Молекулярный механизм действия и цитотоксические свойства РНКазы Streptomyces aureofaciens тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат химических наук Митькевич, Владимир Александрович

• Митькевич, Владимир Александрович
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Митькевич, Владимир Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. РИБОНУКЛЕАЗА SA, РОДСТВЕННЫЕ ФЕРМЕНТЫ И ИХ ИНГИБИТОРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Принципы классификации нуклеаз

1.2. Механизм каталитического действия циклизующих рибонуклеаз

1.3. Структура и свойства РНКазы Sa и подобных ей РНКаз

1.3.1. Структура и механизм действия РНКазы Sa

1.3.2. Каталитические свойства РНКазы Sa и ее гомологов

1.3.3. Термостабильность РНКазы Sa, ее гомологов и мутантов

1.4. Влияние остатков активного центра на стабильность белка

1.5. Ингибиторы рибонуклеаз

1.5.1. Низкомолекулярные ингибиторы РНКаз

1.5.2. Белковые ингибиторы РНКаз

1.5.2.1. Барстар

1.5.2.2. Цитоплазматический ингибитор рибонуклеаз животного происхождения

1.6. Цитотоксичность РНКаз

1.6.1. Токсическое действие РНКазы на клетку

1.6.2. Молекулярные детерминанты цитотоксичности РНКаз

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты и материалы

2.1.1. Бактериальные рибонуклеазы

2.1.2. Барстар А и его мутанты

2.1.3. Получение З'-Ы-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5'-фосфата

2.1.4. Использованные реагенты

2.2. Методы исследований

2.2.1. Измерение каталитических параметров реакций гидролиза субстратов РНКазами

2.2.2. Определение жизнеспособности клеток в присутствии РНКазы

2.2.3. Дифференциальная Сканирующая Калориметрия (ДСК)

2.2.4. Круговой Дихроизм (КД)

2.2.5. Измерение констант связывания

2.2.6. Определение концентраций

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Структурно-функциональный анализ активного центра РНКазы Sa

3.1.1. Роль остатков GIn3 8 и GIu41 в связывании субстрата

3.1.2. Функциональная роль остатков GIu54, Arg65, His85 и GIu

3.1.3. Влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы Sa на ее активность

3.2. Конструирование ингибиторов РНКазы Sa и родственных ферментов

3.2.1. Ингибирование РНКаз металлохелатами

3.2.2. Ингибирование активностей РНКазы Sa и биназы З'-М-гидроксиуреидо-З1-дезокситимидин 5-фосфатом в присутствии цинка(Н)

3.2.3. Ингибирование активности Glu54GIn мутанта РНКазы Sa

З'-Ы-гидроксиуреидо-З'-дезокситимидин 5-фосфатом в присутствии цинка(П)

3.3. Изучение вклада остатков активного центра РНКазы Sa в конформационную стабильность фермента

3.4. Цитотоксические свойства РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с измененным зарядом

3.4.1. Изменение общего заряда молекулы с отрицательного на положительный делает РНКазу Sa цитотоксичной

3.4.2. Роль активируемых кальцием калиевых (Кса) каналов в преодолении цитотоксичности, индуцированной РНКазами

3.4.3. Положительный заряд является основной детерминантой цитотоксичности микробных РНКаз

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярный механизм действия и цитотоксические свойства РНКазы Streptomyces aureofaciens»

Рибонуклеазы (РНКазы) являются традиционными объектами исследования молекулярной биологии, поскольку они участвуют в ключевых процессах реализации генетической информации и представляют собой важнейшие ферменты клеточного метаболизма [1-5]. Биологические функции РНКаз заключаются в трансформации РНК от первичных генных транскриптов до функциональных компонентов трансляционной системы, продукции малых регуляторных РНК и деградации определенных типов РНК. В настоящее время большое внимание уделяется функциям РНКаз, связанным с регуляцией экспрессии генов, ростом и дифференцировкой клеток, защитой от патогенов, индукцией апоптоза. Эти ферменты находят широкое применение в генной инженерии, биохимии и медицине. Кроме того, они являются удобными объектами для изучения механизмов реализации высокой специфичности ферментов. Поэтому изучение молекулярного механизма действия РНКаз представляет собой важную задачу не только для энзимологии ферментов нуклеинового обмена, но и для понимания процессов клеточной регуляции.

В последние годы вырос интерес к созданию эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКаз как потенциальных противораковых средств, подавляющих активность ангиогенина, а также как противоаллергических препаратов, ингибирующих активность РНКаз эозинофилов человека [6]. Потребность в эффективных ингибиторах РНКаз связана и с необходимостью блокирования активности примесных РНКаз при биохимических работах с РНК-содержащими препаратами. Понимание молекулярного механизма действия этих ферментов и изучение структуры их активных центров важно для создания эффективных ингибиторов РНКаз.

Было обнаружено, что некоторые РНКазы семейства РНКазы А токсичны для клеток млекопитающих, особенно для опухолевых клеток [7-9]. В ряде случаев они избирательно атакуют злокачественные клетки, запуская апоптозную реакцию, и поэтому могут рассматриваться как альтернатива классическим химиотерапевтическим препаратам. Так, РНКаза из ооцитов лягушки Rana pipiens, онконаза, в настоящее время проходит клинические испытания для лечения мезотелиомы легких. Бактериальные РНКазы составляют важное семейство РНКаз, некоторые представители которого также обладают цитотоксическими свойствами. Одним из важных факторов цитотоксичности микробных РНКаз по отношению к клеткам млекопитающих является их невосприимчивость к действию цитоплазматического ингибитора РНКаз, присутствующего практически во всех тканях человека и блокирующего каталитическую активность экзогенных РНКаз животного происхождения. Несмотря на большой интерес исследователей к цитотоксичным РНКазам, факторы, определяющие их цитотоксичность, до сих пор недостаточно изучены.

Настоящая работа посвящена установлению молекулярного механизма действия и определению цитотоксических свойств РНКазы Sa из Streptomyces aureofaciens. Выбор этого фермента обусловлен тем, что РНКаза Sa является одним из наименьших ферментов, состоящим из 96 аминокислотных остатков. Ее пространственная структура хорошо изучена как в кристалле, с разрешением 1 А [10], так и в растворе методом Я MP [11], а небольшой размер молекулы позволяет в значительной степени варьировать свойства белка внесением минимальных изменений в его последовательность. Поэтому РНКаза Sa представляет собою удобную модель как для изучения взаимоотношений между белковой структурой и функцией, определяющих эффективность действия фермента, так и для исследования факторов, влияющих на конформационную стабильность белков в растворе.

В задачи работы входило: 1) определение функциональной роли остатков активного центра РНКазы Sa и их вкладов в каталитическую активность фермента;

2) конструирование эффективных низкомолекулярных ингибиторов РНКазы Sa;

3) изучение влияния замен остатков активного центра РНКазы Sa на конформационную стабильность фермента; 4) исследование цитотоксических свойств РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с обращенным зарядом, оценка влияния отдельных клеточных компонент на цитотоксические эффекты, проявляемые РНКазами.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Митькевич, Владимир Александрович

выводы

1. Установлена функциональная роль остатков Gln38, Glu41, Glu54, Arg65 и His85, принадлежащих активному центру гуанилспецифичной РНКазы Sa, и определены вклады этих остатков в каталитическую активность фермента. Обнаружено, что в отличие от ранее изученных гуанилспецифичных РНКаз специфичность РНКазы Sa реализуется без взаимодействия белка с иминогруппой гуанинового основания субстрата. Показано, что катионизация молекулы РНКазы Sa не приводит к существенным изменениям активности фермента.

2. Предложен подход к созданию ингибиторов РНКаз на основе производных нуклеотидов, содержащих N-гидроксимочевину в З'-положении рибозы. В присутствии ионов цинка связывание такого ингибитора в активном центре РНКазы Sa и биназы существенно возрастает за счет образования хелатных связей между ионом цинка, остатком гидроксимочевины и каталитическими группами белка.

3. Установлено, что аминокислотные остатки, отвечающие за связывание лиганда, не оптимальны для стабильности белковой глобулы. Данное заключение основано на изучении термостабильности мутантов РНКазы Sa с заменами остатков в активном центре и мутантов внутриклеточного ингибитора РНКаз барстара с заменами в сайте связывания с РНКазой.

4. Обнаружено, что повышение положительного заряда молекулы РНКазы Sa вызывает возрастание ее цитотоксичности. Показано, что преимущественной мишенью действия токсичного мутанта РНКазы Sa с обращенным зарядом являются клетки, экспрессирующие онкоген ras. Установлена существенно более низкая чувствительность к цитотоксичным РНКазам клеток, экспрессирующих Кса-каналы, по сравнению с клетками, лишенными этих каналов.

Благодарности

В заключение я хочу выразить глубокую признательность своим научным руководителям А.А. Макарову и Г.И. Яковлеву за поддержку, чуткое руководство работой и неоценимую помощь в написании и редактировании данной диссертации, а также О.Н. Ильинской, И.Ю. Петрушанко, В.О. Чехову и В.М. Лобачеву за помощь в работе, плодотворные научные дискуссии, дружеское отношение и участие. N

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Митькевич, Владимир Александрович, 2005 год

1. Dunn J.J., and Studier F.W. T7 early RNAs and Escherichia coli ribosomal RNAs are cut from large precursor RNAs in vivo by ribonuclease III // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973. V.70, p.3296-3300.

2. Young R.A., and Steitz J.A. Complementary sequences 1700 nucleotides apart from a ribonuclease III cleavage site in Escherichia coli ribosomal precursor RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978. V.75, p.3593-3597.

3. Ohtsuki K., Groner Y., and Hurwitz J. Isolation and purification of double-stranded ribonuclease from calf thymus И J. Biol. Chem., 1977. V.252, p.483-491.

4. Grummt I., Hall S.H., and Crouch R.J. Localisation of an endonuclease specific for double-stranded RNA within the nucleolus and its implication in processing ribosomal transcripts И Eur. J. Biochem., 1979. V.94, p.437-443.

5. Xu Y., Petersen-Bjorn S., and Friesen J.D. The PRP4 (RNA4) protein of Saccharomyces cerevisiae is associated with the 5' portion of the U4 small nuclear RNA //Mol. Cell Biol., 1990. V. 10, p.l217-1225.

6. Russo A., Acharya K.R., and Shapiro R. Small molecule inhibitors of RNase A and related enzymes // Methods Enzymol, 2001. V.341, p.629-648.

7. Leland P.A., and Raines R.T. Cancer chemotherapy ribonucleases to the rescue // Chemistry and Biology, 2001. V.8, p.405-413.

8. Makarov A.A., and Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets // FEBS Lett., 2003. V.540, p. 15-20.

9. Ильинская O.H. и Макаров A.A. Почему рибонуклеазы вызывают гибель раковых клеток // Молекулярная Биология, 2005. Т.39, с.1-11.

10. Sevcik J., Lamzin V.S., Dauter Z., and Wilson K.S. Atomic resolution data reveal flexibility in the structure of RNase Sa //Acta. Cristallogr., 2002. V.58, p.1307-1313.

11. Laurents D., Perez-Canadillas J.M., Santoro J., Rico M., Schell D., Pace C.N., and Bruix M. Solution structure and dynamics of ribonuclease Sa // Proteins, 2001. V.44, p.200-211.

12. Barnard E.A. Biological function of pancreatic ribonuclease // Nature, 1969. V.221, p.340-344.

13. Richards F.M., and Wyckoff H.W. Bovine pancreatic ribonuclease. In "The Enzymes" (P.D. Boyer, ed.) V.4, p.647-805. Academic press, New York, 1971.

14. Findlay D., Herries D.G., Marhias A.P., Rabin B.R., and Ross C.A. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease // Nature, 1961. V.190, p.781-784.

15. Deavin A., Mathias A.P., and Rabin B.R. Mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease II Nature, 1966. V.211, p.252-255.

16. Raines R.T. Ribonuclease A // Chem. Rev., 1998. V.98, p. 1045-1065.

17. Steyaert J. A decade of protein engineering on ribonuclease Ti // Eur. J. Biochem., 1997. V.247, p.1-11.

18. Hartley R.W. Barnase and barstar. In "Ribonucleases: structures and functions" (D'Alessio G. and Riordan J.F., ets) p.51-100, Academic Press, New York, 1997.

19. Bacova M., Zelinkova E., Zelinka J. Exocellular ribonuclease from Streptomyses aureofacience // Biochim. Biophys. Acta., 1971. V.235, p.335-342.

20. Hartley R.W. Homology between prokaryotic and eukaryotic ribonucleases // J. Mol. Evol., 1980. V.15, p.355-358.

21. Hebert E.J., Grimsley G.R., Hartley R.W., Horn G., Schell D., Garcia S., Both V., Sevcik J., and Pace C.N. Purification of ribonucleases Sa, Sa2, and Sa3 after expression in Escherichia coli II Protein Express. Purificat., 1997. V.l 1, p. 162-168.

22. Sevcik J., Urbanikova L., Dauter Z., and Wilson K.S. Recognition of RNase Sa by the inhibitor barstar: structure of the complex at \.lk resolution II Acta Cristallogr., 1998. V.54, p.954-963.

23. Sevcik J., Dodson E., and Dodson G.G. Determination and restrained least-squares refinement of the structures of ribonuclease Sa and its complex with З'-guanyIic acid at 1.8 A resolution // Acta Crystallogr., 1991. V.47,240-253.

24. Sevcik J., Dauter Z., Lamzin V.S., and Wilson K.S. Ribonuclease from Streptomyces aureofaciens at atomic resolution // Acta Crystallogr., 1996. V.52, p.327-344.

25. Sevcik J., Urbanikova L., Leland P.A., and Raines R.T. X-ray structure of two crystalline forms of a streptomycete ribonuclease with cytotoxic activity // J. Biol. Chem., 2002. V.277, p.47325-47330.

26. Polyakov K.M., Lebedev A.A., Okorokov A.L., Panov K.I., Schulga A.A., Pavlovsky A.G., and Dodson G.G. The structure of substrat-free microbial ribonuclease binase and its complexes with 3'GMP and sulfat ions II Acta Crystallogr., 2002. V.58, p.744.

27. Голубенко И.А., Лещинская И.Б., Карпейский М.Я. и Яковлев Г.И. Изучение функциональной роли гистидина-101 рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р // Биоорганическая химия, 1982. Т.8, с.1108-1118.

28. Yakovlev G.I., Moiseyev G.P., Bezborodova S.I., Both V., and Sevcik J. A comparative study on the catalytic properties of guanyl-specific ribonucleases // Eur. J. Biochem., 1992. V.204, p.187-190.

29. Ami R., Heinemann U., Tokuoka R., and Saenger W. Three-dimensional structure of the ribonuclease TI 2'-GMP complex at 1.9-A resolution И J. Biol. Chem., 1988. V.263, p.15358-15368.

30. Follmann H., Wieker H.J., and Witzel H. On the mechanism of the ribonuclease reaction. 2. The pre-ordering in the substrate as the accelerating factor in dinucleoside phosphates and analagous compounds // Eur. J. Biochem., 1967. V.l, p.243-250.

31. Day A.G., Parsonage D., Ebel S., Brown Т., and Fersht A.R. Barnase has subsites that give rise to large rate enhancements // Biochemistry, 1992. V.31, p.6390-6395.

32. Buckle A.M., and Fersht A.R. Subsite binding in an RNase structure of a barnase tetranucleotide complex at 1.76-angstrom resolution // Biochemistry, 1994. V.33, p.1644-1653.

33. Shaw K.L., Grimsley G.R., Yakovlev G.I., Makarov A.A., and Pace C.N. The effect of net charge on the solubility, activity and stability of ribonuclease Sa // Protein Sci., 2001. V.10, p.1206-1215.36