¿¿>/-трансгенных растений картофеля // Экологическая генетика. 2004. Т. 2. С. 25-31.

2. Баврина Т.В., Миляева ЭЛ., Гетман И.А., Романов Г.А. Особенности наследования TPD-фенотипа у инерционного мутанта табака с длительным периодом цветения // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 5. С. 730-737.

3. Ботаника. Том 2. Физиология растений / под ред. Зитте П. и др..: «Академия», 2008.

4. Васильева И.С., Пасешниченко В.А. Биологически активные изопреноиды растений, их биосинтез и значение для биотехнологии // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. С. 521-535.

5. Воронина Л.П. Стероидные гормоны растений // Наука в России. 2008. №4. С. 19-26.

6. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. Фотосинтез. Дыхание. М.: Высшая школа, 1975. 392 с.

7. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986, 450 с.

8. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская A.A. и др. Стабильность экспрессии и наследование гена nptll в популяции трансгенных растений табака // Доклады Академии наук. 1999. Т. 369. С. 420-423.

9. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. 408 с.

10. Еремченко Л.А., Еремченко В.М. Атомно-абсорбционный анализ с графитовой печью. М.: МИМАС, 1999, 219 с.

11. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. и др. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. 430 с.

12. Ершов Ю.В. Метилэритритолфосфатный (немевалонатный) путь биосинтеза изопреноидов // Успехи биологической химии. 2005. Т. 45. С. 307-354.

13. Зиновьева C.B., Удалова Ж.В., Васильева И.С. и др. Роль изопреноидных соединений в адаптации растений к биогенному стрессу, вызванному паразитичесими нематодами // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. С. 533-541.

14. Калинкина Л.Г. Накопление пролина в клетках морской и пресноводной хлореллы в зависимости от концентрации NaCl в среде и интенсивности роста водорослей // Физиология растений. 1985. Т. 32. С. 42 52

15. Калинкина Л.Г., Строгонов Б.П. Содержание свободного пролина в клетках морской и пресноводной хлореллы при ингибировании гликолатного пути в условиях засоления // Физиология растений. 1986 Т. 33 С. 746-753.

16. Кандюк Р.П. Методы определения стеринов в морских объектах // Экология моря. 2002. Т. 59. С. 87-90.

17. Караваев В.А., Баулин А. М., Гордиенко Т. В. Изменения фотосинтетического аппарата листьев бобов в зависимости от содержания тяжелых металлов в среде выращивания // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 47-54.

18. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 321-336.

19. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

20. Лебедев В.Г., Шестибратов К.А., Шадрина Т.Е., Булатова И.В., Абрамочкин Д.Г., Мирошников А.И. Ко-трансформация осины и березы тремя областями Т-ДНК, находящимися на двух различных репликонах в одном штамме Agrobacterium tumefaciens II Генетика. 2010. T. 46. С. 1458-

21. Лутова Л.А., Проворова H.A., Тиходеев О.Н. и др. Генетика развития растений. Спб.: Наука, 2000. 547 с.

22. Лутова Л.А., Шумилина Г.М. Метаболиты растений и их роль в устойчивости к фитопатогенам // Экологическая генетика. 2003. Т. 1. № 10. С. 47-58.

23. Малева М.Г., Некрасова Г.Ф., Безель B.C. Реакция гидрофитов на загрязнение среды тяжелыми металлами // Экология. 2004. № 4. С. 266272.

24. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

25. Маркина Ж.В., Айздайчер H.A. Содержание фотосинтетических пигментов, рост и размер клеток микроводоросли Phaeodactylum tricornutum при загрязнении среды медью // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 343-347.

26. Метлицкая Л.В., Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И. Фитостерины и их роль во взаимоотношениях растений с паразитарными грибами (на примере семейства Pythiaceae) II Успехи современной биологии. 1980. Т. 89. С. 28-39.

27. Методы биохимического исследования растений / А. И. Ермаков,

B. В. Арасимович, Н. П. Ярош и др. - Л.: Агропромиздат, 1987. 430 с.

28. Миляева Э.Л., Гурко H.A., Баврина Т.В. и др. Особенности развития мужской репродуктивной сферы инерционного мутанта табака с продолжительным периодом цветения // Физиология растений. 2002. Т. 49.

C. 526-534.

29. Мокроносов А.Т., Борзенкова P.A. Методика количественной оценки и функциональной активности фотосинтезирующих тканей и органов // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции ВНИИ растениеводства. 1978. Т. 61. С. 119.

30. Мокроносов А.Т. Онтогенетический аспект фотосинтеза. М.: Наука, 1981. 196 с.

31. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений / под ред. Вл.В. Кузнецов, В.В.Кузнецов, Г.А. Романов. М.: Бином, 2012. 487 с.

32. Муравьёва Д.А., Бубенчикова В.Н., Беликов В.В. Спектрофотометрическое определение суммы антоцианов в цветках василька синего // Фармакология. 1987. Т. 36. С. 28-29.

33. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена прШ у трансгенных растений табака {Шсойапа 1аЪасит Ь.) с множественными инсерциями Т-ДНК // Генетика. 2000. Т. 36. С. 427-430.

34. Пасешниченко В.А. Новый альтернативный путь биосинтеза изопреноидов у эубактерий и растений // Биохимия. 1998. Т. 63. №2. С. 171-72.

35. Пасешниченко В.А. Терпеноиды и стероиды в жизни растений // Успехи биол. химии. 1991. Т. 32. С. 197-221.

36. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988. 271 с.

37. Племенков В.В. Введение в химию природных соединений. Казань, 2001.376 с.

38. Плотникова Л.Я. Иммунитет растений и селекция на устойчивость к болезням и вредителям / Под ред. Ю.Т. Дьякова. М.: КолосС, 2007. 359 с.

39. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода: учебное пособие / Под ред. И.П. Ермакова. М.: КДУ, 2007. 140 с.

40. Поройко В.А., Рукавцова Е.Б., Орлова И.В., Бурьянов Я.И. Фенотипические изменения трансгенных растений табака с антисмысловой формой гена hmgl II Генетика. 2000. Т. 36. С. 1200-1205.

41. Романов Г.А. Как цитокиннны действуют на растения // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 295-319.

42. Селиванов И.А. Микориза и другие формы консортивных связей в природе. Пермь: ПГПИ, 1983. 74 с.

43. Титов А. Ф., Таланова В. В., Казнина Н. М. и др. Устойчивость растений к тяжелым металлам. Карельский научный центр РАН. Петрозаводск, 2007. 172 с.

44. Холодова В.П., Волков К.С., Кузнецов Вл.В. Адаптация к высоким концентрациям солей меди и цинка хрустальной травки и возможность их использования в целях фиторемедиации // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 848-858.

45. Хрипач В.А., Жабинский В.М., Лахвич Ф.А. Брассиностероиды. Минск: наука и техника, 1993. 287 с.

46. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и её регуляция. Уфа: Гилем, 2001. 160 с.

47. Эсау К. Анатомия растений. М.: Мир, 1969. 660 с.

48. Affek Н.Р., Yakir D. Protection by isoprene against singlet oxygen in leaves // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 269-277.

49. Akiyama K., Hayashi H. Strigolactones: Chemical signals for fungal symbionts and parasitic weeds in plant roots // Ann. Bot. 2006. V. 97. P. 925931.

50. Akiyama K., Matsuzaki K., Hayashi H. Plant sesquiterpenes induce hyphal branching in arbuscular mycorrhizal fungi // Nature. 2005. V. 435. P. 824-827.

51. Alberts A.W., Chen J., Kuron G. et al. Mevinolin: a highly potent competitive inhibitor of hydroxy-coenzyme A reductase and a cholesterol-lowering agent//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 3957-3961.

52. An G, Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary Vectors // Plant Mol. Biol. Manual / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Yerma D.P.S. Dordrecht:

KluwerAcad. Publ., 1988. A3. P. 1-19.

53. Apel K., Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction // Annu. Rev. Plant Biol. 2004. V. 55. P. 373-399.

54. Bach T.J., Lichtenthaler H.K. Plant growth regulation by mevinolin and other sterol biosynthesis inhibitors. Ecology and metabolism of plant lipids. Am. Chem. Soc. Symp. Ser. 325. Washington: American Chemical Society, 1987. P. 109-139.

55. Bach T.J. Synthesis and metabolism of mevalonic acid in plants // Plant Physiol, and Biochem. 1987. V. 25. P. 163-178.

56. Bach T.J., Wener T., Motel A. Some properties of enzyme involved in the biosynthesis and metabolism of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA in plants // Recent Adv. Phytochem. 1990. V. 24. P. 1-82.

57. Baldwin I.T., Halitschke R., Paschold A. Volatile signaling in plant-plant interactions: "talking trees" in the genomics era // Science. 2006. V. 311. P. 812-815.

58. Ball K.L., Barker J.H.A., Halford N.G, Hardie, D.G Immunological evidence that HMG-CoA reductase kinase-A is the cauliflower homologue of the RKIN1 subfamily of plant protein kinases // FEBS Lett. 1995. V. 377. P. 189192.

59. Barna B., Adam A.L., Kiraly Z. Increased levels of cytokinin induce tolerance to necrotic diseases and various oxidative stress-causing agents in plants // Phyton (Austria) Special issue: «Free radicals». 1997. V. 37. Fasc. 3. P. 25-30.

60. Basson M.E., Thorsness M., Rine J. Saccharomyces cerevisiae contains two functional genes encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 5563-5567.

61. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. Rapid determination of free proline content for water stress studies // Plant Soil. 1973. V. 39. P. 205-207.

62. Beauchamp C., Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays

and an assay applicable to acrylamide gels // Anal. Biochem. 1971. V. 44. P. 276-287.

63. Behnke K.5 Ehlting B., Teuber M. et al. Transgenic, non-isoprene emitting poplars don't like it hot // Plant J. 2007. V. 51. P. 485-499.

64. Bick J.A., Lange B.M. Metabolic cross-talk between cytosolic and plastidal pathways of isoprenoid biosynthesis: unidirectional transport of intermediates across the chloroplast envelop membrane // Recent Adv. Phytochem. 2003. V. 145. P. 146-154.

65. Bochar D.A., Stauffacher C.V., Rodwell V.W. Sequence comparisons reveal two classes of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase // Mol Genet Metab. 1999. V. 66. P. 122-127.

66. Borowicz V.A. Do arbuscular mycorrhizal fungi alter plant-pathogen relations? // Ecology. 2001. V. 82. P. 3057-3068.

67. Brilli F., Barta C., Fortunati A. et al. Response of isoprene emission and carbon metabolism to drought in white poplar (Populus alba) saplings // New Phytol. 2007. V. 175. P. 244-254.

68. Bradford M.M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

69. Brundrett M.C. Mycorrhizal associations and other means of nutrition of vascular plants: understanding the global diversity of host plants by resolving conflicting information and developing reliable means of diagnosis // Plant and Soil. 2009. V. 320. P. 37-77.

70. Budar F., Thia-toong L., Van Montagu M., Hernalsteens J.-P. Agrobacterium mediated gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting T-DNA as a single Mendilian factor // Genetics. 1986. V. 114. P. 303-313.

71. Caelles C., Ferrer A., Balcells L., Hegardt F.G, Boronat A. Isolation and structural characterization of a cDNA encoding Arabidopsis thaliana 3-

hydroxy-3-methylglutaiyl coenzyme A reductase // Plant Mol. Biol. 1989. V. 13. P. 627-638.

72. Calogirou A., Larsen B.R., Kotzias D. Gas-phase terpene oxidation products: a review // Atmos. Environ. 1999. V. 33. P. 1423-1439.

73. Chance B., Maehly A.C. Assays catalase and peroxidase. Methods Enzymol. N.Y.: Academic Press, 1955. P. 764-775.

74. Chappel J., Wolf F., Proulx J. et.al. Is the reaction catalized by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase a rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plants? // Plant Physiol. 1995. V. 109. P. 1337-1343.

75. Choe S., Noguchi T., Fujioka S. et.al. The Arabidopsis dwf7/stel mutant is defective in the D7 sterol C-5 desaturation step leading to brassinosteroid biosynthesis // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 207-221.

76. Choi D., Bostok R.M., Avdiushko S. Lipid-derived signals that discriminate wound- and pathogen-responsive isoprenoid pathways in plants; methyl jasmonate and the fungal elecitor arachidonic acid induce different 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase genes and antimicrobial isoprenoids in Solarium tuberosum L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 2329-2333.

77. Choi D., Ward B.L., Bostock R.M. Differential induction and suppression of potato 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase genes in response to Phytophtora infestans and to its elicitor arachidonic acid // Plant Cell. 1992. V. 4. P. 1333-1344.

78. Chye M.L., Tan C.T., Chua N.H. Three genes encode 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in Hevea brasiliensis: hmgl and hmg3 are differentially expressed //Plant Mol. Biol. 1992. V.19. P. 473-484.

79. Clouse S.D. Plant development: A role for sterols in embryogenesis // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 601-604.

80. Clouse S., Feldmann K. Molecular genetics of brassinosteroid action / In Brassinosteroids: Steroidal Plant Hormones, edited by Sakurai A., Yokota T., Clouse S. - Tokyo: Springer, 1999. P. 163-190.

81. Clouse S., Sasse J. Brassinosteroids: essential regulators of plant growth and development // Annu Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 1998. V. 49. P. 427-451.

82. Dale S., Arro M., Becerra B. et al. Bacterial expression of the catalytic domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (isoform HMG1) from Arabidopsis thaliana, and its inactivation by phosphorylation at Ser577 by Brassica oleracea 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase kinase // Eur. J. Biochem. Biophys. 1995. V. 233. P. 506-513.

83. Denbow C J., Lang S. Cramer C.L. The N-terminal domain of tomato 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductases // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 9710-9715.

84. Diener A., Li H., Zhou W-X. et al. Sterol methyltransferase 1 controls the level of cholesterol in plants // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 853-870.

85. Dietz KJ. Redox control, redox signaling, and redox homeostasis in plant cells // Int. Rev. Cytol. 2003. V. 228. P. 141-193.

86. Dudareva N., Andersson S., Orlova I. et al. The nonmevalonate pathway supports both monoterpene and sesquiterpene formation in snapdragon flowers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 933-938.

87. Dudareva N., Negre F., Nagegowda D.A., Orlova I. Plant volatiles: recent advances and future perspectives // Crit. Rev. Plant Sci. 2006. V. 25. P. 417—440.

88. Duhl T.R., Helmig D., Guenther A. Sesquiterpene emissions from vegetation: a review // Biogeosci. Discuss. 2007. V. 4. P. 3987-4023.

89. Edwards K., Johnstone C., Thomson C.A. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

90. Edwards P., Ericsson J. Sterols and isoprenoids: signaling molecules derived from the cholesterol biosynthetic pathway // Annu Rev. Biochem. 1999. V. 68. P. 157-185.

91. Enjuto M., Balsells L., Campos N. et al. Arabidopsis thaliana contains two differentially expressed 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase genes, which encode microsomal forms of the enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 927-931.

92. Fabro G., Kovacs I., Pavet V. et al. Proline accamulation and AtP5CS2 gene activation are induced by plant-pathogen incompatible interactions in Arabidopsis II Mol. Plant Microbe Interact. 2004. V. 17. P. 343350.

93. Farese R.V., Herz J. Cholesterol metabolism and embryogenesis // Trends Genet. 1998. V. 14. P. 115-120.

94. Farhi M., Marhevka E., Masci T. et al. Harnessing yeast subcellular compartments for the production of plant terpenoids // Metab. Eng. 2011. V. 13. P. 474-481.

95. Folch J., Lees M., Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. V. 226. P. 497-509.

96. Fresen J.A., Rodwell V.W. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A (HMG-CoA) reductases // Genome Biol. 2004. V. 5. P. 248.

97. Friedrichsen D., Chory J. Steroid signaling in plants: from the cell surface to the nucleus // Bioessays. 2001. V. 23. P. 1028-36.

98. Fujioka S., Sakurai A. Biosynthesis and metabolism of brassinosteroids// Physiol. Plant. 1997. V. 100. P. 710-715.

99. Gachotte D., Meens R., Benveniste P. An Arabidopsis mutant deficient in sterol biosynthesis: heterologous complementation by ERG3 encoding a D7-C-5-desaturase from yeast // Plant J. 1995. V. 8. P. 407-416.

100. Gershenzon J. Plant volatiles carry both public and private messages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 5257-5258.

101. Gershenzon J., Dudareva N. The function of terpene natural products in the natural world //Nat. Chem. Biol. 2007. V. 3. P. 408-414.

102. Goldstein J.L., Brown M.S. Regulation of the mevalonate pathway // Nature. 1990. V. 343. P. 425^30.

103. Halford N.G., Hardie D.G. SNF1-related protein kinases: global regulators of carbon metabolism in plants? // Plant Mol. Biol. 1998. V. 37. P. 735-748.

104. Halford N.G, Paul M.J. Carbon metabolite sensing and signalling // Plant Biotech. J. 2003. V. 1. P. 381-398.

105. Harborne J.B. The comparative biochemistry of phytoalexin induction in plants //Biochem. Systematics a. Ecol. 1999. V. 27. P. 335-367.

106. Harborne J.B., Tomas-Barberan F.A. Ecological chemistry and biochemistry of plant terpenoids. Oxford, UK: Clarendon, 1991. 432 p.

107. Harker M., Holmberg N., Clayton J.C. et al. Enhancement of seed phytosterol levels by expression of an N-terminal truncated Hevea brasiliensis (rubber tree) 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase // Plant Biotechnol. J. 2003. V. l.P. 113-121.

108. Hartmann M. Plant sterols and the membrane environment // Trends Plant Sci. 1998. V. 3. P. 170-175.

109. He J-X., Fujika S., T-C. Li et.al. Sterols regulate development and gene expression in Arabidiopsis II Plant Physiol. 2003. V. 131. P. 1258-1269.

110. Hedl M., Tabernero L., Stauffacher C.V. Class II 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductases // J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 19271932.

111. Helmig D., Bocquet F., Pollmann J. Analytical techniques for sesquiterpene emission rate studies in vegetation enclosure experiments // Atmos. Environ. 2004. V. 38. P. 557-572.

112. Hemmerlin A., Hoefflen J.F., Mayer O. et al. Cross-talk between the cytosolic mevalonate and the plastidal methylerythritol phosphate pathways in tobacco bright yellow-2 cells // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 26666-26676.

113. Hey S.J., Powers S.J., Beale M.H. et al. Enhanced seed phytosterol accamulation through expression of a modified HMG-CoA reductase // Plant Biotechnol. J. 2006. V. 4. P. 219-229.

114. Horton J.D., Goldstein J.L., Brown M.S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver // J. Clin. Invest. 2002. V. 109. P. 1125-1131.

115. Istvan E.S., Deisenhofer J. The structure of the catalytic portion of human HMG-CoA reductase // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1529. P. 9-18.

116. Jang J.C., Fujioka S., Tasaka M. et al. A critical role of sterols in embryonic patterning and meristem programming revealed by the fackel mutants of Arabidopsis thaliana II Genes. Dev. 2000. V. 14. P. 1485-1497.

117. Kasahara H., Hanada A., Kuzuyama T. et al. Contribution of the mevalonate and methylerythritol phosphate rathways to the biosynthesis of gibberellins in Arabidopsis I I J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 45188-45194.

118. Khripach V., Zhabinskii V., de Groot A. Twenty years of brassinosteroids: steroidal plant hormones warrant better crops for the XXI century //Ann. Bot. 2000. V. 86. P. 441-447.

119. Koncz C., Shell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector//Mol.Gen.Genet. 1986. V. 204. P. 383-396.

120. Korth K.L., Stermer B.A., Bhattacharyya M.K. et al. HMG-CoA reductase gene families that differentially accumulate transcripts in potato tubers are developmentally expressed in floral tissues // Plant Mol. Biol. 1997. V. 33. P. 545-551.

121. Lange B.M., Rujan T., Martin W., Croteau R. Isoprenoid biosynthesis: the evolution of two ancient and distinct pathways across genomes //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 13172-13177.

122. Laule O., Furholz A., Chang H.S. et al. Crosstalk between cytosolic and plastidial pathways of isoprenoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 6866-6871.

123. Lawrence C.M., Rodwell V. W., Stauffacher C.V. The crystal structure of Pseudomonas mevalonii HMG-CoA reductase at 3.0 A resolution // Science. 1995. V. 268. P. 1758-1762.

124. Learned R.M., Fink G.R. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase from Arabidopsis thaliana is structurally distinct from the yeast and animal enzymes (isoprenoid biosynthesis/plant/suppression) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2779-2783.

125. Lichtenthaler H.K. Non-mevalonate isoprenoid biosynthesis: enzymes, genes and inhibitors // Biochem. Soc. Trans. 2000. V. 28. P. 785-789.

126. Lichtenthaler H.K., Schwender J., Disch A., Rohmer M. Biosynthesis of isoprenoids in higher plant chloroplasts proceeds via mevalonate-inderpendent pathway // FEBS Lett. 1997. V. 400. P. 271-274.

127. Lindsey K., Pullen M.L., Topping G.F. Important of plant sterols in pattern formation and hormone signaling // Trends Plant Sci. 2003. V. 8. P. 521— 525.

128. Lipp M., Bluth A., Eyquem F. et al. Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs // Eur. Food Res. Technol. 2001. V. 212. P. 497504.

129. Loivamaki M., Gilmer F., Fischbach R., Sorgel C. et al. Arabidopsis, a model to study biological functions of isoprene emission? // Plant Physiol. 2007. V. 144. P. 1066-1078.

130. Loreto F., Mannozzi M., Maris C. et al. Ozone quenching properties of isoprene and its antioxidant role in leaves // Plant Physiol. 2001. V. 126. P. 993-1000.

131. Loreto F., Sharkey T.D. A gas-exchange study of photosynthesis and isoprene emission in Quercus rubra L. // Planta. 1990. V. 182. P. 523-531.

132. Loreto F., Velikova V. Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage, quenches ozone products, and reduces lipid peroxidation of cellular membranes // Plant Physiol. 2001. V. 127. P.1781-1787.

133. Malec P., Maleva M., Prasad M.N., Strzalka K. Copper toxicity in leaves of Elodea canadensis Michx. // Bull. Environ. Contamination a. Toxicology. 2009. V. 82. P. 627-632.

134. Manzano D., Fernandez-Busquets X., Schaller H. et al. The metabolic imbalance underlying lesion formation in Arabidopsis thaliana overexpressing farnesyl diphosphate synthase (isoform IS) leads to oxidative stress and is triggered by the developmental decline of endogenous HMGR activity // Planta. 2004. V. 219. P. 982-992.

135. Matusova R., Rani K., Verstappen F.W. et al. The strigolactone germination stimulants of the plant-parasitic Striga and Orobanche spp. are derived from the carotenoid pathway // Plant Physiol. 2005. V. 139. P. 920-934.

136. Mayer U., Ruiz R.A.T., Berleth T. et al. Mutations affecting body organization in the Arabidopsis embryo //Nature. 1991. V. 353. P. 402-407.

137. Molinier J., Ries G., Zipfel C. Transgeneration memory of stress in plants //Nature. 2006. V. 442. P. 1046-1049.

138. Monson R.K., Fall R. Isoprene emission from aspen leaves: influence of environment and relation to photosynthesis and photorespiration // Plant Physiol. 1989. V. 90. P. 267-274.

139. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

140. Newsham K.K., Fitter A.H., Watkinson A.R. Arbuscular mycorrhiza protect an annual grass from root pathogenic fungi in the field // J. Ecol. 1995. V. 83. P. 991-1000.

141. Nugroho L.H., Verpoorte R. Secondary metabolism in tobacco // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2002. V. 68. P. 105-125.

142. Ohyama K., Suzuki M., Masuda K. et al. Chemical phenotypes of the hmgl and hmg2 mutants of Arabidopsis demonstrate the in planta role of HMG-CoA reductase in triterpene biosynthesis // Chem. Pharm. Bull. 2007. V. 55. P. 1518-1521.

143. Pawlowski W.P., Torbert K.A., Rines H.W., Somers D.A. Irregular patterns of transgene silencing in allohexaploid oat // Plant Mol. Biol. 1998. V. 38. P. 597-607.

144. Peng L., Kawagoe Y., Hogan P., Delmer D. Sitosterol-beta-glucoside as primer for cellulose synthesis in plants // Science. 2002. V. 295. P. 147-150.

145. Potrykus I., Paszkowski J., Saul M. et al. Molecular and general genetics of a hybrid foreign gene introduced into tobacco by direct gene transfer //Mol. Gen. Genet. 1985. V. 199. P. 169-177.

146. Pozo M.J., Azcon-Aguilar C. Unraveling mycorrhiza-induced resistance // Curr. Opin. Plant Biol. 2007. V. 10. V. 393-398.

147. Re E.B., Jones D., Learned R.M. Co-expression of native and introduced genes reveals cryptic regulation of HMG-CoA reductase expression in Arabidopsis thaliana II Plant J. 1995. V. 7. P. 771-784.

148. Rohmer M. The discovery of a mevalonate-independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria, algae and higher plants // Nat. Prod. Rep. 1999. V. 16. P. 565-574.

149. Russel D.V., Knight J.S., Wilson T.M. Pea seedling HMG-CoA reductases; regulation of activity in vitro by phosphorilation and Ca2+' and posttranslational control in vivo by phytochrome and isoprenoid hormones // Curr. Top. Plant Biochem. Physiol. 1985. V.4. P. 191-206.

Ill

150. Sallaud C., Meynard D., van Boxtel J. et al. Highly efficient production and characterization of T-DNA plants for rice ([Oryza sativa L.) functional genomics II Theor. Appl. Genet. 2003. V. 106. P. 1396-1408.

151. Sasaki K., Saito T., Lamsa M. et al. Plants utilize isoprene emission as a thermotolerance mechanism // Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. P. 12541262.

152. Sato R., Goldstein J.L., Brown M.S. Replacement of serine-871 of hamster 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase prevents phosphorylation by AMP-activated kinase and blocks inhibition of sterol synthesis induced by ATP depletion//Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 9261-9265.

153. Sbrana C., Giovannetti M. Chemotropism in the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae H Mycorrhiza. 2005. V. 15. P. 539-545.

154. Schaeffer A., Bronner R., Benveniste P., Schaller H. The ratio of campesterol to sitosterol that modulates growth in Arabidopsis is controlled by sterol methyltransferase 2; 1. // Plant J. 2001. V. 25. P. 605-615.

155. Schaller H., Grausem B., Benveniste P. et al. Expression of the Hevea brasiliensis (H.B.K.) Miill. Arg. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase 1 in tobacco results in sterol overproduction // Plant Physiol. 1995. V. 109. P.761-770.

156. Scheid M.O., Probst A.V., Afsar K., Paszkowsky J. Two regulatory levels of transcriptional gene silencing in Arabidopsis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 13659-13662.

157. Scheres B., McKhann H., van der Berg C. et al. Experimental and genetic analysis of root development in Arabidopsis thaliana II Plant Soil. 1996. V. 187. P. 97-105.

158. Schrick K., Mayer U., Horrichs A. et al. FACKEL is a sterol C-14 reductase required for organized cell division and expansion in Arabidopsis embryogenesis // Genes Dev. 2000. V. 14. P. 1471-1484.

159. Schrick K., Mayer U., Martin G. et al. Interactions between sterol biosynthesis genes in emdryonic development of Arabidopsis II Plant J. 2002. V. 31. P. 61-73.

160. Schwender J., Gemünden C., Lichtenthaler H.K. Chlorophyta exclusively use the 1-deoxyxylulose 5-phosphate/2-C-methylerythritol 4-phosphate pathway for the biosynthesis of isoprenoids // Planta. 2001. V. 212. P. 416-423.

161. Sharkey T.D., Singsaas, E.L. Why plants emit isoprene // Nature. 1995. V. 374. P. 769.

162. Sharkey T.D., Wiberley A.E., Donohue, A.R. Isoprene emission from plants: why and how // Ann. Bot. (Lond.). 2008. V. 101. P. 5-18.

163. Sharkey T.D., Yeh S. Isoprene emission from plants. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 407-436.

164. Sikes B.A., Cottenie K., Klironomos J.N. Plant and fungal identity determines pathogen protection of plant roots by arbuscular mycorrhizas // J. Ecol. 2009. V. 97. P. 1274-1280.

165. Simon K., Toomre D. Lipid rafts and signal transduction // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2000. V. 1. P. 31-39.

166. Sipat A.B. Hydroxymethylglutaryl CoA reductase (NADPH) in the latex of Hevea brasiliensis II Phytochem. 1982. V. 21. P. 2613-2618.

167. Souter M., Topping J., Pullen M. et al. Hydra mutants oí Arabidopsis are defective in sterol profiles and auxin and ethylene signaling // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 1017-1031.

168. Stermer B.A., Bianchini G.M., Korth K.L. Regulation of HMG-CoA reductase activity in plants II J. Lipid Res. 1994. V. 35. P. 1133-1139.

169. Sugden, C., Donaghy, P., Halford, N.G., Hardie, D.G. Two SNF1-related protein kinases from spinach leaf phosphorylate and inactivate 3-hydroxy-3 methylglutaryl-coenzyme A reductase, nitrate reductase and sucrose phosphate synthase in vitro II Plant Physiol. 1999. V. 120. P. 251-21 A.

170. Suzuki M., Kamide Y., Nagata N. et.al. Loss of function of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 1 (HMG1) in Arabidopsis leads to dwarfing, early senescence and male sterility, and reduced sterol levels II Plant J. 2004. V. 37. P. 750-761.

171. Suzuki M., Nakagawa S., Kobayashi K. et al. Complete blockage of the mevalonate pathway results in male gametophyte lethality // J. Exp. Bot. 2009. V. 60. P. 2055-2064.

172. Tabernero L.D., Bochar D.A., Rodwell V.W., Stauffacher C.V. Substrate-induced closure of the flap domain in the ternary complex structures provides new insights into the mechanism of catalysis by 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 7167-7171.

173. Tholl D., Lee S. Terpene specialized metabolism in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. 2011. 9. e0143.

174. Topping J.F., May V.J., Muskett P.R., Lindsey K. Mutations in the HYDRA1 gene of Arabidopsis perturb cell shape and disrupt embryonic and seedling morphogenesis // Development. 1997. V. 124. P. 4415-4424.

175. Uchiyama M., Mihara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissue by thiobarbituric acid test //Anal. Biochem. 1978. V. 86. P. 287-297.

176. Vickers C.E., Gershenzon J., Lerdau M. T. et al. A unified mechanism of action for volatile isoprenoids in plant abiotic stress // Nat. Chem. Biol. 2009. V. 5. P. 283-291.

177. Wu S., Schalk M., Clark A. et al. Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants // Nat. Biotechnol. 2006. V. 24. P. 1441-1447.

178. Zwenger S., Basu C. Plant terpenoids: applications and future potentials // Biotechnol. Mol. Biol. Rev. 2008. V. 3. P. 001-007.