Моноклональные антитела против ангиотензин-превращающего фермента для направленной доставки изотопов и генетического материала в эндотелий легких тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Гаврилюк, Виталий Дмитриевич

• Гаврилюк, Виталий Дмитриевич
• кандидат биологических наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гаврилюк, Виталий Дмитриевич

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Направленный транспорт веществ.

1.1.1. Введение.

1.1.2. Легочный эндотелий как мишень для направленной доставки лекарственных веществ.

1.1.3 Эндотелиальные антигены для направленной доставки лекарств к легким.

1.1.3.1. Ангиотензин превращающий фермент (АПФ).

1.1.3.2. Тромбомодулин (ТМ).

1.1.3.3. Поверхностные молекулы адгезии ICAM-1, РЕСАМ-1.

1.1.3.4. Другие антигены.

1.1.4. Антитело-зависимый направленный транспорт веществ к эндотелию легких.

1.1.4.1. Иммуносцинтиграфия.

1.1.4.2. Доставка фибринолитиков и антикоагулянтов.

1.1.4.3. Доставка антиоксидазных агентов.

1.1.4.4. Доставка липосом.

1.1.5. Доставка генетического материала к эндотелию легких.

1.1.5.1. Генная терапия легких.

1.1.5.2. Вектора для доставки генетического материала.

1.1.5.3. Невирусные методы доставки генов.

1.1.5.4. Вирусные вектора.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Модификация моноклональных антител против АПФ.

2.1.1 Мечение моноклональных антител радиоактивными изотопами.

2.1.1.1 Мечение антител радиоактивным изотопом иода.

2.1.1.1а. Мечение иодогеном.

2.1.1.16. Мечение реактивом Болтон-Хантера (Bolton-Hunter).

2.1.1.1с. Мечение хлорамином Т на бусах (iodo-beads).

2.1.1.2 Мечение антител радиоактивным изотопом индия (ш1п).

2.1.1.3 Мечение антител радиоактивным технецием (99Тс).

2.1.2 Биотинилирование антител.

2.1.2.1. Биотинилирование антител.

2.1.2.2. Изоэлектрофокусирование антител.

2.1.3 Получение биспецифических антител.

2.1.3.1 Конъюгирование антител или Fab фрагментов через SPDP.

2.1.3.2. Получение bis-конъюгированных антител.

2.2. Биораспределение и накопление в легких экспериментальных животных моноклональных антител, их конъюгатов и модификаций.

2.2.1. Биораспределение меченных моноклональных антител в организме экспериментальных животных.

2.2.2. Изолированные перфузированные легкие.

2.2.3. Изучение распределение эндотелиальных антигенов в сосудистом русле крысы.

2.3. Создание клеточной модели АПФ-зависимого направленного транспорта.

2.3.1. Получение вектора с полной последовательностью, кодирующей АПФ.

2.3.2. Культивирование и трансфекция СНО клеток.„.

2.3.3. Определение активности ангиотензин-превращающего фермента.

2.3.4. Иммуноферментный анализ содержания АПФ на клетках (CELL ELISA).

2.3.5. Электрофорез и Вестерн-блоттинг.

2.3.6. Иммуноцитохимический анализ клеточной культуры.

2.4. Конъюгирование антител против АПФ с генетическим материалом.

2.4.1 Конъюгирование олигонуклеотидов с моноклональными антителами.

2.4.2. Конъюгирование модельной днк с антителами.

2.5. Анализ взаимодействия моноклональных антител и их конъюгатов с АПФ.

2.5.1. Радиоиммуносорбция меченых антител на АПФ иммобилизованным на пластике.

2.5.2. Иммуносорбция активности АПФ из раствора.

2.5.3. Иммуноферментный анализ АПФ.

2.6. Конъюгирование моноклональных антител 9В9 с аденовирусом.

2.6.1. Получение аденовируса.

2.6.2. Взаимодействие вирусных частиц, покрытых конъюгатом 9В9-анти-кноб-РаЬ с клетками.

2.6.3. Определение активности люциферазы.

2.6.3.1. Определение активности люциферазы в лизатах клеточных культур.

2.6.3.2.0пределение активности люциферазы в гомогенатах органов.

2.6.4. Определение (З-галактозидазной активности.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Модификация антител против АПФ для визуализации сосудов легких и направленного транспорта лекарств к легочному эндотелию.

3.1.1. Сравнение различных методов-мечения антител радиоизотопами для визуализации сосудов легких.

3.1.2. Биотинилирование моноклональных антител к АПФ.

3.1.2.1 Подбор условий биотинилирования.

3.1.2.2. Проверка иммунологических свойств биотинилированых моноклональных антител 9В9.

3.1.2.3 Проверка антигеневязывающей активности биотинилированых антител 9В in vitro.

3.1.2.4. Проверка антигеневязывающей активности биотинилированых антител 9В9 in vivo.

3.1.3 Получение биспецифических антител - коньюгатов моноклональных антител к АПФ с другими антителами.

3.1.3.1. Получение коньюгата 9В9 и антител, направленных против FLAG эпитопа аденовируса.

3.1.3.2. Получение бис-коньюгатов антител.

3.1.3.3 Получение коньюгата моноклональных антител к АПФ с Fab фрагментом антител против поверхностного knob-белка аденовируса.

3.2 Сравнение разных антител к эндотелиальным антигенам в качестве вектора для направленной доставки лекарств к эндотелию сосудов легких.

3.2.1. Распределение эндотелиальных антигенов в сосудистом русле крысы.

3.2.2 Распределение меченых антител в организме.

3.2.3 Накопление меченных антиэндотелиальных антител в перфузированных легких

3.3. Создание клеточной модели АПФ-зависимого направленного транспорта лекарств в сосуды легких.

3.4. АПФ-зависимый направленный транспорт генетического материала к легочному эндотелию.

3.4.1. Коньюгирование антител с олигонуклеотидами.

3.4.3. АПФ-зависимый транспорт генов с помощью аденовируса.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моноклональные антитела против ангиотензин-превращающего фермента для направленной доставки изотопов и генетического материала в эндотелий легких»

Абсолютное большинство используемых в клинической практике лекарственных препаратов не являются специфичными к "месту" болезни или патологического процесса. Обычно, получаемый лекарственный препарат распределяется достаточно равномерно по всему организму, что, в свою очередь, требует повышения дозы препарата для достижения терапевтического эффекта в требуемом органе. Увеличение дозы лекарственного вещества часто приводит к возникновению нежелательных побочных эффектов.

Самым приемлемым решением этой проблемы является так называемый направленный транспорт лекарств, т.е. способность лекарственного вещества селективно накапливаться в органе (клетке) -мишени независимо от пути введения в организм.

Очевидно, что вещество, соответствующее этим требованиям, должно состоять, как минимум, из двух частей (компонентов). Один из компонентов должен каким-то образом узнавать и связываться с мишенью, а второй - собственно оказывать терапевтическое действие. На сегодняшний день наиболее универсальным "узнающе-связывающимся " веществом являются антитела. Антитела являются белковыми молекулами, специфически и с высокой аффинностью связывающиеся каким-либо антигеном. Соответственно, селективное накопление антител в органе-мишени будет зависеть от экспрессии антигена в данном органе. Кроме того, связывание антитела с антигеном в организме будет также зависеть от доступности антигена из кровотока, полостей организма или воздушных путей.

В 1986 г в лаборатории Молекулярной и Клеточной Кардиологии ВКНЦ АМН СССР была получена панель антител против ангиотензин-превращающего фермента. Одно из антител, 9В9, селективно накапливается в легких человека и крысы. До 35-40% дозы антител обнаруживается в легких экспериментальных животных через 2 часа после внутривенного введения (Danilov et al., 1987).

Так как антиген (АПФ) для антител 9В9 локализован на люминальной поверхности эндотелиальных клеток, и 100% легочных капилляров экспрессируют АПФ, то антитела 9В9 могут служить вектором для направленной доставки лекарств к эндотелию легких.

Было показано, что радиоактивно меченые антитела 9В9 сохраняют способность накапливаться в легких крыс после внутривенного введения, и могут быть использованы 9

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ПРОВЕДЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫНОСЯТСЯ НА ЗАЩИТУ:

1. Модифицированные и конъюгированные в оптимальных условиях моноклональные антитела 9В9 сохраняют антиген-связывающую способность и специфически накапливаются в легких экспериментальных животных.

2. Из нескольких исследованных анти-эндотелиальных антител на предмет специфичности и накопления в легких экспериметальных животных после внутривенного введения, наиболее специфическими являются антитела 9В9 направленные против ангиотензин-превращающего фермента.

3. Полученная линия клеток, экспрессирующих высокий уровень АПФ, может служить in vitro моделью для изучения АПФ-зависимого направленного транспорта лекарств и генетического материала в эндотелий легких.

4. Продемонстрирован успешный направленный транспорт генетического материала в эндотелий легких in vivo. Конъюгат моноклональных антител 9В9 с Fab фрагментом антител против кноб-белка аденовируса перенаправляет аденовирусный вектор к эндотелию легких после системного введения. При этом наблюдается 20-кратное увеличение экспрессии модельного гена в легких и статистически достоверное снижение экспрессии в других органах.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гаврилюк, Виталий Дмитриевич

ВЫВОДЫ

Выполненная работа позволяет сделать следующие выводы:

1. . Подобраны оптимальные условия для биотинилирования, введения радиоактивной метки и конъюгирования с другими антителами моноклональных антител против АПФ (9В9). Модифицированные, радиоактивно меченные и конъгированные с разными веществами моноклоналоные антитела 9В9 сохраняют антиген-связывающую способность и селективно накапливаются в легких крысы после внутривенного введения. Это позволяет использование этих антител как векторов для АПФ-зависимого транспорта веществ к легочному эндотелию.

2. Проведен сравнительный анализ нескольких анти-эндотелиальных антител с целью получения эффективных векторов для направленного транспорта лекарств к эндотелию легких. Показано, что наиболее эффективным и специфическим вектором (на крысиной модели) являются моноклональные антитела против АПФ -9В9.

3. Получена клеточная линия, экспрессирующая АПФ. Эта линия может служить моделью каппиляров легких in vitro, в контексте изучения возможности АПФ-зависимого транспорта лекарственных веществ к эндотелию легких.

4. Показано, что конъюгат антител 9В9 с Fab фрагментом анти-кноб антител перенаправляет аденовирусный вектор к эндотелию легких при системном введении в кровоток. При этом экспрессия модельного гена в легких экспериментальных животных увеличивается в 20 раз и значительно уменьшается в других органах.

5. Полученные результаты позволяют предложить использование конъюгатов антител против АПФ (9В9) в клинической практике для доставки генетического материала к легочному эндотелию с целью лечения гипертонии легочного генеза, опухолей легких и метастазов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Целью данной работы было исследование возможности антитело-опосредованного направленного транспорта лекарств и генетического материала через АПФ-зависимый путь.

I. Мы проверили влияние различных модификаций антител 9В9 на антигенсвязывающую способность и структуру этих антител, а также биораспределение модифицированных антител в организме животных.

Показано, что радиоактивно меченные в оптимальных условиях антитела 9В9 специфически связыватся с АПФ и сохраняют способность накапливатся в легких экспериментальных животных. Такие антитела можно успешно использовать для визуализации сосудистого русла легких и для диагностики некоторых патологических процессов (Danilov et al., 1989; Muzykantov and Danilov, 1995).

Мы показали, что введение биотиновых остатков в молекулу антитела практически не влияет на эффективность связывания антител 9В9 с ангиотензин-превращающим ферментом при низком соотношении биотин/антитела. При интенсивном биотинилировании происходит изменение изоэлектрической точки (pi) антител и частичная (или полная) денатурация белковой молекулы. Биотинилирование антител при высоком молярном соотношении биотин/белок приводит также к потере антителами антигенсвязывающей способностии и к ухудшению узнавания последних антимышиными иммуноглобулинами. Мы определили, что биотинилирование моноклональных антител 9В9 при молярном соотношении биотин/IgG равном 2-20 является наиболее оптимальным, так как антитела сохраняют свои иммунологические свойства. Было показано изменение внутриклеточного катаболизма биотинилированых антител, выражающегося в ускорении деградации биотинилированых 9В9. Интернализация биотинилированых антител пракически не отличается от интернализации интактных антител.

Результаты этой работы открыли возможность для направленной доставки в легкие антиоксидазных ферментов, активаторов плазминогена и антикоагулянтов, используя пару авидин-биотин. При этом все доставляемые вещества сохраняют свою функциональную активность (Muzykantov et al., 1994; 1996; Atochina et al., 1998), что позволяет применение полученных конъюгатов для лечения таких патологических процессов как повреждение в результате ишемии, гипероксии и воспалительных реакций в легких, а также в случае легочного эмболизма или диссеминированного отложения фибрина.

Мы получили конъюгаты антител 9В9 с антителами к поверхностным белкам аденовируса (антитела против FLAG-эпитопа и кноб-белка аденовируса) и показали, что эти биспецифические конъюгаты сохраняют способность накапливаться в легких экспериментальных животных после системного введения.

II. Мы проверили и показали, что для направленной доставки лекарств к легочному эндотелию можно использовать несколько анти-эндотелиальных векторов-антител, однако из всех проверенных антител наиболее специфическими для легочного эндотелия in vivo оказались антитела против АПФ - 9В9 (до 25-30% введенной дозы накапливается в легких, Danilov et al., 1988; 1989; 1991; Hiemisch et al., 1993). Способность 9B9 накапливаться в легких связана с неравномерностью распределения АПФ в кровеносном русле крысы -эндотелий небольших артерий и артериол сильно экспрессирует АПФ, тогда как в эндотелии аорты, крупных артерий и вен АПФ почти не встречается. Наиболее высокий уровень экспрессии АПФ наблюдается в капиллярах легких - почти 100 % капилляров легких показывают сильную иммунореактивность на АПФ, в то время как только 10-20% капилляров других органов экспрессируют АПФ (Franke et al., 1997; 1999; Gavrilyuk et al., 1999).

Важным является и то, что накопления антител 9В9 в легких крысы происходит независимо от пути введения (внутривенно, интраартериально или перитонеально). И в перфузирумых легких, и in vivo 9В9 накапливаются одинаково, что исключает влияние кровотока на распределение и накопление антител. Так как эндотелиальные антитела 9В9 интернализуются клетками эндотелия (Muzykantov et al., 1996), то возможно использование этих антител для внутриклеточной доставки лекарств и генного материала.

III. Для систематического исследования АПФ-зависимого направленного транспорта лекарств, генетического материала и других приложений, мы получили стабильную линию клеток, экспрессирующую высокий уровень АПФ. Взаимодействие панели антител против АПФ с клетками 2С2 аналогично взаимодействию с клетками HUVEC, что подтверждает возможность использования полученной линии как модель эндотелия легочных капилляров в контексте исследований по направленной доставке лекарств к легочному эндотелию через АПФ-зависимый путь.

IV. Мы показали, что конъюгат 9В9-антикноб-РаЬ перенаправляет аденовирусные частицы к легким экспериментальных крыс после системного введения. При этом экспрессия доставленного вирусом гена люциферазы увеличивается в легких в 22.7 раза. Весьма важно, что в других органах происходит падение экспрессии этого модельного гена - на 83% в печени, на 54% и 57% в почках и селезенке.

Полуколичественный анализ на присутствие специфической вирусной ДНК показал, что увеличение трансгенной экспресии люциферазы в легких связано с увеличением количества вирусной ДНК в органе. Увеличение количества вирусной ДНК доставленной антителами 9В9 коррелирует с экспрессией люциферазы и показывает увеличение в 20 раз по сравнению с контролем (просто аденовирус).

Несмотря на уменьшение экспрессии модельного гена в печени количество вирусной ДНК в этом органе практически не изменяется - разница между экспериментальной и контрольной группой составляет 4%. Это означает, что хотя захват аденовируса клетками печени не изменяется (или изменяется незначительно), однако скорость деградации покрытых конъюгатом 9В9-анти кноб-Fab вирусных частиц в несколько раз выше, чем скорость утилизации просто аденовируса. Механизм этого процесса остается неясным, однако мы предпологаем, что это отражает усиление неспецифического фагоцитоза и деградации покрытых конъюгатом вирусных частиц макрофагами печени (клетки Купфера).

Наша работа является первой в мире, показывающей возможность перенаправления аденовирусных векторов и селективной экспрессии генного материала в органе-мишени (легком) in vivo.

Результаты нашей работы позволяют надеяться, что эффективная и специфическая доставка генного материала через АПФ-зависимый путь может применяться для лечения заболеваний легких, таких как гипертензия легочного генеза (путем доставки в легкие генов NO-синтазы и простагландин-синтазы), легочных опухолей и метастазов (путем доставки и экспрессии генов, продукты которых усиливают противоопухолевой иммунитет - интерлейкина-1 и фактора ингибирования миграции макрофагов).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гаврилюк, Виталий Дмитриевич, 0 год

1. Al-Mehdi, А. В., Shuman, Н., and Fisher, А. В. Intracellular generation of reactive oxygen species during nonhypoxic lung ischemia. Am.J.PhysioI. 272, L294-L300.1997.

2. Albelda, S. M. Endothelial and epithelial cell adhesion molecules. AmJ.Respir.Cell Mol.Biol. 43., 195-203. 1991.

3. Atochina, E, N,, Balyasnikova, I. V., Danilov, S. M., Granger, D. N., Fisher, А. В., and Muzykantov, V. R. Immunotargeting of catalase to ACE or ICAM-1 protects perfused rat lungs against oxidative stress. Am.J.PhysioI. 275, L806-L817. 1998.

4. Balyasnikova, I. V., Danilov, S. M., Muzykantov, V. R., and Fisher, A. B. Modulation of angiotensin-converting enzyme in cultured human vascular endothelial cells. In Vitro Cell Dev.Biol.Anim. 34, 545-554.1998.

5. Balyasnikova I., Gavrilyuk V., McDonald Т., Berkowitz R., Miletich D., Danilov S. In vitro model using a cell line expressing angiotensin-converting enzyme. Tumor. Target. 4, 73-78 1999.

6. Barnard, M. L., Baker, R. R., and Matalon, S. Mitigation of oxidant injury to lung microvasculature by intratrachealinstillation of antioxidant enzymes. Am.J.PhysioI. 265 4 Pt 1., L340-L345.1993.

7. Bevilacqua, M. P. and Nelson, R. M. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in inflammation and metastasis. Thromb.Haemost. 701., 152-154,1993.

8. Bilbao, G., Gomez-Navarro, J., and Curiel, D. T. Targeted adenoviral vectors for cancer gene therapy. Adv.Exp.Med.Biol. 451:365-74,1998.

9. Boado, R. J. and Pardridge, W. M. Complete protection of antisense oligonucleotides against serum nuclease degradation by an avidin-biotin system. Bioconjug.Chem. 36., 519-523. 1992.

10. Brigham, K. L. and Meyrick, B. Endotoxin and lung injury. Am.Rev.Respir.Dis. 1335., 913-927.1986.

11. Caldwell, P. R., Seegal, В. C., Hsu, К. C., Das, M., and Soffer, R. L. Angiotensin-converting enzyme: vascular endothelial localization. Science 1914231., 1050-1051, 1976.

12. Campbell, J. M., Bacon, T. A., and Wickstrom, E. Oligodeoxynucleoside phosphorothioate stability in subcellular extracts, culture media, sera and cerebrospinal fluid. J.Biochem.Biophys.Methods 203., 259-267. 1990.

13. Cao, Y. and Suresh, M. R. Bispecific antibodies as novel bioconjugates. Bioconjug.Chem. 96., 635-644. 1998.

14. Carden, D. L., Young, J. A., and Granger, D. N. Pulmonary microvascular injury after intestinal ischemia-reperfusion: role of P-selectin. J.Appl.Physiol. 756., 2529-2534. 1993.

15. Chesterman, C. N. Ager, A., and Gordon, J. L. Regulation of prostaglandin production and ectoenzyme activities in cultured aortic endothelial cells. J.Cell Physiol. 1161., 4550. 1983.

16. Connor, J., Yatvin, M. В., and Huang, L. pH-sensitive liposomes: acid-induced liposome fusion. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 816., 1715-1718.1984.

17. Conway, E. M., Nowakowski, В., and Steiner-Mosonyi, M. Thrombomodulin lacking the cytoplasmic domain efficiently internalizes thrombin via nonclathrin-coated, pit-mediated endocytosis. J.Cell Physiol. 1582., 285-298. 1994.

18. Corvol, P., Michaud, A., Soubrier, F., and Williams, T. A. Recent advances in knowledge of the structure and function of the angiotensin I converting enzyme. J.Hypertens.Suppl. 13 Suppl 3:S3-10, S3-10.1995.

19. Crooke, S. T. Therapeutic applications of oligonucleotides. Biotechnology (N.Y.) 108., 882-886. 1992.

20. Curiel, D. Т., Pilewski, J. M., and Albelda, S. M. Gene therapy approaches for inherited and acquired lung diseases. AmJ.Respir.Cell Mol.Biol. 14,1-18.1996.

21. Cushman, D. W. and Cheung, H. S. Concentrations of angiotensin-converting enzyme in tissues of the rat. Biochim.Biophys.Acta 2501., 261-265. 1971.

22. Danilov, S., Sakharov, I., Martynov, A., Faerman, A., Muzykantov, V., Klibanov, A., and Trakht, I. Monoclonal antibodies to angiotensin-converting enzyme: a powerful tool for lung and vessel studies. J.Mol.Cell Cardiol. 21 Suppl 1,165-170.1989.

23. Данилов С., Алликметс E., Сахаров И., Духанина Е., Трахт И. Моноклональные антитела к ангиотензин-превращающему ферменту из легких человека. Бюлл.Эксп.Биол.Мед. 103, 699-701.1987.

24. Danilov, S. M., Muzykantov, V. R., Martynov, A. V., Atochina, E. N., Sakharov, I. Y., Trakht, I. N., and Smirnov, V. N. Lung is the target organ for a monoclonal antibody to angiotensin- converting enzyme. Lab.Invest. 64,118-124.1991.

25. Данилов С., Музыкантов В., Мартынов А., Сахаров И., Аточина Е, Литвин Ф., Трахт И., Смирнов В. Специфическое накопление моноклональных антител против ангиотензин-превращающего фермента в легких крысы. Докл.Акад.Наук.СССР. 301,1003-1007. 1988.

26. DeMatteo, R. P., Chu, G., Ahn, M., Chang, E., Burke, C., Raper, S. E., Barker, C. F., and Markmann, J. F. Immunologic barriers to hepatic adenoviral gene therapy for transplantation. Transplantation 632., 315-319,1997.

27. Egea, M. A., Garcia, M. L., Alsina, M. A., and Reig, F. Coating of liposomes with transferrin: physicochemical study of the transferrin-lipid system. J.Pharm.Sci. 832., 169-173. 1994.

28. Eppihimer, M. J., Russell, J., Anderson, D. C., Wolitzky, B. A., and Granger, D. N. Endothelial cell adhesion molecule expression in gene-targeted mice. AmJ.Physiol. 2734 Pt 2., H1903-H1908. 1997.

29. Esmon, С. T. The roles of protein С and thrombomodulin in the regulation of blood coagulation. J.Biol.Chem. 2649., 4743-4746. 1989.

30. Fisher, А. В., Dodia, C., Tan, Z. Т., Ayene, I., and Eckenhoff, R. G. Oxygen-dependent lipid peroxidation during lung ischemia. J.Clin.Invest. 882., 674-679. 1991.

31. FitzGerald, D. J., Padmanabhan, R., Pastan, I., and Willingham, M. C. Adenovirus-induced release of epidermal growth factor and pseudomonas toxin into the cytosol of KB cells during receptor-mediated endocytosis. Cell 322., 607-617.1983.

32. Ford, V. A., Stringer, C., and Kennel, S. J. Thrombomodulin is preferentially expressed in Balb/c lung microvessels. J.Biol.Chem. 2678., 5446-5450.1992.

33. Fraker, P. J. and Speck, J. C. Jr. Protein and cell membrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide, l,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphrenylglycoluril. Biochem.Biophys.Res.Commun. 804., 849-857. 1978.

34. Franke FE, Metzger R, Bohie RM, Reuter SS, Alhenk-Gelas F, Danilov SM. Heterogeneous distribution of angiotensin-converting enzyme in the human and rat vascular system: vessel, organ and species specificity. Arteriol.Thromb.Vasc.Biol. 1999; (Submitted)

35. Freeman, B. A. and Crapo, J. D. Hyperoxia increases oxygen radical production in rat lungs and lung mitochondria. J.Biol.Chem. 25621., 10986-10992.1981.

36. Freeman, B. A., Young, S. L„ and Crapo, J. D. Liposome-mediated augmentation of superoxide dismutase in endothelial cells prevents oxygen injury. J.Biol.Chem. 25820., 12534-12542.10-25-1983.

37. Ghitescu, L. D., Crine, P., and Jacobson, B. S. Antibodies specific to the plasma membrane of rat lung microvascular endothelium. Exp.Cell Res. 2321., 47-55. 1997.

38. Ghosh, P., Das, P. K., and Bachhawat, В. K. Selective uptake of liposomes by different cell types of liver through the involvement of liposomal surface glycosides. Biochem.Soc.Trans. 96., 512-514. 1981.

39. Gregoriadis, G. and Florence, A. T. Recent advances in drug targeting. Trends.Biotechnol. 11 11., 440-442.1993.

40. Heffner, J. E. and Repine, J. E. Pulmonary strategies of antioxidant defense. Am.Rev.Respir.Dis. 1402., 531-554.1989.

41. Helene, C. and Toulme, J. J. Specific regulation of gene expression by antisense, sense and antigene nucleic acids. Biochim.Biophys.Acta 10492., 99-125. 1990.

42. Henry, L. J., Xia, D., Wilke, M. E., Deisenhofer, J., and Gerard, R. D. Characterization of the knob domain of the adenovirus type 5 fiber protein expressed in Escherichia coli. J.Virol. 688., 5239-5246.1994.

43. Hong, J. S. and Engler, J. A. The amino terminus of the adenovirus fiber protein encodes the nuclear localization signal. Virology 1852., 758-767. 1991.

44. Hong, J. S. and Engler, J. A. Domains required for assembly of adenovirus type 2 fiber trimers. J.Virol. 7010., 7071-7078. 1996.

45. Horvat, R. and Palade, G. E. Thrombomodulin and thrombin localization on the vascular endothelium; their internalization and transcytosis by plasmalemmal vesicles. Eur.J.Cell Biol. 61 2., 299-313.1993.

46. Huard, J., Goins, W. F., and Glorioso, J. C. Herpes simplex virus type 1 vector mediated gene transfer to muscle. Gene Ther. 2,385-392.1995.

47. Hug, P. and Sleight, R. G. Liposomes for the transformation of eukaryotic cells. Biochim.Biophys.Acta 10971., 1-17. 1991.

48. Ishii, H., Kizaki, K., Horie, S., and Kazama, M. Oxidized low density lipoprotein reduces thrombomodulin transcription in cultured human endothelial cells through degradation of the lipoprotein in lysosomes. J.Biol.Chem. 27114., 8458-8465. 4-5-1996.

49. Janata-Schwatczek, K., Weiss, K., Riezinger, I., Bankier, A., Domanovits, H., and Seidler, D. Pulmonary embolism. П. Diagnosis and treatment. Semin.Thromb.Hemost. 221., 33-52. 1996.

50. Joo, F. Endothelial cells of the brain and other organ systems: some similarities and differences. Prog.Neurobiol. 483., 255-273.1996.

51. Juliano, R. L., Alahari, S., Yoo, H., Kole, R., and Cho, M. Antisense pharmacodynamics: critical issues in the transport and delivery of antisense oligonucleotides. Pharm.Res. 164., 494-502. 1999.

52. Kennel, S. J., Lankford, Т. K., Ullrich, R. L., and Jamasbi, R. J. Enhancement of lung tumor colony formation by treatment of mice with monoclonal antibodies to pulmonary capillary endothelial cells. Cancer Res. 4817., 4964-4968.1988.

53. Kennel, S. J., Lee, R., Bultman, S., and Kabalka, G. Rat monoclonal antibody distribution in mice: an epitope inside the lung vascular space mediates very efficient localization. Int.J.Rad.Appl.Instrum.B. 17[2], 193-200. 1990.

54. Kiely, J. M., Cybulsky, M. I., Luscinskas, F. W., and Gimbrone, M. A. Jr. Immunoselective targeting of an anti-thrombin agent to the surface of cytokine-activated vascular endothelial cells. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 158., 1211-1218.1995.

55. King, S. J., Booyse, F. M., Lin, P. H., Traylor, M., Narkates, A. J., and Oparil, S. Hypoxia stimulates endothelial cell angiotensin-converting enzyme antigen synthesis. AmJ.Physiol. 2566 Pt 1., C1231-C1238. 1989.

56. Komatsu, S., Flores, S., Gerritsen, M. E., Anderson, D. C., and Granger, D. N. Differential up-regulation of circulating soluble and endothelial cell intercellular adhesion molecule-1 in mice. AmJ.Pathol. 1511., 205-214. 1997.

57. Kramer, P. A. Letter: Albumin microspheres as vehicles for achieving specificity in drug delivery. J.Pharm.Sci. 6310., 1646-1647. 1974.

58. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. Т., and Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. J.Virol. 7010., 6839-6846. 1996.

59. Lentz, S. R. and Sadler, J. E. Inhibition of thrombomodulin surface expression and protein С activation by the thrombogenic agent homocysteine. J.Clin.Invest. 886., 19061914. 1991.

60. Louie, S., Halliwell, В., and Cross, С. E. Adult respiratory distress syndrome: a radical perspective. Adv.Pharmacol. 38:457-90,457-490. 1997.

61. Mannino, R. J. and Gould-Fogerite, S. Liposome mediated gene transfer. Biotechniques 67., 682-690.1988.

62. Marshall, D., Pedley, R. В., Boden, J. A., Boden, R., and Begent, R. H. Clearance of circulating radio-antibodies using streptavidin or second antibodies in a xenograft model. Br J.Cancer 69, 502-507.1994.

63. Maruyama, K., Holmberg, E., Kennel, S. J., Klibanov, A., Torchilin, V. P., and Huang, L. Characterization of in vivo immunoliposome targeting to pulmonary endothelium. J.Pharm.Sci. 7911., 978-984. 1990.

64. Miralles, F., Takeda, Y., and Escribano, M. J. Comparison of carbohydrate and peptide biotinylation on the immunological activity of IgGl murine monoclonal antibodies.

65. J.Immunol. Methods 140,191-196. 1991.

66. Mulligan, M. S., Vaporciyan, A. A., Warner, R. L., Jones, M. L., Foreman, К. E., Miyasaka, M., Todd, R. F., and Ward, P. A. Compartmentalized roles for leukocytic adhesion molecules in lung inflammatory injury. J.Immunol. 1543., 1350-1363. 1995.

67. Muzykantov, V. R., Atochina, E. N., Gavriljuk, V., Danilov, S. M., and Fisher, A. B. Immunotargeting of streptavidin to the pulmonary endothelium. J.Nucl.Med. 35, 13581365.1994.

68. Muzykantov, V. R., Atochina, E. N., Ischiropoulos, H., Danilov, S. M., and Fisher, A. B. Immunotargeting of antioxidant enzyme to the pulmonary endothelium. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93, 5213-5218.1996.

69. Muzykantov, V. R., Atochina, E. N., Kuo, A., Barnathan, E. S., Notarfrancesco, K., Shuman, H., Dodia, C., and Fisher, A. B. Endothelial cells internalize monoclonal antibody to angiotensin- converting enzyme. Am.J.Physiol. 270, L704-L713. 1996.

70. Muzykantov, V. R., Barnathan, E. S., Atochina, E. N., Kuo, A., Danilov, S. M., and Fisher, A. B. Targeting of antibody-conjugated plasminogen activators to the pulmonary vasculature. J.Pharmacol.Exp.Ther. 279,1026-1034.1996.

71. Muzykantov, V. R., Barnathan, E. S., Atochina, E. N., Kuo, A., Danilov, S. M., and Fisher, A. B. Targeting of antibody-conjugated plasminogen activators to the pulmonary vasculature. J.Pharmacol.Exp.Ther. 279,1026-1034. 1996.

72. Muzykantov, V. R. and Danilov, S. M. Glucose oxidase conjugated with anti-endothelial monoclonal antibodies: in vitro and in vivo studies. IntJ.Radiat.Biol. 60,11-15. 1991.

73. Newman, P. J. The biology of PECAM-1. J.Clin.Invest. 10011 Suppl., S25-S29.1997.

74. Pasqualini, R. and Ruoslahti, E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature 3806572., 364-366. 1996.

75. Poznansky, M. J. and Juliano, R. L. Biological approaches to the controlled delivery of drugs: a critical review. Pharmacol.Rev. 36,277-336. 1984.

76. Reiter, Y., Brinkmann, U., Lee, В., and Pastan, I. Engineering antibody Fv fragments for cancer detection and therapy: disulfide-stabilized Fv fragments. Nat.Biotechnol. 1410., 1239-1245.1996.

77. Reynolds P., Zinn K., Gavrilyuk V., Balyasnikova I., Rogers В., Buchsbaum D., Wang M., Miletich D., Douglas J., Danilov S and Curiel D. A targetable, Injectable adenoviral drug delivery to pulmonary endothelium in vivo. Nature Biotech. 1999 S.ubmitted.

78. Rosen, E. M., Noveral, J. P., Mueller, S. N., and Levine, E. M. Regulation of angiotensin I-converting enzyme activity in serially cultivated bovine endothelial cells. J.Cell Physiol. 1221., 30-38. 1985.

79. Ryan, U. S. Pulmonary endothelium: a dynamic interface. Clin.Invest.Med. 92., 124132.1986.

80. Ryan, U. S., Ryan, J. W., Whitaker, C., and Chiu, A. Localization of angiotensin converting enzyme (kininase П). П. Immunocytochemistry and immunofluorescence. Tissue Cell 81., 125-145.1976.

81. Sasso, D. E., Gionfriddo, M. A., Thrall, R. S., Syrbu, S. I., Smilowitz, H. M., and Weiner, R. E. Biodistribution of indium-111-labeled antibody directed against intercellular adhesion molecule-1. J.Nucl.Med. 374., 656-661. 1996.

82. Schechter, В., Silberman, R., Arnon, R., and Wilchek, M. Tissue distribution of avidin and streptavidin injected to mice. Effect of avidin carbohydrate, streptavidin truncation and exogenous biotin. EurJ.Biochem. 189, 327-331. 1990.

83. Seth, P., Pastan, I., and Willingham, M. C. Adenovirus-dependent increase in cell membrane permeability. J.Biol.Chem. 26017., 9598-9602. 1985.

84. Seth, P., Willingham, M. C., and Pastan, I. Binding of adenovirus and its external proteins to Triton X-114. Dependence on pH. J.Biol.Chem. 26027., 14431-14434.1985.

85. Sheibani, N. Prokaryotic gene fusion expression systems and their use in structural and functional studies of proteins. Prep.Biochem.Biotechnol. 291., 77-90.1999.

86. Short, M. P., Choi, В. C., Lee, J. K., Malick, A., Breakefield, X. O., and Martuza, R. L. Gene delivery to glioma cells in rat brain by grafting of a retrovirus packaging cell line. J.Neurosci.Res. 273., 427-439. 1990.

87. Sobol, R. E. and Scanlon, K. J. Cancer gene therapy clinical trials editorial. Cancer Gene Ther. 21., 5-6. 1995.

88. Soubrier, F., Alhenc-Gelas, F., Hubert, C., Allegrini, J., John, M., Tregear, G., and Corvol, P. Two putative active centers in human angiotensin I-converting enzyme revealed by molecular cloning. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 8524., 9386-9390.1988.

89. Stratford-Perricaudet, L. D., Makeh, I., Perricaudet, M., and Briand, P. Widespread long-term gene transfer to mouse skeletal muscles and heart. J.Clin.Invest. 90, 626-630.1992.

90. Verstraete, M. The fibrinolytic system: from Petri dishes to genetic engineering. Thromb.Haemost. 741., 25-35. 1995.

91. Wang, C. Y. and Huang, L. pH-sensitive immunoliposomes mediate target-cell-specific delivery and controlled expression of a foreign gene in mouse. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 8422., 7851-7855. 1987.

92. Weiss, R. A., Boettiger, D., and Murphy, H. M. Pseudotypes of avian sarcoma viruses with the envelope properties of vesicular stomatitis virus. Virology 762., 808-825. 1977.

93. Wickham, T. J., Carrion, M. E., and Kovesdi, I. Targeting of adenovirus penton base to new receptors through replacement of its RGD motif with other receptor-specific peptide motifs. Gene Ther. 210., 750-756.1995.

94. Wickham, T. J., Filardo, E. J., Cheresh, D. A., and Nemerow, G. R. Integrin alpha v beta 5 selectively promotes adenovirus mediated cell membrane permeabilization. J.Cell Biol. 1271., 257-264. 1994.

95. Wickham, T. J., Haskard, D., Segal, D., and Kovesdi, I. Targeting endothelium for gene therapy via receptors up-regulated during angiogenesis and inflammation. Cancer Immunol.Immunother. 453-4., 149-151. 1997.

96. Wickham, T. J., Mathias, P., Cheresh, D. A., and Nemerow, G. R. Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell 732., 309-319. 1993.

97. Wilchek, M. and Bayer, E. A. The avidin-biotin complex in bioanalytical applications. AnaLBiochem. 1711., 1988.

98. Wilson, J. M. Adenoviruses as gene-delivery vehicles. N.Engl.J.Med. 33418., 11851187.1996.