Молекулярные возможности генотипирования антигенов тромбоцитов человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Макарик, Татьяна Викторовна

• Макарик, Татьяна Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Макарик, Татьяна Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Серологические и молекулярные методы типирования тромбоцитспецифических антигенов системы нра человека.

1.1.1. Иммуносерологические методы.

1.1.2. Методы, основанные на ДНК-диагностике.

1.2. иммуногенетика антигенов тромбоцитов человека.

1.2.1. Параметры иммуногенетики.

1.2.2. Особенности распределения антигенов среди представителей различных рас и этнических групп.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров.

2.3. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Полимеразная цепная реакция с использованием модифицированных сиквенс-специфических праймеров.

3.2 Иммуногенетические параметры тромбоцит-специфических антигенов у кадровых доноров компонентов крови г. Москвы и у представителей армянской и хакасской национальностей.

3.2.1. Иммуногенетические параметры НРА у кадровых доноров компонентов крови г. Москвы.

3.2.2. Частоты аллелей и генотипов HP А среди представителей армянской национальности.

3.2.3. Частоты аллелей и генотипов среди представителей хакасской национальности.

3.2.4. Сравнение частоты аллелей и генотипов HP А в обследованных выборках разных этнических групп.

3.3. Частота аллелей генов тромбоцитспецифических антигенов среди жителей России как основа формирования контингента типированных доноров.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные возможности генотипирования антигенов тромбоцитов человека»

Ф Антигены тромбоцитов человека (HPА) включают 16 известных на сегодняшний день биаллельных систем [Ouwehand W. et al., 2000]. Каждый аллоантиген, как было показано, является результатом изменения единичного нуклеотида в последовательности ДНК, приводящего к замене аминокислоты на белковом уровне. Это приводит к изменению третичной структуры мембранных гликопротеинов и, соответственно, возникновению разных эпитопов - мишеней для трансфузионной аллоиммунизации [Norton A. et al., 2004]. Кроме НРА на тромбоцитах локализуются антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). По некоторым данным трансфузия концентратов тромбоцитов без примеси лейкоцитов не вызывает первичную аллоиммунизацию к HLA [Novotny V.M.J, et al., 1995]. Аллоиммунизация к антигенам тромбоцитов может вызывать пост-трансфузионную пурпуру и рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов, кроме того, при беременности аллоиммунизация может быть причиной тромбоцитопении новорожденного [Waters А.Н. et al., 1992, Murphy M.F. et al., 1999, Kekomaki S. et al., 1998]. Необходимым компонентом диагностики и последующего лечения пациентов с этими синдромами является возможность быстрого и точного типирования антигенов тромбоцитов. Традиционно, при определении фенотипа тромбоцитов используют аллоиммунную сыворотку человека,

Ф однако, не ко всем антигенам системы НРА получены антитела [Simsek S. et al., 1994]. Кроме того, в случаях заболеваний системы крови низкий уровень тромбоцитов у значительной части пациентов ограничивает возможность серологического типирования тромбоцитов.

В последнее время для типирования НРА применяют методы, основанные на ДНК-диагностике, такие как полимеразная цепная реакция с последующей рестрикцией полиморфных фрагментов (PCR-RFLP) и секвенирование ДНК [Newmen P.J. et al., 1994]. Эти методы достаточно сложны и дорогостоящи. В отличие от них новый подход с использованием в 5 полимеразной цепной реакции сиквенс-специфичных праймеров представляет собой технически простой и экономичный метод генотипирования НРА. Эффективная амплификация возможна только тогда, когда 3" конец праймера комплементарен последовательности сайта аллельной вариации. Используя серию праймеров, каждый из которых специфично амплифицирует только один аллель НРА, можно сделать вывод о присутствии или отсутствии соответствующих антигенов.

Частоты аллоантигенов тромбоцитов человека различаются между расами и этническими группами. Недавние популяционные исследования показали существенные различия в распределении ЕРА у представителей европеоидной [Simsek S. et al., 1993, Kekomaki S. et al.,1995, Kim H. et al., 1995, Covas D. Et al., 1997, Drzewek K. Et al., 1998] и монголоидной рас [Seo D. et al., 1998, Chang Y.et al., 1998, Chiba A. et al., 2000]. Получены данные о встречаемости НРА-генов в выборках жителей России [Зотшсов Е.А. и др., 2003, Головкина Л.Л. и др., 2004, Golovkina L. et al., 2004]. Изучение частоты аллелей НРА позволяет сделать вывод о перемещении генов и получить важную иммуногенетическую характеристику популяции. Практическое значение генотипирования НРА в первую очередь проявляется в трансфузиологии, поскольку лица белой расы с выраженным полиморфизмом генов НРА-1, -2, -5 являются «реактивными» донорами для реципиентов монголоидной расы, для которой полиморфизм указанных генов не характерен.

Генотипирование антигенов тромбоцитов человека методом полимеразной цепной реакции позволит проводить трансфузии тромбоцитов с учетом их антигенной структуры у донора и реципиента.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

На основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфичных праймеров разработать тест-систему для изучения распределения пяти клинически важных антигенов тромбоцитов (НРА 1-5) у кадровых доноров компонентов крови.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Оптимизация тест-системы на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров; сравнение результатов генотипирования, полученных с помощью модифицированной нами тест-системы и тест-системы фирмы «PROTRANS».

2. Использование модифицированной тест-системы для генотипирования кадровых доноров компонентов крови по системе ЕРА.

3. Изучение иммуногенетических параметров НРА у кадровых доноров компонентов крови и представителей некоторых этнических групп России.

4. Вычисление величины контингента НРА-типированных доноров, необходимого для обеспечения НРА-совместимых трансфузий.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Разработана модифицированная тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров для генотипирования антигенов тромбоцитов человека. Впервые в России рассчитаны все иммуногенетические параметры НРА у кадровых доноров компонентов крови, а также получены ориентировочные данные о распределении частот аллелей и генотипов в двух генетически отдаленных этнических группах (армяне и хакасы). Предложен подход к формированию контингента НРА-типированных доноров в России.

ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ТЕОРИИ И ПРАКТИКИ.

Предложенная в работе модифицированная тест-система на основе полимеразной цепной реакции рекомендуется к использованию для генотипирования антигенов тромбоцитов доноров и реципиентов с целью предотвращения посттрансфузионных осложнений и создания контингента типированных по НРА кадровых доноров компонентов крови.

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликованы 4 работы. Результаты диссертации доложены на 19-й Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Стамбул, 2005г.) и на 28-й конференции «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2005г.).

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 74 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 8 рисунков, 3 диаграммы и 14 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Макарик, Татьяна Викторовна

выводы.

1. Разработана тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров для генотипирования антигенов тромбоцитов человека. Генотипирование «слепым» методом 30 образцов ДНК показало полное совпадение результатов, полученных с помощью предлагаемой нами тест-системы и тест-системы фирмы "PROTRANS".

2. В результате генотипирования 197 кадровых доноров компонентов крови г.Москвы получены данные о распределении частот генов и генотипов НРА, которые оказались сопоставимы с соответствующими литературными данными по генотипированию представителей европейских государств. Отличительной особенностью исследуемой группы кадровых доноров является увеличенная частота аллеля НРА-2Ь - 25,38%, в то время как средний показатель для лиц белой расы -13,2%.

3. Разработанная тест-система была верифицирована на двух изолированных этнических группах (представители армянской и хакасской национальностей). Выявлено статистически достоверное отличие частоты аллеля «Ь» локуса НРА-1 у представителей армянской национальности и смешанной российской популяции (кадровые доноры г.Москвы) - 50% и 24,87%, соответственно. Среди представителей хакасской национальности гомозиготы по аллелю «Ь» в локусах НРА-1, -2, -4, -5 не обнаружены.

4. Установлены количественные критерии контингента НРА-типированных доноров, необходимого для обеспечения НРА-совместимых трансфузий. Величина контингента НРА-типированых доноров с 90% вероятностью подбора составляет 1500 человек.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Макарик Т.В., Головкина JLJL, Орлова Г.К., Шумилова JI.JL, Судариков А.Б. Генотипирование антигенов тромбоцитов человека методом полимеразной цепной реакции с использованием аллель-специфических праймеров. Проблемы гематологии и переливания крови. 2004, 3:27-31.

2. Головкина Л.Л., Макарик Т.В., Судариков А.Б. Иммуногенетические параметры тромбоцитспецифических антигенов (НРА) у россиян основа для формирования контингента типированных доноров. Проблемы гематологии и трансфузиологии. 2005,

3. Головкина JI.JI., Зотиков Е.А., Макарик Т.В., Судариков А.Б. Распространенность тромбоцитспецифических антигенов у россиян как основа формирования контингента типированных доноров. Сборник «Актуальные проблемы трансфузиологии и клинической медицины», г.Киров. 2005, 145-148.

4. Golovkina L.L., Makarik Т., Sudarikov А.В. Distribution of HPA-genes and genotypes in the population of Russian unrelated donors. "Genes & Immunity: genetics, genomics and function" 19-th European Immunogenetics & Histocompatibility Conference. 23-26 April 2005, Istambul-Turkey. 2005, V.6 supplement 1, S.22, poster 36.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

4.1. Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров.

Использование комбинации сиквенс-специфических праймеров, каждый из которых специфично амплифицирует только один аллель НРА, позволяет сделать вывод о присутствии или отсутствии соответствующего гена всех пяти локусов НРА: НРА-1, НРА-2, НРА-3, НРА-4 и НРА-5. Кроме того, добавление в каждую пробирку дополнительной пары праймеров, амплифицирующей фрагмент гена фактора роста человека, обеспечивает положительный контроль для каждой реакции амплификации. Генотипирование «слепым» методом образцов ДНК показало полное совпадение результатов, полученных с помощью предлагаемой нами тест-системы и тест-системы фирмы "PROTRANS".

Предлагаемая нами тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров имеет несколько отличий от аналогичных зарубежных систем.

Во-первых, использование модифицированных нами праймеров для НРА-3, -5 локусов позволяет проводить специфическую амплификацию всех пяти локусов НРА при одинаковой температуре (68°С). В аналогичных тест-системах предлагается проводить отжиг праймеров для разных локусов НРА в нескольких температурных режимах [Cavanagh G. et al., 1996, Jau-Yi Lyou et al., 2003].

Во- вторых, применение 96-луночных планшет с праймерами позволяет одновременно генотипировать 9 образцов ДНК, а также значительно сокращает время постановки реакции.

Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров является достаточно простой процедурой, которая включает только два пост-амплификационных шага - электрофорез и визуальную интерпретацию [Kluter Н. et al., 1996, Kroll H. et al., 1998, Darke C. et al., 1996]. Кроме того, существует возможность применения метода Real-time (полимеразная цепная реакция в реальном времени) для генотипирования НРА, преимуществом которого является отсутствие пост-амплифшсационных шагов.

Таким образом, техника полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров является недорогим, простым и точным методом генотипирования системы НРА как для клинических исследований, так и для создания регистра доноров крови [Sellers J. et al., 1999].

4.2. Иммуногенетические параметры тромбоцит-специфических антигенов у жителей России.

Ранее было показано, что большие расы и локальные популяции населения Земного шара различаются по частоте НРА-генов [Simsek S. et al., 1993, Kekomaki S. et al., 1995, Kim H.O. et al., 1995, Covas D.T. et al., 1997, Drzewek K. et al., 1998]. С помощью модифицированной нами тест-системы получены данные о частоте аллелей и генотипов НРА у 197 жителей России (кадровые доноры крови и ее компонентов). Эти данные позволили рассчитать все иммуногенетические параметры: частоты аллелей, генов и генотипов НРА, величину неравновесного сцепления и генетическую дистанцию. Кроме того, на основании этих данных можно рассчитать необходимую численность контингента типированных по НРА доноров, обеспечивающую возможность иммунологически неконфликтной трансфузии для любого реципиента.

Сведения о частоте аллелей и генотипов НРА у жителей России, полученные путем прямого подсчета, оказались сопоставимы с соответствующими частотами генов в европейской популяции. Так частоты НРА-la, -2а, -2Ь, -За, -ЗЬ, -5а и -5Ь не отличались заметно от

61 соответствующих данных в Австрии [Holensteiner A. et al., 1995], Финляндии [Kekomaki S. et al., 1995], Германии [Simsek S. et al., 1993] или Польше [Drzewek К. et al., 1998]. Аллель HPA-4b отсутствовал как по нашим данным, так и по данным для других популяций (Дания, Германия, Польша) [Simsek S. et al., 1993, Steffensen R. et al., 1996, Unkelbach K. et al., 1995, Legler T.J. et al., 1996].

Отличительной особенностью исследуемой группы кадровых доноров г.Москвы выявлена увеличенная частота гена НРА-2Ь - 25,38%, в то время как средний показатель для лиц белой расы - 13,2%.

Отсутствие расхождений между ожидаемыми и расчетными данными свидетельствовало о корректности проведенного исследования и о нахождении популяции в равновесии с законом Харди-Вайнберга. Генные частоты «а» и «Ь» аллелей НРА определены как 0,86 и 0,14 для локусов НРА-1 и НРА-2; 0,55 и 0,45 для локуса НРА-3; 0,93 и 0,07 для локуса НРА-5. Частота гена НРА-4а составила 1,0.

Частоту гаплотипов НРА-1, -3 вычисляли непосредственно по реультатам генотипирования. Наиболее часто встречались гаплотипы НРА-1 а/3 а и НРА-1а/ЗЬ. Определение величины неравновесного сцепления генов с учетом частоты аллелей НРА выявило незначительную гаметную ассоциацию между генами НРА-1а и НРА-3 а, а также между генами НРА-lb и НРА-ЗЬ.

Изучение генетической дистанции между народами показало близость российских жителей к европейскому населению. Так величина генетической о дистанции между жителями России и Польши составила d=3,6xl0", а между жителями России и Финляндии - d=4,2xl0"2, что подтверждает ранее полученные данные при сопоставлении генных частот HLA-системы [Зарецкая Ю.М., 1983].

Иммуногенетические параметры НРА-генов у кадровых доноров г.Москвы указывают на выраженный полиморфизм локусов НРА-1, -2, -3, -5.

Поэтому трансфузии тромбоцитов должны проводиться с учетом их антигенной структуры у донора и реципиента. Это является важным для предотвращения ал л оимму низ ации больных, развития у них посттрансфузионной тромбоцитопенической пурпуры и иммунологической рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов.

4.3. Частота аллелей и генотипов НРА в выборках из некоторых этнических групп.

Учитывая различия в распределении частот НРА-генов и необходимость подбора НРА-совместимых доноров, а также неоднородность российской популяции, изучение частот аллелей и генотипов НРА в некоторых этнических группах представляет несомненный интерес.

Нами получены предварительные данные о распределении генов и генотипов в двух этнических группах: у 32 представителей армянской национальности и 28 представителей хакасской национальности (национальность устанавливали путем опроса с учетом этнической принадлежности не менее чем в 3-х поколениях). Рассчитать все иммуногенетические параметры, а именно частоты генотипов, гаплотипов и генетическую дистанцию, оказалось невозможным в виду недостаточного объема исследуемых выборок.

На основании полученных нами данных выявлены достоверные различия частот аллелей и генотипов в выборках кадровых доноров г.Москвы, представителей армянской и хакасской национальностей (р < 0,05).

Полученные данные позволяют предложить формирование локальных (национальных) когорт доноров.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Макарик, Татьяна Викторовна, 2005 год

1. Азимов А., Бойд У. Расы и народы. Генетическая мутация и эволюция человека. М.: Центрполиграф. 2003.

2. Головкина JI.JL, Зотиков Е.А. Антигены тромбоцитов (обозначения, молекулярные основы построения, частота встречаемости в популяциях). Клиническая лабораторная диагностика. 2002, 3: 23-35.

3. Головкина Л.Л., Кутьина P.M., Зотиков Е.А. и др. Полиморфизм генов НСРА и его значение при миелотрансплантации от HLA-идентичного сибса. Гематология и трансфузиология. 2004, 49(1): 11-15.

4. Головкина JI.JI., Зотиков Е.А., Февралева И.С. и др. Распространенность генов НОРА в российской популяции. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии, С.-Петербург, 2004, с. 141.

5. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология. М.: Мир. 1993, т.З.

6. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. М.: Медицина. 1983, с.39.

7. Зарещсая Ю.М., Абрамов В.Ю. Новые антигены тканевой совместимости человека. М.: Медицина. 1986, с.100-114.

8. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Головкина JI.JI. Тромбоциты и антитромбоцигарные антитела. М., Монолит, 2003.

9. Красникова Н.А., Пореппша Л.П., Головкина Л.Л. и др. Антитела, реагирующие с тромбоцитами. Клиническая лабораторная диагностика. 2000, 5: 40-45.

10. Кузнецов А.И., Идельсон Л.И., Мазуров А.В. Определение антитромбоцитарных антител на поверхности тромбоцитов с различными формами иммунной тромбоцитопении прямым радиоиммунным методом. Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. 1991, 6: 641-643.

11. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применениепакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера, 2002 (1-е изд.), 2003 (2-е изд.), 312 с.

12. Скобелев С.Г., Чжан Тайсян, Шомалаев А.П. Роды фуюйских кыргызов. Россия и Хакасия: 290 лет совместного развития. Абакан. 1998, с. 76-79.

13. Стентон Гланц. Медико-биологическая биостатистика. М.: Практика. 1999.

14. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека. Проблемы и подходы. М.: Мир. 1989, т.1, с. 151.

15. Drzewek К., Brojer Е., Zupanska В. The frequency of human platelet antigen (HPA) genotypes in the Polish population. Transfusion Medicine. 1998, 8: 339342.

16. Ferrer G., Muniz-Diaz E., Aluja M.P. et al. Analisis of human platelet antigen system in a Moroccan Berber population. Transfus. Med. 2002, 12: 49-54.

17. Ficko Т., Galvani V., Rupreht R. et al. Real-time PCR genotyping of human platelet alloantigens НРА-1, НРА-2, НРА-3, HPA-5 is superior to the standard PCR-SSP method. Transfusion Medicine. 2004, 14: 425-432.

18. Fisher L., Van Belle G. Biostatistics: a methodology for the healh sciences. A Wiley-Interscience Publication, New York, 1993.

19. Fujiwara K., Tokunaga K., Isa K. et al. DNA-based typing of human platelet antigen systems by polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism method. Vox Sanguinis. 1995, 69: 347-351.

20. Garner S.F., Smethurst P.A., Merieux Y. et al. A rapid one-stage whole-blood

21. НРА-la phenotyping assay using a recombinant monoclonal IgGl anti-HPA-la. Br. J. Haematology. 2000, 108(2): 440-447.

22. Golovkina L.L.HPA genes at inhabitans of Russia. In: Abstracts book of 8-th European symposium on platelet an granulocyte immunobiology, Rust, 13-16 May 2004, Post. 18:19.

23. Holensteiner A., Walchshofer S., Adler A. et al. Human platelet antigen frequencies in theAustrian population. Haemostasis .1995, 25: 133.

24. Jau-Yi Lyou, Ying-Ju Chen, Hui-Yu Hu et al. PCR with sequence-specific primer-based simultaneous genotyping of human platelet antigen-1 to -13w. Transfusion .2002, 42:1089-1095.

25. Kekomaki S., Koskeda S., Laaes M. et al. Neonatal thrombocytopenia in two of six human platelet alloantigen (HPA) 5a-positive children of an HPA-5a-immunized mother. Transfiis. Med. 2000, 10(1): 71-75.

26. Kekomaki S., Partanen J., Kekomaki R. Platelet alloantigens HPA-1, -2, -3, -5 and -6b in Finns. Transfusion Medicine. 1995, 5:193-198.

27. Kiefel V., Santoso S., Weisheit M. Monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens (MAIPA): a new tool for the identification of platelet-reactive antibodies. Blood. 1987, 70 (Suppl. 6): 1722-1726.

28. Kiefel V., Vicariot M., Giovangrandi Y. et al. Alloimmunization against Iy, a low-frequency antigen on platelet glycoprotein Ib/IX as a cause of severe neonatal alloimmune Thrombocytopenic purpura. Vox Sang. 1995, 69(3): 250254.

29. Kim H.O., Jin Y., Kickler T.S. et al. Gene frequencies of the five major platelet antigens in African Americans, white and Korean populations. Transfusion1995, 35:863-867.

30. Kluter H., Fehlau К., PanzerS. et al.Rapid typing for human platelet antigen systems-1, -2, -3, and -5 by PCR amplification with sequence specific primers.: Vox Sanguinis. 1996, 71: 121-125.

31. Kroll H., Kiefel V., Santoso S. Clinical aspects and typing of platelet alloantigens. Vox Sanguinis .1998, 74 (Suppl. 2): 345.

32. Legler T.J., Kohler M., Maur W.R. et al. Genotyping of the human platelet antigen systems 1 through 5 by multiplex polymerase chain reaction and ligation-based typing. Transfusion. 1996, 36(5): 426-431.

33. McFarland J.C., Aster R.H., Bussel J.B. et al. Prenatal diagnosis of neonatal alloimmune tlirpmbocytopenia using allele-specific oligonucleotide probes. Blood. 1991, 78: 2276-2282.

34. Merieux Y., Debost M., Bernaud J. et al. Human platelet antigen frequencies of platelet donors in the French population determined by polymerase chain reaction with sequence-specific primers. Pathol.Biol. (Paris). 1997, 45(9):697-700.

35. Metcalfe P. & Waters A.H. HPA-1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP): a rapid and simple technique. British Journal of Haematology. 1993, 85: 227-229.

36. Morel-Kopp M.C., Daviet L., McGregor J. et al. Drawbacks of the MAIPA technique in characterizing human antiplatelet antibodies. Blood Coagul. Fibrinolysis. 1996, 7: 144-146.

37. Mueller-Eckhardt C., Santoso S. & Kiefel V. Platelet alloantigens molecular, genetic, and clinical aspects. Vox Sanguinis. 1994, 67 (Suppl.3): 89-93.

38. Mullis K.B.The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion. PCR Methods Appl. 1991 Aug;l(l):l-4.

39. Muniz-Diaz E., Martinez C., Arilla M. et al. Frecuencia de los antigenos plaquetarios especificos de los sistemas HPA-1, -2, -3, -4, -5 у -6 en poblacion espanola. Haematologic. 1998, 83(2)ed. esp.

40. Murphy M.F., Verjee S., Greaves M. Inadequacies in the postnatal management of fetomaternal alloimmune thrombocytopenia. Br. J. Haematol. 1999, 105: 123-126.

41. Newman P.J. Nomenclature of human platelet alloantigens: a problem with the HPA system. Blood.1994, 83:1447-1451.

42. Norton A., Allen D.L., Murphy M.F. Review: platelet alloantigens and antibodies and their clinical significance. Immunohematology. 2004, 20(2): 89102.

43. Novotny V. M.J., Van Doopn R., Witvliet M.D. et al. Occurrence of allogeneic

44. HLA and non-HLA antibodies after transfusion of prestorage filtered platelets and red Wood cells: a prospective study. Blood. 1995, 85: №7:1736-1741.

45. Ouwehand W., Navarette C. The molecular basis of blood cell alloantigens in molecular haematology. In: Molecular Haematology(eds Provan D., Gribben J.) Oxford, Blackwell Science, 2000: 182-197.ф 47 Porcelijn L. & von dem Borne, A.E.G.K. hnmunemediated

46. Thrombocytopenias: basic and immunological aspects. Baillieres Clinical Haematology. 1998, 11: 331-341.

47. Rachel J.M., Sinor L.T., Tawfik D.W. et al. A solid-phase red cell adherence test for platelet crossmatching. Med. Lab.Sciences. 1985, 42: 194-195.

48. Randen I., Sorensen K., Killie M.K. et al. Rapid and reliable genotyping of human platelet antigen (HPA) -1, -2, -3, -4 and -5 a/b and Gov a/b by meltingcurve analisis. Transfusion. 2003, 43: 445-450.

49. Reviron D., Mercier P., Dabanian C. et al. Platelet group polymorphism in Provence. Comparison with the frequencies of platelet-specific allo-antigens observed in other populations. Rev. Fr. Transfus. Hemobiol. 1992, 35(1): 2532.

50. Rozman P. Platelet antigens. The role of human platelet alloantigens (HPA) in blood transfusion and transplantation. Transplantation Immunology. 2002, 10: 165-181.

51. Santoso S. & Kiefel V. Human platelet-specific alloantigens: update. Vox Sanguinis. 1998, 74(2): 249-253.

52. Santoso S. & Kiefel V. Human platelet-specific alloantigens: update. Vox Sanguinis. 1998, 74 (Suppl. 2): 249-253.

53. Santoso S., Amrheim J., Hoftnan H.A. et al. A point mutation Thr799Met on the alpha 2 integrin leads to the formation of new human platelet alloantigen Sita and affects collagen-induced aggregation. Blood. 1999, 94(12): 4103-4111.

54. Santoso S., Kiefel V., Mueller-Eckhardt C. Blood group A and В determinants are expressed on platelet glycoproteins Ha, Ilia and lb. Thromb. Haemost. 1991, 65(2): 196-201.

55. Sellers J., Guttridge M.G. & Darke C. An imprived method of PCR-SSP HPA-1 typing. European Journal of Immunogenetics. 1995, 22: 102.

56. Sellers J., Thompson J., Guttridge M.G. et al. Human platelet antigens: typing by PCR using sequence-specific primers and their distribution in blood donorsresident in Wales. Eur.J. Immunogenet. 1999, 26: 393-397.

57. Seo D.H., Park S.S., Kim D.W. et al. Gene frequencies of eight human platelet specific antigens in Koreans. Transfusion Medicine .1998, 8:129-132.

58. Shih M.C., Liu T.C., Lin I.L. et al. Gene frequencies of the HPA-1 to HPA-13, Oe and Gov platelet antigen alleles in Taiwanese, Indonesian, Filipino and Thai populations. Int. J. Mol. Med. 2003, 12: 609-614.

59. Shuh A.C., Watkins N.A., Nguyen Q. et al. A tyrosine 703 serine polymorphism of CD 109 defines the Gov platelet alloantigens. Blood. 2002, 99(5): 1692-1698.

60. Simsek S., Borne A.E.G.Kr. Molecular genetics of human platelet antigens. Infusionstherapie Transfusionsmedicin. 1994, 21: 29-33.

61. Simsek S., Faber N.M., Blecker P.M. et al. Determination of human platelet antigen frequencies in the Dutch population by immunophenotyping and DNA (allele-specific restriction enzyme) analysis: Blood .1993, 81:835-840.

62. Skogen В., Bellissimo D.B., Hessner M.J. et al. Rapid determination of platelet alloantigen genotypes by polymerase chain reaction using allele-specific primers. Transfusion. 1994, 34: 955-960.

63. Steffensen R., Kaczan E., Vanning K. et al. Frequency of platelet-specific alloantigens in a Danish population. Tissue Antigens. 1996, 48(2): 93-96.

64. Tanaka S., Ohnoki S., Shibata H. et al. Gene frequencies of human platelet antigens on glycoprotein Ilia in Japanese. Transfusion. 1996, 36: 813-817.

65. Tanaka S., Taniue A., Nagao N. et al. Simultaneous DNA typing of human platelet antigens, 2, 3 and 4 by an allele-specific PCR method. Vox Sanguinis. 1995, 68: 225-230.

66. Tazzari P.L., Cirillo D., Bontandini A. et al. Flow cytometry immunophenotyping and polymerase chain reaction-site-specific primers genotyping for HPA-1 alloantigens in an Italian blood donor population. Vox1. Sang. 1998, 74(1): 42-45.

67. Tijhuis G.J., Klaasen R.J., Modderman P.W. et al. Quantification of platelet-bound immunoglobulins of different class and subclass uing radiolabeled monoclonal antibodies: assay conditions and clinical application. Br.J. Haematology. 1991, 77: 93-101.

68. Tsao K.S., Sun C.F., Lai N.C. The phenotype and gene frequencies of human platelet specific antigens among Chinese in Taiwan. Chung Hua Min Kuo Wei Sheng Wu Chi Mien I Hsueh Tsa Chih. 1992, 25(1): 48-55.

69. Unkelbach K., Kalb R., Santoso S. et al. Genomic RFLP typing of typing of human platelet alloantigens Zw (P1A), Ко, Bak and Br (HPA-1,2,3,5). Br.J. Haematol. 1995, 89: 169-176.

70. Urwijitaroon Y., Barusrus S., Romphruk A. et al. Frequency of human platelet antigens among blood donors in northeastern Thailand. Transfusion. 1995, 35(10): 868-870.

71. Verran J., Grey D., Bennett J. et al. HP A 1, 3, 5 genotyping to establish a typed platelet donor panel. Pathology. 2000, 32: 89-93.

72. Viller S., Dykes D., Polesky H. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleated Acids Research .1988, 16:1215.

73. Von dem Borne A.E., von Riesz E., Verheught F.W. et al. Baka, a new platelet-specific antigen involved in neonatal alloimmune thrombocytopenia. Vox Sanguinis. 1980, 39:113-120.

74. Wang L., Juji Т., Shibata Y. et al. Sequence variation of human platelet membrane glycoprotein Ilia associated with the Yuk/Yuk alloantigen system. Proceedings of the Japan Academy. 1991, 67(1): 102-106.

75. Waters A.H., Autoimmune thrombocytopenia: clinical aspects. Semin. Hematol. 1992, 2: 18-25.

76. Watkins N.A., Armour K.L., Smethurst P.A. et al. Rapid phenotyping of HPA-la using either diabody-based hemagglutination or recombinant IgGl-based assays. Transfusion. 1999, 39(7): 781-789.